Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Abstract

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans interagiert mit einer großen Vielfalt von Mikroorganismen in der Natur. Im Allgemeinen wird C. elegans häufig in faulem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in faulen Früchten wie Äpfeln oder auf Komposthaufen. Es ist auch mit bestimmten wirbellosen Wirten wie Schnecken und Asseln verbunden. Diese Lebensräume sind reich an Mikroben, die als Nahrung für C. elegans dienen und auch den Nematodendarm persistent besiedeln können. Bis heute ist die genaue Vielfalt und Konsistenz der einheimischen C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir einen geeigneten Ansatz, um C. elegans aus der Natur zu isolieren und die Mikrobiota von Würmern zu charakterisieren. Nematoden können leicht aus Kompostmaterial, verrottenden Äpfeln, Schnecken isoliert oder durch das Platzieren von Äpfeln auf Komposthaufen angezogen werden. Die Hauptzeit für den Fund von C. elegans in der nördlichen Hemisphäre ist von September bis November. Würmer können aus gesammeltem Substratmaterial ausgewaschen werden, indem das Substrat in Pufferlösung getaucht wird, gefolgt von der Sammlung von Nematoden und deren Transfer auf Nematodenwachstumsmedium oder PCR-Puffer zur anschließenden Analyse. Wir veranschaulichen weiterhin, wie die Proben verwendet werden können, um die wurmassoziierten Mikroorganismen zu isolieren und zu reinigen und Würmer für die 16S ribosomale RNA-Analyse der Zusammensetzung der Mikrobiota-Gemeinschaft zu verarbeiten. Insgesamt können die beschriebenen Methoden neue Forschungen zur Charakterisierung der C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg anregen und so zu einem umfassenden Verständnis der Vielfalt und Stabilität der Mikrobiota des Fadenwurms als Grundlage für zukünftige funktionelle Forschung beitragen.

Introduction

In der Natur wird C. elegans häufig in faulem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in faulen Früchten wie Äpfeln oder auf Komposthaufen¹. Es ist auch mit bestimmten wirbellosen Wirten wie Schnecken und Asseln assoziiert ^2,3. Diese Lebensräume sind reich an Mikroben, die nicht nur als Nahrung für den Wurm dienen, sondern auch stabile Assoziationen mit ihm bilden können. Informationen zur Vielfalt natürlich assoziierter Mikroorganismen wurden erst 2016 veröffentlicht ^4,5,6. Seitdem haben diese und nur wenige neuere Studien gezeigt, dass C. elegans mit einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen assoziiert ist, am häufigsten einschließlich Bakterien der Gattung Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter und einige andere ^6,7,8. Mehrere assoziierte Bakterien können den Wurmdarm stabil besiedeln, wenn auch nicht alle 6,9,10,11,12. Sie sind wahrscheinlich von zentraler Bedeutung für unser Verständnis der Biologie von C. elegans, da sie Nahrung liefern, vor Krankheitserregern und möglicherweise anderen Stressoren schützen und zentrale Merkmale der Lebensgeschichte wie Fortpflanzungsrate, Entwicklung oder Verhaltensreaktionen beeinflussen können.

Zum Beispiel können natürlich assoziierte Isolate der Gattungen Pseudomonas, Ochrobactrum und auch Enterobacter oder Gluconobacter den Wurm auf unterschiedliche Weise vor Erregerinfektion und -abtötung schützen 5,6,11,13,14. Ein spezifisches Isolat der Gattung Comamonas beeinflusst die Nahrungsreaktion, Entwicklung, Lebensdauer und Fruchtbarkeit von Nematoden^15,16,17. Providencia-Bakterien produzieren den Neuromodulator Tyramin und modulieren dadurch die Aktivität des Nervensystems des Wirts und die daraus resultierenden Verhaltensreaktionen¹⁸. Es wurde gezeigt, dass eine Reihe verschiedener natürlich assoziierter Bakterien die Wachstumsrate, die Fruchtbarkeit und die Verhaltensreaktionen der Bevölkerung beeinflusst 5,6,9,11,19.

Bis heute ist die genaue Vielfalt und Konsistenz der einheimischen C. elegans-Mikrobiota über Lebensräume und geografische Standorte hinweg nicht vollständig verstanden, und weitere Assoziationen zwischen dem Wurm und Mikroben aus seiner Umgebung müssen noch aufgedeckt werden. Mehrere frühere Studien verwendeten Bakterienstämme, die aus einer Bodenumgebung, natürlichen C. elegans-Lebensräumen oder aus Mesokosmenexperimenten (dh Laborumgebungen, die natürliche Lebensräume nachbilden) mit C. elegans-Laborstämmen ^4,5,20 isoliert wurden. Obwohl diese Studien neue Erkenntnisse über den Einfluss von Mikroben auf bestimmte Nematodenmerkmale (z.B. Nematodenstoffwechsel²¹) lieferten, ist die Relevanz dieser Interaktionen für die Biologie von C. elegans in der Natur unklar. Daher beschreibt dieses Manuskript die Methoden, C. elegans direkt aus der Natur zu isolieren und die natürlich assoziierten Mikroben sowohl aus einzelnen Würmern als auch aus Gruppen von Würmern zu isolieren und anschließend zu charakterisieren. Die beschriebenen Methoden sind eine aktualisierte und verbesserte Version der bisher verwendeten Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von natürlichem C. elegans und seiner nativen Mikrobiota ^2,6,7. In Anbetracht der Tatsache, dass C. elegans bei der Zersetzung von Pflanzenmaterial auf der ganzen Welt weit verbreitet ist (insbesondere in verrottenden Früchten, gemäßigten Regionen und im Herbst)1,2,22,23,24,25, kann dieses Protokoll von jedem Labor angewendet werden^, wann immer Interesse an einer Beziehung zu C. elegans besteht. Merkmale zu natürlich assoziierten Mikroben und damit zu einem natürlich relevanteren Kontext. Letzteres ist entscheidend für ein vollständiges Verständnis der Biologie des Fadenwurms, da aus einer Vielzahl anderer Wirtssysteme bekannt ist, dass die assoziierte Mikrobiota verschiedene Merkmale der Lebensgeschichte beeinflussen kann²⁶, ein Aspekt, der derzeit in der Vielzahl von C. elegans-Studien in fast allen lebenswissenschaftlichen Disziplinen weitgehend vernachlässigt wird.

Protocol

1. Vorbereitung von Puffern und Medien

1. Der S-Puffer wird durch Zugabe von 5,85 g NaCl, 1,123 g K2_HPO4, 5,926 g KH_2PO4 und 1 l deionisiertem_H2Oin einen Kolben und Autoklaven für 20 min bei 121 °C hergestellt.
2. Bereiten Sie ein viskoses Medium durch Zugabe von S-Puffer vor, der 1,2% (w/v) Hydroxymethylcellulose (die Substanz, die die Viskosität des Mediums verursacht), 5 mg/ml Cholesterin, 1 mM_MgSO4, 1 mM CaCl₂ und 0,1% (v/v) Aceton enthält. Autoklavieren und rühren Sie das viskose Medium, bis es vollständig homogen ist.
   HINWEIS: Dies kann mehrere Stunden dauern. Auch S-Puffer kann direkt hergestellt und dem viskosen Medium ohne vorherige Sterilisation zugesetzt werden.
3. Der M9-Puffer wird durch Zugabe von 3 g KH 2 PO 4, 6 g NA_{2 HPO4}·2 H₂O, 5 g NaCl und1 L deionisiertem_H2Oin einen 1 L Kolben hergestellt. Autoklavieren Sie die Lösung und fügen Sie nach dem Abkühlen 1 ml 1 M MgSO4 hinzu (123,24 g_MgSO4·_7H2Oin 500 mL deionisiertem_H2O, Filter sterilisiert).
4. Bereiten Sie 10% (v/v) Triton X-100 Stammlösung vor, indem Sie 5 mL Triton X-100 mit 45 mL M9-Puffer mischen. Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.
5. M9-Puffer mit Triton X-100 (M9-T) vorbereiten, indem 2,5 ml der 10%igen (v/v) Triton X-100 Stammlösung zu 1 l M9-Puffer nach dem Autoklavieren gegeben werden, um 0,025% (v/v) M9-T zu erhalten.
6. Bereiten Sie 30% (v/v) Glycerin in S-Puffer vor, indem Sie 15 mL steriles 100% Glycerin und 35 ml steriles S-Puffer in einem 50 ml Röhrchen mischen.

2. Vorbereitung von Umweltproben (Abbildung 1)

1. Sammeln Sie Umweltproben wie Kompost oder faule Früchte und legen Sie jede Probe in einen einzelnen Plastikbeutel, eine Tube oder einen anderen sauberen Behälter.
   HINWEIS: Um Nematoden anzulocken, können Äpfel einige Wochen vor der Probenahme auf Kompost gelegt werden.
2. Teile der Umweltprobe gleichmäßig in einer leeren, sterilen 9 cm langen Petrischale verteilen.
   HINWEIS: Proben mit höherem Zerfallsgrad enthalten eher C. elegans. Optional kann eine Petrischale verwendet werden, die mit peptonfreiem Agarmedium (PFM) gefüllt ist, um den Kontrast zu erhöhen.
3. Decken Sie die Probe vorsichtig mit ca. 20 ml sterilem viskosem Medium ab.
   HINWEIS: Nematoden schweben innerhalb von 1-2 h an die Oberfläche. Das viskose Medium verlangsamt die Bewegung der Würmer und erleichtert die Probenahme. Alternativ kann ein steriler M9-Puffer verwendet werden, die Wurmbewegung ist jedoch schneller.

Abbildung 1: Isolierung von Nematoden aus Substraten. Substratproben werden in leere Petrischalen gegeben und mit viskosem Medium bedeckt, um Nematoden auszuspülen. Nematoden werden auf M9-T übertragen und wiederholt gewaschen, um Bakterien von außen zu entfernen. Einzelne Nematoden können zur DNA-Isolierung, Isolierung assoziierter Bakterien oder auf Agarplatten platziert werden, um Wurmpopulationen zu kultivieren. Figur erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Isolierung von Caenorhabditis-Nematoden (Abbildung 1)

1. Suchen Sie mit einem Seziermikroskop nach Caenorhabditis-Nematoden , gemäß den Richtlinien im WormBook-Kapitel über die Isolierung von C. elegans und verwandten Nematoden von Barrière und Félix²⁷.
   HINWEIS: Caenorhabditis hermaphrodites / Weibchen haben einen Darm von hellbrauner Farbe (unter Durchlicht). Darüber hinaus haben die Darmzellen große Zellkerne, die als weiße Punkte sichtbar sind. Im Gegensatz dazu haben andere Nematodenarten oft einen dunkelbraunen Darm und können anteroposteriore Asymmetrie in der Pigmentintensität und normalerweise keine sichtbaren Kerne aufweisen. Die Vulva erwachsener Caenorhabditis Hermaphroditen/Weibchen befindet sich in der Mitte des Tieres. Diese Vulvalokalisation wird nicht immer von anderen Nematodentaxa gezeigt. Caenorhabditis-Nematoden besitzen zwei Rachenkolben, die beide mit ausreichender Vergrößerung und Durchlicht sichtbar sind und im Gegensatz zu vielen anderen Nematodentaxa stehen. Caenorhabditis-Nematoden haben einen spitzen Schwanz, während einige andere Nematoden einen runden Schwanz haben.
2. Sammeln Sie die Caenorhabditis-Nematoden unter einem Seziermikroskop in möglichst wenig Flüssigkeit mit einer 20-100 μL Pipette. Die gesammelten Nematoden werden direkt in 1-3 ml steriles M9-T in eine sterile 3 cm Petrischale überführt, um die Würmer zu waschen, um nicht anhaftende Mikroben zu entfernen (Schritt 3.3), oder alternativ einzelne Würmer auf eine Platte mit Nematodenwachstumsmedium (NGM) übertragen, um eine Wurmpopulation zu etablieren (Schritt 3.4).
3. Waschen Sie die Nematoden, um Mikroben von der Außenseite des Nematoden zu entfernen.
   HINWEIS: Dieses Protokoll bereichert Darmbakterien, eliminiert jedoch nicht vollständig Bakterien, die an der Wurmkutikula haften.
   1. Inkubieren Sie die Nematoden für 10-15 min in M9-T.
   2. Pipettieren Sie die Nematoden in so wenig Flüssigkeit wie möglich in 1-3 mL frisches M9-T in einer neuen sterilen 3 cm Petrischale.
   3. Wiederholen Sie die Inkubation und übertragen Sie die Nematoden noch zwei weitere Male auf frisches M9-T.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte können entweder mit einzelnen Würmern oder mit Wurmpopulationen durchgeführt werden. Die Würmer können nun zur Charakterisierung von C. elegans und assoziierten Mikroben sowie zur Isolierung von Bakterien (Schritte 4 und 5) verwendet werden. Alternativ können sie einzeln auf NGM-Platten übertragen werden, um eine Wurmpopulation zu etablieren (Schritt 3.4).
4. Um eine Wurmpopulation zu erhalten, pipetten Sie einen einzelnen Nematoden auf eine NGM-Platte.
   HINWEIS: Nur zwittrige Nematoden wie C. elegans oder C . briggsae sind in der Lage, Nachkommen aus einzelnen Würmern zu zeugen. Einzelne Würmer anderer Arten können jedoch noch Nachkommen produzieren, wenn sie bereits gedeckt wurden.
   1. Natürlich isolierte Nematoden enthalten normalerweise Bakterien in ihrem Darm, die sie auf die NGM-Platten abgeben, wo diese Bakterien wachsen und als Nahrung für C. elegans zur Verfügung stehen. Fügen Sie keine separaten Lebensmittelorganismen wie den Standard-Laborlebensmittelorganismus E. coli-Stamm OP50 hinzu.
      HINWEIS: Die Aufzucht von Würmern auf Platten beeinflusst die Zusammensetzung der assoziierten Bakteriengemeinschaft, dennoch ist die Zusammensetzung vergleichbar mit der der natürlichen C. elegans-Isolate ^6,7.
   2. Lassen Sie die Nematoden bis zu 10 Tage bei der entsprechenden Temperatur (z. B. 15-20 °C für gemäßigte Standorte) vermehren. Frieren Sie diese Nematoden ein (Schritt 3.5) oder verwenden Sie sie für die Charakterisierung von C. elegans und assoziierten Mikroben sowie die Isolierung von Mikroben (Schritte 4 und 5).
5. Einfrieren von Nematoden für die Langzeitlagerung
   1. Lassen Sie die Nematoden auf Tellern, bis die Nahrungsbakterien verschwunden sind, und es gibt hauptsächlich kleine Larvenstadien auf den Tellern. Waschen Sie die Würmer in 1,5 ml S-Puffer von den Platten.
   2. Mischen Sie 500 μL wurmhaltigen S-Puffer gründlich mit 500 μL 30% (v/v) Glycerin in S-Puffer in einem sterilen 2 ml Röhrchen. Gefrieren Sie die Röhrchen umgehend bei -80 °C zur Langzeitlagerung, da sonst das Glycerin die Nematoden schädigen kann.

4. Vorbereitung der Würmer zur molekularen Identifizierung von C. elegans und Mikroben

1. Für die unvoreingenommene Identifizierung von Nematoden-assoziierten Mikroben ist eine 96-Well-Platte mit drei sterilen 1-mm-Perlen, 19,5 μL PCR-Puffer und 0,5 μL Proteinase K (20 mg/ml) pro Vertiefung vorzubereiten. Pipettieren Sie einen einzelnen, gewaschenen Fadenwurm in jeden Brunnen und übertragen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich.
2. Wurmpopulationen können ebenfalls verwendet werden. Dazu waschen Sie die Würmer von den Platten mit M9-Puffer und geben ~300 μL wurmhaltigen M9-Puffer in 2 mL Röhrchen mit 10-15 Perlen.
3. Zerlegen Sie die Nematoden mit einem Perlenhomogenisator (z. B. Perlenschlagen für 3 min bei 30 Hz). Zentrifugieren Sie die Platte oder die Röhrchen kurz, um die Flüssigkeit auf den Boden zu bringen (z. B. für 10 s bei 8000 x g bei Raumtemperatur [RT]).
4. Identifizierung von C. elegans
   1. Isolieren Sie die DNA einzelner Nematoden, indem Sie die Proben in einem PCR-Cycler für 1 h bei 50 °C und 15 min bei 95 °C erhitzen. Isolieren Sie die DNA von Wurmpopulationen mit einer beliebigen Isolationsmethode Ihrer Wahl (Beispielprotokolle verschiedener Isolationsmethoden mit kommerziellen Kits ^7,9). Die DNA zur Langzeitlagerung bei -20 °C einfrieren.
   2. Für die Identifizierung von C. elegans verwenden Sie die DNA und das Primerpaar nlp30-F (Tabelle 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') und nlp30-R (Tabelle 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') in einer PCR gemäß den Anweisungen eines Taq-Lieferanten Ihrer Wahl.
   3. Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: erster Denaturierungsschritt bei 95 °C für 2 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95 °C für 45 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 1 min und einem letzten Dehnungsschritt bei 72 °C für 5 min. elegans erzeugt ein 154 bp PCR-Produkt.
5. Charakterisierung der Nematoden-assoziierten Bakterien mittels 16S-Amplikonsequenzierung der V3-V4-Region unter Verwendung der isolierten DNA.
   1. Bereiten Sie eine 16S-Bibliothek mit den 16S-Primern Ihrer Wahl vor und befolgen Sie das Protokoll des Bibliotheksvorbereitungskits. Eine Möglichkeit ist die Verwendung der Primer 341F (Tabelle 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') und 806R (Tabelle 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'), die die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens abdecken, was zu Sequenzen führt, die mit Standarddatenbanken mit guter Auflösung klassifiziert werden können⁷.
      HINWEIS: Die Menge der Eingabe-DNA ist in diesem Schritt kritisch. DNA, die von einzelnen Würmern gewonnen wird, wird viel geringer sein als die von Wurmpopulationen. Bei einzelnen Würmern kann es notwendig sein, die Menge der Eingangs-DNA zu erhöhen oder die Anzahl der PCR-Zyklen zu erhöhen⁷.
   2. Bibliotheken können auf einer Sequenzierungsplattform mit einem geeigneten Sequenzierungskit sequenziert werden.
      HINWEIS: Hier wird die MiSeq-Plattform mit einem geeigneten MiSeq-Reagenzien-Kit verwendet. Die Reagenzien werden ständig verbessert und sollten nach den neuesten Standards ausgewählt werden.

5. Isolierung und Kultivierung von Nematoden-assoziierten Bakterien (Abbildung 2)

1. Um Bakterien zu isolieren, bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit drei sterilen 1-mm-Perlen, 20 μL M9-Puffer pro Vertiefung vor und pipettieren Sie einen einzelnen, gewaschenen Nematoden in jede Vertiefung, wobei so wenig Flüssigkeit wie möglich übertragen wird.
   HINWEIS: Alternativ können Wurmpopulationen mit M9-Puffer von den Platten gewaschen und ~300 μL wurmhaltiger M9-Puffer in 2 mL Röhrchen mit 10-15 Perlen überführt werden. In allen Fällen sollten die Würmer aus einer Kultur stammen, die anhand der Schritte 4.1-4.4 als C. elegans identifiziert wurde.
2. Zerlegen Sie die Nematoden mit einem Perlenhomogenisator (z. B. Perlenschlagen für 3 min bei 30 Hz). Zentrifugieren Sie die Platte oder die Röhrchen kurz, um die Flüssigkeit auf den Boden zu bringen (z. B. für 10 s bei 8000 x g RT).
   HINWEIS: Die Verwendung dieser Methode führte zur Isolierung bakterieller Taxa, ähnlich denen, die durch die 16S rDNA-Amplikonsequenzierung⁷ aufgedeckt wurden, was darauf hindeutet, dass die beschriebene Perlenschlagung die meisten Bakterienzellen intakt lässt.
3. Sammeln Sie den Überstand, verdünnen Sie ihn seriell bei 1:10 und platen Sie bis zu 100 μL auf 9 cm Agarplatten.
   1. Um sicherzustellen, dass die meisten Bakterien kultiviert werden können, verwenden Sie eine Vielzahl alternativer Medien mit unterschiedlichen Nährstoffzusammensetzungen, einschließlich verdünntem Trypticase-Sojaagar (TSA, 1:10 Verdünnung), MacConkey-Agar, Sabouraud Glucose-Agar, Kartoffeldextrose-Agar oder Hefe-Pepton-Dextrose-Agar.
4. Inkubieren Sie die Platten bei den durchschnittlichen Temperaturbedingungen des Probenahmeortes (z. B. Temperaturen zwischen 15-20 °C für gemäßigte Standorte) für 24-48 h.
5. Verwenden Sie die Standard-Drei-Streifen-Technik und eine sterile Schleife, um reine Bakterienkulturen zu erhalten (Abbildung 2).
   1. Nehmen Sie eine einzelne Kolonie von einer Platte mit einer sterilen Schlaufe oder einem Zahnstocher und streifen Sie sie auf eine neue Agarplatte, die das gleiche Agarmedium enthält, das für die Reinigung verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass Sie nur etwa 1/3 der Platte verwenden.
   2. Verwenden Sie entweder eine neue sterile Schlaufe oder sterilisieren Sie eine wiederverwendbare Schlaufe und ziehen Sie sie durch den ersten Streifen, um einen zweiten Streifen auf einem weiteren 1/3 derselben Platte zu erzeugen.
   3. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie eine sterile Schleife durch den zweiten Streifen ziehen.
   4. Inkubieren Sie die Platte unter den gleichen Wachstumsbedingungen, die für die Isolierung verwendet werden. Diese Technik muss dazu führen, dass einzelne Kolonien im Bereich des dritten Streifens wachsen.
      HINWEIS: Es kann notwendig sein, den Reinigungsschritt mehrmals zu wiederholen, da natürliche Isolate dazu neigen, Biofilme und / oder Aggregate zu bilden.
6. Züchten Sie die reinen Kolonien in einem flüssigen Medium (vom gleichen Typ wie das Agarmedium) mit der gleichen Temperatur und Wachstumszeit wie oben (Schritt 5.4)
7. Bereiten Sie Bakterienbrühen vor, indem Sie 300 μL der Bakterienkultur zu 200 μL 86% (v/v) Glycerin (im jeweiligen Wachstumsmedium, z. B. TSB) geben und nach oben und unten pipettieren, um richtig zu mischen. Alternativ können DMSO-Brühen hergestellt werden, indem 50 μL Bakterienkultur mit 50 μL 7% (v/v) DMSO gemischt werden. Zur Langzeitlagerung bei -80 °C einfrieren.
8. Charakterisierung von Bakterien durch Sequenzierung des vollständigen 16S ribosomalen RNA-Gens
   1. Extrahieren Sie die bakterielle DNA aus reinen flüssigen Kulturen mit einer geeigneten Technik (z. B. einem DNA-Extraktionskit; erfahrungsgemäß funktioniert ein CTAB-basiertes Extraktionsprotokoll sehr gut²²).
   2. Amplifizieren Sie das 16S rRNA-Gen mit den Primern 27F (Tabelle 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') und 1495R (Tabelle 1, 5'-CTACGGCTACCTTTACGA -3')28 und den folgenden PCR-Bedingungen: 95 °C, 2 min, ^22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s) und einer letzten Verlängerungsperiode bei 72 °C, 5 min.
   3. Um die vollständigen Sequenzen zu erfassen, verwenden Sie zusätzlich zwei interne Sequenzierungsprimer, wie 701F (Tabelle 1, 5'-GTGTAGCGTGAAATGCG-3') und 785R (Tabelle 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')⁶.

Abbildung 2: Artenbestimmung und Isolierung einzelner Bakterien. Einzelne Nematoden werden mit einem Perlenhomogenisator aufgebrochen und DNA zur Artbestimmung mittels PCR oder Sequenzierung isoliert. Alternativ wird das aufgebrochene Nematodenmaterial seriell verdünnt und auf Wachstumsmediumplatten plattiert. Platten werden inkubiert, bis Bakterienkolonien erscheinen, und einzelne Kolonien werden zu neuen Platten gestreift, um Reinkulturen zu erhalten. Aus einzelnen Kolonien der Reinkulturen werden flüssige Bakterienkulturen zur Vorbereitung von Bakterienbeständen für die Langzeitlagerung bei -80 °C gezüchtet. Figur erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Representative Results

Der Fadenwurm C. elegans findet sich häufig in zersetzenden Früchten wie Äpfeln und auch Kompostproben. In Norddeutschland kommen C. elegans sowie kongenerische Arten (insbesondere C. remanei, aber auch C. briggsae) hauptsächlich von September bis². November vor. Die Nematoden werden am häufigsten in zersetzendem Pflanzenmaterial gefunden, insbesondere in verrottenden Früchten wie Äpfeln oder Birnen, aber auch in Kompost, insbesondere in Material, das einen hohen Zersetzungsgrad aufweist. Die Frucht- und Kompostproben können ins Labor gebracht werden (Abbildung 3A,B), in Petrischalen verteilt (Abbildung 3C,D) und anschließend in ein flüssiges oder viskoses Medium getaucht werden, um die Würmer zu zwingen, das Substratmaterial zu verlassen und zur Oberfläche des Mediums zu schwimmen (Abbildung 3E,F). Danach können die Würmer gesammelt, auf Agarplatten oder Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und die Artidentität mittels diagnostischer PCRs ^2,6,7,22 bestimmt werden.

Abbildung 3: Vorbereitung von Äpfeln zur Isolierung von Nematoden. (A,B) Nematoden können aus Umweltproben wie Kompost oder faulen Früchten isoliert und zusätzlich durch das Setzen von Äpfeln auf Kompost angezogen werden. (C,D) Die Proben werden geteilt und kleine Stücke in eine Petrischale gelegt. (E,F) Den Proben wird viskoses Medium zugesetzt, was normalerweise dazu führt, dass Nematoden das Substratmaterial verlassen und an die Oberfläche des Mediums schwimmen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die PCR unter Verwendung der C. elegans-spezifischen Primer nlp30-F und nlp30-R führt zu einem PCR-Produkt von 154 bp Länge für C. elegans und keinem Produkt für andere Nematoden (Abbildung 4). Um die erfolgreiche Durchführung der PCR zu bestätigen, sollte DNA eines Laborstamms wie N2 als Positivkontrolle gleichzeitig mit der DNA der isolierten Nematoden durchgeführt werden. Kleine Mengen an biologischem Material, wie kleine Larvenstadien, können zu schwachen PCR-Banden führen (Abbildung 4A). Die Sichtbarkeit der PCR-Banden kann verbessert werden, indem mehr DNA in der PCR verwendet wird (beachten Sie, dass dies die Menge an DNA minimiert, die für die bakterielle 16S-rDNA-Amplikonsequenzierung übrig bleibt, z. B. 2 μL DNA anstelle von 1 μL), indem eine größere Menge des PCR-Produkts auf das Gel aufgetragen wird (z. B. 10-15 μL), oder durch Erhöhung der Anzahl der PCR-Zyklen. Im Vergleich zu Einzelwürmern ergeben Wurmpopulationen, die aus mindestens 50 Würmern bestehen, in der Regel eine größere Menge an DNA, und die Banden im Elektrophoresegel sind deutlich sichtbar (Abbildung 4B).

Abbildung 4: PCR-Produkt der C. elegans-spezifischen PCR. (A,B) Die C. elegans-spezifischen Primer nlp30-F und nlp30-R erzeugen ein PCR-Produkt von 154 bp Länge. Als Beispiel wurden PCRs an (A) Einzelwürmern und (B) Wurmpopulationen (z. B. 300-500 Individuen) durchgeführt, die alle mit dem beschriebenen Protokoll aus verrottendem Pflanzenmaterial aus dem Kompost des Botanischen Gartens in Kiel isoliert wurden. (A) DNA einzelner Würmer und insbesondere kleiner Larvenstadien führt häufig zu schwachen PCR-Banden. (B) DNA, die aus Wurmpopulationen (z. B. 300-500 Individuen) isoliert wurde, führt zu klareren Banden. DNA von C. elegans N2 wurde als Positivkontrolle verwendet (+), keine Schablone wurde als Negativkontrolle verwendet (-). Die Abstriche unterhalb der PCR-Banden sind Gelartefakte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Mikroben, die mit C. elegans assoziiert sind, können aus Würmern und auch den wurmhaltigen Substratproben isoliert werden. Die Mikrobenisolierung folgt allgemeinen mikrobiologischen Standards, einschließlich der Isolierung von Reinkulturen aus Agarplatten, ihrem Wachstum in flüssigen Medien und ihrer anschließenden Charakterisierung (z. B. unter Verwendung der Sequenzen des ribosomalen RNA-Gens 16S für Bakterien). Es ist wichtig, dass die Mikroben als reine Einzelkolonien aus Platten isoliert werden, wobei mikrobiologische Standardverfahren verwendet werden (Abbildung 5). Dies ist wichtig, da einige der C. elegans-assoziierten Bakterien Biofilme bilden und/oder leicht aggregieren können, was zu Mehrartenkulturen führt (Abbildung 5C,D). Die Reinheit der isolierten Bakterienkulturen kann durch die Sequenzen des 16S rRNA-Gens bestätigt werden, wie dies bei zuvor isolierten C. elegans-assoziierten Mikroben ^6,7 der Fall ist. Die gewonnenen Mikroben können anschließend in Experimenten mit C. elegans verwendet werden.

Abbildung 5: Bakterienisolate auf Agarplatten. Einzelne Bakterienisolate werden auf Agarplatten gestreift, in diesem Fall tryptische Sojaagar (TSA) -Platten, die als Beispiele ein Isolat von (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens und ein Beispiel mit mehreren Bakterienarten zeigen, dargestellt als (C) Überblick über die gesamte Platte und (D) Vergrößerung eines Abschnitts dieser Platte, in dem verschiedene Kolonietypen sichtbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1: Liste der in dieser Studie verwendeten Primer Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans ist einer der am intensivsten untersuchten Modellorganismen in der biologischen Forschung. Es wurde von Sydney Brenner in den 1960er Jahren eingeführt, ursprünglich zum Verständnis der Entwicklung und der Funktion des Nervensystems²⁹. Seitdem ist C. elegans zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung grundlegender Prozesse in allen biologischen Disziplinen geworden, einschließlich Verhaltensbiologie, Neurobiologie, Altern, Evolutionsbiologie, Zellbiologie, Entwicklungsbiologie und Immunologie. Sein Erfolg basiert auf einer einzigartigen Kombination vorteilhafter Eigenschaften, darunter eine kurze Generationszeit von ca. 3 Tagen, einfache Kultivierung, transparenter Körper (ermöglicht eine effiziente Phänotypisierung), Überleben des Einfrierens, effiziente Sterilisation und Entwicklungssynchronisation sowie effiziente Methoden zur genetischen Manipulation durch Mutagenese, CRISPR-Cas oder RNAi. Heute wird C. elegans in etwa 1.500 Laboratorien weltweit untersucht. Als Sydney Brenner C. elegans erstmals als Modellsystem im Labor etablierte, züchtete er den bakterivoren Nematoden auf dem gramnegativen Bakterium Escherichia coli OP50 als Nahrungsquelle. Seitdem wird C. elegans in monoxenischer Kultur auf E. coli OP50 in Laboratorien auf der ganzen Welt gehalten²⁹. Darüber hinaus werden C. elegans-Populationen gewöhnlich durch ein Bleichverfahren synchronisiert oder dekontaminiert, das nur von sterilen Eiern und keiner zugehörigen Mikrobe überlebt wird. So ist es einfach, sterile Tiere zu erzeugen, die dann unter streng kontrollierten Bedingungen einzelnen Bakterien ausgesetzt werden können. Als Ergebnis dieser standardisierten Laborpflegeprotokolle von C. elegans wurden jedoch fast alle Studien zur Biologie von C. elegans in Abwesenheit seiner natürlich assoziierten Bakterien durchgeführt. Tatsächlich wurden Informationen über die Vielfalt der natürlich assoziierten Mikroorganismen erst 2016 veröffentlicht ^4,5,6, und die genaue Vielfalt der assoziierten Mikroben ist noch nicht vollständig erforscht.

Die beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt der Mikroben, die in der Natur mit C. elegans assoziiert sind, weiter zu charakterisieren. Diese Mikroben sind wahrscheinlich wichtige Determinanten der Lebensgeschichte des Fadenwurms und sollten daher eine wesentliche Ressource für die zukünftige Arbeit mit diesem Wurm sein. Die beschriebenen Methoden sind eine aktualisierte Version der einzigen bisher veröffentlichten Methoden zur Isolierung von Mikroben aus natürlichen C. elegans-Proben, die direkt aus dem Feld entnommen wurden ^6,7. Das Protokoll macht sich die Tatsache zunutze, dass C. elegans zersetzendes Pflanzenmaterial in der Natur bewohnt. Solches verrottendes Material ist reich an Mikroben, die als Nahrung für C. elegans dienen und wahrscheinlich andere Funktionen erfüllen, wie z.B. Immunschutz (d.h. Schutz vor Krankheitserregern)5,6,11,13,14. Der erste wichtige Schritt besteht daher darin, geeignete Substrate für die Schneckenisolierung zu erhalten. Die Eignung kann von der Jahreszeit abhängen; in Norddeutschland kommt C. elegans vor allem von September bis^{zum 2}. November vor. Dies ist die Zeit, in der Früchte wie Äpfel oder Birnen verfügbar werden und auf dem Boden zu verrotten beginnen. Die genaue Zeit wird wahrscheinlich zwischen den geografischen Regionen^23,24,25,30 variieren. Jedes Pflanzenmaterial scheint für C. elegans geeignet zu sein, solange es einen hohen Zersetzungsgrad aufweist und somit eine reiche mikrobielle Gemeinschaft aufweist - mit Ausnahme von Material, das von Pilzen dominiert wird, die oft pathogen für C. elegans¹ sind. Darüber hinaus ist C. elegans in der Regel besonders häufig, wenn die allgemeine Luftfeuchtigkeit nicht zu niedrig ist². Bis heute fehlen systematische Informationen darüber, ob Caenorhabditis-Nematoden in der Häufigkeit von Pflanzenmaterial aus industriellem oder biologischem Anbau oder Oberflächen- versus tieferen Detritusschichten oder Abhängigkeit von Regen variieren oder nicht.

Sobald die Proben gesammelt und ins Labor gebracht wurden, müssen Würmer aus ihren Substraten "gelockt" werden. Dies wurde mit verschiedenen Ansätzen erreicht, beispielsweise durch Wurmextraktion durch Baermann-Trichter³¹ oder die Platzierung von Proben auf einer Agarplatte, die das E. coli-Laborfutter als Lockstoff in der Mitte²⁷ enthält. Nach unserer Erfahrung ist das hier beschriebene Protokoll in der Regel schneller und effizienter. Es basiert auf der Idee, dass die Substratproben in eine flüssige oder viskose Lösung getaucht werden, die die Würmer effizient aus dem Substrat und an die Oberfläche der Flüssigkeit drückt, von wo aus sie leicht gesammelt werden können. Die Viskosität des Mediums ist nicht unbedingt erforderlich, verlangsamt jedoch die Bewegung der Würmer und kann so das Sammeln erleichtern. Die effiziente Sammlung von Würmern wird erleichtert, wenn die Flüssigkeit vorsichtig in das Substrat gegeben wird, wodurch eine Solubilisierung von Humusstoffen vermieden wird, die die Flüssigkeit verdunkeln und das Sehen der Nematoden erschweren können.

Die nächste Herausforderung besteht darin, C. elegans zu identifizieren. Einige morphologische Merkmale können helfen, Caneorhabditis-Würmer von anderen Nematoden^{zu unterscheiden 27}, reichen jedoch für eine genaue Artbestimmung nicht aus. Verrottendes Pflanzenmaterial enthält oft andere ähnlich aussehende Nematoden, einschließlich kongenerischer Arten wie C. briggsae oder C. remanei 2,6,23,25^, die auf den ersten Blick nicht zu unterscheiden sind. Daher kann C. elegans am besten und zuverlässigsten mit Hilfe der diagnostischen PCR unter Verwendung speziesspezifischer Primer ^2,6,7, wie im Protokoll beschrieben^, identifiziert werden. In diesem Zusammenhang kann es sinnvoll sein, eine proliferierende Population der isolierten natürlichen C. elegans im Labor beispielsweise auf Standard-NGM-Platten zu etablieren. Die natürlichen C. elegans bringen in der Regel assoziierte Bakterien mit, die auf die NGM-Platten abgegeben werden, wo die Bakterien normalerweise wachsen und anschließend als Nahrung für die Würmer dienen ^6,7. Obwohl sich die genaue Zusammensetzung der assoziierten Mikroben während der Proliferation von C. elegans auf Platten ändert, ist sie immer noch vergleichbar mit der der unmittelbar charakterisierten natürlichen Nematodenproben ^6,7 und ist somit ein nützlicher Kompromiss, der die Isolierung sowohl von C. elegans als auch von den zugehörigen Mikroben ermöglicht.

Sobald C. elegans erfolgreich identifiziert ist, können die Nematoden oder die zugehörigen Substratproben für die Isolierung und Charakterisierung der zugehörigen Mikroben verwendet werden. Um sicherzustellen, dass die Mikroben in der Natur wirklich mit C. elegans assoziiert sind, ist es von größter Bedeutung, Kontaminationen in allen Schritten der Protokolle zu vermeiden. Die Sammlung von Kompost- und Fruchtproben auf dem Feld sollte vom Forscher mit besonderer Sorgfalt unter Verwendung von sterilisiertem Material durchgeführt werden. Jede Verarbeitung von Material im Labor muss ein hohes Maß an Hygiene gewährleisten und wieder sterilisierte Kunststoffwaren und Puffer enthalten. Um das Kontaminationsrisiko zu reduzieren, sollten alle Laborarbeiten idealerweise in einem separaten Laborraum durchgeführt werden, der ausschließlich der Isolierung der Mikroben gewidmet ist. Alternativ sollten alle Arbeiten mit offenen Platten, Rohren oder anderen Behältern in einem Laminar-Flow-Schrank durchgeführt werden. Zur Beurteilung des Kontaminationsrisikos sollten geeignete Kontrollproben (z. B. ohne Proben oder ohne Würmer) parallel verarbeitet werden. Darüber hinaus könnte eine Vielzahl unterschiedlicher Medien verwendet werden, um sicherzustellen, dass alle unterschiedlichen Bakterienarten mit ihren unterschiedlichen Wachstumsanforderungen kultiviert und isoliert werden können. Frühere Arbeiten deuteten jedoch darauf hin, dass alle bisher isolierten Bakterien, die mit natürlichen C. elegans-Isolaten assoziiert sind, leicht auf NGM- und TSA-Platten wachsen . Daher kann es ausreichen, sich auf diese Medien zu konzentrieren.

Die isolierten und charakterisierten Mikroben werden zu einem besseren Verständnis der Naturgeschichte von C. elegans beitragen. Noch wichtiger ist, dass bis heute nicht gut verstanden ist, wie C. elegans auf seine natürlich assoziierten Mikroben reagiert, welche molekularen Prozesse beteiligt sind und welche Funktionen die Interaktion des Wurms mit seinen mikrobiellen Partnern vermitteln. Eine der wichtigsten Ausnahmen ist die umfassende Arbeit der Walhout-Gruppe über die Interaktion zwischen C. elegans und Comamonas DA 1877. Es zeigte sich Vitamin B12 als zentraler Metabolit des Bakteriums, der die Genexpression, Fruchtbarkeit, Lebensdauer und Entwicklung von Würmern beeinflusst^15,16,17. Die Walhout-Gruppe zeigte weiter, dass die Wirkung von Vitamin B12 auf Fruchtbarkeit und Entwicklung vom Methionin/S-Adenosylmethionin-Zyklus abhängt und von mehreren Transkriptionsfaktoren wie dem nukleären Hormonrezeptor NHR-23^15,16,17 beeinflusst wird. Darüber hinaus trägt bakterielles Vitamin B12 zum Abbau der potenziell toxischen kurzkettigen Fettsäure Propionatsäure bei, die in Abwesenheit von Vitamin B12 durch metabolische Netzwerkneuverdrahtung kompensiert werden kann, offenbar durch die Produktion von 3-Hydroxypropionat^16,32. Ein anderes Beispiel ist die neuromodulatorische Wirkung von Providencia, die vom Sengupta-Labor entdeckt wurde, wo bakterielles Tyramin durch das Tyramin C. elegans β-Hydroxylase in Octopamin umgewandelt wird, das anschließend das Verhalten von Würmern durch seine Interaktion mit dem OCTR-1-Octopaminrezeptor in spezifischen sensorischen Neuronen beeinflusst¹⁸. Ein weiteres Beispiel ist der Immunschutz, den verschiedene Bakterien, insbesondere die der Gattung Pseudomonas, bieten. Dies geschieht entweder durch die Produktion antimikrobieller Verbindungen oder durch eine indirekte Wirkung, möglicherweise durch die Aktivierung spezifischer Wirtsantworten 6,11,14. Zusätzliche Mikroben und insbesondere die Verwendung natürlich assoziierter mikrobieller Gemeinschaften werden dazu beitragen, die Biologie dieses Modellnematoden realistischer zu verstehen.

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COMSOL	COMSOL		multiphysics simulation software