Summary
تقدم هذه الدراسة إجراء مفصلا لإجراء تجارب نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) على مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCRs) باستخدام وضع العلامات الخاصة بالموقع عن طريق دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA). يوفر البروتوكول دليلا خطوة بخطوة لإعداد عينة smFRET والتجارب وتحليل البيانات.
Abstract
تعد قدرة الخلايا على الاستجابة للإشارات الخارجية ضرورية لتطوير الخلايا ونموها وبقائها. للاستجابة لإشارة من البيئة ، يجب أن تكون الخلية قادرة على التعرف عليها ومعالجتها. تعتمد هذه المهمة بشكل أساسي على وظيفة مستقبلات الغشاء ، التي يتمثل دورها في تحويل الإشارات إلى اللغة الكيميائية الحيوية للخلية. تشكل المستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة من بروتينات مستقبلات الغشاء في البشر. من بين GPCRs ، مستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluRs) هي فئة فرعية فريدة تعمل كدايمرات ملزمة وتمتلك مجالا كبيرا خارج الخلية يحتوي على موقع ربط الليغاند. أدت التطورات الحديثة في الدراسات الهيكلية ل mGluRs إلى تحسين فهم عملية تنشيطها. ومع ذلك ، فإن انتشار التغيرات التوافقية واسعة النطاق من خلال mGluRs أثناء التنشيط والتشكيل غير مفهوم بشكل جيد. يعد نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) تقنية قوية لتصور وقياس الديناميكيات الهيكلية للجزيئات الحيوية على مستوى البروتين الواحد. لتصور العملية الديناميكية لتنشيط mGluR2 ، تم تطوير أجهزة استشعار مطابقة فلورية تعتمد على دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) التي سمحت بوضع علامات على البروتين الخاص بالموقع دون إزعاج البنية الأصلية للمستقبلات. يشرح البروتوكول الموصوف هنا كيفية إجراء هذه التجارب ، بما في ذلك نهج وضع العلامات UAA الجديد ، وإعداد العينات ، والحصول على بيانات smFRET وتحليلها. هذه الاستراتيجيات قابلة للتعميم ويمكن توسيعها للتحقيق في الديناميكيات التوافقية لمجموعة متنوعة من بروتينات الغشاء.
Introduction
يعتمد نقل المعلومات عبر غشاء البلازما بشكل كبير على وظيفة مستقبلات الغشاء1. يؤدي ارتباط الرباط بالمستقبل إلى تغيير مطابق وتنشيط المستقبلات. غالبا ما تكون هذه العملية ألوستيريك في طبيعتها2. مع أكثر من 800 عضو ، تعد المستقبلات المرتبطة بالبروتين G (GPCRs) أكبر عائلة من مستقبلات الغشاء في البشر3. نظرا لدورها في جميع العمليات الخلوية تقريبا ، أصبحت GPCRs أهدافا مهمة للتطوير العلاجي. في النموذج الأساسي لإشارات GPCR ، يؤدي تنشيط ناهض إلى تغييرات تطابقية للمستقبل الذي ينشط لاحقا مركب بروتين G غير المتجانس عن طريق تبادل الناتج المحلي الإجمالي مقابل GTP في جيب ربط النيوكليوتيدات في Gα. ثم تتحكم الوحدات الفرعية G α-GTP و Gβγ المنشطة في نشاط البروتينات المستجيبة في اتجاه المصب وتنشر سلسلة الإشارات 4,5. تعتمد عملية الإشارة هذه بشكل أساسي على قدرة الأربطة على تغيير الشكل ثلاثي الأبعاد للمستقبل. إن الفهم الميكانيكي لكيفية تحقيق الليغاند لذلك أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات جديدة وتصميم مستقبلات وأجهزة استشعار اصطناعية.
مستقبلات الغلوتامات الأيضية (mGluRs) هي أعضاء في عائلة GPCR من الفئة C وهي مهمة للتأثيرات العصبية البطيئة للغلوتامات وضبط استثارة الخلايا العصبية 6,7. من بين جميع GPCRs ، تعد GPCRs من الفئة C فريدة من نوعها من الناحية الهيكلية من حيث أنها تعمل كدايمرات ملزمة. يحتوي mGluRs على ثلاثة مجالات هيكلية: مجال مصيدة ذبابة الزهرة (VFT) ، والمجال الغني بالسيستين (CRD) ، والمجال عبر الغشاء (TMD)8. التغييرات التوافقية أثناء عملية التنشيط معقدة وتشمل اقتران التشكيل المحلي والعالمي الذي ينتشر على مسافة 12 نانومتر ، فضلا عن التعاون الخافت. التشكيلات الوسيطة ، والترتيب الزمني للدول ، ومعدل الانتقال بين الدول غير معروفة. من خلال اتباع تشكيل المستقبلات الفردية في الوقت الفعلي ، من الممكن تحديد الحالات الوسيطة العابرة وتسلسل التغيرات التوافقية أثناء التنشيط. يمكن تحقيق ذلك من خلال تطبيق نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء 9,10 (smFRET) ، كما تم تطبيقه مؤخرا لتصور انتشار التغيرات التوافقية أثناء تنشيط mGluR2 11. تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية في تجارب FRET في توليد مستشعرات FRET عن طريق الإدخال الخاص بالموقع للفلوروفورات المانحة والمتقبلة في البروتين محل الاهتمام. تم اعتماد استراتيجية دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) 12،13،14،15 للتغلب على قيود تقنيات وضع العلامات الفلورية النموذجية الخاصة بالموقع والتي تتطلب إنشاء طفرات أقل من السيستين أو إدخال علامة كبيرة مشفرة وراثيا. وقد سمح ذلك بإعادة الترتيب التوافقي للوصلة الألوستيرية المدمجة الأساسية ، والتي انضمت إلى مجالات ربط الليغاند والإشارات في mGluR2. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم دليل خطوة بخطوة لإجراء تجارب smFRET على mGluR2 ، بما في ذلك نهج وضع العلامات الخاصة بالموقع على mGluR2 مع UAA لربط الفلوروفورات باستخدام تفاعل تسيكل الأزيد المحفز بالنحاس. علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول منهجية الالتقاط المباشر لبروتينات الغشاء وتحليل البيانات. البروتوكول الموضح هنا ينطبق أيضا على دراسة الديناميكيات التوافقية لبروتينات الغشاء الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويرد وصف لسير العمل العام للبروتوكول في الشكل 1.
1. إعداد غرفة العينة
- تنظيف الانزلاق والغطاء
ملاحظة: تهدف هذه الخطوات إلى تنظيف أسطح الشرائح وكذلك الأغطية وإعدادها للأمينوسيلان. أحد المتطلبات الحاسمة لإجراء تجارب التألق أحادية الجزيء على جزيئات مربوطة بالسطح هو السطح المخمل. تتضمن تقنية التخميل الأكثر موثوقية والقابلة للتكرار ربط سلاسل البوليمر الخاملة تساهميا بالسطح الزجاجي كطبقة كثيفة. البولي إيثيلين جلايكول (PEG) هو البوليمر الأكثر كفاءة المستخدم في تخميل السطح16. تفاصيل إجراء التخميل باستخدام PEG (PEGylation) موصوفة أدناه:- ضع علامة على الثقوب المراد حفرها على الشرائح بعلامة (~ 6 مم بعيدا عن الحافة). استخدم Dremel لحفر ثقوب صغيرة (قطرها 1 مم) على الشريحة الزجاجية. اغمر الشرائح في الماء أثناء عملية الحفر.
- اغسل الشرائح بالأسيتون لإزالة الحبر المتبقي من العلامة.
- أخرجيها من الأسيتون واشطفي الشرائح بالماء، ثم ضعيها في الميكروويف لمدة 5 دقائق في الماء بقوة عالية (700 واط).
- نظف الشرائح بالماء قبل وضعها في وعاء تلطيخ زجاجي ليتم صوتيتها. ضع الأغطية في جرة تلطيخ مختلفة.
- قم بإلغاء صوت الشرائح والأغطية في الأسيتون لمدة 30 دقيقة في سونيكتور الحمام عند 23 درجة مئوية.
- في غضون ذلك ، قم بتنظيف قارورة زجاجية لإعداد محلول aminosilanization المستخدم خلال الخطوة التالية. املأ القارورة ب 1 M KOH ، وقم بسونيك القارورة لمدة 30 دقيقة ، واشطف KOH جيدا بالماء ، ثم قم بسونيك لمدة 30 دقيقة إضافية في الميثانول. اترك القارورة في الميثانول حتى وقت خطوة الأمينوسيلان.
- في غضون ذلك ، قم بإزالة aminosilane و mPEG و biotin-PEG من الفريزر (-20 درجة مئوية) واسمح لهم بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام.
- تخلص من الأسيتون من الشريحة وأغطية الجرار في حاوية النفايات الكيميائية المناسبة ، وشطفها جيدا بالماء ، ثم قم بصوتنة الشرائح في 5 M KOH لمدة 30 دقيقة.
- شطف الشرائح وأغطية بالماء ، ثم سونيك في الميثانول لمدة 2 دقيقة (كرر مرتين). اترك الجرار مليئة بالميثانول حتى خطوة الأمينوسيلان.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام المياه منزوعة الأيونات ما لم يذكر خلاف ذلك. يتم استخدام سونيكتور حمام يعمل عند 23 درجة مئوية.
- أمينوسيلانية
ملاحظة: تهدف هذه الخطوة إلى ربط الأمينوسيلان تساهميا بسطح الشريحة والغطاء النظيف. سوف يرتبط mPEG والبيوتين-PEG الوظيفيان تساهميا بهذا السطح في الخطوة التالية.- تحضير خليط أمينوسيلانات في قارورة نظيفة (الخطوة 1.6). تحضير الحل عن طريق خلط الميثانول (150 مل) ، وحمض الخليك (7.5 مل ، واستخدام ماصة زجاجية) ، والأمينوسيلان (2.5 مل).
- امزج المحلول بلطف في غطاء الدخان الكيميائي ، ثم صبه في الشريحة والجرار المغطاة . استخدم 50 مل للأغطية و 100 مل للشرائح. تأكد من أن الشرائح وقسائم الغطاء مغمورة بالكامل في المحلول.
- احتضن لمدة 10 دقائق ، ثم سونيك الجرار لمدة 1 دقيقة (الصوتنة تزيل الشوائب من السطح) ، وتحضن لمدة 10 دقائق أخرى.
- تخلص من محلول أمينوسيلان في حاوية جمع النفايات. أضف الميثانول إلى الجرار ، وأغلق الجرار بأغطية ، ورجها بلطف باليد. تخلص من الميثانول ، واملأ الجرار بالماء.
- أعد زجاجة الأمينوسيلان إلى الفريزر (-20 درجة مئوية).
- بيجالاتيون
ملاحظة: تصف هذه الخطوات إجراء PEGylation.- أثناء أمينوسيلان، قم بإعداد المخزن المؤقت pegylation. يزن 84 ملغ من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) وإضافته إلى 10 مل من الماء (10 ملليمتر). بالإضافة إلى ذلك ، قم بوزن mPEG والبيوتين-PEG ووضعها جانبا. بالنسبة لست شرائح وأغطية ، استخدم 96 ملغ من mPEG و 1.2-2.4 ملغ من البيوتين-PEG.
ملاحظة: من المهم عدم إضافة الكثير من البيوتين-PEG لأنه يمكن أن يزيد من عدد بقع الخلفية. لا تذوب خليط PEG حتى قبل التطبيق مباشرة على الشرائح. - شطف الشرائح بالماء ، وجففها بضربة هواء لطيفة ، ثم ضعها في صناديق التجميع المرطبة.
ملاحظة: من الضروري استخدام شركة طيران نظيفة. تجنب استخدام الهواء المعلب المضغوط ، والذي يمكن أن يترك بقايا على الزجاج. - أضف المخزن المؤقت pegylation إلى خليط مسحوق PEG وماصة لأعلى ولأسفل بلطف عدة مرات حتى تذوب. أضف 55 ميكرولتر من المخزن المؤقت pegylation لكل شريحة (بالنسبة لست شرائح ، أضف 330 ميكرولتر من المخزن المؤقت pegylation).
- جهاز طرد مركزي عند 9600 × جم لمدة 1 دقيقة عند 23 درجة مئوية لترسيب الجسيمات غير الذائبة. جمع supernatant لاستخدامها في الخطوة التالية.
ملاحظة: يتحلل البيوتين-PEG بسرعة بسبب وجود مجموعة NHS. من المهم القيام بخطوات الخلط والطرد المركزي بسرعة. - ضع 60 ميكرولتر من محلول PEGylation على كل شريحة ثم ضع الغطاء في الأعلى بحيث يكون محلول PEGylation محصورا بين الشريحة والغطاء الانزلاقي.
ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات بين الشريحة والغطاء ، لأن هذا سيقلل من كفاءة التخميل. قم بإزالة أي فقاعات عن طريق ضبط الغطاء والشريحة بطرف ماصة. - ضع الشرائح في درج مسطح ومظلم. يمكن تخزين الشرائح بين عشية وضحاها. ومع ذلك ، فإن الحضانة لمدة 4-6 ساعات تؤدي إلى التخميل الأمثل.
ملاحظة: من الضروري أن نتذكر أي جانب هو pegylated. - ضع علامة على الجانب غير المغطى قبل التخزين. بعد الحضانة ، قم بتفكيك وشطف الشرائح والأغطية بلطف بالماء
- جفف الشرائح والأغطية عن طريق نفخ الهواء. احتفظ بالشرائح والأغطية في أنبوب معقم (50 مل)، بحيث يكون السطح PEGylated مواجها بعيدا عن بعضها البعض. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى يوم التجربة.
ملاحظة: من الأفضل استخدام الشرائح وأغطية الغطاء في غضون 4 أسابيع من التحضير. يجب أن تواجه الأسطح PEGylated بعيدا عن بعضها البعض. يمكن أن يؤدي تخزين شرائح وأغطية PEGylated في أكياس محكمة الغلق بالتفريغ إلى زيادة مدة صلاحيتها.
- أثناء أمينوسيلان، قم بإعداد المخزن المؤقت pegylation. يزن 84 ملغ من بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) وإضافته إلى 10 مل من الماء (10 ملليمتر). بالإضافة إلى ذلك ، قم بوزن mPEG والبيوتين-PEG ووضعها جانبا. بالنسبة لست شرائح وأغطية ، استخدم 96 ملغ من mPEG و 1.2-2.4 ملغ من البيوتين-PEG.
2. تعبير mGluR2 مع الأحماض الأمينية غير الطبيعية المدمجة ، ووضع العلامات الفلورية ، والاستخراج
ملاحظة: يحدد هذا البروتوكول إعداد الخلايا وكواشفها ومعالجتها للتعبير عن mGluR2 التي تحتوي على UAA 4-azido-L-phenylalanine (AZP). الإجراء هو لخلايا HEK293T المزروعة على أغطية زجاجية 18 مم. يمكن توسيع نطاق الإجراء حسب الضرورة.
- بذر
ملاحظة: حافظ على خلايا HEK293T في DMEM مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (v / v) ، و 100 وحدة · mL−1 البنسلين الستربتومايسين ، و 15 mM HEPES المخزن المؤقت (الملف التكميلي 1) (الرقم الهيدروجيني 7.4) عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.- تمرير الخلايا مع 0.05 ٪ التربسين-EDTA. خلايا HEK293T البذرية على أغطية زجاجية بولي لتر / دي ليسين (PLL / PDL) بحيث تصل إلى ≥80٪ من الالتقاء خلال وقت النقل.
- النقل
- قم بإعداد محلول مخزون 40 mM من AZP في 0.1 M NaOH.
- قم بإعداد وسائط مكملة ب AZP لنمو الخلايا وتعبير mGluR2. تكملة الوسائط القياسية (+ FBS، القلم/البكتيريا العقدية، 15 mM HEPES) باستخدام حل مخزون AZP سعة 40 ملليمتر. اجعل تركيز AZP النهائي إلى 0.6 ملليمتر. أضف حل 1 M HEPES (تمت إضافة نصف حجم حل مخزون AZP البالغ 40 mM). على سبيل المثال ، لإعداد 10 مل من الوسائط التكميلية AZP ، اجمع بين 9.775 مل من الوسائط القياسية ، و 150 ميكرولتر من محلول مخزون AZP 40 mM ، و 75 ميكرولتر من محلول 1 M HEPES.
- تصفية (تعقيم) الوسائط باستخدام مرشح حقنة (0.2 ميكرومتر ، PES).
- استبدل الوسائط القياسية بوسائط تحتوي على وسائط مكملة ب AZP قبل النقل.
ملاحظة: احرص على عدم تجفيف الخلايا أثناء استبدال الوسائط. - قم بنقل الخلايا باستخدام كاشف النقل (جدول المواد) باتباع دليل الشركة المصنعة. نقل خلايا HEK293T على غطاء 18 مم باستخدام ما مجموعه 2 ميكروغرام من الحمض النووي (1000 نانوغرام من tRNA / synthetase + 1000 نانوغرام من بلازميد البروتين المحتوي على الكودون الكهرماني). ارجع إلى الجدول 1 لمعرفة تركيز وحجم المكونات المستخدمة.
- قم بتغيير الوسائط لمدة 24 ساعة بعد النقل إلى وسائط جديدة مكملة ب AZP واسمح للخلايا بالنمو لمدة 24 ساعة إضافية.
- وضع العلامات مع أصباغ السيانين الألكين
- قبل 20 دقيقة من وضع العلامات، اغسل أغطية الأغطية بمخزن تسجيل مؤقت دافئ (37 درجة مئوية) (RB) (ملف تكميلي 1) مرتين، وانقلها إلى وسائط قياسية دافئة (37 درجة مئوية) بدون AZP (+ FBS، Pen/Strep، 15 mM HEPES).
- قم بإعداد محلول وضع العلامات الذي يحتوي على Cy3-alkyne و Cy5-alkyne و BTTES وكبريتات النحاس (II) (CuSO4) و (+) الصوديوم L-ascorbate و aminoguanidine.
- اتبع ترتيب صنع الحلول وإضافتها (الجدول 2):
- إعداد 50 mM BTTES.
- تحضير 100 مللي متر أمينوجوانيدين.
- تحضير 100 mM Na-ascorbate.
- تحضير 655.5 ميكرولتر من RB.
- أضف صبغة الألكين Cy3 / Cy5 (10 mM في مخزون DMSO) إلى RB.
ملاحظة: إضافة أمينوجوانيدين إلى RB. - تحضير 20 mM CuSO4.
- امزج CuSO4 و BTTES في أنبوب جديد (سيتحول المحلول إلى اللون الأزرق).
- أضف خليط CuSO4 و BTTES إلى RB (2.3.3.6.)
- أضف Na-Ascorbate.
- اتبع الحجم الوارد في الجدول 2 أدناه للحصول على غطاء مقاس 18 مم.
- اخلطي المحلول جيدا واحتضنيه على الثلج وفي الظلام لمدة 10 دقائق قبل وضع العلامات على الخلايا.
- قبل إضافة حل وضع العلامات إلى الأغطية ، قم بإزالة الوسائط واغسلها باستخدام RB. أضف محلول وضع العلامات واحتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظروف المظلمة.
- ملاحظة: لتحسين وضع العلامات، أضف الغلوتامات (التركيز النهائي ~ 0.5 ملليمتر) بعد 10 دقائق واحتضنها لمدة 5 دقائق إضافية. النحاس سام جدا للخلايا ، ويجب ألا يستمر تفاعل وضع العلامات لأكثر من 15 دقيقة في الجسم الحي. تحضير جميع المكونات الطازجة. أضف Na-Ascorbate أخيرا. حافظ على التفاعل عند 4 درجات مئوية أثناء التحضير. ومع ذلك ، عند إضافة محلول وضع العلامات ، يجب تخزين الخلايا عند 37 درجة مئوية داخل الحاضنة.
- حصاد الخلايا واستخراج البروتينات (تحلل الخلايا)
- قم بإزالة محلول وضع العلامات واغسل الغطاء (18 مم) الذي يحتوي على الخلايا المنقولة mGluR2 مرتين باستخدام RB.
- باستخدام ماصة ، اغسل الخلايا من الغطاء وأعد تعليقها في RB (1 مل).
ملاحظة: قلل من تعرض العينة للضوء قدر الإمكان بعد هذه النقطة. - قم بتكوير الخلايا عن طريق الدوران عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق وإزالة السوبرناتانت. أعد تعليق بيليه الخلية في 80-130 ميكرولتر من محلول التحلل.
ملاحظة: يجب أن تكون حبيبة الخلية مرئية بالعين. يعتمد حجم التحلل على كمية العينة المفقودة أثناء عملية وضع العلامات والغسيل. - تخلط بلطف عن طريق السحب لتفتيت الكريات. التفاف في احباط ووضعها على الروك في 4 درجة مئوية لمدة 0.5-1 ساعة لتحليل الخلايا.
- حبيبات الكسر غير القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي عند 20000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب بارد طازج (البروتين المحلل الذي يحتوي على البروتين الموسوم بالفلورسنت محل الاهتمام) وقم بتخزينه على الجليد لإجراء التجارب.
3. تجميع غرفة تدفق جزيء واحد ووظائفها
- قم بإزالة الشريحة والغطاء من الفريزر واتركيهما يسخنان في RT في الظلام (~ 30 دقيقة).
- قم بتجميع الغرفة باستخدام شريط على الوجهين عن طريق وضع شرائح من الشريط على الوجهين بين الشريحة والغطاء . تأكد من أن الأسطح PEGylated تشكل الجزء الداخلي من غرفة التدفق.
- باستخدام طرف ماصة ، اضغط على الغطاء للتأكد من أن الشريط يتلامس تماما مع كل من الغطاء والشريحة ؛ احرص على عدم كسر الغطاء. تطبيق الايبوكسي على حواف الشرائح.
ملاحظة: لا تضيف الكثير بحيث يملأ الإيبوكسي الثقوب المحفورة. - ضع غرفة التدفق مع توجيه جانب الغطاء لأسفل في صندوق مظلم رطب للسماح للإيبوكسي بالجفاف (~ 30 دقيقة).
ملاحظة: أضف المخزن المؤقت T50 (الملف التكميلي 1) من خلال الثقوب المحفورة لمنع الايبوكسي من تغطية الثقوب (10-15 ميكرولتر) خلال فترة التجفيف. - احتضان كل حارة غرفة مع 500 نانومتر نيوترافيدين (مخفف في T50) عن طريق تطبيق ببطء ~ 40 ميكرولتر على كل حارة.
- احتضان في RT لمدة 2 دقيقة داخل صندوق مظلم رطب. يغسل مع ~ 100 ميكرولتر من T50 المخزن المؤقت لكل حارة.
- احتضان كل ممر غرفة مع 20 نانومتر من الأجسام المضادة البيوتينيل11. يعتمد اختيار الأجسام المضادة على العلامة الموجودة على البروتين.
ملاحظة: إذا لم يكن الجسم المضاد الأساسي حيويا ، فقم أولا باحتضان الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل لمدة 30 دقيقة ثم احتضنه بالجسم المضاد الأساسي. - احتضن في RT لمدة 30 دقيقة داخل صندوق مظلم رطب. يغسل مع ~ 200 ميكرولتر من T50 لكل حارة.
ملاحظة: تأكد من أن الممرات لن تجف أبدا أثناء عملية التحضير.
4. المخازن المؤقتة أحادية الجزيء
- المخزن المؤقت Trolox
ملاحظة: المخزن المؤقت Trolox هو المخزن المؤقت لبدء عمل المخزن المؤقت للتصوير. تعتمد مكونات المخزن المؤقت على التجربة وقد تختلف اعتمادا على البروتين محل الاهتمام. يتضمن المخزن المؤقت المستخدم في البروتوكول الموصوف هنا الأملاح (كلوريد الصوديوم ، KCl ، CaCl 2 ، MgCl2) ، عامل التخزين المؤقت (HEPES) ، و Trolox (الرقم الهيدروجيني ~ 7.35).- قم بإذابة 9-10 ملغ من Trolox في 10 مل من المخزن المؤقت لتسجيل جزيء واحد (SRB ، الملف التكميلي 1)
ملاحظة: Trolox يجعل المخزن المؤقت حمضيا قليلا. اضبط الرقم الهيدروجيني في هذه المرحلة باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، 10 M (الرقم الهيدروجيني 7.35). سيتم إجراء تعديل درجة الحموضة الدقيقة بعد حل Trolox بالكامل ؛ ومع ذلك ، فإن زيادة الرقم الهيدروجيني في هذه المرحلة يزيد من قابلية ذوبان Trolox. - امزج المحلول في RT باستخدام آلة الروك على الطاولة لمدة 4-8 ساعات (ملفوفة بورق الألومنيوم) لإذابة Trolox بالكامل.
- تحقق من الرقم الهيدروجيني واضبطه إذا لزم الأمر.
- تأكد من حل Trolox بالكامل. تعقيم الحل مع مرشح حقنة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب استخدام المخزن المؤقت بعد 2-10 أيام من الشيخوخة. يساعد Trolox على قمع الوميض ويستخدم عادة في دراسات الجزيء الواحد17. تأتي الخصائص المضادة للوميض من مشتق مؤكسد من Trolox18. وبالتالي ، يوصى بالاحتفاظ بها في RT لبضع ساعات على الأقل حتى تنضج. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل الأشعة فوق البنفسجية لمحلول Trolox الطازج على تسريع عملية الأكسدة ويمكن استخدامها لتسريع "شيخوخة" Trolox buffer18.
- قم بإذابة 9-10 ملغ من Trolox في 10 مل من المخزن المؤقت لتسجيل جزيء واحد (SRB ، الملف التكميلي 1)
- وصفة المخزن المؤقت للتصوير: مزيج Trolox المخزن المؤقت + المنظفات (~ 2 أضعاف قيمة CMC للمنظف) + 4 mM protocatechuic acid (PCA).
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بتركيز المنظفات بالقرب من CMC لأن تركيزات المنظفات العالية قد تؤدي إلى زيادة تمسخ البروتين. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الخليط التالي 955 ميكرولتر ترولوكس + 5 ميكرولتر 10٪ DDM + الكوليسترول (W٪ ، 10: 1) + 40 ميكرولتر من محلول مخزون PCA 100 mM. هنا ، يعمل PCA كعامل مضاد للأكسدة وكان يستخدم سابقا في دراسات smFRET19. DDM غير أيوني ، ويستخدم عادة لإذابة بروتينات الغشاء20,21 ، وقد استخدم في دراسات جزيء واحد. DDM هو منظف جيد الخيار الأول. ومع ذلك ، نوصي باختبار منظفات متعددة وضمان اتساق النتائج.
5. إعداد المجهر والحصول على بيانات smFRET
- قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر. قم بتشغيل الليزر للإحماء (532 نانومتر لإثارة Cy3 و 640 نانومتر لإثارة Cy5).
ملاحظة: هنا ، تم استخدام مجهر مقلوب مجهز بهدف TIRF 100x (N.A. 1.49) ، ومقسم الصور ، وكاميرا EMCCD. تم تجهيز الإعداد بجهاز دمج ليزر من أربعة أسطر ، ومرآة ثنائية اللون ، ومرشح انبعاث طويل المرور ، ومرشح ثنائي اللون للانبعاثات ، ومرشح من الشق. - قم بتشغيل كاميرا EMCCD وافتح برنامج الكاميرا. انتظر 20 دقيقة حتى تصل الكاميرا إلى -69 درجة مئوية وتستقر فيها.
- قم بتركيب غرفة العينة على مرحلة المجهر. أضف عينة البروتين تدريجيا لتحقيق ~ 400 جزيء لكل مجال رؤية (الخطوة 2.4.5). اغسل الغرفة ب 100 ميكرولتر من مخزن التصوير المؤقت.
- اضبط الكسب ومعدل الاكتساب وقوى الليزر بحيث يتم اكتشاف إشارات التألق أحادية الجزيء في كل من القنوات المانحة والمتقبلة. اضبط تركيز البروتينات داخل غرفة العينة إذا لزم الأمر.
ملاحظة: مع وجود أكثر من 400 جزيء في مجال الرؤية ، يصبح التمييز بين الجزيئات الفردية أكثر صعوبة ، وستكون ضوضاء الخلفية أعلى. - إثارة المتبرع والحصول على آثار زمنية حتى يتم تبييض ما لا يقل عن 80٪ من جزيئات المتبرع في مجال الرؤية ضوئيا.
- في نهاية الفيلم ، قم بتشغيل ليزر 640 نانومتر لإثارة المتقبل مباشرة حتى تقوم بعض جزيئات المستقبل بالتبييض الضوئي ، مما يسهل جزيء واحد من التمييز متعدد المراحيض.
- انتقل إلى مجال رؤية مختلف وكرر الخطوات المذكورة أعلاه لجمع ثلاثة أفلام على الأقل (نسخ طبق الأصل تقني) لكل شرط.
ملاحظة: استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة أثناء تحديد منطقة اهتمام جديدة (ROI) والتركيز لتقليل التبييض الضوئي. انتبه إلى انحراف المرحلة أثناء الاستحواذ. إذا لوحظ انحراف ملحوظ بعد الانتقال إلى عائد استثمار جديد ، فانتظر لمدة 3 دقائق قبل البدء في الاستحواذ.
6. تحليل البيانات
- محاذاة قناة المتبرع والمتلقي (رسم خرائط الأفلام)
- تسجيل صور حبة الفلورسنت في قنوات المتبرع والمتقبل.
- قم بإنشاء ملف رسم الخرائط باستخدام بيانات الخرزة لربط التألق المانح والمتلقي من كل جزيء22,23.
ملاحظة: تنقسم إشارة الانبعاث من جزيء واحد إلى إشارات مانحة وإشارات متقبلة بواسطة مرشح ثنائي اللون للانبعاثات داخل مقسم الصورة. يتم عرض صور المتبرع والمتقبل على الكاميرا جنبا إلى جنب. لربط كثافة المتبرع والمتلقي بدقة لجزيء واحد بين المنطقتين ، غالبا ما يتم إنشاء ملف رسم خرائط باستخدام عينات من حبة الفلورسنت. باستخدام ملف رسم الخرائط هذا ، يتم تعيين جميع الجزيئات التي يتم اكتشافها في قنوات المتبرع والمتقبل على بعضها البعض. ثم يولد التحليل آثار الوقت ، والتي هي كثافة المتبرع والمتلقي بمرور الوقت ، لكل جزيء.
- اختيار آثار FRET أحادية الجزيء (انتقاء الجسيمات)
ملاحظة: يتم فحص آثار الجسيمات الفردية واختيارها للتحليل النهائي باستخدام MATLAB. تعتمد معايير الاختيار الدقيقة على النظام. يتم توضيح المبادئ التوجيهية العامة حول ما يشكل جسيما عالي الجودة هنا. تتوفر جميع الرموز المعدلة حسب الطلب على GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).- حدد الآثار التي تكون فيها الكثافة الكلية للآثار (المتبرع + المتقبل) مستقرة بمرور الوقت. حدد الآثار ذات التغيرات المضادة للارتباط في كثافة المتبرع والمتقبل.
- حدد الجزيئات المانحة والمتقبلة التي تظهر التبييض الضوئي بخطوة واحدة. حدد الآثار التي يبلغ طولها >5 ثانية.
ملاحظة: يجب أن تنتقل الخلفية في كل قناة بعد التبييض إلى الصفر. لا ينبغي أن يكون للآثار العديد من الأحداث الوامضة. هذا سيزيد من صعوبة التحليل. - احسب كفاءة FRET باستخدام المعادلة E = (I A− 0.088 × I D)/(I D + [I A− 0.088 × I D])24,25,26، حيث I D وI A هما كثافة المتبرع الخام والمتقبل، على التوالي.
ملاحظة: يتم تحديد تسرب انبعاث المتبرع إلى قناة المتقبل باستخدام عينة تحمل علامة المتبرع فقط متحمسة باستخدام ليزر 532 نانومتر26. قد يختلف عامل تصحيح التسرب، 0.088، باختلاف الإعدادات وفقا لمجموعات الفلتر المستخدمة. ومن المهم ملاحظة أن التحويل الكمي والقوي لكفاءات FRET إلى مسافات مطلقة يتطلب تصحيح كثافة المانحين والمتقبلين لعوامل متعددة وقد نوقش على نطاق واسع قبل27.
- تحديد الحالة التوافقية بواسطة نمذجة ماركوف المخفية (HMM)
- قم بتنفيذ برنامج vbFRET28 في MATLAB واستورد الآثار المحددة لحالة معينة. تعيين القيود المفروضة على عدد الحالات والتكرارات المحتملة التي سيتم تنفيذها.
ملاحظة: استنادا إلى البيانات الأولية المستمدة من النتائج التمثيلية، افترض أن هناك ما يصل إلى أربع حالات منفصلة من حالات FRET يشغلها المستشعر المطابق؛ وهكذا ، تم تعيين مجموعة من دولة واحدة إلى أربع دول. تم تحديد التحسينات في التركيب سابقا على أنها زيادة طفيفة مع تكرار >25 ؛ وهكذا ، تم استخدام 25 تكرارا لملاءمة البيانات التمثيلية. - تحليل آثار smFRET وتصدير الآثار المثالية وجلسة التحليل. احفظ الآثار المثالية في مجلد منفصل للتحليل النهائي.
ملاحظة: تم توفير البرامج المستخدمة لاستخراج بيانات انتقال الحالة ووقت الإقامة من الآثار المثالية في العملالمنشور سابقا 29. - باستخدام برامج MATLAB ، قم باستخراج انتقالات الحالة ورسمها كخريطة حرارية مع إحداثيات X التي تشير إلى تشكيل البداية وإحداثيات Y التي تشير إلى التوافق النهائي.
ملاحظة: يتم تعريف الانتقالات على أنها تغييرات في قيمة FRET >0.1 في النتائج التمثيلية التي تمت مناقشتها هنا. تعتمد عتبة الانتقالات على الحالات التوافقية المفترضة التي يشغلها بروتين الاهتمام (تعيين عتبة الانتقال لتكون أقل من الفرق بين أقرب حالات FRET) ، بالإضافة إلى الدقة التي يسمح بها الإعداد التجريبي. يتيح فحص الخرائط الحرارية لظروف متعددة تحديد الحالات التوافقية الأكثر شيوعا التي ينتقل منها المستشعر ، وبالتالي يشغلها. تم تحديد أربع حالات FRET للنتائج التمثيلية (FRET = 0.31 و 0.51 و 0.71 و 0.89). - باستخدام برامج MATLAB ، قم باستخراج أوقات الإقامة لكل حالة توافقية محددة. قم بتعيين مجموعة من قيم FRET التي تحدد كل حالة ودقة زمنية أثناء الحصول على البيانات. يتم تقسيم نطاقات FRET بالتساوي على حالات FRET المجاورة. تصدير أوقات الإقامة لظروف العلاج المحددة.
ملاحظة: في معظم الحالات، يمكن تقدير بيانات وقت الإقامة بشكل جيد بواسطة دالة اضمحلال أسي واحدة. يمكن إجراء هذا التحليل في برنامج تحليل البيانات والرسوم البيانية.
- قم بتنفيذ برنامج vbFRET28 في MATLAB واستورد الآثار المحددة لحالة معينة. تعيين القيود المفروضة على عدد الحالات والتكرارات المحتملة التي سيتم تنفيذها.
- تركيب غاوسي للرسوم البيانية للسكان smFRET لتحديد حجم إشغال الدولة
- استيراد المدرج التكراري ل FRET للسكان للظروف ذات الأهمية في تحليل البيانات وبرامج الرسوم البيانية لتحليل الذروة المتعددة.
- حدد عدد القمم الموجودة (أربع قمم أو حالات استنادا إلى تحليل HMM). تم إجراء التركيب باستخدام توزيعات غاوسية متعددة30 تم تعريفها على أنها
، حيث A هي منطقة الذروة ، xc هي مركز الذروة ، و w هي عرض الذروة لكل ذروة. - تقييد معلمات التركيب ك A > 0 و xc = FRET ± 0.02 و 0.1 ≤w≤ 0.24. كانت أربع قمم FRET لفرادى السكان FRET مناسبة في وقت واحد. تطبيق القيود المحددة لتركيبات جميع الظروف.
- احسب حالة الإشغال (النسبة المئوية) كمنطقة ذروة الاهتمام مقسومة على المساحة الإجمالية، والتي تعرف بأنها مجموع جميع القمم.
، حيث A هي منطقة الذروة ، xc هي مركز الذروة ، و w هي عرض الذروة لكل ذروة.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التعبير ووضع العلامات الفلورية لمستشعر FRET القائم على UAA
هنا ، تتم مناقشة النتائج النموذجية لإدراج ووضع العلامات الفلورية على UAA (AZP) داخل CRD من mGluR2 (548UAA)11. كما ذكرنا سابقا ، لإدراج AZP في mGluR2 ، من الضروري التعبير المشترك عن الآلات الانتقالية الهندسية ، والتي تتضمن تركيب tRNA المعدل و tRNA التكميلي (pIRE4-Azi) ، و mGluR2 الذي يحتوي على كودون كهرماني في الموضع 548 ، تم إنشاؤه باستخدام الطفرات ، (الشكل 2A ، B). يتم تحقيق وضع العلامات على AZP بواسطة أصباغ السيانين من خلال تفاعل الإضافة الحلقية المحفزة بالنحاس (الشكل 2C) وينتج عنه وضع علامات فعالة على غشاء البلازما 548UAA (الشكل 2D). للتحقق من ترجمة 548UAA كاملة الطول وسلامة المستقبل dimeric ، تم إجراء الرحلان الكهربائي SDS-PAGE على تحلل الخلية من خلايا HEK293T التي تعبر عن 548UAA المسمى Cy5. ولوحظ وجود نطاق واحد عند 250 دينارا كويتيا، وهو ما تزامن مع الديمريك mGluR2 كامل الطول (الشكل 2E).
الحصول على البيانات وتحليلها
تم تصنيف الخلايا التي تعبر عن 548UAA مع علامة FLAG-FLAG الطرفية C مع Cy3 (المتبرع) و Cy5 (المتقبل) ثم تم تحليلها بالمنظف31 في وجود مثبط للأنزيم البروتيني للدراسة في المختبر. عند الانتهاء من تحلل الخلايا وإزالة الجزء غير القابل للذوبان عن طريق الطرد المركزي ، تم تطبيق supernatant على غطاء مخمل من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) يعمل بجسم مضاد مضاد ل FLAG-tag لتصوير التألق الداخلي الكلي (TIRF) (الشكل 3). تمت إضاءة العينة باستخدام ليزر 532 نانومتر ، وتم اختيار الجسيمات للتحليل النهائي باستخدام برنامج smCamera. تم إنشاء آثار المتبرع الخام والمتقبل و FRET لجميع الجزيئات المختارة في smCamera وتم اختيارها باستخدام MATLAB (القسم 6; الشكل 4). تم تطبيق تصحيح نزيف المتبرع بنسبة 8.8٪ على شدة المتقبل للإعداد التجريبي المستخدم هنا. وسيختلف عامل التصحيح هذا باختلاف الإعداد التجريبي، والمرشحات ثنائية اللون، ومرشحات الانبعاثات المستخدمة، وينبغي تحديده عن طريق قياس إشارات المتبرع والمتقبل في ظل الظروف التجريبية القياسية باستخدام الخلايا الموسومة بالفلوروفور المانح فقط وحساب النزيف ([شدة المقبول]/[شدة المانح]). ويبين الشكل 4 عدة آثار تمثيلية ل FRET وإشارات الجهات المانحة والمتقبلة المقابلة. وقد اختيرت هذه الآثار باستخدام معايير سبق وصفها في البروتوكول (القسم 6). تظهر الآثار المختارة التمثيلية التي تظهر الانتقالات بين حالات متعددة وأحداث التبييض المانحة والمتقبلة في الشكل 4B-D.
تحديد الحالات التوافقية
لتحديد الحالات التوافقية التي احتلها 548UAA وعلاقة هذه الحالات بالنسبة لبعضها البعض ، تم إجراء تحليل نمذجة ماركوف المخفية (HMM). تم إجراء تحليل HMM باستخدام برنامج vbFRET الذي تم تنفيذه على MATLAB28 (الشكل 5A). يستخدم الشكل 5 بيانات من تركيز الغلوتامات الوسيط ( 5μM ) لتوضيح عملية تحديد الحالة. استنادا إلى آثار smFRET الخام ، تم افتراض وجود ما يصل إلى أربع حالات FRET محتملة ل CRD. وهكذا ، تم تقييد عدد الولايات إلى واحد إلى أربعة. بشكل عام ، تم إجراء 25 تكرارا للتركيب لكل أثر لتحديد عدد الحالات الموجودة. من هذه الملاءمة المثالية ، يمكن استخراج الانتقالات بين حالات FRET المنفصلة ورسمها كخريطة حرارية لكثافة الانتقال (الشكل 5B). تسلط الخريطة الحرارية الضوء على أربع حالات منفصلة ل FRET عند 0.31 و 0.51 و 0.71 و 0.89 ، يشار إليها بخطوط منقطة. تم تعريف التحولات على أنها تغييرات في FRET >0.1. كما تسفر آثار FRET المثالية عن معلومات عن وقت الإقامة لكل تشكيل محدد (الشكل 5C).
السكان FRET توليد الرسم البياني وذروة الملاءمة
تظهر في الشكل 6A,B آثار الجزيء الواحد التمثيلية ل 548UAA في وجود تركيزات مختلفة من الغلوتامات التي تم اختيارها يدويا لمزيد من التحليل. التحليل العام لتجارب smFRET هو توليد المدرج التكراري للسكان من مئات من آثار smFRET لكل حالة تجريبية (الشكل 6C). يتم إنشاء المدرج التكراري ل FRET للسكان من جزء الآثار قبل التبييض. لتجنب تحيز الرسم البياني نحو سلوك الآثار الأطول ، من الضروري إنشاء رسم بياني FRET طبيعي من كل أثر قبل المتوسط. وهذا يضمن أن كل أثر يساهم بالتساوي في الرسم البياني النهائي. في هذا النظام ، تظهر الصور التكرارية FRET تحولا عاما نحو FRET أعلى مع زيادة تركيز الغلوتامات ، مما يشير إلى انخفاض في المسافة بين CRDs وتحول نحو التشكيل النشط. ومع ذلك ، بغض النظر عن تركيز الغلوتامات ، تظل إشارة FRET متفرقة للغاية ، مما يشير إلى درجة عالية من الديناميكيات الجوهرية ل CRD. بالإضافة إلى التحول العام نحو FRET الأعلى ، تصبح إعادة توزيع المجموعة التوافقية واضحة في الرسم البياني (منحنيات الألوان). يمكن أيضا رؤية جزيئات فردية تزور هذه الحالات التوافقية (الخطوط المتقطعة) (الشكل 6B). لتحديد احتمال إشغال الدولة ، يجب على المرء تقسيم مساحة الذروة على المساحة الإجمالية ، والتي تعرف بأنها مجموع جميع مناطق الذروة الفردية الأربعة. عرض الرسم البياني smFRET الذي تم إنشاؤه من تجربة smFRET ل CRD من mGluR2 أربع حالات ديناميكية مع قمم عند 0.31 و 0.51 و 0.71 و 0.89 (تم تصنيفها عند الحالات 1-4) ، على التوالي.
الشكل 1: مخطط انسيابي لبروتوكول العمل وتحليل البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وضع العلامات الخاصة بالموقع على mGluR2 بواسطة كيمياء النقر . (أ) مخطط لعملية دمج الحمض الأميني غير الطبيعي 4-azido-L-phenylalanine في الخلايا. (ب) مخطط يوضح وضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع على mGluR2 ، مع وجود الحمض الأميني غير الطبيعي في الموضع 548 ، بواسطة تفاعل النقر الأزيد - الألكين المحفز بالنحاس. (ج) بنية ثلاثية الأبعاد ل mGluR2 المسمى بالفلورسنت (جزيء مانح باللون الأخضر ، جزيء متقبل باللون الأحمر) مع جزيئات Cy3 و Cy5 راسية . (د) صورة مجهرية تمثيلية متحدة البؤرة لخلايا HEK293T تعبر عن 548UAA مع مجموعة سطح الخلية الموسومة بالمتبرع (الأخضر: Cy3) والمتقبل (الأحمر: Cy5) الفلوروفورات من خلال كيمياء النقر. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (E) صورة للرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد غير المختزل بنسبة 4٪ -20٪ من الخلايا المحللة الخلوية من خلايا HEK293T التي تعبر عن 548UAA وتحمل علامة Cy5-alkyne. تم تصوير الجل بطول موجي للإثارة 633 نانومتر ومرشح انبعاث 670-BP30-Lane a: سلم البروتين. حارة ب: خلية محللة. حارة ج: صبغة Cy5-alkyne. تمثل النتائج تجربة فردية. ويعاد استخدام الأفرقة باء ودال وهاء من Liauw et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التمثيل التخطيطي لتجارب smFRET وإعداد المجهر (TIRF). تظهر صورة التألق أحادية الجزيء للمتبرع باللون الأخضر (شريط المقياس = 1000 نانومتر) والمتقبل باللون الأحمر. كان المتبرع متحمسا عند 532 نانومتر باستخدام الليزر. المتقبل متحمس من قبل FRET من المتبرع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: آثار كثافة المتبرع (الأخضر) والمتقبل (الأحمر) المسمى mGluR2. (A) رسم كاريكاتوري يوضح ديناميكيات المستقبلات والتغير في المسافة بين تحقيقات FRET. (ب) حالة FRET عالية طويلة العمر. (ج) حالات FRET متعددة مع التبييض الضوئي المتقبل أولا يليه التبييض الضوئي للمانحين. (د) حالة FRET قصيرة الأجل مع التبييض الضوئي المتقبل. (ه) حالة FRET مستقرة طويلة العمر مع التبييض الضوئي المتقبل. وقد استنسخ هذا الرقم بأقل قدر من التعديل من Liauw et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحديد الحالة التكوينية . (أ) تتبع FRET التمثيلي مع تراكب مناسب مثالي (أحمر) إلى جانب إشارة المتبرع والمستقبل المقابلة. (ب) خريطة حرارية لكثافة الانتقال تسلط الضوء على التحولات التوافقية الأكثر شيوعا التي يمر بها 548UAA. تشير الخطوط المتقطعة إلى حالات FRET. (ج) متوسط أوقات الإقامة في كل حالة توافقية. وقد استنسخ هذا الرقم مع إدخال حد أدنى من التعديل من Liauw et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: يكشف FRET أحادي الجزيء عن أربع حالات توافقية ل mGluR2 CRD . (A) إطار تمثيلي من فيلم أحادي الجزيء مع قناة مانحة (Cy3) على اليسار وقناة المستقبل (Cy5) على اليمين. يشار إلى الجزيئات المختارة بواسطة برنامج التحليل للمعالجة النهائية بواسطة الدوائر الخضراء. شريط المقياس = 3 ميكرومتر (B) مثال على آثار زمنية أحادية الجزيء ل 548UAA بتركيزات مختلفة من الغلوتامات. يتم عرض كثافة المتبرع (الأخضر) والمتقبل (الأحمر) و FRET المقابل (الأزرق). تمثل الخطوط المتقطعة أربع حالات متميزة من FRET. (ج) المدرج التكراري لسكان smFRET في مجموعة من تركيزات الغلوتامات. تمثل البيانات متوسط ± SEM. من N = 3 تجارب مستقلة. وقد استنسخ هذا الرقم مع إدخال حد أدنى من التعديل من Liauw et al.11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: ملخص البروتوكول العام . (أ) سير العمل لزراعة ووضع العلامات على الخلايا التي تعبر عن بروتين يحتوي على حمض أميني غير طبيعي. (ب) سير عمل تجريبي وتحليلي ل FRET أحادي الجزيء يستخدم لتحديد الحالات التوافقية وتوصيف الخصائص الديناميكية لمجال CRD في mGluR2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مكون | الحجم/التفاعل (ميكرولتر) |
| انخفاض متوسط المصل | 100 |
| كاشف النقل | 4.4 |
| مكون | الحجم/التفاعل (ميكرولتر) |
| انخفاض متوسط المصل | 100 |
| ص3000 | 4 |
| اسم البناء/المكون | التركيز (نانوغرام/ميكرولتر) | حجم / بئر (12 بئر) (ميكرولتر) | ويلز (#) | الحمض النووي المضاف (ميكرولتر) |
| tRNA / synthetase | 1000 | 1 | 1 | 1 |
| كودون العنبر يحتوي على البروتين | 1000 | 1 | 1 | 1 |
الجدول 1: كواشف نقل خلية HEK 293 T.
| الكواشف | حجم لإضافة (ميكرولتر) | الأسهم المخروطية (ملليمتر) | النهائي كونك (ملليمتر) |
| 1x RB | 655.5 | ||
| BTTES | 10.5 | 50 | 0.75 |
| كوسو 4 | 5.25 | 20 | 0.15 |
| ناسك | 17.5 | 100 | 2.5 |
| أمينو جي | 8.75 | 100 | 1.25 |
| Cy3-Alkyne (10 mM) | 1.25 | 10 | 0.018 |
| Cy5-ألكين (10 ملليمتر) | 1.25 | 10 | 0.018 |
الجدول 2: تكوين حل وضع العلامات (انقر فوق الكيمياء).
الملف التكميلي 1: تكوين المخازن المؤقتة المختلفة المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GPCRs هي بروتينات تعمل على غشاء الخلية لبدء نقل الإشارة. ويتألف العديد من المحافل العالمية للإبلاغ من مجالات متعددة، وتعتمد الإشارات على التفاعل التعاوني بين المجالات. لتعديل خصائص مستقبلات الغشاء هذه ، من الضروري فهم السلوك الديناميكي للمجالات المتعددة. نقل طاقة الرنين الفلوري أحادي الجزيء (smFRET) هو تقنية تألق تمكن من قياس تشوه البروتين وديناميكياته في الوقت الفعلي11,32. هنا ، يتم وصف نهج يجمع بين smFret ، وسحب جزيء واحد لأسفل (SiMPull) ، والفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) لتصور مباشرة إعادة ترتيب البروتينات الفردية المجمدة على سطح مخمل5،11،33. FRET حساس للغاية للمسافة ويعمل بفعالية كمسطرة نانوية مناسبة للتحقيق في التغيرات داخل الجزيئات (3-8 نانومتر). بالمقارنة مع النهج الفيزيائية الحيوية التقليدية ، فإن smFRET مناسب بشكل خاص لدراسة الديناميكيات التوافقية الكبيرة على نطاق زمني ~ 10 مللي ثانية ويتطلب حجم عينة صغير (حوالي 1 fmole لكل تجربة). وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من القياسات الجماعية للديناميات التوافقية، مثل تلك التي يوفرها الرنين المغناطيسي النووي (NMR)34 أو التحليل الطيفي للرنين الإلكتروني الإلكتروني المزدوج (DEER)35، يسمح smFRET بالتعيين الصريح لكل من الحالات التوافقية وترتيبها الزمني، فضلا عن الكشف المباشر عن الحالات الوسيطة النادرة والعابرة.
في الوقت الحالي ، تشكل قيود وضع العلامات الفلورية الخاصة بالموقع تحديا تقنيا يمنع التطبيق الأوسع ل smFRET لدراسة ديناميكيات التشكيل للبروتينات. علاوة على ذلك ، من الصعب تنقية بروتينات الغشاء بكميات كبيرة والحفاظ على نشاطها. تستخدم استراتيجيات وضع العلامات الشائعة علامات بروتين كبيرة أو تتطلب توليد الحد الأدنى من طفرات السيستين ، وغالبا ما تقصر اقتران الفلوروفور على تيرميني البروتينات التي لا تحتوي على بقايا سيستين مكشوفة. للتحايل على هذه القيود ، تم تكييف وتحسين استراتيجية دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية (UAA) ، مما يسمح بوضع علامات غير مزعجة خاصة بالبقايا باستخدام تفاعل نقر محفز بالنحاس11،12،14. تتيح هذه الاستراتيجية اقتران الفلوروفورات في جميع أنحاء المناطق المعرضة للمذيبات في مستقبل الغشاء وتمكن من توليد مجموعة أوسع من أجهزة الاستشعار التطابقية. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام نوع واحد من كيمياء الاقتران. وينتج عن ذلك مجموعات سكانية من المانحين والمتبرعين والمتقبلين والمتقبلين فقط، والتي يتم حذفها أثناء التحليل النهائي. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام استراتيجيتين متعامدتين لوضع العلامات لتجنب ذلك أو التغلب على عدم التجانس المحتمل عندما يكون البروتين محل الاهتمام غير متماثل.
يساعد الالتقاط المباشر للبروتين على تجاوز خطوات التنقية التقليدية التي تستغرق وقتا طويلا وتمثل تحديا تقنيا. نظرا للسمية الخلوية للنحاس ، يتم أيضا استخدام كيمياء النقر الخالية من النحاس على أساس عبر السيكلوكتان36 أو ميثيل تيترازين37 . ومع ذلك ، فإن هذه الكواشف باهظة الثمن ، وتؤدي الطبيعة غير المحددة38 للتفاعل إلى انخفاض إنتاجية البروتين الموسوم بالفلورسنت.
تم تقديم إرشادات شاملة لتجارب smFRET في المختبر ، بدءا من إعداد غرفة التدفق إلى تحليل البيانات ، هنا. تم جمع بيانات smFRET باستخدام إعداد TIRF ، وتم إجراء التحليل باستخدام رمز MATLAB مكتوب خصيصا.
وينبغي ملاحظة بعض الاعتبارات الرئيسية. أولا ، يجب على المرء إعداد السطح المخمل PEG ليكون متجانسا وأقل كثافة مع البيوتين-PEG. قد يؤدي البيوتين-PEG الزائد إلى سحب البروتين المفرط ، مما يجعل من الصعب حل إشارات الفلورسنت من الجزيئات الفردية. ثانيا ، يجب تخفيف عينة البروتين (supernatant محلل الخلية) تماما قبل إضافتها إلى غرفة العينة لتجنب التشبع السطحي. يعتمد إنتاج البروتين على كثافة الخلية والمنظفات المفضلة وتركيز المنظفات. لتحسين عدد أزواج المتبرعين والمستقبلين الفرديين ، يجب على المرء استهداف كثافة ~ 400 جزيء في مجال رؤية 256 × 512 بكسل. ثالثا ، يجب تخزين المخزن المؤقت Trolox عند -20 درجة مئوية للاستخدام على المدى الطويل (أشهر). يبقى المخزن المؤقت Trolox مستقرا لمدة 2 أسابيع عند تخزينه عند 4 درجات مئوية. أخيرا ، يجب الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في غرفة التدفق بعد التشغيل الوظيفي مع الجسم المضاد. سيؤدي تجفيف غرفة التدفق إلى انخفاض كفاءة تجميد البروتين وتمسخ عينة البروتين.
تم فحص الديناميكيات التوافقية لمستشعر mGluR2 الموصوف هنا بنجاح على مستوى المستقبل الفردي باستخدام smFRET وقدمت نظرة ثاقبة على آلية تنشيط المستقبلات. تم العثور على CRD لإظهار مستوى عال من الديناميكيات الجوهرية ، الموجودة في توازن بين أربع حالات FRET متطابقة بغض النظر عن وجود أو عدم وجود الغلوتامات. وقد تبين أن التحول نحو حالات FRET أعلى أو مستقبل أكثر إحكاما يحدث بطريقة تعتمد على تركيز الغلوتامات (الشكل 6). ومن المثير للاهتمام ، حتى عند مستويات التشبع من الغلوتامات ، ظل CRD ديناميكيا. الطريقة المعروضة هنا (ملخصة في الشكل 7) لفهم الديناميكيات التوافقية قابلة للتطبيق على GPCRs الأخرى من الفئة C ، وكذلك البروتينات الغشائية الأخرى مثل القنوات الأيونية ، والمستقبلات الأيونية ، ومستقبلات التيروزين كيناز (RTKs) 32,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبر رضا فابابخش على المناقشات. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01GM140272 (إلى R.V.) ، وصندوق سيرل للقيادة لعلوم الحياة في جامعة نورث وسترن ، ومن قبل اتحاد شيكاغو الطبي الحيوي بدعم من صناديق سيرل في صندوق شيكاغو المجتمعي (إلى R.V). تم دعم B.W.L. من قبل منحة التدريب T32GM-008061 من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
