Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

Abstract

הנמטודה Caenorhabditis elegans אינטראקציה עם מגוון גדול של מיקרואורגניזמים בטבע. באופן כללי, C. elegans נמצא בדרך כלל בחומר צמחי רקוב, במיוחד פירות רקובים כמו תפוחים או על ערימות קומפוסט. הוא קשור גם למארחים חסרי חוליות מסוימים כגון שבלולים ועץ. בתי גידול אלה עשירים במיקרובים, המשמשים כמזון ל-C. elegans ואשר יכולים גם ליישב בהתמדה את מעי הנמטודה. נכון להיום, המגוון והעקביות המדויקים של המיקרוביוטה המקומית C. elegans על פני בתי גידול ומיקומים גיאוגרפיים אינם מובנים במלואם. במאמר זה נתאר גישה מתאימה לבידוד C. elegans מהטבע ולאפיון המיקרוביוטה של התולעים. נמטודות ניתן לבודד בקלות מחומר קומפוסט, תפוחים נרקבים, שבלולים, או למשוך על ידי הנחת תפוחים על ערימות קומפוסט. זמן הפריים טיים למציאת C. elegans בחצי הכדור הצפוני הוא מספטמבר עד נובמבר. ניתן לשטוף תולעים מחומר המצע שנאסף על ידי טבילת המצע בתמיסת חיץ, ולאחר מכן איסוף נמטודות והעברתן למדיום גידול נמטודות או מאגר PCR לניתוח לאחר מכן. אנו ממחישים עוד יותר כיצד ניתן להשתמש בדגימות כדי לבודד ולטהר את המיקרואורגניזמים הקשורים לתולעים ולעבד תולעים עבור ניתוח RNA ריבוזומלי 16S של הרכב קהילת המיקרוביוטה. באופן כללי, השיטות המתוארות עשויות לעורר מחקר חדש על אפיון המיקרוביוטה של C. elegans על פני בתי גידול ומיקומים גיאוגרפיים, ובכך לסייע בהשגת הבנה מקיפה של המגוון והיציבות של המיקרוביוטה של הנמטודה כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי.

Introduction

בטבע, C. elegans נמצא בדרך כלל בחומר צמחי רקוב, במיוחד פירות רקובים כמו תפוחים או על ערימות קומפוסט1. הוא קשור גם לפונדקאים חסרי חוליות מסוימים כמו שבלולים ועץ 2,3. בתי גידול אלה עשירים במיקרובים, אשר לא רק משמשים מזון לתולעת, אלא עשויים גם ליצור קשרים יציבים איתה. מידע על מגוון המיקרואורגניזמים הקשורים באופן טבעי פורסם רק בשנת 2016 4,5,6. מאז, מחקרים אלה ורק כמה מחקרים עדכניים יותר גילו כי C. elegans קשורה למגוון של חיידקים ופטריות, בדרך כלל כולל חיידקים מהסוג Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter, ועודכמה 6,7,8. מספר חיידקים קשורים יכולים ליישב ביציבות את מעי התולעת, אם כי לא כולם 6,9,10,11,12. הם עשויים להיות בעלי חשיבות מרכזית להבנתנו את הביולוגיה של C. elegans מכיוון שהם יכולים לספק תזונה, להגן מפני פתוגנים ואולי גורמי עקה אחרים, ולהשפיע על תכונות מרכזיות בהיסטוריית החיים כגון קצב הרבייה, התפתחות או תגובות התנהגותיות.

לדוגמה, מבודדים הקשורים באופן טבעי של הסוגים Pseudomonas, Ochrobactrum, וגם Enterobacter או Gluconobacter יכול להגן על התולעת מפני זיהום פתוגן והרג בדרכים שונות 5,6,11,13,14. בידוד ספציפי של הסוג Comamonas משפיע על התגובה התזונתית של נמטודה, התפתחות, תוחלת חיים ופוריות15,16,17. חיידקי פרובידנסיה מייצרים את הטיראמין הנוירומודולטורי ובכך מווסתים את פעילות מערכת העצבים המארחת ואת התגובות ההתנהגותיות הנובעות מכך18. קבוצה של חיידקים שונים הקשורים באופן טבעי הודגמו כמשפיעים על קצב גידול האוכלוסייה, הפוריות והתגובות ההתנהגותיות 5,6,9,11,19.

נכון להיום, המגוון והעקביות המדויקים של המיקרוביוטה המקומית C. elegans על פני בתי גידול ומיקומים גיאוגרפיים אינם מובנים במלואם, וקשרים נוספים בין התולעת למיקרובים מסביבתה עדיין נחשפים. מספר מחקרים קודמים השתמשו בזני חיידקים שבודדו מסביבת קרקע כלשהי, מבתי גידול טבעיים של C. elegans, או מניסויים במזוקוסמוס (כלומר, סביבות מבוססות מעבדה המשחזרות בתי גידול טבעיים) עם זני מעבדה של C. elegans 4,5,20. אף על פי שמחקרים אלה השיגו תובנות חדשות על השפעתם של מיקרובים על תכונות נמטודות ספציפיות (למשל, מטבוליזם של נמטודות21), הרלוונטיות של אינטראקציות אלה לביולוגיה של C. elegans בטבע אינה ברורה. לכן, כתב יד זה מתאר את השיטות לבודד ישירות C. elegans מהטבע ולבודד ולאחר מכן לאפיין את המיקרובים הקשורים באופן טבעי הן מתולעים בודדות והן מקבוצות של תולעים. השיטות המתוארות הן גרסה מעודכנת ומשופרת של ההליכים ששימשו בעבר לבידוד ואפיון של C. elegans טבעיים והמיקרוביוטה המקורית שלה 2,6,7. בהתחשב בכך ש- C. elegans נמצא באופן נרחב בחומר צמחי מתפרק ברחבי העולם (במיוחד בפירות נרקבים, באזורים ממוזגים ובסתיו)1,2,22,23,24,25, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה בכל פעם שיש עניין בהתייחסות ל- C. elegans תכונות למיקרובים הקשורים באופן טבעי ולכן הקשר רלוונטי יותר באופן טבעי. זה האחרון הוא חיוני להבנה מלאה של הביולוגיה של הנמטודה מכיוון שידוע ממגוון של מערכות מארחות אחרות שהמיקרוביוטה הקשורה יכולה להשפיע על מאפייני היסטוריית חיים מגוונים26, היבט שכיום מוזנח במידה רבה בריבוי המחקרים של C. elegans כמעט בכל תחומי מדעי החיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מאגרים ומדיה

  1. הכן את מאגר ה-S על-ידי הוספת 5.85 גרם של NaCl, 1.123 גרם של K 2 HPO 4, 5.926 גרם של KH 2 PO4, ו-1 L של H2O שעבר דה-יוניזציה לבקבוקון ואוטוקלאב למשך 20 דקות ב-121 °C.
  2. הכינו מדיום צמיג על ידי הוספת S-buffer המכיל 1.2% (w/v) הידרוקסימתיל צלולוז (החומר הגורם לצמיגות המדיום), 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול, 1 מ"מ MgSO4, 1 mM CaCl2 ואצטון 0.1% (v/v). Autoclave ומערבבים את המדיום צמיג עד שהוא הומוגני לחלוטין.
    הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות. כמו כן, S-buffer ניתן להכין ישירות ולהוסיף למדיום צמיג ללא עיקור מוקדם.
  3. הכן את מאגר M9 על-ידי הוספת 3 גרם של KH 2 PO 4, 6 גרם של NA 2 HPO4·2 H 2 O, 5 גרם של NaCl, ו-1 L של H2O שעבר דה-יוניזציה לבקבוק של 1ליטר. Autoclave את התמיסה, ולאחר קירור, להוסיף 1 מ"ל של 1 M MgSO 4 (123.24 גרם של MgSO4·7H 2 O ב 500 מ"ל של H2O deionized, מסנן מעוקר).
  4. הכן 10% (v/v) פתרון מלאי Triton X-100 על ידי ערבוב 5 מ"ל של Triton X-100 עם 45 מ"ל של מאגר M9. סננו ועקרו את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
  5. הכן את מאגר M9 עם Triton X-100 (M9-T) על-ידי הוספת 2.5 מ"ל מתוך 10% (v/v) פתרון המניות של Triton X-100 ל-1 ליטר של מאגר M9 לאחר autoclaving כדי להשיג 0.025% (v/v) M9-T.
  6. הכינו 30% (v/v) גליצרול ב-S-buffer על ידי ערבוב של 15 מ"ל של 100% גליצרול סטרילי ו-35 מ"ל של S-buffer סטרילי בצינור של 50 מ"ל.

2. הכנת דגימות סביבתיות (איור 1)

  1. אספו דגימות סביבתיות כמו קומפוסט או פירות רקובים והניחו כל דגימה בשקית ניילון בודדת, בצינור או במיכל נקי אחר.
    הערה: על מנת למשוך נמטודות, ניתן להניח תפוחים על קומפוסט מספר שבועות לפני הדגימה.
  2. פזרו חתיכות מהדגימה הסביבתית באופן שווה בצלחת פטרי ריקה, סטרילית, בקוטר 9 ס"מ.
    הערה: דגימות עם רמות גבוהות יותר של דעיכה נוטות יותר להכיל C. elegans. לחלופין, ניתן להשתמש בצלחת פטרי מלאה במדיום אגר נטול פפטון (PFM) כדי להגביר את הניגודיות.
  3. לכסות את הדגימה בזהירות עם כ 20 מ"ל של מדיום צמיג סטרילי.
    הערה: נמטודות צפות אל פני השטח תוך 1-2 שעות. המדיום הצמיג מאט את תנועת התולעים ומקל על דגימתן. ניתן להשתמש במאגר M9 סטרילי כחלופה, עם זאת, תנועת התולעת תהיה מהירה יותר.

Figure 1
איור 1: בידוד נמטודות ממצעים. דגימות המצע מונחות בצלחות פטרי ריקות ומכוסות במדיום צמיג כדי לשטוף נמטודות. נמטודות מועברות ל-M9-T ונשטפות שוב ושוב כדי להסיר חיידקים מבחוץ. נמטודות בודדות יכולות לשמש לבידוד דנ"א, בידוד של חיידקים קשורים, או מונחות על צלחות אגר לאוכלוסיות תולעי תרבית. איור שנוצר עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. בידוד של נמטודות Caenorhabditis (איור 1)

  1. חפש נמטודות Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופ מנתח, בהתאם להנחיות שהוצגו בפרק WormBook על הבידוד של C. elegans ונמטודות קשורות על ידי Barrière ו Félix27.
    הערה: Caenorhabditis hermaphrodites / נקבות יש מעיים של צבע חום בהיר (תחת תאורה משודרת). יתר על כן, לתאי המעיים יש גרעיני תאים גדולים, הנראים כנקודות לבנות. לעומת זאת, למיני נמטודות אחרים יש לעתים קרובות מעיים חומים כהים והם עשויים להראות אסימטריה אנטרופוסטרית בעוצמת הפיגמנט ובדרך כלל ללא גרעינים נראים לעין. הפות של הרמפרודיטים/נקבות Caenorhabditis בוגרות נמצא במרכז החיה. לוקליזציה זו של הפות לא תמיד מוצגת על ידי טקסה נמטודות אחרות. נמטודות Caenorhabditis הן בעלות שתי נורות לוע, ששתיהן נראות לעין עם הגדלה מספקת ותאורה מועברת ומנוגדות לטקסות נמטודות רבות אחרות. לנמטודות Caenorhabditis יש זנב מחודד, בעוד שלכמה נמטודות אחרות יש זנב עגול.
  2. לאסוף את נמטודות Caenorhabditis תחת מיקרוסקופ מנתח בנוזל קטן ככל האפשר באמצעות פיפטה 20-100 μL. העבירו את הנמטודות שנאספו ישירות ל-1-3 מ"ל של M9-T סטרילי בצלחת פטרי סטרילית בקוטר 3 ס"מ לשטיפת התולעים כדי להסיר מיקרובים שאינם מחוברים (שלב 3.3) או לחילופין, העבירו תולעים בודדות לצלחת עם מדיום גידול נמטודות (NGM) כדי לבסס אוכלוסיית תולעים (שלב 3.4).
  3. שטפו את הנמטודות כדי להסיר חיידקים מהחלק החיצוני של הנמטודה.
    הערה: פרוטוקול זה מעשיר את חיידק המעיים, אך אינו מבטל לחלוטין את היצמדות החיידקים לציפורן התולעת.
    1. דגירה של הנמטודות במשך 10-15 דקות ב-M9-T.
    2. מוזגים את הנמטודות בנוזל קטן ככל האפשר לתוך 1-3 מ"ל של M9-T טרי בצלחת פטרי סטרילית חדשה בגודל 3 ס"מ.
    3. חזור על הדגירה והעבר את הנמטודות ל- M9-T טרי פעמיים נוספות.
      הערה: ניתן לבצע את השלבים הבאים עם תולעים בודדות או עם אוכלוסיות תולעים. התולעים יכולות כעת לשמש לאפיון של C. elegans ומיקרואורגניזמים קשורים, כמו גם לבידוד של חיידקים (שלבים 4 ו -5). לחלופין, ניתן להעביר אותם בנפרד לצלחות NGM כדי לבסס אוכלוסיית תולעים (שלב 3.4).
  4. כדי להשיג אוכלוסיית תולעים, פיפטה נמטודה בודדת לצלחת NGM.
    הערה: רק נמטודות הרמפרודיטיות כגון C. elegans או C . briggsae מסוגלות לייצר צאצאים מתולעים בודדות. עם זאת, תולעים בודדות של מינים אחרים עדיין עשויות לייצר צאצאים אם הם כבר הזדווגו.
    1. נמטודות מבודדות באופן טבעי מכילות בדרך כלל חיידקים במעיים שלהן, שאותם הן משילות על צלחות ה-NGM, שם החיידקים האלה גדלים וזמינים כמזון ל-C. elegans. אין להוסיף אורגניזמים נפרדים של מזון כמו אורגניזם המזון הסטנדרטי במעבדה, זן E. coli OP50.
      הערה: גידול תולעים על צלחות משפיע על הרכב קהילת החיידקים הקשורים, אך ההרכב עדיין דומה לזה של C. elegans הטבעי מבודד 6,7.
    2. אפשרו לנמטודות להתרבות עד 10 ימים בטמפרטורה המתאימה (למשל, 15-20 מעלות צלזיוס במקומות ממוזגים). הקפיאו את הנמטודות האלה (שלב 3.5) או השתמשו בהן לאפיון של C. elegans ומיקרובים קשורים, כמו גם לבידוד של מיקרובים (שלבים 4 ו-5).
  5. הקפאת נמטודות לאחסון לטווח ארוך
    1. השאירו את הנמטודות על צלחות עד שחיידקי המזון נעלמו, ויש בעיקר שלבי זחל קטנים על הצלחות. לשטוף את התולעים מן הצלחות ב 1.5 מ"ל של S-buffer.
    2. ערבבו היטב 500 μL של S-buffer המכיל תולעת עם 500 μL של 30% (v/v) גליצרול ב-S-buffer בצינור סטרילי של 2 מ"ל. הקפיאו את הצינורות מיד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך, אחרת הגליצרול עלול להזיק לנמטודות.

4. הכנת התולעים לזיהוי מולקולרי של C. elegans ומיקרובים

  1. לזיהוי בלתי משוחד של מיקרובים הקשורים לנמטודה, הכינו צלחת בגודל 96 בארות עם שלושה חרוזים סטריליים בקוטר 1 מ"מ, 19.5 מיקרוגרם PCR ו-0.5 מיקרוליטר פרוטאינאז K (20 מ"ג/מ"ל) לכל באר. פיפטה בודדת, נמטודה שטופה לכל באר, העברת כמה שפחות נוזלים.
  2. ניתן להשתמש גם באוכלוסיות תולעים. לשם כך, לשטוף את התולעים מן הצלחות עם M9-buffer ולהעביר ~ 300 μL של תולעת המכילה M9-buffer ל 2 מ"ל צינורות עם 10-15 חרוזים.
  3. מפרקים את הנמטודות באמצעות הומוגנייזר חרוזים (למשל, מכות חרוזים במשך 3 דקות ב-30 הרץ). צנטריפוגה של הצלחת או הצינורות לזמן קצר כדי להביא את הנוזל לתחתית (למשל, במשך 10 שניות ב 8000 x גרם בטמפרטורת החדר [RT]).
  4. זיהוי של C. elegans
    1. לבודד את הדנ"א של נמטודות בודדות על ידי חימום הדגימות במחזור PCR למשך שעה אחת ב-50 מעלות צלזיוס ו-15 דקות ב-95 מעלות צלזיוס. לבודד את הדנ"א של אוכלוסיות תולעים בכל שיטת בידוד שתבחרו (פרוטוקולים לדוגמה של שיטות בידוד שונות באמצעות ערכות מסחריות 7,9). הקפיאו את הדנ"א בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
    2. לזיהוי C. elegans, השתמש בדנ"א ובזוג הפריימרים nlp30-F (טבלה 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') ו-nlp30-R (טבלה 1, 5'-TACTTTCCCCCGTATC-3') ב-PCR, בהתאם להוראות של ספק Taq לפי בחירה.
    3. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים: שלב דנטורציה ראשוני ב-95°C למשך 2 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 95°C למשך 45 שניות, 55 °C למשך 30 שניות, 72°C למשך דקה אחת, ושלב התארכות סופי ב-72°C למשך 5 דקות.
  5. אפיון החיידקים הקשורים לנמטודה באמצעות ריצוף אמפליקון 16S של אזור V3-V4, באמצעות הדנ"א המבודד.
    1. הכן ספריית 16S עם פריימרים 16S לבחירה ופעל לפי פרוטוקול ערכת הכנת הספרייה. אפשרות אחת היא להשתמש בפריימרים 341F (טבלה 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') ו-806R (טבלה 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') המכסים את אזור V3-V4 של הגן 16S rRNA, מה שמביא לרצפים שניתן לסווג עם מסדי נתונים סטנדרטיים ברזולוציה טובה7.
      הערה: כמות הדנ"א של הקלט היא קריטית בשלב זה. דנ"א שנרכש מתולעים בודדות הולך להיות הרבה פחות מזה המתקבל מאוכלוסיות תולעים. עבור תולעים בודדות, ייתכן שיהיה צורך להגדיל את כמות הדנ"א הקלט או להגדיל את כמות מחזורי ה-PCR7.
    2. ניתן לרצף ספריות על פלטפורמת רצף באמצעות ערכת רצף מתאימה.
      הערה: כאן, פלטפורמת MiSeq משמשת עם ערכת ריאגנטים מתאימה של MiSeq. הריאגנטים משתפרים כל הזמן ויש לבחור אותם בסטנדרטים החדשים ביותר.

5. בידוד וטיפוח של חיידקים הקשורים לנמטודות (איור 2)

  1. כדי לבודד חיידקים, להכין צלחת 96 באר עם שלושה חרוזים סטריליים 1 מ"מ, 20 μL של M9-buffer לכל באר, פיפטה בודד, נמטודה שטף לכל באר, העברת נוזל קטן ככל האפשר.
    הערה: לחלופין, ניתן לשטוף אוכלוסיות תולעים מהצלחות עם מאגר M9 ו~ 300 μL של חיץ M9 המכיל תולעת ניתן להעביר לצינורות 2 מ"ל עם 10-15 חרוזים. בכל המקרים, התולעים צריכות להגיע מתרבית שזוהתה כ- C. elegans באמצעות שלבים 4.1-4.4.
  2. מפרקים את הנמטודות באמצעות הומוגנייזר חרוזים (למשל, מכות חרוזים במשך 3 דקות ב-30 הרץ). צנטריפוגה של הצלחת או הצינורות לזמן קצר כדי להביא את הנוזל לתחתית (למשל, עבור 10 שניות ב 8000 x גרם ב RT).
    הערה: השימוש בשיטה זו הוביל לבידוד של טקסה חיידקית דומה לאלה שהתגלו על ידי ריצוף אמפליקון rDNA 16S7, מה שמרמז על כך שהכאת החרוזים המתוארת משאירה את רוב תאי החיידקים ללא פגע.
  3. אוספים את הסופרנטנט, מדללים אותו באופן סדרתי בשעה 1:10, ולוחים עד 100 μL על צלחות אגר בקוטר 9 ס"מ.
    1. כדי להבטיח שניתן יהיה לטפח את רוב החיידקים, השתמשו במגוון מדיות חלופיות עם הרכבים תזונתיים שונים, כולל אגר סויה טריפטיקאז מדולל (TSA, דילול 1:10), אגר מקונקי, אגר גלוקוז סבורו, אגר דקסטרוז תפוחי אדמה, או אגר דקסטרוז פפטון שמרים.
  4. דגירה של הלוחות בתנאי הטמפרטורה הממוצעת של מיקום הדגימה (למשל, טמפרטורות בין 15-20 מעלות צלזיוס עבור מקומות ממוזגים) במשך 24-48 שעות.
  5. השתמשו בטכניקה הסטנדרטית של שלושה פסים ולולאה סטרילית כדי להשיג תרביות חיידקים טהורות (איור 2).
    1. בחרו מושבה בודדת מצלחת באמצעות לולאה סטרילית או קיסם ופזרו אותה על צלחת אגר חדשה המכילה את אותו מדיום אגר המשמש לטיהור. הקפידו להשתמש רק בכ-1/3 מהצלחת.
    2. השתמש בלולאה סטרילית חדשה או עקר לולאה לשימוש חוזר וגרור אותה דרך הפס הראשון כדי ליצור פס שני על 1/3 נוסף מאותו לוח.
    3. חזור על שלב זה על-ידי גרירת לולאה סטרילית דרך הפס השני.
    4. לדגור את הצלחת באותם תנאי גידול המשמשים לבידוד. טכניקה זו חייבת לגרום למושבות בודדות לגדול באזור הפס השלישי.
      הערה: ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלב הטיהור מספר פעמים מכיוון שמבודדים טבעיים נוטים ליצור ביופילמים ו/או אגרגטים.
  6. לגדל את המושבות הטהורות במדיום נוזלי (מאותו סוג כמו מדיום האגר) תוך שימוש באותה טמפרטורה וזמן גדילה כמו לעיל (שלב 5.4)
  7. הכן מלאי חיידקים על ידי הוספת 300 μL של תרבית החיידקים ל-200 μL של 86% (v/v) גליצרול (במדיום הגידול המתאים, למשל, TSB) ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב כראוי. לחלופין, הכינו מלאי DMSO על ידי ערבוב של 50 μL של תרבית חיידקים עם 50 μL של 7% (v/v) DMSO. הקפאה בטמפרטורה של -80°C לאחסון לטווח ארוך.
  8. אפיון חיידקים באמצעות ריצוף של גן ה-RNA הריבוזומלי המלא 16S
    1. חלצו את הדנ"א החיידקי מתרביות נוזליות טהורות בטכניקה מתאימה (למשל, ערכת מיצוי DNA; מניסיון, פרוטוקול מיצוי מבוסס CTAB עובד טוב מאוד22).
    2. הגבר את הגן 16S rRNA באמצעות הפריימרים 27F (טבלה 1, 5'-GAGAGTTTTTCCTGGCTCG-3') ו- 1495R (טבלה 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 ותנאי ה-PCR הבאים: 95 °C, 2 דקות, 22x (95 °C, 30 שניות; 55 °C, 30 שניות; 72 °C, 100 שניות), ותקופת הארכה סופית ב- 72 °C, 5 דקות.
    3. על מנת לרכוש את הרצפים המלאים, השתמש בנוסף בשני פריימרים פנימיים לריצוף, כגון 701F (טבלה 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') ו- 785R (טבלה 1, 5'-GGATTAGATACCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
איור 2: זיהוי מינים ובידודם של חיידקים בודדים. נמטודות בודדות מתפרקות באמצעות הומוגנייזר חרוזים, והדנ"א מבודד לקביעת מינים באמצעות PCR או ריצוף. לחלופין, חומר הנמטודה המתפרק מדולל באופן סדרתי ומצופה על לוחות בינוניים לצמיחה. לוחות דוגרים עד להופעת מושבות חיידקים, ומושבות בודדות מפוספסות ללוחות חדשים כדי להשיג תרביות טהורות. מושבות בודדות של תרביות טהורות משמשות לגידול תרביות חיידקים נוזליות להכנת מלאי חיידקים לאחסון לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס. איור שנוצר עם BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנמטודה C. elegans נמצאת לעתים קרובות בפירות מתפרקים, כגון תפוחים, וגם בדגימות קומפוסט. בצפון גרמניה, C. elegans כמו גם מינים מולדים (במיוחד C. remanei אך גם C. briggsae) נמצאים בעיקר מספטמבר עד2 בנובמבר. הנמטודות נמצאות לרוב בחומר צמחי מתפרק, במיוחד פירות נרקבים כמו תפוחים או אגסים, וגם בקומפוסט, במיוחד חומר שמראה דרגה גבוהה של פירוק. ניתן לקחת את דגימות הפרי והקומפוסט למעבדה (איור 3A,B), להתפזר בצלחות פטרי (איור 3C,D), ולאחר מכן לטבול אותן בתווך נוזלי או צמיג כדי לאלץ את התולעים לעזוב את חומר המצע ולשחות אל פני השטח של המדיום (איור 3E,F). לאחר מכן, ניתן לאסוף את התולעים, להעבירן לצלחות אגר או לצינורות מיקרוצנטריפוגה, ולזהות המין נקבעת באמצעות PCR אבחוני 2,6,7,22.

Figure 3
איור 3: הכנת תפוחים לבידוד נמטודות. (A,B) ניתן לבודד נמטודות מדגימות סביבתיות כמו קומפוסט או פירות רקובים ובנוסף להימשך על ידי הנחת תפוחים על קומפוסט. (ג,ד) הדגימות מחולקות, וחתיכות קטנות מונחות בצלחת פטרי. (ה,ו) מדיום צמיג מתווסף לדגימות, מה שמוביל בדרך כלל לנמטודות שעוזבות את חומר המצע ושוחות אל פני השטח של המדיום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שימוש ב-PCR באמצעות הפריימרים הספציפיים של C. elegans nlp30-F ו-nlp30-R גורם למכפלת PCR באורך של 154 bp עבור C. elegans וללא מוצר עבור נמטודות אחרות (איור 4). כדי לאשר את הביצועים המוצלחים של ה-PCR, יש להפעיל דנ"א של זן מעבדה כגון N2 כבקרה חיובית במקביל לדנ"א של הנמטודות המבודדות. כמויות קטנות של חומר ביולוגי, כגון שלבי זחל קטנים, יכולות לגרום לרצועות PCR חלשות (איור 4A). ניתן לשפר את הנראות של רצועות ה-PCR על ידי שימוש ביותר דנ"א ב-PCR (שימו לב שזה ימזער את כמות הדנ"א שנותרה לריצוף אמפליקון של 16S rDNA חיידקי, למשל, 2 μL של דנ"א במקום 1 μL), על ידי מריחת כמות גדולה יותר של מוצר ה-PCR על הג'ל (למשל, 10-15 μL), או על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR. בהשוואה לתולעים בודדות, אוכלוסיות תולעים הכוללות לפחות 50 תולעים מניבות בדרך כלל כמות גדולה יותר של דנ"א, והרצועות בג'ל האלקטרופורזה נראות בבירור (איור 4B).

Figure 4
איור 4: תוצר PCR של PCR ספציפי ל-C. elegans. (א,ב) הפריימרים הספציפיים ל-C. elegans nlp30-F ו-nlp30-R מייצרים מוצר PCR באורך 154 כ"ס. לדוגמה, PCRs בוצעו על (A) תולעים בודדות ו-(B) אוכלוסיות תולעים (למשל, 300-500 פרטים), כולן בודדו בפרוטוקול המתואר מחומר צמחי נרקב מהקומפוסט של הגן הבוטני בקיל, גרמניה. (A) דנ"א של תולעים בודדות, ובמיוחד של שלבי זחל קטנים, גורם לעתים קרובות לרצועות PCR חלשות. (B) דנ"א שבודד מאוכלוסיות תולעים (למשל, 300-500 פרטים) מביא לפסים ברורים יותר. דנ"א של C. elegans N2 שימש כבקרה חיובית (+), אף תבנית לא שימשה כבקרה שלילית (-). המריחות מתחת לרצועות PCR הן חפצי ג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

המיקרובים, הקשורים ל- C. elegans, יכולים להיות מבודדים מתולעים וגם מדגימות המצע המכילות תולעים. בידוד מיקרובים תואם את הסטנדרטים המיקרוביולוגיים הכלליים, כולל בידוד של תרביות טהורות מצלחות אגר, צמיחתן במדיה נוזלית ואפיונן לאחר מכן (למשל, שימוש ברצפים של גן הרנ"א הריבוזומלי 16S לחיידקים). חיוני שהמיקרובים יבודדו כמושבות בודדות טהורות מצולחות, באמצעות הליכים מיקרוביולוגיים סטנדרטיים (איור 5). זה חשוב מאחר שחלק מהחיידקים הקשורים ל-C. elegans יכולים ליצור ביופילמים ו/או לצבור בקלות, וכתוצאה מכך ליצור תרביות רב-מיניות (איור 5C,D). ניתן לאשר את טוהר תרביות החיידקים המבודדות באמצעות רצפי הגן 16S rRNA, כפי שנעשה עבור מיקרובים 6,7 הקשורים ל-C. elegans שבודדו בעבר. המיקרובים המתקבלים יכולים לשמש לאחר מכן בניסויים עם C. elegans.

Figure 5
איור 5: חיידקים מבודדים על צלחות אגר. מבודדי חיידקים בודדים מפוספסים על צלחות אגר, במקרה זה, צלחות אגר סויה טריפטית (TSA), המציגות כדוגמאות בידוד של (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens, ודוגמה עם מספר מיני חיידקים, המוצגת כסקירה (C) של הצלחת כולה ו-(D) הגדלה של מקטע של צלחת זו, שבה נראים סוגי מושבות שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: רשימת הפריימרים ששימשו במחקר זה אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא אחד מאורגניזמי המודל הנחקרים ביותר במחקר ביולוגי. הוא הוצג על ידי סידני ברנר בשנות ה -60, במקור להבנת ההתפתחות והתפקוד של מערכת העצבים29. מאז, C. elegans הפך למודל רב עוצמה לחקר תהליכים בסיסיים בכל הדיסציפלינות הביולוגיות, כולל ביולוגיה התנהגותית, נוירוביולוגיה, הזדקנות, ביולוגיה אבולוציונית, ביולוגיה של התא, ביולוגיה התפתחותית ואימונולוגיה. הצלחתו מבוססת על שילוב ייחודי של תכונות מועילות, כולל זמן ייצור קצר של כ-3 ימים, קלות הגידול, גוף שקוף (המאפשר פנוטיפ יעיל), הישרדות בהקפאה, עיקור יעיל וסנכרון התפתחותי, וכן שיטות יעילות למניפולציה גנטית על ידי מוטגנזה, קריספר-קאס או RNAi. כיום, C. elegans נחקר בכ-1,500 מעבדות ברחבי העולם. כאשר סידני ברנר הקים לראשונה את C. elegans כמערכת מודל במעבדה, הוא גידל את נמטודת הבקטריבורים על החיידק הגראם שלילי Escherichia coli OP50 כמקור מזון. מאז, C. elegans נשמר בתרבית מונוקסנית על E. coli OP50 במעבדות בכל רחבי העולם29. יתר על כן, אוכלוסיות C. elegans מסונכרנות באופן קבוע או מזוהמות על ידי הליך הלבנה ששרד רק על ידי ביצים סטריליות וללא חיידקים קשורים. לכן קל לייצר בעלי חיים סטריליים שיכולים להיחשף לחיידקים בודדים בתנאים מבוקרים מאוד. עם זאת, כתוצאה מפרוטוקולי תחזוקת המעבדה הסטנדרטיים של C. elegans, כמעט כל המחקרים על הביולוגיה של C. elegans נעשו בהיעדר חיידקים הקשורים אליו באופן טבעי. למעשה, מידע על מגוון המיקרואורגניזמים הקשורים באופן טבעי פורסם רק בשנת 2016 4,5,6, והמגוון המדויק של מיקרובים קשורים עדיין לא נחקר במלואו.

השיטות המתוארות יסייעו לאפיין עוד יותר את מגוון המיקרובים הקשורים ל- C. elegans בטבע. מיקרובים אלה הם ככל הנראה גורמים חשובים בהיסטוריית החיים של הנמטודה, ולכן הם צריכים להיות משאב חיוני לעבודה עתידית עם תולעת זו. השיטות המתוארות הן גרסה מעודכנת של השיטות היחידות שפורסמו בעבר לבידוד מיקרובים מדגימות C. elegans טבעיות שנאספו ישירות מהשדה 6,7. הפרוטוקול מנצל את העובדה ש-C. elegans מאכלס חומר צמחי מתפרק בטבע. חומר נרקב כזה עשיר במיקרובים, המשמשים מזון ל- C. elegans וסביר שימלאו תפקידים אחרים, כגון הגנה על מערכת החיסון (כלומר, הגנה מפני פתוגנים)5,6,11,13,14. שלב המפתח הראשון הוא אפוא להשיג מצעים מתאימים לבידוד תולעים. ההתאמה עשויה להיות תלויה בזמן השנה; בצפון גרמניה, C. elegans נמצא בעיקר מספטמבר עד2 בנובמבר. זה הזמן שבו פירות כמו תפוחים או אגסים הופכים לזמינים ומתחילים להירקב על הקרקע. הזמן המדויק עשוי להשתנות בין אזורים גיאוגרפיים23,24,25,30. כל חומר צמחי נראה מתאים ל- C. elegans, כל עוד הוא מראה רמה גבוהה של פירוק ולכן נושא קהילה מיקרוביאלית עשירה - למעט חומר הנשלט על ידי פטריות, שלעתים קרובות הן פתוגניות ל- C. elegans1. יתר על כן, C. elegans הוא בדרך כלל נפוץ במיוחד כאשר לחות כללית אינה נמוכה מדי2. נכון להיום, חסר מידע שיטתי על האם נמטודות Caenorhabditis שונות בשפע בחומר צמחי מחקלאות תעשייתית לעומת אורגנית או פני השטח לעומת שכבה עמוקה יותר של דטריטוס או תלות בגשם או לא.

לאחר שהדגימות נאספו והועברו למעבדה, יש "לפתות" את התולעים לצאת מהמצעים שלהן. זה הושג עם כמה גישות שונות, למשל, על ידי מיצוי תולעים דרך משפכי Baermann31 או מיקום של דגימות על צלחת אגר המכיל את מזון המעבדה E. coli כמו מושך באמצע27. מניסיוננו, הפרוטוקול המתואר כאן הוא בדרך כלל מהיר ויעיל יותר. הוא מבוסס על הרעיון שדגימות המצע שקועות בתמיסה נוזלית או צמיגה, אשר מאלצת ביעילות את התולעים לצאת מהמצע ועד לפני השטח של הנוזל, משם ניתן לאסוף אותן בקלות. צמיגות המדיום אינה נחוצה לחלוטין, אך היא מאטה את תנועת התולעים ובכך עשויה להקל על איסוף התולעים. איסוף יעיל של תולעים הוא הקל כאשר הנוזל מתווסף בזהירות למצע, ובכך למנוע solubilization של כל החומרים humous, אשר יכול להחשיך את הנוזל ועלול להקשות על לראות את הנמטודות.

האתגר הבא הוא לזהות את C. elegans. כמה תכונות מורפולוגיות יכולות לעזור להבחין בין תולעי Caneorhabditis לבין נמטודות אחרות27, אך אינן מספיקות לזיהוי מינים מדויק. חומר צמחי נרקב מכיל לעתים קרובות נמטודות דומות למראה, כולל מינים מולדים, כגון C. briggsae או C. remanei 2,6,23,25, שלא ניתן להבחין ביניהם ממבט ראשון. לכן, C. elegans יכול להיות מזוהה בצורה הטובה ביותר ואמינה ביותר בעזרת PCR אבחון באמצעות פריימרים ספציפיים למין 2,6,7, כמתואר בפרוטוקול. בהקשר זה, זה יכול להיות שימושי כדי להקים אוכלוסייה מתרבה של C. elegans טבעי מבודד במעבדה, למשל, על לוחות NGM סטנדרטיים. ה-C. elegans הטבעיים בדרך כלל מביאים עמם חיידקים קשורים, אשר נשפכים על לוחות ה-NGM, שם החיידקים גדלים בדרך כלל, ולאחר מכן משמשים כמזון לתולעים 6,7. למרות שההרכב המדויק של המיקרובים הקשורים משתנה במהלך התפשטות C. elegans על צלחות, הוא עדיין דומה לזה של דגימות נמטודות טבעיות המאופיינות מיד 6,7, ולכן הוא פשרה שימושית המאפשרת בידוד של C. elegans ואת המיקרובים הקשורים.

לאחר זיהוי מוצלח של C. elegans , ניתן להשתמש בנמטודות או בדגימות המצע הקשורות לבידוד ואפיון של המיקרובים הקשורים. כדי להבטיח שהמיקרובים באמת קשורים ל-C. elegans בטבע, יש חשיבות עליונה להימנע מזיהום בכל שלבי הפרוטוקולים. איסוף דוגמאות קומפוסט ופירות בשטח צריך להיעשות בזהירות מיוחדת על ידי החוקר, תוך שימוש בחומר מעוקר. כל עיבוד של חומר במעבדה חייב להבטיח רמה גבוהה של היגיינה ושוב מעוקרים פלסטיק כלים ובופרים. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, כל עבודת המעבדה צריכה להתבצע באופן אידיאלי בחדר מעבדה נפרד, אשר מוקדש אך ורק לבידוד של חיידקים. כחלופה, כל עבודה עם צלחות פתוחות, צינורות או מיכלים אחרים צריכה להיעשות בארון זרימה למינרית. כדי להעריך את הסיכון לזיהום, יש לעבד במקביל דגימות בקרה מתאימות (למשל, ללא דגימות או ללא תולעים). יתר על כן, ניתן להשתמש במגוון מדיות שונות כדי להבטיח שניתן יהיה לטפח ולבודד את כל סוגי החיידקים השונים עם דרישות הגדילה השונות שלהם. עם זאת, עבודות קודמות הצביעו על כך שכל החיידקים שבודדו עד כה, הקשורים למבודדים טבעיים של C. elegans , גדלים בקלות על צלחות NGM ו- TSA. לכן, זה עשוי להיות מספיק כדי להתמקד בתקשורת זו.

המיקרובים המבודדים והמאופיינים יתרמו להבנה משופרת של ההיסטוריה הטבעית של C. elegans. חשוב מכך, נכון להיום, לא מובן היטב כיצד C. elegans מגיב למיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי, אילו תהליכים מולקולריים מעורבים, ואילו פונקציות מתווכות את האינטראקציה של התולעת עם הקשרים המיקרוביאליים שלה. אחד החריגים העיקריים הוא העבודה המקיפה של קבוצת Walhout על האינטראקציה בין C. elegans ו Comamonas DA 1877. הוא חשף ויטמין B12 כמטבוליט מרכזי שמספק החיידק, המשפיע על ביטוי גנים של תולעים, פוריות, תוחלת חיים והתפתחות15,16,17. קבוצת Walhout הראתה עוד כי השפעת ויטמין B12 על פוריות והתפתחות תלויה במחזור מתיונין/S-אדנוזיל-מתיונין ומושפעת ממספר גורמי שעתוק, כגון קולטן ההורמון הגרעיני NHR-2315,16,17. יתר על כן, ויטמין B12 חיידקי תורם לפירוק חומצת השומן קצרת השרשרת שעלולה להיות רעילה, חומצה פרופיונאטית, אשר בהיעדר ויטמין B12 ניתן לפצות באמצעות חיווט מחדש של רשת מטבולית, ככל הנראה באמצעות ייצור של 3-hydroxypropionate16,32. דוגמה אחרת היא ההשפעה הנוירו-מודולטורית של פרובידנסיה, שהתגלתה על ידי מעבדת סנגופטה, שבה טיראמין חיידקי מומר על ידי הטיראמין C. elegans β-הידרוקסילאז לתמנון, אשר לאחר מכן משפיע על התנהגות התולעת באמצעות האינטראקציה שלו עם קולטן OCTR-1 אוקטופמין בנוירונים חושיים ספציפיים18. דוגמה נוספת היא הגנה חיסונית, המסופקת על ידי חיידקים שונים, במיוחד אלה של הסוג Pseudomonas. זה קורה או באמצעות ייצור של תרכובות מיקרוביאליות או באמצעות השפעה עקיפה, אולי באמצעות הפעלה של תגובות מארח ספציפיות 6,11,14. מיקרובים נוספים ובמיוחד השימוש בקהילות מיקרוביות הקשורות באופן טבעי יעזרו להשיג הבנה מציאותית יותר של הביולוגיה של נמטודת מודל זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אנו מצהירים כי אין לנו ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מכירים בתמיכה כספית מקרן המדע הגרמנית (פרויקטים A1.1 ו- A1.2 של מרכז המחקר השיתופי 1182 על מקורם ותפקודם של מטאאורגניזמים). אנו מודים לחברי מעבדת שולנבורג על עצתם ותמיכתם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

ביולוגיה גיליון 186 Caenorhabditis elegans אינטראקציות פונדקאי-מיקרוביוטה תפוח קומפוסט אוכרובקטרום פסאודומונס לורידה
בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter