Isolatie en karakterisering van de natuurlijke microbiota van het modelnematode Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelsoorten in de biologie, maar bijna al het onderzoek wordt uitgevoerd in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde microben. De hier beschreven methoden zullen helpen om ons begrip van de diversiteit van geassocieerde microben te verbeteren als basis voor toekomstig functioneel C. elegans-onderzoek .

Abstract

De nematode Caenorhabditis elegans interageert met een grote diversiteit aan micro-organismen in de natuur. Over het algemeen wordt C. elegans vaak aangetroffen in rot plantenmateriaal, vooral rotte vruchten zoals appels of op composthopen. Het wordt ook geassocieerd met bepaalde ongewervelde gastheren zoals slakken en pissebedden. Deze habitats zijn rijk aan microben, die dienen als voedsel voor C. elegans en die ook aanhoudend de nematoden darm kunnen koloniseren. Tot op heden is de exacte diversiteit en consistentie van de inheemse C. elegans microbiota over habitats en geografische locaties niet volledig begrepen. Hier beschrijven we een geschikte aanpak voor het isoleren van C. elegans uit de natuur en het karakteriseren van de microbiota van wormen. Nematoden kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit compostmateriaal, rottende appels, slakken of worden aangetrokken door appels op composthopen te plaatsen. De prime time voor het vinden van C. elegans op het noordelijk halfrond is van september tot november. Wormen kunnen uit verzameld substraatmateriaal worden gewassen door het substraat onder te dompelen in een bufferoplossing, gevolgd door het verzamelen van nematoden en hun overdracht op het groeimedium van nematoden of PCR-buffer voor latere analyse. We illustreren verder hoe de monsters kunnen worden gebruikt om de worm-geassocieerde micro-organismen te isoleren en te zuiveren en om wormen te verwerken voor 16S ribosomale RNA-analyse van de samenstelling van de microbiotagemeenschap. Over het algemeen kunnen de beschreven methoden nieuw onderzoek naar de karakterisering van de C. elegans-microbiota over habitats en geografische locaties stimuleren, waardoor wordt bijgedragen aan het verkrijgen van een uitgebreid begrip van de diversiteit en stabiliteit van de microbiota van de nematode als basis voor toekomstig functioneel onderzoek.

Introduction

In de natuur wordt C. elegans vaak aangetroffen in rot plantenmateriaal, vooral rotte vruchten zoals appels of op composthopen¹. Het wordt ook geassocieerd met bepaalde ongewervelde gastheren zoals slakken en pissebedden ^2,3. Deze habitats zijn rijk aan microben, die niet alleen dienen als voedsel voor de worm, maar er ook stabiele associaties mee kunnen vormen. Informatie over de diversiteit van natuurlijk geassocieerde micro-organismen werd pas in 2016 gepubliceerd ^4,5,6. Sindsdien hebben deze en slechts enkele recentere studies aangetoond dat C. elegans wordt geassocieerd met een verscheidenheid aan bacteriën en schimmels, meestal waaronder bacteriën van het geslacht Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter en verschillende anderen ^6,7,8. Verschillende geassocieerde bacteriën kunnen de wormendarm stabiel koloniseren, hoewel niet alle 6,9,10,11,12. Ze zijn waarschijnlijk van cruciaal belang voor ons begrip van de biologie van C. elegans omdat ze voeding kunnen bieden, kunnen beschermen tegen ziekteverwekkers en mogelijk andere stressoren en centrale levensgeschiedeniskenmerken zoals voortplantingssnelheid, ontwikkeling of gedragsreacties kunnen beïnvloeden.

Als voorbeeld, natuurlijk geassocieerde isolaten van de geslachten Pseudomonas, Ochrobactrum en ook Enterobacter of Gluconobacter kunnen de worm beschermen tegen pathogene infectie en doden op verschillende manieren ^5,6,11,13,14. Een specifiek isolaat van het geslacht Comamonas beïnvloedt de voedingsrespons, ontwikkeling, levensduur en vruchtbaarheid van nematoden 15,16,17. Providencia-bacteriën produceren de neuromodulator tyramine en moduleren daardoor de activiteit van het zenuwstelsel van de gastheer en de daaruit voortvloeiende gedragsreacties¹⁸. Een reeks verschillende natuurlijk geassocieerde bacteriën bleek de bevolkingsgroei, vruchtbaarheid en gedragsresponsen te beïnvloeden 5,6,9,11,19.

Tot op heden zijn de exacte diversiteit en consistentie van de inheemse C. elegans microbiota in habitats en geografische locaties niet volledig begrepen, en verdere associaties tussen de worm en microben uit zijn omgeving moeten nog worden ontdekt. Verschillende eerdere studies gebruikten bacteriestammen geïsoleerd uit een bepaald bodemmilieu, natuurlijke C. elegans-habitats of uit mesokosmosexperimenten (d.w.z. laboratoriumomgevingen die natuurlijke habitats recreëren) met C. elegans laboratoriumstammen ^4,5,20. Hoewel deze studies nieuwe inzichten verkregen in de invloed van microben op specifieke nematodenkenmerken (bijv. nematodenmetabolisme²¹), is de relevantie van deze interacties voor de biologie van C. elegans in de natuur onduidelijk. Daarom beschrijft dit manuscript de methoden om C. elegans direct uit de natuur te isoleren en vervolgens de natuurlijk geassocieerde microben te isoleren en vervolgens te karakteriseren van zowel enkele wormen als groepen wormen. De beschreven methoden zijn een bijgewerkte en verbeterde versie van de procedures die eerder werden gebruikt voor de isolatie en karakterisering van natuurlijke C. elegans en zijn inheemse microbiota ^2,6,7. Gezien het feit dat C. elegans op grote schaal wordt aangetroffen in ontbindend plantaardig materiaal over de hele wereld (vooral in rottende vruchten, gematigde streken en in de herfst)1,2,22,23,24,25, kan dit protocol door elk laboratorium worden toegepast wanneer er interesse is in het relateren van C. elegans eigenschappen van natuurlijk geassocieerde microben en dus een meer natuurlijk relevante context. Dit laatste is cruciaal voor een volledig begrip van de biologie van de nematode, omdat het bekend is uit een verscheidenheid van andere gastheersystemen dat de bijbehorende microbiota verschillende levensgeschiedeniskenmerken kan beïnvloeden²⁶, een aspect dat momenteel grotendeels wordt verwaarloosd in de veelheid van C. elegans-studies in bijna alle life science-disciplines.

Protocol

1. Bereiding van buffers en media

1. Bereid de S-buffer voor door 5,85 g NaCl, 1,123 g K₂HPO₄, 5,926 g KH₂PO₄ en 1 l gedeïoniseerd H 2 O gedurende₂₀minuten bij 121 °C aan een kolf en autoclaaf toe te voegen.
2. Bereid een viskeus medium door toevoeging van een S-buffer met 1,2% (g/v) hydroxymethylcellulose (de stof die viscositeit van het medium veroorzaakt), 5 mg/ml cholesterol, 1 mM MgSO₄, 1 mM CaCl₂ en 0,1% (v/v) aceton. Autoclaaf en roer het viskeuze medium totdat het volledig homogeen is.
   OPMERKING: Dit kan meerdere uren duren. Ook kan S-buffer direct worden bereid en toegevoegd aan het viskeuze medium zonder voorafgaande sterilisatie.
3. Bereid M9-buffer voor door 3 g KH₂PO₄, 6 g NA₂HPO₄·2 H₂O, 5 g NaCl en 1 l gedeïoniseerd H₂O toe te voegen aan een kolf van 1 l. Autoclaaf de oplossing en voeg na afkoeling 1 ml 1 M MgSO₄ toe (123,24 g MgSO₄·7H₂O in 500 ml gedeïoniseerd H₂O, filter gesteriliseerd).
4. Bereid 10% (v/v) Triton X-100 stockoplossing door 5 ml Triton X-100 te mengen met 45 ml M9-buffer. Filter-steriliseer de oplossing met behulp van een filter van 0,2 μm.
5. Bereid M9-buffer met Triton X-100 (M9-T) door 2,5 ml van de 10% (v/v) Triton X-100 stockoplossing toe te voegen aan 1 l M9-buffer na autoclaveren om 0,025% (v/v) M9-T te verkrijgen.
6. Bereid 30% (v/v) glycerol in S-buffer door 15 ml steriele 100% glycerol en 35 ml steriele S-buffer in een buis van 50 ml te mengen.

2. Bereiding van milieumonsters (figuur 1)

1. Verzamel milieumonsters zoals compost of rotte vruchten en plaats elk monster in een individuele plastic zak, buis of andere schone container.
   OPMERKING: Om nematoden aan te trekken, kunnen appels enkele weken voorafgaand aan de bemonstering op compost worden geplaatst.
2. Verdeel stukjes van het milieumonster gelijkmatig in een lege, steriele petrischaal van 9 cm.
   OPMERKING: Monsters met hogere niveaus van verval hebben meer kans om C. elegans te bevatten. Optioneel kan een petrischaal gevuld met peptonvrij agarmedium (PFM) worden gebruikt om het contrast te verhogen.
3. Bedek het monster zorgvuldig met ongeveer 20 ml steriel viskeus medium.
   OPMERKING: Nematoden drijven binnen 1-2 uur naar de oppervlakte. Het stroperige medium vertraagt de beweging van de wormen en maakt het gemakkelijker om ze te bemonsteren. Steriele M9-buffer kan als alternatief worden gebruikt, maar de wormbeweging zal sneller zijn.

Figuur 1: Isolatie van nematoden uit substraten. Substraatmonsters worden in lege petrischalen geplaatst en bedekt met viskeus medium om nematoden weg te spoelen. Nematoden worden overgebracht naar M9-T en herhaaldelijk gewassen om bacteriën van buitenaf te verwijderen. Individuele nematoden kunnen worden gebruikt voor DNA-isolatie, isolatie van geassocieerde bacteriën of op agarplaten worden geplaatst om wormpopulaties te kweken. Figuur gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Isolatie van Caenorhabditis nematoden (figuur 1)

1. Zoek naar Caenorhabditis-nematoden met behulp van een ontleedmicroscoop, volgens de richtlijnen die worden gepresenteerd in het hoofdstuk WormBook over de isolatie van C. elegans en verwante nematoden door Barrière en Félix²⁷.
   OPMERKING: Caenorhabditis hermafrodieten / vrouwtjes hebben een darm van lichtbruine kleur (onder doorgelaten verlichting). Bovendien hebben de darmcellen grote celkernen, die zichtbaar zijn als witte stippen. Andere aaltjessoorten daarentegen hebben vaak een donkerbruine darm en kunnen anteroposterior asymmetrie in pigmentintensiteit vertonen en meestal geen zichtbare kernen. De vulva van volwassen Caenorhabditis hermafrodieten/vrouwtjes wordt gevonden in het midden van het dier. Deze vulvalokalisatie wordt niet altijd aangetoond door andere nematodentaxa. Caenorhabditis nematoden bezitten twee faryngeale bollen, die beide zichtbaar zijn met voldoende vergroting en doorgegeven verlichting en contrast met vele andere nematodentaxa. Caenorhabditis nematoden hebben een puntige staart, terwijl sommige andere nematoden een ronde staart hebben.
2. Verzamel de Caenorhabditis nematoden onder een ontleedmicroscoop in zo min mogelijk vloeistof met behulp van een pipet van 20-100 μL. Breng de verzamelde nematoden rechtstreeks over op 1-3 ml steriel M9-T in een steriele petrischaal van 3 cm voor het wassen van de wormen om niet-gehechte microben te verwijderen (stap 3.3) of, als alternatief, breng individuele wormen over op een plaat met nematodengroeimedium (NGM) om een wormpopulatie vast te stellen (stap 3.4).
3. Was de aaltjes om microben van de buitenkant van de nematode te verwijderen.
   OPMERKING: Dit protocol verrijkt voor darmbacteriën, maar elimineert niet volledig bacteriën die aan de wormenriem kleven.
   1. Incubeer de nematoden gedurende 10-15 min in M9-T.
   2. Pipetteer de aaltjes in zo min mogelijk vloeistof tot 1-3 ml verse M9-T in een nieuwe steriele petrischaal van 3 cm.
   3. Herhaal de incubatie en breng de aaltjes nog twee keer over naar verse M9-T.
      OPMERKING: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd met individuele wormen of met wormpopulaties. De wormen kunnen nu worden gebruikt voor de karakterisering van C. elegans en bijbehorende microben, evenals de isolatie van bacteriën (stappen 4 en 5). Als alternatief kunnen ze individueel worden overgebracht naar NGM-platen om een wormpopulatie vast te stellen (stap 3.4).
4. Om een wormpopulatie te verkrijgen, pipetteer je een individuele nematode naar een NGM-plaat.
   OPMERKING: Alleen hermafrodiete nematoden zoals C. elegans of C. briggsae zijn in staat om nakomelingen te produceren van enkele wormen. Enkele wormen van andere soorten kunnen echter nog steeds nakomelingen produceren als ze al waren gedekt.
   1. Natuurlijk geïsoleerde nematoden bevatten meestal bacteriën in hun darm, die ze afwerpen op de NGM-platen, waar deze bacteriën groeien en beschikbaar zijn als voedsel voor C. elegans. Voeg geen afzonderlijke voedselorganismen toe zoals het standaard laboratoriumvoedingsorganisme, E. coli-stam OP50.
      OPMERKING: Het kweken van wormen op platen beïnvloedt de samenstelling van de geassocieerde bacteriële gemeenschap, maar de samenstelling is nog steeds vergelijkbaar met die van de natuurlijke C. elegans isolaten ^6,7.
   2. Laat de nematoden tot 10 dagen woekeren bij de juiste temperatuur (bijv. 15-20 °C voor gematigde locaties). Vries deze aaltjes in (stap 3.5) of gebruik ze voor de karakterisering van C. elegans en bijbehorende microben en de isolatie van microben (stap 4 en 5).
5. Invriezen van aaltjes voor langdurige opslag
   1. Laat de aaltjes op borden liggen totdat de voedselbacteriën zijn verdwenen en er zijn vooral kleine larvale stadia op de platen. Was de wormen van de platen in 1,5 ml S-buffer.
   2. Meng 500 μL wormbevattende S-buffer grondig met 500 μL 30% (v/v) glycerol in S-buffer in een steriele buis van 2 ml. Vries de buizen onmiddellijk in bij -80 °C voor langdurige opslag, anders kan de glycerol de nematoden beschadigen.

4. Voorbereiding van de wormen voor moleculaire identificatie van C. elegans en microben

1. Voor onbevooroordeelde identificatie van nematoden-geassocieerde microben, bereid een 96-well plaat met drie steriele 1 mm kralen, 19,5 μL PCR-buffer en 0,5 μL Proteinase K (20 mg / ml) per put. Pipetteer een individu, gewassen nematode naar elke put en breng zo min mogelijk vloeistof over.
2. Wormpopulaties kunnen ook worden gebruikt. Was hiervoor de wormen van de platen met M9-buffer en breng ~ 300 μL wormbevattende M9-buffer over naar 2 ml buizen met 10-15 kralen.
3. Breek de aaltjes op met een kraalhomogenisator (bijvoorbeeld kraalkloppen gedurende 3 minuten bij 30 Hz). Centrifugeer de plaat of buizen kort om de vloeistof naar de bodem te krijgen (bijvoorbeeld gedurende 10 s bij 8000 x g bij kamertemperatuur [RT]).
4. Identificatie van C. elegans
   1. Isoleer het DNA van individuele nematoden door de monsters in een PCR-cycler gedurende 1 uur bij 50 °C en 15 min bij 95 °C te verhitten. Isoleer het DNA van wormpopulaties met behulp van een isolatiemethode naar keuze (voorbeeldprotocollen van verschillende isolatiemethoden met behulp van commerciële kits ^7,9). Vries het DNA in bij -20 °C voor langdurige opslag.
   2. Gebruik voor de identificatie van C. elegans het DNA en het primerpaar nlp30-F (tabel 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') en nlp30-R (tabel 1, 5'-TACTTTCCCCATCATCCGTATC-3') in een PCR, volgens de instructies van een Taq-leverancier naar keuze.
   3. Gebruik de volgende PCR-omstandigheden: initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 35 cycli van 95 °C gedurende 45 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 1 minuut en een laatste rekstap bij 72 °C gedurende 5 minuten. C. elegans produceert een PCR-product van 154 bp.
5. Karakteriseer de nematode-geassocieerde bacteriën via 16S amplicon sequencing van het V3-V4 gebied, met behulp van het geïsoleerde DNA.
   1. Bereid een 16S-bibliotheek voor met de 16S-primers naar keuze en volg het protocol van de bibliotheekvoorbereidingskit. Een optie is om de primers 341F (Tabel 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') en 806R (Tabel 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') te gebruiken voor het V3-V4-gebied van het 16S-rRNA-gen, wat resulteert in sequenties die kunnen worden geclassificeerd met standaarddatabases met een goede resolutie⁷.
      OPMERKING: De hoeveelheid input-DNA is van cruciaal belang in deze stap. DNA verkregen van enkele wormen zal veel minder zijn dan dat verkregen van wormpopulaties. Voor enkele wormen kan het nodig zijn om de hoeveelheid input-DNA te verhogen of om het aantal PCR-cycli^{te verhogen 7}.
   2. Bibliotheken kunnen worden gesequenced op een sequencingplatform met behulp van een geschikte sequencingkit.
      OPMERKING: Hier wordt het MiSeq-platform gebruikt met een geschikte MiSeq-reagenskit. De reagentia worden voortdurend verbeterd en moeten worden gekozen volgens de nieuwste normen.

5. Isolatie en teelt van nematoden-geassocieerde bacteriën (figuur 2)

1. Om bacteriën te isoleren, bereidt u een 96-well plaat met drie steriele 1 mm kralen, 20 μL M9-buffer per put, en pipetteert een individu, gewassen nematode naar elke put, waarbij zo min mogelijk vloeistof wordt overgebracht.
   OPMERKING: Als alternatief kunnen wormpopulaties worden gewassen van de platen met M9-buffer en ~ 300 μL wormbevattende M9-buffer kan worden overgebracht naar 2 ml buizen met 10-15 kralen. In alle gevallen moeten de wormen afkomstig zijn uit een cultuur die met behulp van stap 4.1-4.4 werd geïdentificeerd als C. elegans .
2. Breek de aaltjes op met een kraalhomogenisator (bijvoorbeeld kraalkloppen gedurende 3 minuten bij 30 Hz). Centrifugeer de plaat of buizen kort om de vloeistof naar de bodem te krijgen (bijvoorbeeld gedurende 10 s bij 8000 x g bij RT).
   OPMERKING: Het gebruik van deze methode leidde tot de isolatie van bacteriële taxa vergelijkbaar met die onthuld door 16S rDNA amplicon sequencing⁷, wat suggereert dat de beschreven kraal-kloppen de meeste bacteriële cellen intact laat.
3. Verzamel het supernatant, verdun het serieel op 1:10 en breng tot 100 μL op agarplaten van 9 cm.
   1. Om ervoor te zorgen dat de meeste bacteriën kunnen worden gekweekt, gebruikt u een verscheidenheid aan alternatieve media met verschillende voedingssamenstellingen, waaronder verdunde trypticase soja-agar (TSA, 1:10 verdunning), MacConkey-agar, Sabouraud-glucose-agar, aardappeldextrose-agar of gist peptone dextrose-agar.
4. Incubeer de platen bij de gemiddelde temperatuuromstandigheden van de bemonsteringslocatie (bijv. temperaturen tussen 15-20 °C voor gematigde locaties) gedurende 24-48 uur.
5. Gebruik de standaard driestrengtechniek en een steriele lus om zuivere bacterieculturen te verkrijgen (figuur 2).
   1. Kies een enkele kolonie van een plaat met behulp van een steriele lus of tandenstoker en streep het uit op een nieuwe agarplaat met hetzelfde agarmedium als gebruikt voor zuivering. Zorg ervoor dat u slechts ongeveer 1/3 van de plaat gebruikt.
   2. Gebruik een nieuwe steriele lus of steriliseer een herbruikbare lus en sleep deze door de eerste streep om een tweede streep op een andere 1/3 van dezelfde plaat te maken.
   3. Herhaal deze stap door een steriele lus door de tweede streep te slepen.
   4. Incubeer de plaat bij dezelfde groeiomstandigheden die worden gebruikt voor isolatie. Deze techniek moet resulteren in enkele kolonies die groeien in het gebied van de derde streep.
      OPMERKING: Het kan nodig zijn om de zuiveringsstap meerdere keren te herhalen, omdat natuurlijke isolaten de neiging hebben om biofilms en / of aggregaten te vormen.
6. Kweek de zuivere kolonies in een vloeibaar medium (van hetzelfde type als het agarmedium) met dezelfde temperatuur en groeitijd als hierboven (stap 5.4)
7. Bereid bacterievoorraden voor door 300 μL van de bacteriecultuur toe te voegen aan 200 μL van 86% (v/v) glycerol (in het betreffende groeimedium, bijvoorbeeld TSB) en pipet op en neer om goed te mengen. U kunt ook DMSO-voorraden bereiden door 50 μL bacteriekweek te mengen met 50 μL van 7% (v/v) DMSO. Vries in bij -80 °C voor langdurige opslag.
8. Karakteriseren van bacteriën met behulp van sequencing van het volledige 16S ribosomale RNA-gen
   1. Extraheer het bacteriële DNA uit zuivere vloeibare culturen met behulp van een geschikte techniek (bijvoorbeeld een DNA-extractiekit; uit ervaring werkt een op CTAB gebaseerd extractieprotocol heel goed²²).
   2. Versterk het 16S-rRNA-gen met behulp van de primers 27F (tabel 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') en 1495R (tabel 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')²⁸ en de volgende PCR-voorwaarden: 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) en een laatste verlengingsperiode bij 72 °C, 5 min.
   3. Om de volledige sequenties te verkrijgen, gebruikt u bovendien twee interne sequencingprimers, zoals 701F (tabel 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') en 785R (tabel 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')⁶.

Figuur 2: Identificatie en isolatie van individuele bacteriën. Individuele nematoden worden afgebroken met behulp van een kraalhomogenisator en DNA wordt geïsoleerd voor soortbepaling via PCR of sequencing. Als alternatief wordt het afgebroken nematodenmateriaal serieel verdund en op groeimediumplaten geplateerd. Platen worden geïncubeerd totdat bacteriekolonies verschijnen en enkele kolonies worden naar nieuwe platen gestreept om zuivere culturen te verkrijgen. Afzonderlijke kolonies van de zuivere culturen worden gebruikt om vloeibare bacterieculturen te kweken voor de bereiding van bacterievoorraden voor langdurige opslag bij -80 °C. Figuur gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Representative Results

De nematode C. elegans wordt vaak aangetroffen in ontbindende vruchten, zoals appels, en ook compostmonsters. In Noord-Duitsland worden zowel C. elegans als congenerische soorten (met name C. remanei maar ook C. briggsae) voornamelijk gevonden van september tot² november. De nematoden worden meestal aangetroffen in ontbindend plantaardig materiaal, vooral rottend fruit zoals appels of peren, en ook compost, met name materiaal dat een hoge mate van ontbinding vertoont. De fruit- en compostmonsters kunnen in het laboratorium worden genomen (figuur 3A, B), worden verdeeld in petrischalen (figuur 3C, D) en vervolgens worden ondergedompeld in een vloeibaar of viskeus medium om de wormen te dwingen het substraatmateriaal te verlaten en naar het oppervlak van het medium te zwemmen (figuur 3E, F). Daarna kunnen de wormen worden verzameld, overgebracht op agarplaten of microcentrifugebuizen en kan de soortidentiteit worden bepaald met behulp van diagnostische PCR's 2,6,7,22.

Figuur 3: Voorbereiding van appels voor isolatie van nematoden. (A,B) Nematoden kunnen worden geïsoleerd uit milieumonsters zoals compost of rotte vruchten en bovendien worden aangetrokken door appels op compost te plaatsen. (C,D) De monsters worden verdeeld en kleine stukjes worden in een petrischaaltje geplaatst. (E,F) Viskeus medium wordt toegevoegd aan de monsters, wat er meestal toe leidt dat nematoden het substraatmateriaal verlaten en naar het oppervlak van het medium zwemmen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

PCR met behulp van de C. elegans specifieke primers nlp30-F en nlp30-R resulteert in een PCR-product van 154 bp lengte voor C. elegans en geen product voor andere nematoden (Figuur 4). Om de succesvolle prestaties van de PCR te bevestigen, moet DNA van een laboratoriumstam zoals N2 als positieve controle gelijktijdig met het DNA van de geïsoleerde nematoden worden uitgevoerd. Kleine hoeveelheden biologisch materiaal, zoals kleine larvale stadia, kunnen leiden tot zwakke PCR-banden (figuur 4A). De zichtbaarheid van de PCR-banden kan worden verbeterd door meer DNA in de PCR te gebruiken (merk op dat dit de hoeveelheid DNA die overblijft voor bacteriële 16S rDNA amplicon-sequencing, bijvoorbeeld 2 μL DNA in plaats van 1 μL), zal minimaliseren door een grotere hoeveelheid van het PCR-product op de gel aan te brengen (bijv. 10-15 μL), of door het aantal PCR-cycli te verhogen. In vergelijking met enkele wormen leveren wormpopulaties bestaande uit ten minste 50 wormen meestal een grotere hoeveelheid DNA op en zijn de banden in de elektroforesegel duidelijk zichtbaar (figuur 4B).

Figuur 4: PCR-product van C. elegans-specifieke PCR. (A,B) De C. elegans-specifieke primers nlp30-F en nlp30-R produceren een PCR-product van 154 bp lengte. Als voorbeeld werden PCR's uitgevoerd op (A) enkele wormen en (B) wormpopulaties (bijv. 300-500 individuen), allemaal geïsoleerd met het beschreven protocol van rottend plantenmateriaal uit de compost van de Botanische Tuin in Kiel, Duitsland. (A) DNA van enkele wormen en in het bijzonder van kleine larvale stadia resulteert vaak in zwakke PCR-banden. (B) DNA geïsoleerd uit wormpopulaties (bijv. 300-500 individuen) resulteert in duidelijkere banden. DNA van C. elegans N2 werd gebruikt als positieve controle (+), geen sjabloon werd gebruikt als negatieve controle (-). De uitstrijkjes onder PCR-banden zijn gelartefacten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De microben, die geassocieerd zijn met C. elegans, kunnen worden geïsoleerd uit wormen en ook de wormbevattende substraatmonsters. Microbe-isolatie volgt algemene microbiologische normen, waaronder isolatie van zuivere culturen uit agarplaten, hun groei in vloeibare media en hun daaropvolgende karakterisering (bijvoorbeeld met behulp van de sequenties van het 16S ribosomale RNA-gen voor bacteriën). Het is van cruciaal belang dat de microben worden geïsoleerd als zuivere enkelvoudige kolonies uit platen, met behulp van standaard microbiologische procedures (figuur 5). Dit is belangrijk omdat sommige van de C. elegans-geassocieerde bacteriën biofilms kunnen vormen en / of gemakkelijk kunnen aggregeren, wat resulteert in multi-species culturen (figuur 5C, D). De zuiverheid van de geïsoleerde bacterieculturen kan worden bevestigd door de sequenties van het 16S-rRNA-gen, zoals gedaan voor eerder geïsoleerde C. elegans-geassocieerde microben ^6,7. De verkregen microben kunnen vervolgens worden gebruikt in experimenten met C. elegans.

Figuur 5: Bacteriële isolaten op agarplaten. Individuele bacteriële isolaten worden uitgestreept op agarplaten, in dit geval tryptische soja-agar (TSA) platen, met als voorbeelden een isolaat van (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens, en een voorbeeld met verschillende bacteriesoorten, weergegeven als een (C) overzicht van de hele plaat en (D) vergroting van een deel van deze plaat, waarin verschillende kolonietypen zichtbaar zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Lijst van primers die in dit onderzoek zijn gebruikt Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

De nematode Caenorhabditis elegans is een van de meest intensief bestudeerde modelorganismen in het biologisch onderzoek. Het werd geïntroduceerd door Sydney Brenner in de jaren 1960, oorspronkelijk voor het begrijpen van de ontwikkeling en de functie van het zenuwstelsel²⁹. Sindsdien is C. elegans een krachtig model geworden voor het bestuderen van fundamentele processen in alle biologische disciplines, waaronder gedragsbiologie, neurobiologie, veroudering, evolutionaire biologie, celbiologie, ontwikkelingsbiologie en immunologie. Het succes is gebaseerd op een unieke combinatie van voordelige eigenschappen, waaronder een korte generatietijd van ongeveer 3 dagen, teeltgemak, transparant lichaam (waardoor efficiënte fenotypering mogelijk is), overleving van bevriezing, efficiënte sterilisatie en ontwikkelingssynchronisatie, en ook efficiënte methoden voor genetische manipulatie door mutagenese, CRISPR-Cas of RNAi. Tegenwoordig wordt C. elegans bestudeerd in ongeveer 1.500 laboratoria wereldwijd. Toen Sydney Brenner voor het eerst C. elegans als modelsysteem in het laboratorium oprichtte, kweekte hij het bacterivore nematode op de Gram-negatieve bacterie Escherichia coli OP50 als voedselbron. Sindsdien is C. elegans in monoxeenkweek op E. coli OP50 in laboratoria over de hele wereld^{gehandhaafd 29}. Bovendien worden C. elegans-populaties gewoonlijk gesynchroniseerd of gedesinfecteerd door een bleekprocedure die alleen wordt overleefd door steriele eieren en geen bijbehorende microbe. Het is dus gemakkelijk om steriele dieren te genereren die vervolgens onder zeer gecontroleerde omstandigheden kunnen worden blootgesteld aan individuele bacteriën. Als gevolg van deze gestandaardiseerde C. elegans laboratoriumonderhoudsprotocollen werden echter bijna alle studies naar de biologie van C. elegans gedaan in afwezigheid van de natuurlijk geassocieerde bacteriën. In feite werd informatie over de diversiteit van natuurlijk geassocieerde micro-organismen pas in 2016 gepubliceerd ^4,5,6, en de exacte diversiteit van geassocieerde microben is nog steeds niet volledig onderzocht.

De beschreven methoden zullen helpen om de diversiteit van microben die geassocieerd zijn met C. elegans in de natuur verder te karakteriseren. Deze microben zijn waarschijnlijk belangrijke determinanten van de levensgeschiedenis van de nematode en zouden dus een essentiële hulpbron moeten zijn voor toekomstig werk met deze worm. De beschreven methoden zijn een bijgewerkte versie van de enige eerder gepubliceerde methoden voor het isoleren van microben uit natuurlijke C. elegans-monsters die rechtstreeks uit het veld zijn verzameld ^6,7. Het protocol maakt gebruik van het feit dat C. elegans in de natuur in ontbinding van plantenmateriaal woont. Dergelijk rottend materiaal is rijk aan microben, die dienen als voedsel voor C. elegans en waarschijnlijk andere functies vervullen, zoals immuunbescherming (d.w.z. bescherming tegen pathogenen)5,6,11,13,14. De eerste belangrijke stap is dus het verkrijgen van geschikte substraten voor wormisolatie. Geschiktheid kan afhangen van de tijd van het jaar; in Noord-Duitsland wordt C. elegans voornamelijk gevonden van september tot² november. Dit is het moment waarop fruit zoals appels of peren beschikbaar komt en op de grond begint te rotten. De exacte tijd zal waarschijnlijk variëren tussen geografische regio's 23,24,25,30. Elk plantaardig materiaal lijkt geschikt voor C. elegans, zolang het een hoge mate van ontbinding vertoont en dus een rijke microbiële gemeenschap draagt - behalve materiaal dat wordt gedomineerd door schimmels, die vaak pathogeen zijn voor C. elegans¹. Bovendien komt C. elegans meestal bijzonder vaak voor wanneer de algemene luchtvochtigheid niet te laag is². Tot op heden ontbreekt systematische informatie over de vraag of Caenorhabditis-nematoden in overvloed variëren in plantaardig materiaal van industriële versus biologische landbouw of oppervlakte versus diepere laag van afval of afhankelijkheid van regen of niet.

Zodra de monsters zijn verzameld en overgebracht naar het laboratorium, moeten wormen uit hun substraten worden "gelokt". Dit is bereikt met een aantal verschillende benaderingen, bijvoorbeeld door wormextractie via Baermann-trechters³¹ of de plaatsing van monsters op een agarplaat met het E. coli-laboratoriumvoedsel als lokstof in het midden^{van 27}. Onze ervaring is dat het hier beschreven protocol over het algemeen sneller en efficiënter is. Het is gebaseerd op het idee dat de substraatmonsters worden ondergedompeld in een vloeibare of viskeuze oplossing, die de wormen efficiënt uit het substraat en naar het oppervlak van de vloeistof dwingt, van waaruit ze gemakkelijk kunnen worden verzameld. De viscositeit van het medium is niet absoluut nodig, maar het vertraagt de beweging van de wormen en kan het dus gemakkelijker maken om ze te verzamelen. De efficiënte verzameling van wormen wordt vergemakkelijkt wanneer de vloeistof zorgvuldig aan het substraat wordt toegevoegd, waardoor oplosbaarheid van humeuze stoffen wordt vermeden, wat de vloeistof donkerder kan maken en het moeilijk kan maken om de nematoden te zien.

De volgende uitdaging is om C. elegans te identificeren. Sommige morfologische kenmerken kunnen helpen om Caneorhabditis-wormen te onderscheiden van andere nematoden²⁷, maar zijn onvoldoende voor nauwkeurige soortidentificatie. Rottend plantenmateriaal bevat vaak andere vergelijkbaar uitziende nematoden, waaronder congenerische soorten, zoals C. briggsae of C. remanei 2,6,23,25, die op het eerste gezicht onmogelijk te onderscheiden zijn. Daarom kunnen C. elegans het beste en meest betrouwbaar worden geïdentificeerd met behulp van diagnostische PCR met behulp van soortspecifieke primers ^2,6,7, zoals beschreven in het protocol. In deze context kan het nuttig zijn om een groeiende populatie van de geïsoleerde natuurlijke C. elegans in het laboratorium vast te stellen, bijvoorbeeld op standaard NGM-platen. De natuurlijke C. elegans brengen meestal geassocieerde bacteriën mee, die op de NGM-platen worden geworpen, waar de bacteriën meestal groeien en vervolgens dienen als voedsel voor de wormen ^6,7. Hoewel de exacte samenstelling van de geassocieerde microben verandert tijdens de proliferatie van C. elegans op platen, is deze nog steeds vergelijkbaar met die van onmiddellijk gekarakteriseerde natuurlijke nematodenmonsters ^6,7, en is dus een nuttig compromis dat de isolatie van zowel C. elegans als de bijbehorende microben mogelijk maakt.

Zodra C. elegans met succes is geïdentificeerd, kunnen de nematoden of de bijbehorende substraatmonsters worden gebruikt voor de isolatie en karakterisering van de bijbehorende microben. Om ervoor te zorgen dat de microben echt geassocieerd worden met C. elegans in de natuur, is het van het grootste belang om besmettingen in alle stappen van de protocollen te voorkomen. Het verzamelen van compost- en fruitmonsters in het veld moet met bijzondere zorg worden gedaan door de onderzoeker, met behulp van gesteriliseerd materiaal. Alle verwerking van materiaal in het laboratorium moet zorgen voor een hoog niveau van hygiëne en opnieuw gesteriliseerde plastic waren en buffers. Om het besmettingsrisico te verminderen, moet al het laboratoriumwerk idealiter worden uitgevoerd in een aparte laboratoriumruimte, die uitsluitend is gewijd aan de isolatie van de microben. Als alternatief moet al het werk met open platen, buizen of andere containers worden gedaan in een laminaire stromingskast. Om het besmettingsrisico te beoordelen, moeten passende controlemonsters (bv. zonder monsters of zonder wormen) parallel worden verwerkt. Bovendien kan een verscheidenheid aan verschillende media worden gebruikt om ervoor te zorgen dat alle verschillende soorten bacteriën met hun verschillende groeibehoeften kunnen worden gekweekt en geïsoleerd. Niettemin gaf eerder werk aan dat alle tot nu toe geïsoleerde bacteriën, die worden geassocieerd met natuurlijke C. elegans-isolaten , gemakkelijk groeien op NGM- en TSA-platen. Het kan dus voldoende zijn om je op deze media te concentreren.

De geïsoleerde en gekarakteriseerde microben zullen bijdragen aan een beter begrip van de natuurlijke geschiedenis van C. elegans. Wat nog belangrijker is, tot op heden is het niet goed begrepen hoe C. elegans reageert op zijn natuurlijk geassocieerde microben, welke moleculaire processen betrokken zijn en welke functies de interactie van de worm met zijn microbiële medewerkers bemiddelen. Een van de belangrijkste uitzonderingen is het uitgebreide werk van de Walhout-groep over de interactie tussen C. elegans en Comamonas DA 1877. Het onthulde vitamine B12 als een centrale metaboliet die wordt geleverd door de bacterie, die de expressie, vruchtbaarheid, levensduur en ontwikkeling van wormgenen beïnvloedt 15,16,17. De Walhoutgroep toonde verder aan dat het vitamine B12-effect op vruchtbaarheid en ontwikkeling afhankelijk is van de methionine/S-Adenosylmethioninecyclus en wordt beïnvloed door verschillende transcriptiefactoren, zoals de nucleaire hormoonreceptor NHR-23 15,16,17. Bovendien draagt bacteriële vitamine B12 bij aan de afbraak van het potentieel toxische vetzuurpropionaat met korte keten, dat bij afwezigheid van vitamine B12 kan worden gecompenseerd door metabole netwerkbedrading, blijkbaar door de productie van 3-hydroxypropionaat^16,32. Een ander voorbeeld is het neuromodulerende effect van Providencia, ontdekt door het Sengupta-lab, waar bacteriële tyramine door de C. elegans tyramine β-hydroxylase wordt omgezet in octopamine, dat vervolgens het gedrag van wormen beïnvloedt door zijn interactie met de OCTR-1 octopaminereceptor in specifieke sensorische neuronen¹⁸. Nog een ander voorbeeld is immuunbescherming, die wordt geboden door verschillende bacteriën, vooral die van het geslacht Pseudomonas. Dit gebeurt hetzij door de productie van antimicrobiële verbindingen of door een indirect effect, mogelijk via de activering van specifieke gastheerresponsen ^6,11,14. Extra microben en vooral het gebruik van natuurlijk geassocieerde microbiële gemeenschappen zullen helpen om een realistischer begrip te krijgen van de biologie van dit modelnematode.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
COMSOL	COMSOL		multiphysics simulation software