Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выделение и характеристика естественной микробиоты модельной нематоды Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans является одним из основных модельных видов в биологии, но почти все исследования проводятся в отсутствие его естественно связанных микробов. Методы, описанные здесь, помогут улучшить наше понимание разнообразия ассоциированных микробов в качестве основы для будущих функциональных исследований C. elegans .

Abstract

Нематода Caenorhabditis elegans взаимодействует с большим разнообразием микроорганизмов в природе. В целом, C. elegans обычно встречается в гнилом растительном материале, особенно в гнилых плодах, таких как яблоки или на компостных кучах. Он также связан с определенными беспозвоночными хозяевами, такими как слизни и мокрицы. Эти места обитания богаты микробами, которые служат пищей для C. elegans и которые также могут постоянно колонизировать кишечник нематоды. На сегодняшний день точное разнообразие и консистенция местной микробиоты C. elegans в разных местах обитания и географических местоположениях до конца не изучены. Здесь мы опишем подходящий подход для выделения C. elegans от природы и характеристики микробиоты червей. Нематод можно легко изолировать из компостного материала, гниющих яблок, слизней или привлечь, поместив яблоки на компостные кучи. Лучшее время для поиска C. elegans в Северном полушарии — с сентября по ноябрь. Черви могут быть вымыты из собранного материала субстрата путем погружения субстрата в буферный раствор с последующим сбором нематод и их переносом на среду роста нематод или буфер ПЦР для последующего анализа. Далее мы иллюстрируем, как образцы могут быть использованы для выделения и очистки микроорганизмов, связанных с червями, и для обработки червей для анализа рибосомной РНК 16S состава сообщества микробиоты. В целом, описанные методы могут стимулировать новые исследования по характеристике микробиоты C. elegans в местах обитания и географических местоположениях, тем самым помогая получить всестороннее понимание разнообразия и стабильности микробиоты нематоды в качестве основы для будущих функциональных исследований.

Introduction

В природе C. elegans обычно встречается в гнилом растительном веществе, особенно в гнилых фруктах, таких как яблоки или на компостных кучах1. Он также связан с определенными беспозвоночными хозяевами, такими как слизни и мокрицы 2,3. Эти места обитания богаты микробами, которые не только служат пищей для червя, но и могут образовывать с ним устойчивые ассоциации. Информация о разнообразии естественно ассоциированных микроорганизмов была опубликована только в 2016 году 4,5,6. С тех пор эти и только несколько более поздних исследований показали, что C. elegans связан с различными бактериями и грибами, чаще всего включая бактерии рода Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter и некоторые другие 6,7,8. Несколько ассоциированных бактерий могут стабильно колонизировать кишечник червя, хотя не все 6,9,10,11,12. Они, вероятно, будут иметь ключевое значение для нашего понимания биологии C. elegans, потому что они могут обеспечить питание, защитить от патогенов и, возможно, других стрессоров и влиять на основные черты истории жизни, такие как репродуктивная скорость, развитие или поведенческие реакции.

Например, естественно ассоциированные изоляты родов Pseudomonas, Ochrobactrum, а также Enterobacter или Gluconobacter могут защищать червя от заражения патогенами и убивать различными способами 5,6,11,13,14. Специфический изолят рода Comamonas влияет на диетическую реакцию нематод, развитие, продолжительность жизни и фертильность 15,16,17. Бактерии Providencia продуцируют нейромодулятор тирамин и тем самым модулируют активность нервной системы хозяина и результирующие поведенческие реакции18. Было продемонстрировано, что набор различных естественно ассоциированных бактерий влияет на темпы роста населения, фертильность и поведенческие реакции 5,6,9,11,19.

На сегодняшний день точное разнообразие и консистенция местной микробиоты C. elegans в местах обитания и географических местоположениях не полностью поняты, и дальнейшие ассоциации между червем и микробами из его окружающей среды еще предстоит раскрыть. В нескольких предыдущих исследованиях использовались бактериальные штаммы, выделенные из некоторой почвенной среды, естественных мест обитания C. elegans или из экспериментов с мезокосмом (то есть лабораторных сред, которые воссоздают естественную среду обитания) с лабораторными штаммами C. elegans 4,5,20. Несмотря на то, что эти исследования дали новое представление о влиянии микробов на конкретные черты нематод (например, метаболизм нематод21), актуальность этих взаимодействий для биологии C. elegans в природе неясна. Поэтому в данной рукописи описываются методы непосредственного выделения C. elegans от природы и выделения и последующей характеристики естественно связанных микробов как от отдельных червей, так и от групп червей. Описанные способы представляют собой обновленный и улучшенный вариант процедур, применявшихся ранее для выделения и характеристики природного C. elegans и его нативной микробиоты 2,6,7. Учитывая, что C. elegans широко встречается в разлагающемся растительном веществе по всему земному шару (особенно в гниющих фруктах, умеренных регионах и осенью)1,2,22,23,24,25, этот протокол может применяться любой лабораторией всякий раз, когда есть интерес к связи C. elegans черты к естественно связанным микробам и, следовательно, более естественно релевантный контекст. Последнее имеет решающее значение для полного понимания биологии нематоды, потому что из множества других систем-хозяев известно, что связанная микробиота может влиять на различные характеристики истории жизни26, аспект, который в настоящее время в значительной степени игнорируется во множестве исследований C. elegans почти во всех дисциплинах наук о жизни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка буферов и сред

  1. Получают S-буфер, добавляя 5,85 г NaCl, 1,123 гK2HPO4, 5,926 г KH2PO4 и 1 л деионизированногоH2O в колбу и автоклав в течение 20 мин при 121 °C.
  2. Готовят вязкую среду, добавляя S-буфер, содержащий 1,2% (мас./об.) гидроксиметилцеллюлозы (вещество, вызывающее вязкость среды), 5 мг/мл холестерина, 1 мМ МгСО4, 1 мМCaCl2 и 0,1% (v/v) ацетона. Автоклав и перемешайте вязкую среду до тех пор, пока она не станет полностью однородной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять несколько часов. Кроме того, S-буфер может быть непосредственно приготовлен и добавлен в вязкую среду без предварительной стерилизации.
  3. Готовят M9-буфер, добавляя 3 г KH2PO4, 6 г NA2HPO4·2H2O, 5 г NaCl и 1 л деионизированногоH2O в колбу объемом 1 л. Автоклавируют раствор, а после охлаждения добавляют 1 мл 1 М МгСО4 (123,24 г МгСО4·7Н2Ов 500 мл деионизированногоН2О, фильтр стерилизуют).
  4. Готовят 10% (v/v) раствор Triton X-100, смешивая 5 мл Triton X-100 с 45 мл M9-буфера. Фильтруют-стерилизуют раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
  5. Получают M9-буфер с Triton X-100 (M9-T) путем добавления 2,5 мл 10% (v/v) запасного раствора Triton X-100 в 1 л M9-буфера после автоклавирования для получения 0,025% (v/v) M9-T.
  6. Готовят 30% (v/v) глицерина в S-буфере, смешивая 15 мл стерильного 100% глицерина и 35 мл стерильного S-буфера в пробирке объемом 50 мл.

2. Подготовка проб окружающей среды (рисунок 1)

  1. Соберите образцы окружающей среды, такие как компост или гнилые фрукты, и поместите каждый образец в отдельный пластиковый пакет, трубку или другой чистый контейнер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы привлечь нематод, яблоки можно поместить на компост за несколько недель до отбора проб.
  2. Равномерно распределите кусочки образца окружающей среды в пустую, стерильную, 9 см чашку Петри.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы с более высокими уровнями распада с большей вероятностью содержат C. elegans. Опционально, чашка Петри, наполненная безпептидной агаровой средой (PFM), может быть использована для повышения контрастности.
  3. Тщательно накройте образец приблизительно 20 мл стерильной вязкой среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нематоды всплывают на поверхность в течение 1-2 ч. Вязкая среда замедляет движение червей и облегчает их отбор проб. В качестве альтернативы можно использовать стерильный M9-буфер, однако движение червя будет происходить быстрее.

Figure 1
Рисунок 1: Выделение нематод из субстратов. Образцы субстрата помещают в пустые чашки Петри и покрывают вязкой средой для вымывания нематод. Нематод переносят в М9-Т и многократно промывают для удаления бактерий извне. Отдельные нематоды могут быть использованы для выделения ДНК, выделения ассоциированных бактерий или помещены на агаровые пластины для культивирования популяций червей. Рисунок, созданный с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Выделение нематод Caenorhabditis (рисунок 1)

  1. Поиск нематод Caenorhabditis с помощью рассекающего микроскопа в соответствии с рекомендациями, представленными в главе WormBook об изоляции C. elegans и родственных нематод Barrière и Félix27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Caenorhabditis hermaphrodites/ самки имеют кишечник светло-коричневого цвета (при передаваемом освещении). Более того, клетки кишечника имеют большие клеточные ядра, которые видны в виде белых точек. Напротив, другие виды нематод часто имеют темно-коричневый кишечник и могут проявлять переднезаднюю асимметрию в интенсивности пигмента и, как правило, отсутствие видимых ядер. Вульва взрослых гермафродитов Caenorhabditis / самок находится в середине животного. Эта локализация вульвы не всегда проявляется у других таксонов нематод. Нематоды Caenorhabditis обладают двумя глоточными луковицами, которые видны с достаточным увеличением и передаваемым освещением и контрастом со многими другими таксонами нематод. Caenorhabditis nematodes имеют заостренный хвост, тогда как некоторые другие нематоды имеют круглый хвост.
  2. Соберите нематод Caenorhabditis под рассекающим микроскопом в как можно меньше жидкости, используя пипетку 20-100 мкл. Перенесите собранные нематоды непосредственно в 1-3 мл стерильного M9-T в стерильную 3 см чашку Петри для мытья червей для удаления неприсоединенных микробов (стадия 3.3) или, альтернативно, переложите отдельных червей на пластину со средой роста нематод (NGM) для создания популяции червей (этап 3.4).
  3. Вымойте нематод, чтобы удалить микробы с внешней стороны нематоды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол обогащает кишечные бактерии, но не полностью устраняет бактерии, прилипшие к кутикуле червя.
    1. Инкубировать нематод в течение 10-15 мин в М9-Т.
    2. Пипетку нематод в как можно меньшем количестве жидкости в 1-3 мл свежего М9-Т в новой стерильной чашке Петри 3 см.
    3. Повторите инкубацию и переведите нематод на свежий М9-Т еще два раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут быть выполнены как с отдельными червями, так и с популяциями червей. Черви теперь могут быть использованы для характеристики C. elegans и связанных с ними микробов, а также для выделения бактерий (шаги 4 и 5). Альтернативно, они могут быть перенесены индивидуально на пластины NGM для создания популяции червей (шаг 3.4).
  4. Чтобы получить популяцию червей, пипетку отдельной нематоды на пластину NGM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только гермафродитные нематоды, такие как C. elegans или C. briggsae , способны производить потомство от одиночных червей. Тем не менее, одиночные черви других видов все еще могут производить потомство, если они уже были спарены.
    1. Естественно изолированные нематоды обычно содержат бактерии в кишечнике, которые они проливают на пластины NGM, где эти бактерии растут и доступны в качестве пищи для C. elegans. Не добавляйте отдельные пищевые организмы, такие как стандартный лабораторный пищевой организм, штамм E. coli OP50.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивание червей на пластинах влияет на состав ассоциированного бактериального сообщества, но состав по-прежнему сопоставим с составом природного C. elegans изолирует 6,7.
    2. Дайте нематодам размножаться до 10 дней при соответствующей температуре (например, 15-20 ° C для умеренных мест). Заморозьте этих нематод (шаг 3.5) или используйте их для характеристики C. elegans и связанных с ними микробов, а также для выделения микробов (шаги 4 и 5).
  5. Замораживание нематод для длительного хранения
    1. Оставляйте нематод на тарелках до тех пор, пока пищевые бактерии не исчезнут, и на пластинах в основном есть небольшие личиночные стадии. Смойте червей с пластин в 1,5 мл S-буфера.
    2. Тщательно смешайте 500 мкл червесодержащего S-буфера с 500 мкл 30% (v/v) глицерина в S-буфере в стерильной пробирке объемом 2 мл. Быстро заморозьте трубки при -80 °C для длительного хранения, иначе глицерин может нанести вред нематодам.

4. Подготовка червей к молекулярной идентификации C. elegans и микробов

  1. Для объективной идентификации нематод-ассоциированных микробов подготовьте 96-луночную пластину с тремя стерильными шариками по 1 мм, 19,5 мкл ПЦР-буфера и 0,5 мкл протеиназы К (20 мг/мл) на лунку. Пипетка индивидуальная, промытая нематода к каждой лунке, передавая как можно меньше жидкости.
  2. Популяции червей также могут быть использованы. Для этого промыть червей с пластин с М9-буфером и перенести ~300 мкл червесодержащего М9-буфера в 2 мл пробирки по 10-15 шариков.
  3. Разбейте нематод с помощью гомогенизатора бусин (например, бисерное взбивание в течение 3 мин при 30 Гц). Ненадолго центрифугируйте пластину или трубки, чтобы доставить жидкость на дно (например, в течение 10 с при 8000 х г при комнатной температуре [RT]).
  4. Идентификация C. elegans
    1. Выделяют ДНК отдельных нематод путем нагревания образцов в цикле ПЦР в течение 1 ч при 50 °C и 15 мин при 95 °C. Изолируйте ДНК популяций червей с помощью любого выбранного метода изоляции (примеры протоколов различных методов изоляции с использованием коммерческих наборов 7,9). Заморозьте ДНК при -20 °C для длительного хранения.
    2. Для идентификации C. elegans используйте ДНК и праймерную пару nlp30-F (таблица 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') и nlp30-R (таблица 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') в ПЦР, следуя инструкциям поставщика Taq по выбору.
    3. Используйте следующие условия ПЦР: начальная стадия денатурации при 95 °C в течение 2 мин, затем 35 циклов 95 °C в течение 45 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 1 мин и конечная стадия удлинения при 72 °C в течение 5 мин. C. elegans производит ПЦР-продукт 154 bp.
  5. Охарактеризовать нематод-ассоциированные бактерии с помощью секвенирования 16S ампликонов области V3-V4, используя изолированную ДНК.
    1. Подготовьте библиотеку 16S с выбранными букварями 16S и следуйте протоколу комплекта подготовки библиотеки. Одним из вариантов является использование праймеров 341F (Таблица 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') и 806R (Таблица 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'), охватывающих область V3-V4 гена 16S рРНК, что приводит к последовательностям, которые могут быть классифицированы со стандартными базами данных с хорошим разрешением7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество входной ДНК имеет решающее значение на этом этапе. ДНК, полученной от одиночных червей, будет намного меньше, чем у популяций червей. Для одиночных червей может потребоваться увеличить количество входной ДНК или увеличить количество циклов ПЦР7.
    2. Библиотеки могут быть секвенированы на платформе виртуализации с использованием подходящего комплекта секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется платформа MiSeq с подходящим набором реагентов MiSeq. Реагенты постоянно совершенствуются и должны быть подобраны по новейшим стандартам.

5. Выделение и культивирование нематод-ассоциированных бактерий (Рисунок 2)

  1. Чтобы изолировать бактерии, подготовьте 96-луночную пластину с тремя стерильными шариками 1 мм, 20 мкл M9-буфера на лунку и пипетку индивидуальной, промытой нематодой к каждой лунке, передавая как можно меньше жидкости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, популяции червей могут быть смыты с пластин с M9-буфером и ~300 мкл червесодержащего M9-буфера могут быть перенесены в трубки 2 мл с 10-15 шариками. Во всех случаях черви должны происходить из культуры, которая была идентифицирована как C. elegans на шагах 4.1-4.4.
  2. Разбейте нематод с помощью гомогенизатора бусин (например, бисерное взбивание в течение 3 мин при 30 Гц). Ненадолго центрифугируйте пластину или трубки, чтобы доставить жидкость на дно (например, в течение 10 с при 8000 х г при RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование этого метода привело к выделению бактериальных таксонов, аналогичных тем, которые были выявлены при секвенировании ампликона 16S рДНК7, предполагая, что описанное биение шариков оставляет большинство бактериальных клеток нетронутыми.
  3. Соберите супернатант, последовательно разбавьте его в 1:10 и нанесите до 100 мкл на агаровую пластину размером 9 см.
    1. Чтобы обеспечить возможность культивирования большинства бактерий, используйте различные альтернативные среды с различными питательными составами, включая разбавленный триптиказный соевый агар (TSA, разведение 1: 10), агар Макконки, агар глюкозы Sabouraud, агар декстрозы картофеля или дрожжевой пептон декстрозы агар.
  4. Инкубируйте плиты в средних температурных условиях места отбора проб (например, при температуре между 15-20 °C для умеренных мест) в течение 24-48 ч.
  5. Используйте стандартную трехполосную технику и стерильную петлю для получения чистых бактериальных культур (рисунок 2).
    1. Выберите одну колонию из тарелки, используя стерильную петлю или зубочистку, и выложите ее на новую агаровую пластину, содержащую ту же агаровую среду, которая используется для очистки. Убедитесь, что используете только примерно 1/3 пластины.
    2. Либо используйте новую стерильную петлю, либо стерилизуйте многоразовую петлю и проведите ее через первую полосу, чтобы создать вторую полосу на другой 1/3 той же пластины.
    3. Повторите этот шаг, протащив стерильную петлю через вторую полосу.
    4. Инкубируйте пластину в тех же условиях роста, которые используются для изоляции. Этот метод должен привести к тому, что одиночные колонии растут в области третьей полосы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется повторить стадию очистки несколько раз, поскольку природные изоляты имеют тенденцию образовывать биопленки и/или агрегаты.
  6. Выращивайте чистые колонии в жидкой среде (того же типа, что и агаровая среда), используя ту же температуру и время роста, что и выше (шаг 5.4)
  7. Подготовьте запасы бактерий, добавив 300 мкл бактериальной культуры к 200 мкл 86% (v/v) глицерина (в соответствующей питательной среде, например, TSB) и пипетку вверх и вниз для правильного смешивания. Альтернативно, получают запасы ДМСО путем смешивания 50 мкл бактериальной культуры с 50 мкл 7% (v/v) DMSO. Заморозить при -80 °C для длительного хранения.
  8. Характеристика бактерий с использованием секвенирования полного гена рибосомальной РНК 16S
    1. Экстрагируйте бактериальную ДНК из чистых жидких культур с использованием подходящей техники (например, набора для экстракции ДНК; по опыту, протокол экстракции на основе CTAB работает очень хорошо22).
    2. Амплифицируют ген 16S рРНК с помощью праймеров 27F (Таблица 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1495R (Таблица 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 и следующих условий ПЦР: 95 °C, 2 мин, 22x (95 °C, 30 с; 55 °C, 30 с; 72 °C, 100 с) и окончательного периода расширения при 72 °C, 5 мин.
    3. Чтобы получить полные последовательности, дополнительно используйте два внутренних праймера секвенирования, такие как 701F (Таблица 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') и 785R (Таблица 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
Рисунок 2: Видовая идентификация и выделение отдельных бактерий. Отдельные нематоды разбиваются с помощью гомогенизатора бусин, а ДНК выделяется для определения видов с помощью ПЦР или секвенирования. В качестве альтернативы, разрушенный нематодный материал последовательно разбавляют и наносят на пластины среды роста. Пластины инкубируют до тех пор, пока не появятся бактериальные колонии, а отдельные колонии переносятся на новые пластины для получения чистых культур. Одиночные колонии чистых культур используют для выращивания жидких бактериальных культур для подготовки бактериальных запасов к длительному хранению при -80 °C. Рисунок, созданный с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Нематода C. elegans часто встречается в разлагающихся фруктах, таких как яблоки, а также в образцах компоста. В Северной Германии C. elegans, а также родственные виды (особенно C. remanei, а также C. briggsae) в основном встречаются с сентября по2 ноября. Нематоды чаще всего встречаются в разлагающемся растительном веществе, особенно в гниющих фруктах, таких как яблоки или груши, а также в компосте, особенно в материале, который показывает высокую степень разложения. Образцы фруктов и компоста могут быть взяты в лабораторию (рисунок 3A, B), распределены в чашках Петри (рисунок 3C, D), а затем погружены в жидкую или вязкую среду, чтобы заставить червей покинуть материал субстрата и доплыть до поверхности среды (рисунок 3E, F). После этого черви могут быть собраны, перенесены на агаровые пластины или микроцентрифужные трубки, а видовая идентичность определена с помощью диагностических ПЦР 2,6,7,22.

Figure 3
Рисунок 3: Подготовка яблок к выделению нематод. (A,B) Нематоды могут быть выделены из образцов окружающей среды, таких как компост или гнилые плоды, и дополнительно привлечены путем размещения яблок на компосте. (С,Г) Образцы делятся, и небольшие кусочки помещаются в чашку Петри. (Э,Ф) В образцы добавляется вязкая среда, что обычно приводит к тому, что нематоды покидают материал подложки и плавают на поверхности среды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ПЦР с использованием специфических праймеров C. elegans nlp30-F и nlp30-R приводит к получению ПЦР-продукта длиной 154 bp для C. elegans и без продукта для других нематод (рисунок 4). Чтобы подтвердить успешное выполнение ПЦР, ДНК лабораторного штамма, такого как N2, должна быть запущена в качестве положительного контроля одновременно с ДНК изолированных нематод. Небольшие количества биологического материала, такие как небольшие личиночные стадии, могут привести к слабым полосам ПЦР (рисунок 4А). Видимость полос ПЦР может быть улучшена путем использования большего количества ДНК в ПЦР (обратите внимание, что это минимизирует количество ДНК, оставшейся для секвенирования бактериального ампликона 16S рДНК, например, 2 мкл ДНК вместо 1 мкл), путем нанесения большего количества продукта ПЦР на гель (например, 10-15 мкл), или путем увеличения числа циклов ПЦР. По сравнению с одиночными червями, популяции червей, состоящие по меньшей мере из 50 червей, обычно дают большее количество ДНК, и полосы в геле электрофореза хорошо видны (рисунок 4B).

Figure 4
Рисунок 4: ПЦР-продукт C. elegans-специфической ПЦР. (А,Б) Специфические для C. elegans праймеры nlp30-F и nlp30-R производят ПЦР-продукт длиной 154 bp. Например, ПЦР были выполнены на (А) одиночных червях и (В) популяциях червей (например, 300-500 особей), все они были выделены с описанным протоколом из гниющего растительного вещества из компоста Ботанического сада в Киле, Германия. (А) ДНК одиночных червей и, в частности, небольших личиночных стадий часто приводит к слабым полосам ПЦР. (B) ДНК, выделенная из популяций червей (например, 300-500 особей), приводит к более четким полосам. ДНК C. elegans N2 использовалась в качестве положительного контроля (+), ни один шаблон не использовался в качестве отрицательного контроля (-). Мазки под полосами ПЦР представляют собой гелевые артефакты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Микробы, которые связаны с C. elegans, могут быть выделены из червей, а также из образцов субстрата, содержащих червей. Выделение микробов следует общим стандартам микробиологии, включая выделение чистых культур из агаровых пластин, их рост в жидких средах и их последующую характеристику (например, с использованием последовательностей гена рибосомальной РНК 16S для бактерий). Крайне важно, чтобы микробы были выделены как чистые одиночные колонии из пластин, используя стандартные микробиологические процедуры (рисунок 5). Это важно, потому что некоторые из бактерий, связанных с C. elegans, могут образовывать биопленки и / или легко агрегироваться, что приводит к многовидовым культурам (рисунок 5C, D). Чистота выделенных бактериальных культур может быть подтверждена с помощью последовательностей гена 16S рРНК, как это сделано для ранее выделенных C. elegans-ассоциированных микробов 6,7. Полученные микробы впоследствии могут быть использованы в экспериментах с C. elegans.

Figure 5
Рисунок 5: Бактериальные изоляты на агаровых пластинах. Отдельные бактериальные изоляты наносятся на агаровые пластины, в данном случае на пластины триптического соевого агара (TSA), показывая в качестве примеров изолят (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens и пример с несколькими видами бактерий, показанный в виде (C) обзора всей пластины и (D) увеличения участка этой пластины, в котором видны различные типы колоний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Список грунтовок, используемых в этом исследовании Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нематода Caenorhabditis elegans является одним из наиболее интенсивно изучаемых модельных организмов в биологических исследованиях. Он был введен Сиднеем Бреннером в 1960-х годах, первоначально для понимания развития и функции нервной системы29. С тех пор C. elegans стал мощной моделью для изучения фундаментальных процессов во всех биологических дисциплинах, включая поведенческую биологию, нейробиологию, старение, эволюционную биологию, клеточную биологию, биологию развития и иммунологию. Его успех основан на уникальном сочетании преимущественных свойств, включая короткое время генерации около 3 дней, простоту культивирования, прозрачное тело (позволяющее эффективное фенотипирование), выживание при замораживании, эффективную стерилизацию и синхронизацию развития, а также эффективные методы генетических манипуляций с помощью мутагенеза, CRISPR-Cas или RNAi. Сегодня C. elegans изучается примерно в 1 500 лабораториях по всему миру. Когда Сидни Бреннер впервые установил C. elegans в качестве модельной системы в лаборатории, он вырастил бактериворную нематоду на грамотрицательной бактерии Escherichia coli OP50 в качестве источника пищи. С тех пор C. elegans поддерживается в моноксеновой культуре на E. coli OP50 в лабораториях по всему миру29. Кроме того, популяции C. elegans обычно синхронизируются или очищаются от обесцвечивания с помощью процедуры отбеливания, которая выживает только благодаря стерильным яйцам и не связанным с ними микробам. Таким образом, легко создать стерильных животных, которые затем могут подвергаться воздействию отдельных бактерий в строго контролируемых условиях. Однако в результате этих стандартизированных протоколов лабораторного обслуживания C. elegans почти все исследования по биологии C. elegans были проведены в отсутствие его естественно ассоциированных бактерий. На самом деле, информация о разнообразии естественно ассоциированных микроорганизмов была опубликована только в 2016 году 4,5,6, а точное разнообразие ассоциированных микробов до сих пор полностью не изучено.

Описанные методы помогут дополнительно охарактеризовать разнообразие микробов, которые связаны с C. elegans в природе. Эти микробы, вероятно, являются важными детерминантами истории жизни нематоды и, таким образом, должны быть важным ресурсом для будущей работы с этим червем. Описанные способы являются обновленной версией единственных ранее опубликованных способов выделения микробов из природных образцов C. elegans, собранных непосредственно с поля 6,7. Протокол использует тот факт, что C. elegans обитает в разлагающемся растительном веществе в природе. Такой гниющий материал богат микробами, которые служат пищей для C. elegans и, вероятно, выполняют другие функции, такие как иммунная защита (т.е. защита от патогенов)5,6,11,13,14. Таким образом, первым ключевым шагом является получение подходящих субстратов для изоляции червей. Пригодность может зависеть от времени года; в Северной Германии C. elegans в основном встречается с сентября по2 ноября. Это время, когда фрукты, такие как яблоки или груши, становятся доступными и начинают гнить на земле. Точное время, вероятно, будет варьироваться между географическими регионами 23,24,25,30. Любой растительный материал представляется подходящим для C. elegans, если он показывает высокую степень разложения и, таким образом, несет богатое микробное сообщество, за исключением материала, в котором преобладают грибы, которые часто являются патогенными для C. elegans1. Кроме того, C. elegans обычно особенно распространен, когда общая влажность не слишком низкая2. На сегодняшний день отсутствует систематическая информация о том, различаются ли нематоды Caenorhabditis в изобилии в растительном материале от промышленного или органического земледелия или поверхностного по сравнению с более глубоким слоем детрита или зависимостью от дождя или нет.

После того, как образцы были собраны и переданы в лабораторию, червей необходимо «выманить» из их субстратов. Это было достигнуто с помощью нескольких различных подходов, например, путем экстракции червей через воронки Baermann31 или размещения образцов на агаровой пластине, содержащей лабораторную пищу E. coli в качестве аттрактанта в середине27. По нашему опыту, протокол, описанный здесь, как правило, быстрее и эффективнее. Он основан на идее, что образцы субстрата погружаются в жидкий или вязкий раствор, который эффективно вытесняет червей из субстрата и поднимается на поверхность жидкости, откуда их можно легко собрать. Вязкость среды не является абсолютно необходимой, но она замедляет движение червей и, таким образом, может облегчить их сбор. Эффективный сбор червей облегчается, когда жидкость осторожно добавляется в субстрат, тем самым избегая солюбилизации любых гумусных веществ, которые могут затемнить жидкость и могут затруднить зрение нематод.

Следующая задача состоит в том, чтобы идентифицировать C. elegans. Некоторые морфологические особенности могут помочь отличить червей Caneorhabditis от других нематод27, но недостаточны для точной идентификации видов. Гниющее растительное вещество часто содержит другие похожие на вид нематоды, в том числе родственные виды, такие как C. briggsae или C. remanei 2,6,23,25, которые невозможно различить с первого взгляда. Поэтому C. elegans лучше всего и достоверно можно идентифицировать с помощью диагностической ПЦР с использованием видоспецифических праймеров 2,6,7, как описано в протоколе. В этом контексте может быть полезно установить размножающуюся популяцию изолированных природных C. elegans в лаборатории, например, на стандартных пластинах NGM. Природные C. elegans обычно приносят с собой ассоциированные бактерии, которые выделяются на пластины NGM, где бактерии обычно растут, впоследствии служа пищей для червей 6,7. Хотя точный состав ассоциированных микробов изменяется во время пролиферации C. elegans на пластинах, он по-прежнему сопоставим с таковым у непосредственно охарактеризованных образцов природных нематод 6,7 и, таким образом, является полезным компромиссом, который позволяет выделить как C. elegans, так и связанные с ними микробы.

Как только C. elegans успешно идентифицирован, нематоды или связанные с ними образцы субстрата могут быть использованы для выделения и характеристики связанных микробов. Чтобы гарантировать, что микробы действительно связаны с C. elegans в природе , крайне важно избегать загрязнений на всех этапах протоколов. Сбор образцов компоста и фруктов в полевых условиях должен осуществляться исследователем с особой осторожностью, с использованием стерилизованного материала. Вся обработка материала в лаборатории должна обеспечивать высокий уровень гигиены и снова стерилизовать пластиковую посуду и буферы. Чтобы снизить риск заражения, все лабораторные работы в идеале должны выполняться в отдельном лабораторном помещении, которое предназначено исключительно для выделения микробов. В качестве альтернативы, вся работа с открытыми пластинами, трубками или другими контейнерами должна выполняться в ламинарной проточной камере. Для оценки риска загрязнения соответствующие контрольные образцы (например, без образцов или без червей) должны обрабатываться параллельно. Кроме того, различные среды могут быть использованы для обеспечения того, чтобы все различные типы бактерий с их различными потребностями роста могли быть культивированы и изолированы. Тем не менее, предыдущая работа показала, что все до сих пор изолированные бактерии, которые связаны с природными изолятами C. elegans , легко растут на пластинах NGM и TSA. Таким образом, может быть достаточно сосредоточиться на этих средствах массовой информации.

Изолированные и охарактеризованные микробы будут способствовать лучшему пониманию естественной истории C. elegans. Что еще более важно, на сегодняшний день не совсем понятно, как C. elegans реагирует на свои естественно связанные микробы, какие молекулярные процессы участвуют и какие функции опосредуют взаимодействие червя с его микробными партнерами. Одним из главных исключений является всесторонняя работа группы Walhout по взаимодействию между C. elegans и Comamonas DA 1877. Он выявил витамин B12 в качестве центрального метаболита, обеспечиваемого бактерией, который влияет на экспрессию генов червей, фертильность, продолжительность жизни и развитие 15,16,17. Группа Walhout также продемонстрировала, что влияние витамина B12 на фертильность и развитие зависит от цикла метионина / S-аденозилметионина и зависит от нескольких факторов транскрипции, таких как рецептор ядерного гормона NHR-23 15,16,17. Более того, бактериальный витамин В12 способствует расщеплению потенциально токсичной короткоцепочечной жирной кислоты пропионатной кислоты, которая в отсутствие витамина В12 может быть компенсирована за счет переподключения метаболической сети, по-видимому, за счет производства 3-гидроксипропионата16,32. Другим примером является нейромодулирующий эффект Providencia, обнаруженный лабораторией Sengupta, где бактериальный тирамин превращается C. elegans tyramine β-гидроксилазой в октопамин, который впоследствии влияет на поведение червя через его взаимодействие с октопаминным рецептором OCTR-1 в специфических сенсорных нейронах18. Еще одним примером является иммунная защита, которая обеспечивается различными бактериями, особенно из рода Pseudomonas. Это происходит либо через выработку антимикробных соединений, либо через косвенный эффект, возможно, через активацию специфических ответов хозяина 6,11,14. Дополнительные микробы и особенно использование естественно связанных микробных сообществ помогут получить более реалистичное понимание биологии этой модели нематоды.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Мы заявляем, что у нас нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы признаем финансовую поддержку со стороны Немецкого научного фонда (проекты A1.1 и A1.2 Центра совместных исследований 1182 по происхождению и функциям метаорганизмов). Мы благодарим членов лаборатории Шуленбурга за их советы и поддержку.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMSOL COMSOL multiphysics simulation software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schulenburg, H., Félix, M. -A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
  2. Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors. BMC Ecology. 14 (1), 4 (2014).
  3. Petersen, C., et al. Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes. BMC Ecology. 15 (1), 19 (2015).
  4. Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
  5. Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).
  6. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
  7. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  8. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  9. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  10. Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).
  11. Kissoyan, K. A. B., et al. Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728 (2022).
  12. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  13. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  14. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  15. Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response. Cell. 153 (1), 253-266 (2013).
  16. Watson, E., et al. Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits. Cell. 156 (4), 759-770 (2014).
  17. MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
  18. O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
  19. Snoek, B. L., et al. A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits. BMC Biology. 17 (1), 24 (2019).
  20. Avery, L., Shtonda, B. B. Food transport in the C. elegans pharynx. Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).
  21. Zhang, J., et al. A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development. Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).
  22. Petersen, C., et al. Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations. Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).
  23. Félix, M. -A., Duveau, F. Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. BMC Biology. 10 (1), 59 (2012).
  24. Barrière, A., Félix, M. -A. Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations. Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).
  25. Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae. Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).
  26. Douglas, A. E. Simple animal models for microbiome research. Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).
  27. Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. WormBook. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).
  28. Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).
  29. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  30. Crombie, T. A., et al. Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands. Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).
  31. Haber, M. Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding. Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).
  32. Watson, E., et al. Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans. eLife. 5, 17670 (2016).

Tags

Биология выпуск 186 Caenorhabditis elegans взаимодействие хозяина и микробиоты яблоко компост Ochrobactrum Pseudomonas lurida
Выделение и характеристика естественной микробиоты модельной нематоды <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Petersen, C., Dierking, K., Johnke,… More

Petersen, C., Dierking, K., Johnke, J., Schulenburg, H. Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (186), e64249, doi:10.3791/64249 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter