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Biology

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64249
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Evolutionary Ecology and Genetics, University of Kiel, 2Max-Planck-Institute for Evolutionary Biology

Summary

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Abstract

El nematodo Caenorhabditis elegans interactúa con una gran diversidad de microorganismos en la naturaleza. En general, C. elegans se encuentra comúnmente en materia vegetal podrida, especialmente frutas podridas como manzanas o en montones de compost. También se asocia con ciertos huéspedes invertebrados como y cochinillas. Estos hábitats son ricos en microbios, que sirven como alimento para C. elegans y que también pueden colonizar persistentemente el intestino del nematodo. Hasta la fecha, la diversidad exacta y la consistencia de la microbiota nativa de C. elegans en todos los hábitats y ubicaciones geográficas no se comprende completamente. Aquí, describimos un enfoque adecuado para aislar C. elegans de la naturaleza y caracterizar la microbiota de los gusanos. Los nematodos pueden aislarse fácilmente del material de compost, manzanas podridas, o atraídos colocando manzanas en montones de compost. El mejor momento para encontrar C. elegans en el hemisferio norte es de septiembre a noviembre. Los gusanos se pueden lavar del material de sustrato recolectado sumergiendo el sustrato en una solución tampón, seguido de la recolección de nematodos y su transferencia al medio de crecimiento de nematodos o tampón de PCR para su posterior análisis. Además, ilustramos cómo las muestras se pueden utilizar para aislar y purificar los microorganismos asociados al gusano y para procesar gusanos para el análisis de ARN ribosómico 16S de la composición de la comunidad de microbiota. En general, los métodos descritos pueden estimular nuevas investigaciones sobre la caracterización de la microbiota de C. elegans en hábitats y ubicaciones geográficas, ayudando así a obtener una comprensión integral de la diversidad y estabilidad de la microbiota del nematodo como base para futuras investigaciones funcionales.

Introduction

En la naturaleza, C. elegans se encuentra comúnmente en materia vegetal podrida, especialmente frutas podridas como manzanas o en montones de compost1. También se asocia con ciertos huéspedes invertebrados como y cochinillas 2,3. Estos hábitats son ricos en microbios, que no solo sirven como alimento para el gusano, sino que también pueden formar asociaciones estables con él. La información sobre la diversidad de microorganismos asociados naturalmente solo se publicó en 2016 4,5,6. Desde entonces, estos y solo unos pocos estudios más recientes han revelado que C. elegans se asocia con una variedad de bacterias y hongos, más comúnmente incluyendo bacterias del género Pseudomonas, Enterobacter, Ochrobactrum, Erwinia, Comamonas, Gluconobacter y varios otros 6,7,8. Varias bacterias asociadas pueden colonizar de manera estable el intestino del gusano, aunque no todas 6,9,10,11,12. Es probable que sean de importancia clave para nuestra comprensión de la biología de C. elegans porque pueden proporcionar nutrición, proteger contra patógenos y posiblemente otros factores estresantes, y afectar rasgos centrales de la historia de vida, como la tasa reproductiva, el desarrollo o las respuestas conductuales.

Como ejemplo, los aislados naturalmente asociados de los géneros Pseudomonas, Ochrobactrum, y también Enterobacter o Gluconobacter pueden proteger al gusano de la infección y muerte de patógenos de distintas maneras 5,6,11,13,14. Un aislado específico del género Comamonas influye en la respuesta dietética de los nematodos, el desarrollo, la esperanza de vida y la fertilidad15,16,17. Las bacterias de Providencia producen el neuromodulador tiramina y, por lo tanto, modulan la actividad del sistema nervioso del huésped y las respuestas conductuales resultantes18. Se demostró que un conjunto de diferentes bacterias naturalmente asociadas afectan la tasa de crecimiento de la población, la fertilidad y las respuestas conductuales 5,6,9,11,19.

Hasta la fecha, la diversidad exacta y la consistencia de la microbiota nativa de C. elegans en todos los hábitats y ubicaciones geográficas no se comprenden completamente, y aún no se han descubierto otras asociaciones entre el gusano y los microbios de su entorno. Varios estudios previos utilizaron cepas bacterianas aisladas de algún ambiente del suelo, hábitats naturales de C. elegans o de experimentos de mesocosmos (es decir, ambientes de laboratorio que recrean hábitats naturales) con cepas de laboratorio de C. elegans 4,5,20. A pesar de que estos estudios obtuvieron nuevos conocimientos sobre la influencia de los microbios en rasgos específicos de nematodos (por ejemplo, el metabolismo de los nematodos21), la relevancia de estas interacciones para la biología de C. elegans en la naturaleza no está clara. Por lo tanto, este manuscrito describe los métodos para aislar directamente C. elegans de la naturaleza y para aislar y posteriormente caracterizar los microbios naturalmente asociados tanto de gusanos individuales como de grupos de gusanos. Los métodos descritos son una versión actualizada y mejorada de los procedimientos utilizados anteriormente para el aislamiento y caracterización de C. elegans natural y su microbiota nativa 2,6,7. Teniendo en cuenta que C. elegans se encuentra ampliamente en la materia vegetal en descomposición en todo el mundo (especialmente en frutas podridas, regiones templadas y en otoño)1,2,22,23,24,25, este protocolo puede ser aplicado por cualquier laboratorio siempre que haya interés en relacionar C. elegans rasgos a microbios naturalmente asociados y, por lo tanto, un contexto más naturalmente relevante. Este último es fundamental para una comprensión completa de la biología del nematodo porque se sabe por una diversidad de otros sistemas huéspedes que la microbiota asociada puede afectar diversas características de la historia de vida26, un aspecto que actualmente se descuida en gran medida en la multitud de estudios de C. elegans en casi todas las disciplinas de ciencias de la vida.

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Protocol

1. Preparación de buffers y medios

  1. Preparar el tampón S añadiendo 5,85 g de NaCl, 1,123 g de K 2 HPO 4, 5,926 g de KH2PO4 y 1 L deH2Odesionizado a un matraz y autoclave durante 20 min a 121 °C.
  2. Prepare un medio viscoso agregando tampón S que contenga 1.2% (p/v) de hidroximetilcelulosa (la sustancia que causa la viscosidad del medio), 5 mg / ml de colesterol, 1 mM de MgSO4, 1 mM de CaCl2 y 0.1% (v / v) de acetona. Autoclave y agita el medio viscoso hasta que sea completamente homogéneo.
    NOTA: Esto puede tardar varias horas. Además, el tampón S se puede preparar directamente y agregar al medio viscoso sin esterilización previa.
  3. Preparar el tampón M9 añadiendo 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de NA 2 HPO4·2 H2O, 5 g de NaCl y1 L deH2Odesionizado a un matraz de 1 L. Autoclave la solución, y después de enfriar, añadir 1 mL de 1 MMgSO4 (123,24 g de MgSO4·7H2O en 500 mL deH2Odesionizado, filtro esterilizado).
  4. Prepare una solución madre de Triton X-100 al 10% (v/v) mezclando 5 ml de Triton X-100 con 45 ml de tampón M9. Filtrar-esterilizar la solución con un filtro de 0,2 μm.
  5. Prepare el tampón M9 con Triton X-100 (M9-T) agregando 2,5 ml de la solución madre Triton X-100 al 10% (v/v) a 1 L de tampón M9 después del autoclave para obtener M9-T al 0,025% (v/v).
  6. Prepare glicerol al 30% (v/v) en tampón S mezclando 15 ml de glicerol estéril al 100% y 35 ml de tampón S estéril en un tubo de 50 ml.

2. Preparación de muestras ambientales (Figura 1)

  1. Recoja muestras ambientales como compost o frutas podridas y coloque cada muestra en una bolsa de plástico individual, tubo u otro recipiente limpio.
    NOTA: Para atraer nematodos, las manzanas se pueden colocar en compost varias semanas antes del muestreo.
  2. Extienda los trozos de la muestra ambiental uniformemente en una placa de Petri vacía y estéril de 9 cm.
    NOTA: Las muestras con niveles más altos de descomposición tienen más probabilidades de contener C. elegans. Opcionalmente, se puede usar una placa de Petri llena de medio de agar sin peptona (PFM) para aumentar el contraste.
  3. Cubra la muestra cuidadosamente con aproximadamente 20 ml de medio viscoso estéril.
    NOTA: Los nematodos flotan a la superficie dentro de 1-2 h. El medio viscoso ralentiza el movimiento de los gusanos y facilita su muestreo. El tampón M9 estéril se puede utilizar como alternativa, sin embargo, el movimiento del gusano será más rápido.

Figure 1
Figura 1: Aislamiento de nematodos de sustratos. Las muestras de sustrato se colocan en placas de Petri vacías y se cubren con medio viscoso para eliminar los nematodos. Los nematodos se transfieren a M9-T y se lavan repetidamente para eliminar las bacterias del exterior. Los nematodos individuales se pueden usar para el aislamiento del ADN, el aislamiento de bacterias asociadas o colocarse en placas de agar para cultivar poblaciones de gusanos. Figura creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Aislamiento de nematodos Caenorhabditis (Figura 1)

  1. Búsqueda de nematodos Caenorhabditis utilizando un microscopio de disección, siguiendo las pautas presentadas en el capítulo de WormBook sobre el aislamiento de C. elegans y nematodos relacionados por Barrière y Félix27.
    NOTA: Caenorhabditis hermafroditas/hembras tienen un intestino de color marrón claro (bajo iluminación transmitida). Además, las células intestinales tienen núcleos celulares grandes, que son visibles como puntos blancos. Por el contrario, otras especies de nematodos a menudo tienen un intestino marrón oscuro y pueden mostrar asimetría anteroposterior en la intensidad del pigmento y generalmente sin núcleos visibles. La vulva de Caenorhabditis hermafroditas/hembras adultas se encuentra en el centro del animal. Esta localización de la vulva no siempre es mostrada por otros taxones de nematodos. Los nematodos Caenorhabditis poseen dos bulbos faríngeos, que son visibles con suficiente aumento y transmiten iluminación y contraste con muchos otros taxones de nematodos. Los nematodos Caenorhabditis tienen una cola puntiaguda, mientras que algunos otros nematodos tienen una cola redonda.
  2. Recoger los nematodos Caenorhabditis bajo un microscopio de disección en el menor líquido posible utilizando una pipeta de 20-100 μL. Transfiera los nematodos recolectados directamente a 1-3 ml de M9-T estéril en una placa de Petri estéril de 3 cm para lavar los gusanos para eliminar los microbios no adheridos (paso 3.3) o, alternativamente, transfiera gusanos individuales a una placa con medio de crecimiento de nematodos (NGM) para establecer una población de gusanos (paso 3.4).
  3. Lave los nematodos para eliminar los microbios del exterior del nematodo.
    NOTA: Este protocolo enriquece las bacterias intestinales, pero no elimina completamente las bacterias que se adhieren a la cutícula del gusano.
    1. Incubar los nematodos durante 10-15 min en M9-T.
    2. Pipetear los nematodos en el menor líquido posible en 1-3 ml de M9-T fresco en una nueva placa de Petri estéril de 3 cm.
    3. Repita la incubación y transfiera los nematodos a M9-T fresco dos veces más.
      NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar con gusanos individuales o con poblaciones de gusanos. Los gusanos ahora se pueden usar para la caracterización de C. elegans y microbios asociados, así como para el aislamiento de bacterias (pasos 4 y 5). Alternativamente, pueden transferirse individualmente a placas NGM para establecer una población de gusanos (paso 3.4).
  4. Para obtener una población de gusanos, pipetear un nematodo individual a una placa NGM.
    NOTA: Sólo los nematodos hermafroditas como C. elegans o C. briggsae son capaces de producir descendencia a partir de gusanos individuales. Sin embargo, los gusanos individuales de otras especies aún pueden producir descendencia si ya estaban apareados.
    1. Los nematodos aislados naturalmente generalmente contienen bacterias en su intestino, que arrojan a las placas NGM, donde estas bacterias crecen y están disponibles como alimento para C. elegans. No agregue organismos alimentarios separados como el organismo alimenticio estándar de laboratorio, E. coli cepa OP50.
      NOTA: La cría de gusanos en placas influye en la composición de la comunidad bacteriana asociada, sin embargo, la composición sigue siendo comparable a la de los aislados naturales de C. elegans 6,7.
    2. Permita que los nematodos proliferen hasta 10 días a la temperatura adecuada (por ejemplo, 15-20 °C para lugares templados). Congelar estos nematodos (paso 3.5) o utilizarlos para la caracterización de C. elegans y microbios asociados, así como para el aislamiento de microbios (pasos 4 y 5).
  5. Congelación de nematodos para almacenamiento a largo plazo
    1. Deje los nematodos en las placas hasta que las bacterias de los alimentos hayan desaparecido, y haya principalmente pequeñas etapas larvales en las placas. Lave los gusanos de las placas en 1,5 ml de tampón S.
    2. Mezcle bien 500 μL de tampón S que contiene gusanos con 500 μL de glicerol al 30% (v/v) en tampón S en un tubo estéril de 2 ml. Congele los tubos rápidamente a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo, de lo contrario el glicerol puede dañar los nematodos.

4. Preparación de los gusanos para la identificación molecular de C. elegans y microbios

  1. Para la identificación imparcial de microbios asociados a nematodos, prepare una placa de 96 pocillos con tres perlas estériles de 1 mm, 19,5 μL de tampón de PCR y 0,5 μL de proteinasa K (20 mg/ml) por pocillo. Pipetear un nematodo individual lavado a cada pocillo, transfiriendo la menor cantidad de líquido posible.
  2. También se pueden utilizar poblaciones de gusanos. Para esto, lave los gusanos de las placas con M9-buffer y transfiera ~300 μL de membrujo M9 que contiene gusanos a tubos de 2 mL con 10-15 perlas.
  3. Rompa los nematodos usando un homogeneizador de cuentas (por ejemplo, batir cuentas durante 3 minutos a 30 Hz). Centrifugar la placa o los tubos brevemente para que el líquido llegue al fondo (p. ej., durante 10 s a 8000 x g a temperatura ambiente [RT]).
  4. Identificación de C. elegans
    1. Aislar el ADN de nematodos individuales calentando las muestras en un ciclador de PCR durante 1 h a 50 °C y 15 min a 95 °C. Aislar el ADN de las poblaciones de gusanos utilizando cualquier método de aislamiento de elección (protocolos de ejemplo de diferentes métodos de aislamiento utilizando kits comerciales 7,9). Congelar el ADN a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo.
    2. Para la identificación de C. elegans, utilice el ADN y el par de cebadores nlp30-F (Tabla 1, 5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3') y nlp30-R (Tabla 1, 5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3') en una PCR, siguiendo las instrucciones de un proveedor de Taq de elección.
    3. Utilice las siguientes condiciones de PCR: etapa de desnaturalización inicial a 95 °C durante 2 min, seguida de 35 ciclos de 95 °C durante 45 s, 55 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min, y una etapa final de elongación a 72 °C durante 5 min. C. elegans produce un producto de PCR de 154 pb.
  5. Caracterizar las bacterias asociadas a nematodos mediante la secuenciación del amplicón 16S de la región V3-V4, utilizando el ADN aislado.
    1. Prepare una biblioteca 16S con los cebadores 16S de su elección y siga el protocolo del kit de preparación de la biblioteca. Una opción es utilizar los cebadores 341F (Tabla 1, 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') y 806R (Tabla 1, 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') cubriendo la región V3-V4 del gen 16S rRNA, lo que da como resultado secuencias que pueden clasificarse con bases de datos estándar con buena resolución7.
      NOTA: La cantidad de ADN de entrada es crítica en este paso. El ADN adquirido de gusanos individuales va a ser mucho menor que el obtenido de las poblaciones de gusanos. Para gusanos individuales, podría ser necesario aumentar la cantidad de ADN de entrada o aumentar la cantidad de ciclos de PCR7.
    2. Las bibliotecas se pueden secuenciar en una plataforma de secuenciación utilizando un kit de secuenciación adecuado.
      NOTA: Aquí, la plataforma MiSeq se utiliza con un kit de reactivos MiSeq adecuado. Los reactivos se mejoran constantemente y deben elegirse según los estándares más nuevos.

5. Aislamiento y cultivo de bacterias asociadas a nematodos (Figura 2)

  1. Para aislar las bacterias, prepare una placa de 96 pocillos con tres perlas estériles de 1 mm, 20 μL de tampón M9 por pocillo y pipete un nematodo lavado individual a cada pocillo, transfiriendo la menor cantidad de líquido posible.
    NOTA: Alternativamente, las poblaciones de gusanos se pueden lavar de las placas con tampón M9 y ~ 300 μL de tampón M9 que contiene gusanos se pueden transferir a tubos de 2 ml con 10-15 perlas. En todos los casos, los gusanos deben provenir de un cultivo que se identificó como C. elegans siguiendo los pasos 4.1-4.4.
  2. Rompa los nematodos usando un homogeneizador de cuentas (por ejemplo, batir cuentas durante 3 minutos a 30 Hz). Centrifugar la placa o los tubos brevemente para que el líquido llegue al fondo (por ejemplo, durante 10 s a 8000 x g en RT).
    NOTA: El uso de este método condujo al aislamiento de taxones bacterianos similares a los revelados por la secuenciación del amplicón de ADNr 16S7, lo que sugiere que el batido de cuentas descrito deja intactas la mayoría de las células bacterianas.
  3. Recoger el sobrenadante, diluirlo en serie a 1:10 y colocar hasta 100 μL en placas de agar de 9 cm.
    1. Para asegurarse de que la mayoría de las bacterias se puedan cultivar, use una variedad de medios alternativos con diferentes composiciones de nutrientes, incluido el agar de soja tripticasa diluido (TSA, dilución 1:10), agar MacConkey, agar de glucosa Sabouraud, agar dextrosa de papa o agar dextrosa peptona de levadura.
  4. Incubar las placas a las condiciones de temperatura media del lugar de muestreo (por ejemplo, temperaturas entre 15-20 °C para lugares templados) durante 24-48 h.
  5. Utilice la técnica estándar de tres rayas y un asa estéril para obtener cultivos bacterianos puros (Figura 2).
    1. Elija una sola colonia de una placa usando un asa estéril o palillo de dientes y estézcala en una nueva placa de agar que contenga el mismo medio de agar que se usa para la purificación. Asegúrese de usar solo aproximadamente 1/3 del plato.
    2. Use un nuevo bucle estéril o esterilice un bucle reutilizable y arrástrelo a través de la primera raya para crear una segunda raya en otro 1/3 de la misma placa.
    3. Repita este paso arrastrando un bucle estéril a través de la segunda raya.
    4. Incubar la placa en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el aislamiento. Esta técnica debe dar lugar a colonias individuales que crezcan en el área de la tercera raya.
      NOTA: Puede ser necesario repetir el paso de purificación varias veces, ya que los aislados naturales tienden a formar biopelículas y / o agregados.
  6. Cultivar las colonias puras en un medio líquido (del mismo tipo que el medio de agar) utilizando la misma temperatura y tiempo de crecimiento que el anterior (paso 5.4)
  7. Prepare las reservas de bacterias agregando 300 μL del cultivo bacteriano a 200 μL de glicerol al 86% (v / v) (en el medio de crecimiento respectivo, por ejemplo, TSB) y pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar correctamente. Alternativamente, prepare las existencias de DMSO mezclando 50 μL de cultivo bacteriano con 50 μL de DMSO al 7% (v / v). Congelar a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
  8. Caracterización de bacterias mediante la secuenciación del gen completo del ARN ribosómico 16S
    1. Extraer el ADN bacteriano de cultivos líquidos puros utilizando una técnica adecuada (por ejemplo, un kit de extracción de ADN; por experiencia, un protocolo de extracción basado en CTAB funciona muy bien22).
    2. Amplificar el gen 16S rRNA utilizando los cebadores 27F (Tabla 1, 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') y 1495R (Tabla 1, 5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3')28 y las siguientes condiciones de PCR: 95 °C, 2 min, 22x (95 °C, 30 s; 55 °C, 30 s; 72 °C, 100 s), y un período de extensión final a 72 °C, 5 min.
    3. Para adquirir las secuencias completas, utilice adicionalmente dos cebadores de secuenciación internos, como 701F (Tabla 1, 5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3') y 785R (Tabla 1, 5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3')6.

Figure 2
Figura 2: Identificación de especies y aislamiento de bacterias individuales. Los nematodos individuales se rompen utilizando un homogeneizador de perlas, y el ADN se aísla para la determinación de especies mediante PCR o secuenciación. Alternativamente, el material del nematodo roto se diluye en serie y se coloca en placas de medio de crecimiento. Las placas se incuban hasta que aparecen colonias bacterianas, y las colonias individuales se rayan a nuevas placas para obtener cultivos puros. Las colonias individuales de cultivos puros se utilizan para cultivar cultivos bacterianos líquidos para la preparación de reservas bacterianas para su almacenamiento a largo plazo a -80 °C. Figura creada con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

El nematodo C. elegans se encuentra con frecuencia en frutas en descomposición, como manzanas, y también muestras de compost. En el norte de Alemania, C. elegans, así como especies congenéricas (particularmente C. remanei pero también C. briggsae) se encuentran principalmente desde septiembre hasta el2 de noviembre. Los nematodos se encuentran más comúnmente en la materia vegetal en descomposición, especialmente en frutas podridas como manzanas o peras, y también compost, particularmente material que muestra un alto grado de descomposición. Las muestras de fruta y compost pueden llevarse al laboratorio (Figura 3A, B), distribuirse en placas de Petri (Figura 3C, D) y posteriormente sumergirse en un medio líquido o viscoso para obligar a los gusanos a abandonar el material del sustrato y nadar hacia la superficie del medio (Figura 3E, F). Posteriormente, los gusanos pueden ser recolectados, transferidos a placas de agar o tubos de microcentrífuga, y la identidad de la especie determinada mediante PCR diagnóstica 2,6,7,22.

Figure 3
Figura 3: Preparación de manzanas para el aislamiento de nematodos. (A,B) Los nematodos pueden aislarse de muestras ambientales como compost o frutas podridas y, además, ser atraídos colocando manzanas en compost. (C,D) Las muestras se dividen y se colocan pequeños trozos en una placa de Petri. (E,F) Se agrega medio viscoso a las muestras, lo que generalmente conduce a que los nematodos abandonen el material del sustrato y naden hacia la superficie del medio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La PCR utilizando los cebadores específicos de C. elegans nlp30-F y nlp30-R da como resultado un producto de PCR de 154 pb de longitud para C. elegans y ningún producto para otros nematodos (Figura 4). Para confirmar el rendimiento exitoso de la PCR, el ADN de una cepa de laboratorio como N2 debe ejecutarse como control positivo simultáneamente con el ADN de los nematodos aislados. Pequeñas cantidades de material biológico, como pequeñas etapas larvales, pueden dar lugar a bandas de PCR débiles (Figura 4A). La visibilidad de las bandas de PCR se puede mejorar utilizando más ADN en la PCR (tenga en cuenta que esto minimizará la cantidad de ADN que queda para la secuenciación del amplicón de ADNr 16S bacteriano, por ejemplo, 2 μL de ADN en lugar de 1 μL), aplicando una mayor cantidad del producto de PCR al gel (por ejemplo, 10-15 μL), o aumentando el número de ciclos de PCR. En comparación con los gusanos individuales, las poblaciones de gusanos que consisten en al menos 50 gusanos generalmente producen una mayor cantidad de ADN, y las bandas en el gel de electroforesis son claramente visibles (Figura 4B).

Figure 4
Figura 4: Producto de PCR de PCR específica de C. elegans. (A,B) Los cebadores específicos de C. elegans nlp30-F y nlp30-R producen un producto de PCR de 154 pb de longitud. Como ejemplo, se realizaron PCR en (A) gusanos individuales y (B) poblaciones de gusanos (por ejemplo, 300-500 individuos), todos aislados con el protocolo descrito de materia vegetal podrida del compost del Jardín Botánico de Kiel, Alemania. (A) El ADN de gusanos individuales y, en particular, de pequeñas etapas larvales a menudo da lugar a bandas de PCR débiles. (B) El ADN aislado de poblaciones de gusanos (por ejemplo, 300-500 individuos) da como resultado bandas más claras. El ADN de C. elegans N2 se utilizó como control positivo (+), ninguna plantilla se utilizó como control negativo (-). Los frotis debajo de las bandas de PCR son artefactos de gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los microbios, que están asociados con C. elegans, se pueden aislar de gusanos y también de muestras de sustrato que contienen gusanos. El aislamiento de microbios sigue los estándares generales de microbiología, incluido el aislamiento de cultivos puros de placas de agar, su crecimiento en medios líquidos y su posterior caracterización (por ejemplo, utilizando las secuencias del gen de ARN ribosómico 16S para bacterias). Es fundamental que los microbios se aíslen como colonias individuales puras de placas, utilizando procedimientos microbiológicos estándar (Figura 5). Esto es importante porque algunas de las bacterias asociadas a C. elegans pueden formar biopelículas y/o agregarse fácilmente, lo que resulta en cultivos de múltiples especies (Figura 5C, D). La pureza de los cultivos bacterianos aislados puede confirmarse a través de las secuencias del gen 16S rRNA, como se hace para microbios asociados a C. elegans previamente aislados 6,7. Los microbios obtenidos pueden ser utilizados posteriormente en experimentos con C. elegans.

Figure 5
Figura 5: Aislados bacterianos en placas de agar. Los aislados bacterianos individuales se rayan en placas de agar, en este caso, placas trípticas de agar de soja (TSA), mostrando como ejemplos un aislado de (A) Pseudomonas lurida, (B) Pseudomonas fluorescens, y un ejemplo con varias especies bacterianas, que se muestra como una (C) visión general de toda la placa y (D) aumento de una sección de esta placa, en la que se ven distintos tipos de colonias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Lista de cebadores utilizados en este estudio Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

El nematodo Caenorhabditis elegans es uno de los organismos modelo más intensamente estudiados en la investigación biológica. Fue introducido por Sydney Brenner en la década de 1960, originalmente para comprender el desarrollo y la función del sistema nervioso29. Desde entonces, C. elegans se ha convertido en un poderoso modelo para estudiar procesos fundamentales en todas las disciplinas biológicas, incluida la biología del comportamiento, la neurobiología, el envejecimiento, la biología evolutiva, la biología celular, la biología del desarrollo y la inmunología. Su éxito se basa en una combinación única de propiedades ventajosas, que incluyen un corto tiempo de generación de aproximadamente 3 días, facilidad de cultivo, cuerpo transparente (que permite un fenotipado eficiente), supervivencia de la congelación, esterilización eficiente y sincronización del desarrollo, y también métodos eficientes para la manipulación genética por mutagénesis, CRISPR-Cas o ARNi. Hoy en día, C. elegans se estudia en aproximadamente 1.500 laboratorios en todo el mundo. Cuando Sydney Brenner estableció por primera vez C. elegans como un sistema modelo en el laboratorio, cultivó el nematodo bacterívoro en la bacteria gramnegativa Escherichia coli OP50 como fuente de alimento. Desde entonces, C. elegans se ha mantenido en cultivo monoxénico en E. coli OP50 en laboratorios de todo el mundo29. Además, las poblaciones de C. elegans están habitualmente sincronizadas o descontaminadas mediante un procedimiento de blanqueamiento que solo sobrevive con huevos estériles y sin microbios asociados. Por lo tanto, es fácil generar animales estériles que luego pueden exponerse a bacterias individuales en condiciones altamente controladas. Sin embargo, como resultado de estos protocolos estandarizados de mantenimiento de laboratorio de C. elegans, casi todos los estudios sobre la biología de C. elegans se realizaron en ausencia de sus bacterias naturalmente asociadas. De hecho, la información sobre la diversidad de microorganismos asociados naturalmente solo se publicó en 2016 4,5,6, y la diversidad exacta de microbios asociados aún no se explora completamente.

Los métodos descritos ayudarán a caracterizar aún más la diversidad de microbios que están asociados con C. elegans en la naturaleza. Estos microbios son probablemente determinantes importantes de la historia de vida del nematodo y, por lo tanto, deberían ser un recurso esencial para el trabajo futuro con este gusano. Los métodos descritos son una versión actualizada de los únicos métodos publicados previamente para aislar microbios de muestras naturales de C. elegans recolectadas directamente del campo 6,7. El protocolo aprovecha el hecho de que C. elegans habita materia vegetal en descomposición en la naturaleza. Tal material podrido es rico en microbios, que sirven como alimento para C. elegans y es probable que cumplan otras funciones, como la protección inmune (es decir, la protección contra patógenos)5,6,11,13,14. El primer paso clave es, por lo tanto, obtener sustratos adecuados para el aislamiento de lombrices. La idoneidad puede depender de la época del año; en el norte de Alemania, C. elegans se encuentra principalmente desde septiembre hasta el2 de noviembre. Este es el momento en que frutas como manzanas o peras están disponibles y comienzan a pudrirse en el suelo. Es probable que la hora exacta varíe entre las regiones geográficas23,24,25,30. Cualquier material vegetal parece adecuado para C. elegans, siempre y cuando muestre un alto grado de descomposición y, por lo tanto, tenga una rica comunidad microbiana, excepto el material dominado por hongos, que a menudo son patógenos para C. elegans1. Además, C. elegans suele ser particularmente común cuando la humedad general no es demasiado baja2. Hasta la fecha, falta información sistemática sobre si los nematodos Caenorhabditis varían en abundancia en el material vegetal de la agricultura industrial versus orgánica o superficial versus la capa más profunda de detritus o la dependencia de la lluvia o no.

Una vez que las muestras han sido recolectadas y transferidas al laboratorio, los gusanos necesitan ser "atraídos" fuera de sus sustratos. Esto se ha logrado con un par de enfoques diferentes, por ejemplo, mediante la extracción de gusanos a través de embudos de Baermann31 o la colocación de muestras en una placa de agar que contiene el alimento de laboratorio de E. coli como atrayente en el medio27. En nuestra experiencia, el protocolo descrito aquí es generalmente más rápido y eficiente. Se basa en la idea de que las muestras de sustrato se sumergen en una solución líquida o viscosa, lo que obliga eficientemente a los gusanos a salir del sustrato y subir a la superficie del líquido, desde donde se pueden recolectar fácilmente. La viscosidad del medio no es absolutamente necesaria, pero ralentiza el movimiento de los gusanos y, por lo tanto, puede facilitar su recolección. La recolección eficiente de gusanos se facilita cuando el líquido se agrega cuidadosamente al sustrato, evitando así la solubilización de cualquier sustancia humosa, que puede oscurecer el líquido y dificultar la visión de los nematodos.

El siguiente desafío es identificar C. elegans. Algunas características morfológicas pueden ayudar a distinguir los gusanos Caneorhabditis de otros nematodos27, pero son insuficientes para la identificación precisa de la especie. La materia vegetal podrida a menudo contiene otros nematodos de aspecto similar, incluidas especies congenéricas, como C. briggsae o C. remanei 2,6,23,25, que son imposibles de distinguir a primera vista. Por lo tanto, C. elegans puede identificarse mejor y de manera más confiable con la ayuda de PCR diagnóstica utilizando cebadores específicos de la especie 2,6,7, como se describe en el protocolo. En este contexto, puede ser útil establecer una población proliferante de C. elegans naturales aislados en el laboratorio, por ejemplo, en placas NGM estándar. Los C. elegans naturales generalmente traen consigo bacterias asociadas, que se derraman en las placas NGM, donde las bacterias generalmente crecen, sirviendo posteriormente como alimento para los gusanos 6,7. Aunque la composición exacta de los microbios asociados cambia durante la proliferación de C. elegans en placas, sigue siendo comparable a la de las muestras de nematodos naturales inmediatamente caracterizadas6,7, y por lo tanto es un compromiso útil que permite el aislamiento tanto de C. elegans como de los microbios asociados.

Una vez que C. elegans se identifica con éxito, los nematodos o las muestras de sustrato asociadas se pueden utilizar para el aislamiento y caracterización de los microbios asociados. Para garantizar que los microbios estén verdaderamente asociados con C. elegans en la naturaleza, es de suma importancia evitar las contaminaciones en todos los pasos de los protocolos. La recolección de muestras de compost y frutas en el campo debe hacerse con especial cuidado por parte del investigador, utilizando material esterilizado. Todo el procesamiento de material en el laboratorio debe garantizar un alto nivel de higiene y, de nuevo, artículos y tampones de plástico esterilizados. Para reducir el riesgo de contaminación, todo el trabajo de laboratorio idealmente debe realizarse en una sala de laboratorio separada, que se dedica exclusivamente al aislamiento de los microbios. Como alternativa, todo el trabajo con placas abiertas, tubos u otros recipientes debe realizarse en un gabinete de flujo laminar. Para evaluar el riesgo de contaminación, se deben procesar en paralelo muestras de control apropiadas (por ejemplo, sin muestras o sin gusanos). Además, se podría utilizar una variedad de medios diferentes para garantizar que todos los diferentes tipos de bacterias con sus diferentes requisitos de crecimiento puedan cultivarse y aislarse. Sin embargo, trabajos previos indicaron que todas las bacterias aisladas hasta ahora, que están asociadas con aislados naturales de C. elegans , crecen fácilmente en placas NGM y TSA. Por lo tanto, puede ser suficiente centrarse en estos medios.

Los microbios aislados y caracterizados contribuirán a una mejor comprensión de la historia natural de C. elegans. Más importante aún, hasta la fecha, no se entiende bien cómo responde C. elegans a sus microbios naturalmente asociados, qué procesos moleculares están involucrados y qué funciones median la interacción del gusano con sus asociados microbianos. Una de las principales excepciones es el trabajo exhaustivo del grupo Walhout sobre la interacción entre C. elegans y Comamonas DA 1877. Reveló la vitamina B12 como un metabolito central proporcionado por la bacteria, que influye en la expresión génica del gusano, la fertilidad, la esperanza de vida y el desarrollo15,16,17. El grupo de Walhout demostró además que el efecto de la vitamina B12 sobre la fertilidad y el desarrollo depende del ciclo metionina/S-adenosilmetionina y está influenciado por varios factores de transcripción, como el receptor de la hormona nuclear NHR-2315,16,17. Además, la vitamina B12 bacteriana contribuye a la descomposición del ácido propionato de ácido graso de cadena corta potencialmente tóxico, que en ausencia de vitamina B12 puede compensarse mediante el recableado de la red metabólica, aparentemente a través de la producción de 3-hidroxipropionato16,32. Un ejemplo diferente es el efecto neuromodulador de Providencia, descubierto por el laboratorio Sengupta, donde la tiramina bacteriana es convertida por la tiramina β-hidroxilasa de C. elegans en octopamina, que posteriormente influye en el comportamiento del gusano a través de su interacción con el receptor de octopamina OCTR-1 en neuronas sensoriales específicas18. Otro ejemplo es la protección inmune, que es proporcionada por varias bacterias, especialmente las del género Pseudomonas. Esto ocurre ya sea a través de la producción de compuestos antimicrobianos o a través de un efecto indirecto, posiblemente a través de la activación de respuestas específicas del huésped 6,11,14. Los microbios adicionales y especialmente el uso de comunidades microbianas naturalmente asociadas ayudarán a obtener una comprensión más realista de la biología de este nematodo modelo.

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Disclosures

Declaramos que no tenemos ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Reconocemos el apoyo financiero de la Fundación Alemana de Ciencia (proyectos A1.1 y A1.2 del Centro de Investigación Colaborativa 1182 sobre el Origen y la Función de los Metaorganismos). Agradecemos a los miembros del laboratorio Schulenburg por sus consejos y apoyo.

Materials

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References

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Biología Número 186 Caenorhabditis elegans interacciones huésped-microbiota manzana compost Ochrobactrum Pseudomonas lurida
Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo <em>Caenorhabditis elegans</em>
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