Summary
本研究提出了一种详细的程序，通过非天然氨基酸（UAA）掺入 使用 位点特异性标记对G蛋白偶联受体（GPCR）进行单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验。该协议为 smFRET 样品制备、实验和数据分析提供了分步指南。
Abstract
细胞对外部信号做出反应的能力对于细胞发育、生长和存活至关重要。为了响应来自环境的信号，细胞必须能够识别和处理它。这项任务主要依靠膜受体的功能，膜受体的作用是将信号转化为细胞的生化语言。G蛋白偶联受体（GPCR）是人类最大的膜受体蛋白家族。在GPCR中，代谢性谷氨酸受体（mGluR）是一个独特的亚类，其功能是专性二聚体，并具有包含配体结合位点的大细胞外结构域。mGluR结构研究的最新进展提高了对其活化过程的理解。然而，在激活和调制过程中通过mGluR传播大规模构象变化知之甚少。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种在单蛋白水平上可视化和量化生物分子结构动力学的强大技术。为了可视化mGluR2活化的动态过程，开发了基于非天然氨基酸（UAA）掺入的荧光构象传感器，该传感器允许位点特异性蛋白质标记而不会干扰受体的天然结构。此处描述的协议解释了如何执行这些实验，包括新型UAA标记方法，样品制备以及smFRET数据采集和分析。这些策略是可推广的，可以扩展到研究各种膜蛋白的构象动力学。
Introduction
跨质膜的信息传递在很大程度上取决于膜受体的功能1。配体与受体结合导致构象变化和受体活化。这个过程在本质上通常是变构的2.G蛋白偶联受体（GPCR）拥有800多个成员，是人类最大的膜受体家族3。由于其在几乎所有细胞过程中的作用，GPCR已成为治疗开发的重要靶标。在GPCR信号传导的典型模型中，激动剂激活导致受体的构象变化，随后通过在Gα的核苷酸结合口袋中将GDP交换为GTP来激活异源三聚体G蛋白复合物。活化的Gα-GTP和Gβγ亚基然后控制下游效应蛋白的活性并传播信号级联4，5。这种信号传导过程基本上取决于配体改变受体三维形状的能力。对配体如何实现这一目标的机制理解对于开发新疗法和设计合成受体和传感器至关重要。
代谢性谷氨酸受体（mGluRs）是C类GPCR家族的成员，对于谷氨酸的缓慢神经调节作用和调节神经元兴奋性很重要6，7。在所有GPCR中，C类GPCR在结构上是独一无二的，因为它们作为专性二聚体起作用。mGluR包含三个结构域：金星捕蝇器（VFT）结构域，富含半胱氨酸的结构域（CRD）和跨膜结构域（TMD）8。活化过程中的构象变化是复杂的，涉及在12 nm距离上传播的局部和全局构象耦合，以及二聚体的协同性。中间构象、状态的时间顺序和状态之间的转换速率是未知的。通过实时跟踪单个受体的构象，可以识别瞬时中间状态和激活过程中构象变化的序列。这可以通过应用单分子荧光共振能量转移9，10（smFRET）来实现，就像最近应用于可视化mGluR211活化过程中构象变化的传播一样。FRET实验的一个关键步骤是通过将供体和受体荧光团插入目标蛋白质的位点特异性插入来生成FRET传感器。采用非天然氨基酸（UAA）掺入策略12，13，14，15，以克服典型的位点特异性荧光标记技术的局限性，该技术需要创建无半胱氨酸突变体或插入大型基因编码标签。这允许观察到基本的致密变构接头的构象重排，该接头连接了mGluR2的配体结合和信号结构域。在该协议中，提供了在mGluR2上进行smFRET实验的分步指南，包括使用UAA对mGluR2进行位点特异性标记以使用铜催化叠氮化物环化反应附着荧光团的方法。此外，该协议描述了直接捕获膜蛋白和数据分析的方法。此处概述的方案也适用于研究其他膜蛋白的构象动力学。
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Protocol
该协议的整体工作流程如图 1 所示。
1. 样品室的准备
- 玻片和盖玻片清洁
注意：这些步骤旨在清洁载玻片的表面以及盖玻片，并为氨基硅烷化做好准备。对表面束缚分子进行单分子荧光实验的一个关键要求是钝化表面。最可靠和可重复的钝化技术涉及将惰性聚合物链作为致密层共价附着到玻璃表面。聚乙二醇（PEG）是用于表面钝化的最有效聚合物16。使用PEG（聚乙二醇化）的钝化程序的详细信息如下所述：- 用记号笔标记要在载玻片上钻的孔（相距~6毫米，远离边缘）。使用Dremel在载玻片上钻小孔（直径1毫米）。在钻孔过程中将滑块浸入水中。
- 用丙酮清洗载玻片以去除记号笔上的残留墨水。
- 从丙酮中取出并用水冲洗载玻片，然后在水中以高功率（700 W）微波5分钟。
- 用水清洁载玻片，然后将其放入玻璃染色罐中进行超声处理。将盖玻片放入不同的染色罐中。
- 在23°C的浴超声仪中用丙酮超声处理载玻片和盖玻片30分钟。
- 同时，清洁玻璃烧瓶以制备下一步中使用的氨基硅烷化溶液。用1M KOH填充烧瓶，超声处理烧瓶30分钟，用水彻底冲洗出KOH，然后在甲醇中再超声处理30分钟。将烧瓶留在甲醇中，直到氨基硅烷化步骤的时间。
- 同时，从冰箱（-20°C）中取出氨基硅烷，mPEG和生物素-PEG，并让它们在黑暗中达到室温（RT）。
- 将载玻片和盖玻片罐中的丙酮丢弃在适当的化学废物容器中，用水彻底冲洗，然后在5M KOH中超声处理载玻片30分钟。
- 用水冲洗载玻片和盖玻片，然后在甲醇中超声处理2分钟（重复两次）。将罐子装满甲醇，直到氨基硅烷化步骤。
注意：在本研究中，除非另有说明，否则使用去离子水。使用在23°C下工作的浴超声仪。
- 氨基硅烷化
注意：此步骤旨在将氨基硅烷共价连接到干净的载玻片和盖玻片表面。功能化的mPEG和生物素-PEG将在下一步中共价结合到该表面。- 在干净的烧瓶中制备氨基硅烷化混合物（步骤1.6）。通过混合甲醇（150 mL）、乙酸（7.5 mL，使用玻璃移液管）和氨基硅烷（2.5 mL）制备溶液。
- 在化学通风橱中轻轻混合溶液，然后将其倒入载玻片和盖玻片罐中。盖玻片使用 50 mL，载玻片使用 100 mL。确保载玻片和盖玻片完全浸入溶液中。
- 孵育10分钟，然后将罐子超声处理1分钟（超声处理去除表面的杂质），再孵育10分钟。
- 将氨基硅烷化溶液丢弃在废物收集容器中。向罐子中加入甲醇，盖上盖子的罐子，用手轻轻摇晃。处理甲醇，并在罐子里装满水。
- 将氨基硅烷瓶放回冰箱（-20°C）。
- 聚乙二醇化
注意：这些步骤描述了聚乙二醇化过程。- 在氨基硅烷化过程中，制备聚乙二醇化缓冲液。称取 84 毫克碳酸氢钠 （NaHCO3），并将其加入 10 mL 水 （10 mM） 中。此外，称量mPEG和生物素-PEG并将它们放在一边。对于六张载玻片和盖玻片，使用96毫克mPEG和1.2-2.4毫克生物素-PEG。
注意：重要的是不要添加太多的生物素-PEG，因为它会增加背景斑点的数量。在应用于载玻片之前不要溶解PEG混合物。 - 用水冲洗载玻片，用温和的空气吹干，然后将它们放入加湿的组装盒中。
注意：使用清洁的航空公司至关重要。避免使用压缩罐装空气，这会在玻璃上留下残留物。 - 将聚乙二醇化缓冲液加入PEG粉末混合物中，轻轻上下移液多次以使其溶解。每张载玻片加入 55 μL 聚乙二醇化缓冲液（对于 6 张玻片，加入 330 μL 聚乙二醇化缓冲液）。
- 在23°C下以9，600× g 离心1分钟以沉淀未溶解的颗粒。收集上清液以在下一步中使用。
注意：由于NHS组的存在，生物素-PEG水解迅速。快速完成混合和离心步骤非常重要。 - 将 60 μL 聚乙二醇化溶液涂在每张载玻片上，然后将盖玻片放在顶部，使聚乙二醇化溶液夹在载玻片和盖玻片之间。
注意：避免在载玻片和盖玻片之间引入气泡，因为这会降低钝化效率。通过用移液管吸头调整盖玻片和载玻片来去除任何气泡。 - 将载玻片放在平坦而黑暗的抽屉中。载玻片可以存放过夜;然而，孵育4-6小时导致最佳钝化。
注意：必须记住哪一面是聚乙二醇化的。 - 储存前标记非聚乙二醇化的一面。孵育后，轻轻拆卸并用水彻底冲洗载玻片和盖玻片
- 通过吹风擦干载玻片和盖玻片。将载玻片和盖玻片放在无菌管（50 mL）中，聚乙二醇化表面彼此背对。储存在-20°C直至实验当天。
注意：最好在准备后 4 周内使用载玻片和盖玻片。聚乙二醇化表面应彼此背对。将聚乙二醇化玻片和盖玻片存放在真空密封袋中可以延长其保质期。
- 在氨基硅烷化过程中，制备聚乙二醇化缓冲液。称取 84 毫克碳酸氢钠 （NaHCO3），并将其加入 10 mL 水 （10 mM） 中。此外，称量mPEG和生物素-PEG并将它们放在一边。对于六张载玻片和盖玻片，使用96毫克mPEG和1.2-2.4毫克生物素-PEG。
2. mGluR2表达，掺入非天然氨基酸，荧光标记和提取
注意：本协议概述了表达含有UAA 4-叠氮基-L-苯丙氨酸（AZP）的mGluR2的细胞的制备，试剂和处理。该程序适用于在18毫米玻璃盖玻片上生长的HEK293T细胞。该过程可以根据需要扩大规模。
- 播种
注意：将HEK293T细胞维持在补充有10%（v / v）胎牛血清，100单位·mL−1 青霉素链霉素和15mM HEPES缓冲液（补充文件1）（pH 7.4）的DMEM中，在37°C下，在5%CO2下。- 用0.05%胰蛋白酶-EDTA传代细胞。将HEK293T细胞接种在聚-L/D-赖氨酸（PLL/PDL）玻璃盖玻片上，使其在转染期间达到≥80%汇合度。
- 转染
- 在0.1M NaOH中制备40 mM的AZP储备溶液。
- 制备补充 AZP 的培养基用于生长细胞和 mGluR2 表达。使用40 mM AZP储备溶液补充标准培养基（+FBS，笔/链球菌，15 mM HEPES）。将最终AZP浓度降至0.6 mM。加入1 M HEPES溶液（添加40 mM AZP储备溶液体积的一半）。例如，要制备 10 mL AZP 补充培养基，请混合 9.775 mL 标准培养基、150 μL 40 mM AZP 储备溶液和 75 μL 1 M HEPES 溶液。
- 使用注射器过滤器（0.2μm，PES）过滤（灭菌）培养基。
- 转染前，将标准培养基更换为含有AZP补充培养基的培养基。
注：更换介质时注意不要使细胞干燥。 - 按照制造商手册用转染试剂（材料表）转染细胞。使用总共 2 μg DNA（1000 ng tRNA/合成酶 + 1000 ng 含琥珀色密码子的蛋白质质粒）在 18 mm 盖玻片上转染 HEK293T 细胞。有关所用成分的浓度和体积，请参阅 表1 。
- 转染后24小时更换培养基至新鲜的AZP补充培养基，并让细胞再生长24小时。
- 用炔烃菁染料标记
- 标记前20分钟，用温热（37°C）记录缓冲液（RB）（补充文件1）洗涤盖玻片两次，并将它们移动到没有AZP（+ FBS，笔/链球菌，15mM HEPES）的温热（37°C）标准培养基中。
- 制备含有Cy3-炔烃，Cy5-炔烃，BTTES，硫酸铜（II）（CuSO4），（+）L-抗坏血酸钠和氨基胍的标记溶液。
- 按照制作和添加溶液的顺序（表2）：
- 准备 50 mM BTTES。
- 准备100 mM氨基胍。
- 准备100mM抗坏血酸钠。
- 准备 655.5 μL RB。
- 将 Cy3/Cy5 炔烃染料（DMSO 储备液中的 10 mM）添加到 RB 中。
注意：将氨基胍添加到RB中。 - 准备 20 mM 铜4.
- 在新管中混合CuSO4和BTTES（溶液将变成蓝色）。
- 将CuSO4和BTTES混合物添加到RB（2.3.3.6）中。
- 加入钠抗坏血酸。
- 按照下面 表 2 中给出的体积进行 18 mm 盖玻片。
- 彻底混合溶液，在标记细胞之前在冰上和黑暗中孵育10分钟。
- 在将标签溶液添加到盖玻片之前，取出培养基并用RB洗涤。加入标记溶液，并在黑暗条件下在37°C孵育15分钟。
- 注意：为了改善标记，在10分钟后加入谷氨酸（终浓度~0.5mM）并再孵育5分钟。铜对细胞毒性很大，标记反应在 体内不应持续超过15分钟。新鲜准备所有组件。最后加入抗坏血酸钠。制备时将反应保持在 4°C。然而，在加入标记溶液后，细胞应储存在培养箱内的37°C。
- 收获细胞并提取蛋白质（细胞裂解）
- 取出标记溶液，用RB洗涤含有mGluR2转染细胞的盖玻片（18mm）。
- 使用移液管将细胞从盖玻片上洗掉并重悬于RB（1 mL）中。
注意：在此之后，尽可能减少样品暴露在光线下。 - 通过在4°C下以1，000× g 旋转5分钟来沉淀细胞并除去上清液。将细胞沉淀重悬于80-130μL裂解液中。
注意：细胞沉淀应该是肉眼可见的。裂解体积取决于标记和洗涤过程中损失的样品量。 - 通过移液轻轻混合以分解沉淀。用箔纸包裹，并在4°C下放在摇杆上0.5-1小时以裂解细胞。
- 通过在20，000× g 和4°C下离心20分钟来沉淀不溶性级分。将上清液转移到新鲜的冷管（含有目标荧光标记蛋白质的裂解蛋白）中，并将其储存在冰上进行实验。
3. 单分子流动室组装与功能化
- 从冰箱中取出载玻片和盖玻片，让它们在黑暗中在室温下加热（~30分钟）。
- 使用双面胶带组装腔室，方法是在载玻片和盖玻片之间夹上双面胶带。确保聚乙二醇化表面形成流动室的内部。
- 使用移液器吸头，按压盖玻片以确保胶带与盖玻片和载玻片完全接触;注意不要打破盖玻片。将环氧树脂涂在幻灯片的边缘。
注意： 不要添加太多，以免环氧树脂填充钻孔。 - 将盖玻片面朝下的流动室放在加湿的暗盒中，让环氧树脂干燥（~30分钟）。
注意：通过钻孔添加T50缓冲液（补充文件1），以防止环氧树脂在干燥期间覆盖孔（10-15μL）。 - 通过向每个泳道缓慢施用 ~40 μL，用 500 nM Neutravidin（在 T50 中稀释）孵育每个腔室泳道。
- 在室温下在潮湿的暗盒内孵育2分钟。每泳道用 ~100 μL T50 缓冲液洗涤。
- 用 20 nM 生物素化抗体11 孵育每个腔室泳道。抗体的选择取决于蛋白质上的标签。
注意：如果一抗未生物素化，则首先与生物素化的二抗孵育30分钟，然后与一抗孵育。 - 在室温下在潮湿的暗箱内孵育30分钟。每泳道用 ~200 μL T50 洗涤。
注意：确保通道在制备过程中永远不会变干。
4. 单分子缓冲液
- 特洛克斯缓冲液
注意：Trolox 缓冲液是制作成像缓冲液的起始缓冲液。缓冲液的组分取决于实验，并且可能因感兴趣的蛋白质而异。此处描述的方案中使用的缓冲液包括盐（NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2），缓冲剂（HEPES）和Trolox（pH ~7.35）。- 将 9-10 mg Trolox 溶解在 10 mL 单分子记录缓冲液中（SRB， 补充文件 1）
注意：Trolox 使缓冲液呈微酸性。在此阶段使用氢氧化钠（NaOH）溶液10M（pH 7.35）调节pH值。在卓乐完全溶解后进行精细的pH调节;然而，此时增加pH值会增加Trolox的溶解度。 - 使用台式摇杆在室温下混合溶液4-8小时（用铝箔包裹）以完全溶解Trolox。
- 检查pH值并根据需要进行调整。
- 确保 Trolox 完全溶解。用注射器过滤器对溶液进行灭菌并储存在4°C。
注意：缓冲液应在老化2-10天后使用。Trolox有助于抑制眨眼，通常用于单分子研究17。防眨眼特性来自 Trolox18 的氧化衍生物;因此，建议将其在室温下保持至少几个小时以使其成熟。此外，新鲜Trolox溶液的紫外线辐射加速了氧化过程，可用于加速Trolox缓冲液18的“老化”。
- 将 9-10 mg Trolox 溶解在 10 mL 单分子记录缓冲液中（SRB， 补充文件 1）
- 成像缓冲液配方：混合 Trolox 缓冲液 + 洗涤剂（~2 倍洗涤剂的 CMC 值）+ 4 mM 原儿茶酸 （PCA）。
注意：洗涤剂浓度保持在CMC附近，因为高洗涤剂浓度可能导致蛋白质变性增加。例如，以下混合物可以使用955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + 胆固醇 （W%， 10：1） + 40 μL 100 mM PCA 储备溶液。在这里，PCA作为一种抗氧化剂，以前用于smFRET研究19。DDM是非离子的，通常用于溶解膜蛋白20，21，并已用于单分子研究。DDM是良好的首选洗涤剂;但是，我们建议测试多种洗涤剂并确保结果一致。
5. 显微镜设置和smFRET数据采集
- 打开电脑和显微镜。打开激光器进行预热（Cy3 激发为 532 nm，Cy5 激发为 640 nm）。
注意：这里使用了配备100倍TIRF物镜（N.A. 1.49）、图像分配器和EMCCD相机的倒置显微镜。该装置配备了一个四线激光组合器、一个二向色镜、一个长通发射滤光片、一个发射二向色滤光片和一个陷波滤光片。 - 打开 EMCCD 相机并打开相机软件。等待20分钟，使相机达到-69°C并稳定下来。
- 将样品室安装在显微镜载物台上。逐渐加入蛋白质样品，以达到每个视场~400个分子（步骤2.4.5）。用 100 μL 成像缓冲液清洗腔室。
- 调整增益、采集速率和激光功率，以便在供体和受体通道中检测到单分子荧光信号。如果需要，调整样品室内蛋白质的浓度。
注意：视野中有超过 400 个分子，区分单个分子变得更加困难，背景噪声也会更高。 - 激发供体并获得时间轨迹，直到视野中至少80%的供体分子被光漂白。
- 在影片的最后，打开640nm激光直接激发受体，直到部分受体分子光漂白，有利于单分子从多聚体判别。
- 移动到不同的视野并重复上述步骤，以每个条件收集至少三部电影（技术重复）。
注意：在选择新的感兴趣区域（ROI）并进行聚焦以最大程度地减少光漂白时使用尽可能低的激光功率。注意采集过程中的载物台漂移。如果在移动到新的ROI后观察到明显的漂移，请等待3分钟，然后再开始采集。
6. 数据分析
- 供体和受体通道对齐（电影映射）
- 在供体和受体通道中记录荧光珠图像。
- 使用磁珠数据生成映射文件，以关联来自每个分子22，23的供体和受体荧光。
注意：来自单个分子的发射信号由图像分配器内的发射二向色滤光片分成供体和受体信号。供体和受体图像并排投影在相机上。为了准确地将两个区域之间单个分子的供体和受体强度联系起来，通常使用荧光珠样品生成映射文件。使用此映射文件，在供体和受体通道中检测到的所有分子都相互映射。然后，分析生成时间轨迹，即每个分子随时间推移的供体和受体强度。
- 单分子FRET迹线的选择（颗粒拾取）
注意：使用 MATLAB 检查并选择单个粒子迹线进行下游分析。确切的选择标准取决于系统。这里概述了关于什么构成优质颗粒的一般准则。所有自定义修改的代码都可以在 GitHub （https://github.com/vafabakhsh-lab） 上找到。- 选择迹线（供体+受体）的总强度随时间稳定的迹线。选择供体和受体强度具有反相关变化的迹线。
- 选择显示一步光漂白的供体和受体分子。选择长度为 >5 s 的迹线。
注意：漂白后每个通道中的背景应为零。跟踪不应具有许多闪烁事件;这将增加分析的难度。 - 使用等式E = （I A− 0.088 × I D）/（I D + [IA− 0.088 × I D]）24，25，26计算FRET效率，其中I D和IA分别是原始供体和受体强度。
注意：使用使用532 nm激光激发的仅供体标记样品26来确定供体发射到受体通道中的泄漏。泄漏校正系数 0.088 可能因所使用的过滤器组而异。重要的是要注意，FRET效率到绝对距离的定量和稳健转换需要校正供体和受体强度的多种因素，并且在27之前已经进行了广泛的讨论。
- 通过隐马尔可夫建模（HMM）识别构象状态
- 在 MATLAB 中执行 vbFRET28 程序，并为给定条件导入选定的跟踪。设置要执行的潜在状态和迭代数的约束。
注意：根据代表性结果的原始数据，假设构象传感器占据多达四个离散的FRET状态;因此，指定了一至四个国家的范围。以前确定拟合的改进在迭代 >25 次时可以忽略不计;因此，使用了25次迭代来拟合代表性数据。 - 分析 smFRET 迹线并导出理想化的迹线和分析会话。将理想化的迹线保存到单独的文件夹中，以便进行下游分析。
注意：用于从理想化迹线中提取状态转换和停留时间数据的程序在先前发表的工作29中可用。 - 使用 MATLAB 程序，提取状态转换并将其绘制为热图，其中 X 坐标表示开始构象，Y 坐标表示结束构象。
注意：转换定义为此处讨论的代表性结果中FRET值>0.1的变化。跃迁阈值取决于感兴趣的蛋白质所占据的假设构象状态（将跃迁阈值设置为小于最接近的FRET状态之间的差异），以及实验设置允许的分辨率。检查多种条件的热图可以识别传感器转换并因此占据的最常见构象状态。代表性结果确定了四种FRET状态（FRET=0.31、0.51、0.71和0.89）。 - 使用 MATLAB 程序，提取每个已识别构象状态的停留时间。指定一系列FRET值，描述数据采集过程中的每个状态和时间分辨率。FRET范围被相邻的FRET状态平均划分。导出给定处理条件下的停留时间。
注意：在大多数情况下，停留时间数据可以通过单个指数衰减函数很好地估计。该分析可以在数据分析和绘图软件中执行。
- 在 MATLAB 中执行 vbFRET28 程序，并为给定条件导入选定的跟踪。设置要执行的潜在状态和迭代数的约束。
- smFRET种群直方图的高斯拟合以量化状态占用率
- 将感兴趣条件的总体FRET直方图导入数据分析和绘图软件，以进行多个峰拟合分析。
- 指示存在的峰数（基于HMM分析的四个峰或状态）。拟合使用定义为 的
多个高斯分布30 进行，其中 A 是峰面积，xc 是峰心，w 是每个峰的峰宽。 - 将拟合参数约束为 A > 0、 xc = FRET ± 0.02 和 0.1 ≤w≤ 0.24。单个群体FRET直方图的四个FRET峰同时拟合。对所有条件的管接头应用定义的约束。
- 将占用状态（百分比）计算为感兴趣的峰值面积除以总面积，定义为所有峰值的总和。
多个高斯分布30 进行，其中 A 是峰面积，xc 是峰心，w 是每个峰的峰宽。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
基于UAA的FRET传感器的表达和荧光标记
本文讨论了在mGluR2（548UAA）的CRD内插入和荧光标记UAA（AZP）的示例性结果11。如前所述，要将AZP插入mGluR2中，工程翻译机制的共表达是必要的，其中包括修饰的tRNA合成酶和互补tRNA（pIRE4-Azi），以及使用诱变创建的在位置548处含有琥珀色密码子的mGluR2（图2A，B）。通过铜催化的环加成反应（图2C）通过铜催化的环加成反应实现AZP的标记，并导致548UAA的有效质膜标记（图2D）。为了验证全长548UAA的翻译和二聚体受体的完整性，对表达用Cy5标记的548UAA的HEK293T细胞的细胞裂解物进行了SDS-PAGE电泳。观察到250KDa的单条带，这与全长二聚体mGluR2一致（图2E）。
数据采集和分析
用Cy3（供体）和Cy5（受体）标记表达带有C端FLAG标签的548UAA的细胞，然后在蛋白酶抑制剂存在下用去垢剂31裂解以进行体外研究。通过离心完成细胞裂解和去除不溶性级分后，将上清液施用聚乙二醇（PEG）钝化盖玻片上，该盖玻片用抗FLAG标签抗体官能化，用于全内反射荧光（TIRF）成像（图3）。使用532 nm激光照射样品，并使用smCamera软件选择颗粒进行下游分析。为smCamera中的所有选定分子生成原始供体，受体和FRET迹线，并使用MATLAB进行选择（第6节;图4）。对此处使用的实验设置的受体强度应用8.8%的供体出血校正。该校正因子将随所使用的实验设置、二向色滤光片和发射滤光片而变化，应通过在标准实验条件下使用仅用供体荧光团标记的细胞测量供体和受体信号并计算渗漏（[受体强度]/[供体强度]）来确定。图4显示了几种代表性的FRET迹线以及相应的供体和受体信号。这些迹线是使用协议中先前描述的标准选择的（第6节）。图4B-D显示了显示多种状态与供体和受体漂白事件之间转换的代表性选定迹线。
构象状态的识别
为了确定548UAA占据的构象状态以及这些状态之间的关系，进行了隐马尔可夫建模（HMM）分析。HMM分析是在MATLAB28 上执行的vbFRET程序进行的（图5A）。 图5 使用来自中间谷氨酸浓度（5μM）的数据来说明状态鉴定的过程。基于原始的smFRET痕迹，假设CRD存在多达四种潜在的FRET状态。因此，国家的数量被限制在一到四个。总体而言，对每条迹线执行了 25 次拟合迭代，以确定存在的状态数。从这些理想化的拟合中，可以提取离散FRET状态之间的转换并将其绘制为过渡密度热图（图5B）。热图突出显示了 0.31、0.51、0.71 和 0.89 处的四种离散 FRET 状态，用虚线表示。转换定义为FRET>0.1的变化。理想化的FRET迹线还产生了每个已识别构象的停留时间信息（图5C）。
群体FRET直方图生成和峰值拟合
在存在不同谷氨酸浓度的情况下，548UAA的代表性单分子迹线被手动选择用于进一步分析，如图 6A，B所示。smFRET实验的一般分析是从每个实验条件的数百个smFRET迹线生成群体直方图（图6C）。群体FRET直方图是在漂白前从迹线段创建的。为避免直方图偏向较长迹线的行为，有必要在求平均值之前从每条迹线生成归一化FRET直方图。这可确保每条迹线对最终直方图的贡献相同。在该系统中，FRET直方图显示随着谷氨酸浓度的增加，FRET向更高FRET的一般转变，表明CRD之间的距离减小并向活性构象转移。然而，无论谷氨酸浓度如何，FRET信号仍然相当零星，表明CRD的内在动力学程度很高。除了向更高 FRET（颜色曲线）的一般转变外，构象系综的重新分布在直方图（颜色曲线）中变得明显。还可以看到单个分子访问这些构象状态（虚线）（图6B）。要确定状态占用的概率，必须将峰值的面积除以总面积，总面积定义为所有四个单独峰面积的总和。mGluR2 CRD 的 smFRET 实验生成的 smFRET 直方图显示四种动态状态，峰分别为 0.31、0.51、0.71 和 0.89（标记在状态 1-4）。
图 1：工作协议和数据分析的流程图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：通过点击化学对 mGluR2 进行位点特异性标记 。 （A）细胞中非天然氨基酸4-叠氮基-L-苯丙氨酸掺入过程示意图。（B）示意图显示mGluR2的位点特异性荧光标记，非天然氨基酸位于位置548，通过铜催化的叠氮化物 - 炔烃点击反应。（C）荧光标记的mGluR2（绿色供体分子，红色受体分子）的三维结构，Cy3和Cy5分子对接。 （D）表达548UAA的HEK293T细胞的代表性共聚焦显微镜图像，细胞表面群体通过点击化学用供体（绿色：Cy3）和受体（红色：Cy5）荧光团标记。比例尺 = 10 μm。 （E）来自表达548UAA的HEK293T细胞的细胞裂解物的非还原4%-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳图像，并由Cy5-炔烃标记。凝胶用633nm激发波长和670-BP30发射滤光片-泳道a：蛋白质分子量标准进行成像;泳道B：细胞裂解物;车道C：Cy5-炔烃染料。结果代表单个实验。面板 B， D和 E 从Liauw等人11中重复使用。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：smFRET 实验和显微镜设置 （TIRF） 的示意图。 供体的单分子荧光图像以绿色显示（比例尺= 1000nm），受体以红色显示。使用激光在532nm处激发供体。接受者被来自捐赠者的FRET所激发。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：标记的 mGluR2 的供体（绿色）和受体（红色）的强度曲线。 （A）显示受体动力学和FRET探针之间距离变化的卡通。（B）长寿命高FRET状态。（C）受体光漂白的多种FRET状态首先是供体光漂白。（D）短暂的FRET状态与受体光漂白。（E）具有受体光漂白的长寿命稳定FRET状态。该图由Liauw等人11稍作修改后复制。请点击此处查看此图的大图。
图5：构象状态识别 。 （A）代表性FRET迹线，理想拟合叠加（红色）以及相应的供体和受体信号。（B）过渡密度热图，突出显示548UAA经历的最常见的构象转变。虚线表示 FRET 状态。（C）每种构象状态的平均停留时间。该图由Liauw等人11稍作修改后复制。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：单分子 FRET 揭示了 mGluR2 CRD 的四种构象状态。 （A） 来自单分子电影的代表性帧，左侧是供体通道 （Cy3），右侧是受体通道 （Cy5）。分析软件选择用于下游处理的分子用绿色圆圈表示。比例尺= 3μm。 （B）548UAA在不同谷氨酸浓度下的单分子时间曲线示例。显示供体（绿色）和受体（红色）强度以及相应的FRET（蓝色）。虚线表示四种不同的 FRET状态。（C）谷氨酸浓度范围内的smFRET群体直方图。数据表示平均± SEM. N = 3 个独立实验。该图由Liauw等人11稍作修改后复制。请点击此处查看此图的大图。
图 7：整个协议的摘要 。 （A）生长和标记表达含有非天然氨基酸的蛋白质的细胞的工作流程。（B）单分子FRET实验和分析工作流程，用于识别构象状态并表征mGluR2中CRD结构域的动态特性。 请点击此处查看此图的大图。
| 元件 | 体积/反应（μL） |
| 还原血清培养基 | 100 |
| 转染试剂 | 4.4 |
| 元件 | 体积/反应（μL） |
| 还原血清培养基 | 100 |
| P3000系列 | 4 |
| 构造/组件名称 | 浓度（纳克/微升） | 体积/孔（12孔）（μL） | 井 （#） | 添加的脱氧核糖核酸（微升） |
| tRNA/合成酶 | 1000 | 1 | 1 | 1 |
| 含蛋白质的琥珀色密码子 | 1000 | 1 | 1 | 1 |
表1：用于转染HEK 293 T细胞的试剂。
| 试剂 | 添加体积（μL） | 库存浓度（月米） | 最终浓度 （月M） |
| 1x RB | 655.5 | ||
| 贝特斯 | 10.5 | 50 | 0.75 |
| 四氧化铜 | 5.25 | 20 | 0.15 |
| 纳斯克 | 17.5 | 100 | 2.5 |
| 氨基G | 8.75 | 100 | 1.25 |
| Cy3-炔烃（10毫米） | 1.25 | 10 | 0.018 |
| Cy5-炔烃（10毫米） | 1.25 | 10 | 0.018 |
表2：标记溶液的组成（点击化学）。
补充文件1：本研究中使用的各种缓冲液的组成。请点击此处下载此文件。
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Discussion
GPCR是在细胞膜上起作用以启动信号转导的蛋白质。许多GPCR由多个域组成，信令依赖于域之间的合作相互作用。为了调节这些膜受体的性质，必须了解多个结构域的动态行为。单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种荧光技术，能够实时测量蛋白质构象和动力学11，32。这里描述了一种结合smFRET，单分子下拉（SiMPull）和全内反射荧光（TIRF）显微镜以直接可视化固定在钝化表面上的单个蛋白质的重排的方法5，11，33。FRET对距离高度敏感，并有效地用作纳米级标尺，适用于探测分子内变化（3-8 nm）。与传统的生物物理方法相比，smFRET特别适合在~10 ms的时间尺度上研究大构象动力学，并且需要小样品体积（每个实验约1 fmol）。此外，与构象动力学的集成测量（例如核磁共振（NMR）34或双电子-电子共振（DEER）波谱35提供的测量相比，smFRET允许明确分配构象状态及其时间排序，以及直接检测罕见和瞬态中间态。
目前，位点特异性荧光标记的局限性带来了技术挑战，阻碍了smFRET在研究蛋白质构象动力学方面的更广泛应用。此外，很难大量纯化膜蛋白并保持其活性。常见的标记策略利用大蛋白质标签或需要产生最小的半胱氨酸突变体，通常将荧光团偶联限制在没有暴露半胱氨酸残基的蛋白质末端。为了规避这些限制，调整和优化了非天然氨基酸（UAA）掺入策略，允许使用铜催化的点击反应进行非扰动的残基特异性标记11，12，14。该策略使得在膜受体的溶剂暴露区域中偶联荧光团成为可能，并能够产生更广泛的构象传感器阵列。在该协议中，使用单一类型的偶联化学。这导致供体-供体和受体-受体仅群体，在下游分析过程中被省略。或者，当感兴趣的蛋白质不对称时，可以使用两种正交标记策略来避免这种情况或克服可能的异质性。
直接捕获蛋白质有助于绕过耗时且技术上具有挑战性的传统纯化步骤。由于铜的细胞毒性，还采用了基于反式环辛烷36 或甲基四嗪37 的无铜点击化学。然而，这些试剂价格昂贵，并且反应的非区域特异性38 性质导致目标荧光标记蛋白的产率低。
本文介绍了从流动室制备到数据分析的 体外 smFRET实验的完整指南。使用TIRF设置收集smFRET数据，并使用自定义编写的MATLAB代码进行分析。
应注意几个关键因素。首先，应用生物素-PEG制备PEG钝化表面，使其均匀且密度较低。过量的生物素-PEG可能导致蛋白质过度下拉，难以分辨来自单个分子的荧光信号。其次，蛋白质样品（细胞裂解物上清液）在加入样品室之前应彻底稀释，以避免表面饱和。蛋白质的产量取决于细胞密度、选择的去垢剂和去垢剂浓度。为了优化单个供体和受体对的数量，应该在256 x 512像素的视野中靶向~400个分子的密度。第三，Trolox缓冲液应储存在-20°C，以便长期使用（数月）。Trolox缓冲液在4°C下储存时保持稳定2周。 最后，应注意不要在与抗体功能化后将气泡引入流动室。流动室干燥将导致蛋白质固定和样品蛋白质变性效率降低。
使用smFRET在单个受体水平上成功检查了此处描述的mGluR2传感器的构象动力学，并提供了对受体激活机制的见解。发现CRD表现出高水平的内在动力学，无论是否存在谷氨酸，都存在于四种构象FRET状态之间的平衡中。向更高FRET状态或更紧凑的受体的转变被证明以谷氨酸浓度依赖性的方式发生（图6）。有趣的是，即使在谷氨酸饱和水平下，CRD仍然是动态的。这里介绍的了解构象动力学的方法（总结在 图7中）适用于其他C类GPCR，以及其他膜蛋白，例如离子通道，离子致性受体和受体酪氨酸激酶（RTK）32，39。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
我们感谢Reza Vafabakhsh实验室成员的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款R01GM140272（R.V.），西北大学Searle生命科学领导基金和芝加哥生物医学联盟的支持，并得到了芝加哥社区信托基金的Searle基金（对R.V.）的支持。B.W.L.得到了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）培训补助金T32GM-008061的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
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