Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Visualisering af konformationsdynamikken i membranreceptorer ved hjælp af enkeltmolekyle FRET

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254

Summary

Denne undersøgelse præsenterer en detaljeret procedure til udførelse af enkeltmolekyle fluorescensresonansenergioverførsel (smFRET) eksperimenter på G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) ved hjælp af stedsspecifik mærkning via unaturlig aminosyre (UAA) inkorporering. Protokollen giver en trinvis vejledning til smFRET-prøveforberedelse, eksperimenter og dataanalyse.

Abstract

Cellernes evne til at reagere på eksterne signaler er afgørende for cellulær udvikling, vækst og overlevelse. For at reagere på et signal fra miljøet skal en celle være i stand til at genkende og behandle det. Denne opgave er hovedsageligt afhængig af funktionen af membranreceptorer, hvis rolle er at konvertere signaler til cellens biokemiske sprog. G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) udgør den største familie af membranreceptorproteiner hos mennesker. Blandt GPCR'er er metabotrope glutamatreceptorer (mGluR'er) en unik underklasse, der fungerer som obligatoriske dimerer og har et stort ekstracellulært domæne, der indeholder ligandbindingsstedet. Nylige fremskridt inden for strukturelle undersøgelser af mGluR'er har forbedret forståelsen af deres aktiveringsproces. Imidlertid er udbredelsen af store konformationsændringer gennem mGluRs under aktivering og modulering dårligt forstået. Enkeltmolekyle fluorescens resonans energioverførsel (smFRET) er en kraftfuld teknik til at visualisere og kvantificere biomolekylers strukturelle dynamik på enkeltproteinniveau. For at visualisere den dynamiske proces med mGluR2-aktivering blev der udviklet fluorescerende konformationssensorer baseret på unaturlig aminosyreinkorporering (UAA), der tillod stedsspecifik proteinmærkning uden forstyrrelse af receptorernes oprindelige struktur. Protokollen, der er beskrevet her, forklarer, hvordan man udfører disse eksperimenter, herunder den nye UAA-mærkningsmetode, prøveforberedelse og smFRET-dataindsamling og -analyse. Disse strategier er generaliserbare og kan udvides til at undersøge konformationsdynamikken i en række membranproteiner.

Introduction

Overførslen af information over plasmamembranen er stærkt afhængig af funktionen af membranreceptorer1. Ligandbinding til en receptor fører til en konformationsændring og receptoraktivering. Denne proces er ofte allosterisk i naturen2. Med over 800 medlemmer er G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) den største familie af membranreceptorer hos mennesker3. På grund af deres rolle i næsten alle cellulære processer er GPCR'er blevet vigtige mål for terapeutisk udvikling. I den kanoniske model af GPCR-signalering resulterer agonistaktivering i konformationsændringer af receptoren, der efterfølgende aktiverer det heterotrimeriske G-proteinkompleks via udveksling af BNP for GTP ved nukleotidbindingslommen af Gα. De aktiverede Gα-GTP- og Gβγ-underenheder styrer derefter aktiviteten af nedstrøms effektorproteiner og udbreder signalkaskaden 4,5. Denne signalproces afhænger i det væsentlige af ligandernes evne til at ændre receptorens tredimensionelle form. En mekanistisk forståelse af, hvordan ligander opnår dette, er afgørende for at udvikle nye terapier og designe syntetiske receptorer og sensorer.

Metabotrope glutamatreceptorer (mGluR'er) er medlemmer af klasse C GPCR-familien og er vigtige for de langsomme neuromodulerende virkninger af glutamat og tuning neuronal excitabilitet 6,7. Blandt alle GPCR'er er klasse C GPCR'er strukturelt unikke, fordi de fungerer som obligatoriske dimers. mGluR'er indeholder tre strukturelle domæner: Venus flytrap (VFT) domænet, cystein-rich domain (CRD) og transmembrane domain (TMD)8. Konformationsændringerne under aktiveringsprocessen er komplekse og involverer lokal og global konformationskobling, der forplanter sig over en afstand på 12 nm samt dimer kooperativitet. De mellemliggende konformationer, den tidsmæssige rækkefølge af stater og overgangshastigheden mellem stater er ukendte. Ved at følge konformationen af individuelle receptorer i realtid er det muligt at identificere de forbigående mellemtilstande og sekvensen af konformationsændringer under aktivering. Dette kan opnås ved at anvende enkeltmolekyle fluorescens resonans energioverførsel 9,10 (smFRET), som for nylig blev anvendt til at visualisere udbredelsen af konformationsændringer under aktiveringen af mGluR2 11. Et vigtigt skridt i FRET-eksperimenter er generering af FRET-sensorer ved stedsspecifik indsættelse af donor- og acceptorfluorophorer i det pågældende protein. En unaturlig aminosyre (UAA) inkorporeringsstrategi blev vedtaget12,13,14,15 for at overvinde begrænsningerne ved typiske stedsspecifikke fluorescerende mærkningsteknologier, der kræver oprettelse af cystein-mindre mutanter eller indsættelse af et stort genetisk kodet mærke. Dette gjorde det muligt at observere den konformationelle omlejring af den essentielle kompakte allosteriske linker, som sluttede sig til ligandbindings- og signaldomænerne i mGluR2. I denne protokol præsenteres en trinvis vejledning til udførelse af smFRET-eksperimenter på mGluR2, herunder tilgangen til stedsspecifik mærkning af mGluR2 med UAA for at fastgøre fluoroforer ved hjælp af den kobberkatalyserede azidcykliseringsreaktion. Desuden beskriver denne protokol metoden til direkte indfangning af membranproteiner og dataanalyse. Protokollen skitseret her gælder også for at studere konformationsdynamikken i andre membranproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollens overordnede arbejdsgang er beskrevet i figur 1.

1. Forberedelse af prøvekammeret

  1. Rengøring af glide- og dæksel
    BEMÆRK: Disse trin sigter mod at rense overfladerne på diasene såvel som dækslikkerne og forberede dem til aminosilanisering. Et kritisk krav til udførelse af enkeltmolekyle fluorescenseksperimenter på overfladebundne molekyler er en passiveret overflade. Den mest pålidelige og reproducerbare passiveringsteknik involverer kovalent fastgørelse af inerte polymerkæder til glasoverfladen som et tæt lag. Polyethylenglycol (PEG) er den mest effektive polymer, der anvendes til overfladepassivering16. Detaljerne i passiveringsproceduren ved hjælp af PEG (PEGylation) er beskrevet nedenfor:
    1. Marker huller, der skal bores på diasene med en markør (~ 6 mm fra hinanden og væk fra kanten). Brug en Dremel til at bore små huller (1 mm i diameter) på glasbeholderen. Nedsænk rutsjebanerne i vand under boreprocessen.
    2. Vask diasene med acetone for at fjerne resterende blæk fra markøren.
    3. Fjern dem fra acetone og skyl diasene med vand, og mikrobølge dem derefter i 5 minutter i vand ved høj effekt (700 W).
    4. Rengør diasene med vand, før du lægger dem i en glasmosaik, der skal sonikeres. Læg dækslerne i en anden farvebeholder.
    5. Soniker diasene og dækslerne i acetone i 30 minutter i en badesonikator ved 23 °C.
    6. I mellemtiden skal du rengøre en glaskolbe til fremstilling af aminosilaniseringsopløsningen, der anvendes under næste trin. Fyld kolben med 1 M KOH, soniker kolben i 30 min, skyl KOH grundigt ud med vand, og soniker derefter i yderligere 30 minutter i methanol. Kolben efterlades i methanol indtil tidspunktet for aminosilaniseringstrinnet.
    7. I mellemtiden skal du fjerne aminosilan, mPEG og biotin-PEG fra fryseren (-20 °C) og lade dem komme til stuetemperatur (RT) i mørke.
    8. Bortskaf acetone fra rutsjebanen og dækslipglas i den passende kemiske affaldsbeholder, skyl grundigt med vand, og soniker derefter diasene i 5 M KOH i 30 minutter.
    9. Skyl dias og dæksler med vand, og soniker derefter i methanol i 2 minutter (gentag to gange). Lad glassene være fyldt med methanol indtil aminosilaniseringstrinnet.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse anvendes deioniseret vand, medmindre andet er angivet. Der anvendes en badesonikator, der arbejder ved 23 °C.
  2. Aminosilanisering
    BEMÆRK: Dette trin sigter mod kovalent at forbinde aminosilan til den rene glide- og dækslipoverflade. Funktionaliseret mPEG og biotin-PEG vil kovalent binde til denne overflade i det næste trin.
    1. Der fremstilles en aminosilaniseringsblanding i en ren kolbe (trin 1.6). Forbered opløsningen ved at blande methanol (150 ml), eddikesyre (7,5 ml, brug glaspipette) og aminosilan (2,5 ml).
    2. Bland opløsningen forsigtigt i den kemiske røghætte, hæld den derefter i glideren og dækslet. Brug 50 ml til dækslikkerne og 100 ml til diasene. Sørg for, at dias og dækslips er helt nedsænket i løsningen.
    3. Inkuber i 10 min, soniker derefter glassene i 1 min (sonikering fjerner urenhederne fra overfladen) og inkuberes i yderligere 10 min.
    4. Bortskaf aminosilaniseringsopløsning i affaldsindsamlingsbeholderen. Tilsæt methanol til glassene, luk glassene med låg, og ryst forsigtigt i hånden. Bortskaf methanolen, og fyld krukkerne med vand.
    5. Aminosilanflasken returneres til fryseren (-20 °C).
  3. PEGylation
    BEMÆRK: Disse trin beskriver PEGylation-proceduren.
    1. Under aminosilanisering skal du forberede pegylationsbufferen. Vej 84 mg natriumbicarbonat (NaHCO3) og tilsæt det til 10 ml vand (10 mM). Derudover skal du veje mPEG og biotin-PEG og sætte dem til side. Til seks dias og coverslips, brug 96 mg mPEG og 1,2-2,4 mg biotin-PEG.
      BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at tilføje for meget biotin-PEG, da det kan øge antallet af baggrundspletter. Opløs ikke PEG-blandingen, før den er påført lige før påføring på dias.
    2. Skyl diasene med vand, tør dem med et blidt luftblæsning, og læg dem derefter i de befugtede samlekasser.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge et rent flyselskab. Undgå at bruge trykluft på dåse, som kan efterlade rester på glasset.
    3. Tilsæt pegyleringsbuffer til PEG-pulverblandingen og pipetter forsigtigt op og ned flere gange for at opløses. Tilføj 55 μL pegylationsbuffer pr. dias (for seks dias tilføjes 330 μL pegylationsbuffer).
    4. Der centrifugeres ved 9.600 x g i 1 minut ved 23 °C for at udfælde uopløste partikler. Saml supernatanten til brug i næste trin.
      BEMÆRK: Biotin-PEG hydrolyserer hurtigt på grund af tilstedeværelsen af NHS-gruppen. Det er vigtigt at gøre blandings- og centrifugeringstrinnene hurtigt.
    5. Påfør 60 μL PEGylation-opløsning på hvert dias, og placer derefter dækslippet ovenpå, så PEGylation-opløsningen er klemt mellem diaset og dækslippet.
      BEMÆRK: Undgå at indføre bobler mellem glideren og dækslip, da dette vil reducere passiveringseffektiviteten. Fjern eventuelle bobler ved at justere dækslikket og glideren med en pipetspids.
    6. Placer diasene i en skuffe, der er flad og mørk. Dias kan gemmes natten over; inkubation i 4-6 timer resulterer dog i optimal passivering.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at huske, hvilken side der er pegyleret.
    7. Marker den ikke-pegylerede side før opbevaring. Efter inkubation adskilles forsigtigt og skylles gliderne og dækslynges grundigt med vand
    8. Tør dias og dæksler ved at blæse luft. Opbevar dias og dæksler i et sterilt rør (50 ml), hvor PEGylated-overfladen vender væk fra hinanden. Opbevares ved -20 °C indtil forsøgsdagen.
      BEMÆRK: Det er bedst at bruge dias og coverslips inden for 4 uger efter forberedelsen. De PEGylerede overflader skal vende væk fra hinanden. Opbevaring af PEGylated dias og coverslips i vakuumforseglede poser kan øge deres holdbarhed.

2. mGluR2-ekspression med inkorporeret unaturlig aminosyre, fluorescerende mærkning og ekstraktion

BEMÆRK: Denne protokol skitserer præparation, reagenser og behandling af celler til ekspression af mGluR2 indeholdende UAA 4-azido-L-phenylalanin (AZP). Proceduren er for HEK293T-celler dyrket på 18 mm glasdæksler. Proceduren kan skaleres op efter behov.

  1. Såning
    BEMÆRK: Oprethold HEK293T-cellerne i DMEM suppleret med 10% (v / v) føtalt bovint serum, 100 enhed · ml-1 penicillin-streptomycin og 15 mM HEPES-buffer (supplerende fil 1) (pH 7,4) ved 37 ° C under 5% CO2.
    1. Passage cellerne med 0,05% trypsin-EDTA. Frø HEK293T celler på poly-L / D-lysin (PLL / PDL) glas coverslips, så de når ≥80% sammenløb i løbet af transfektionstidspunktet.
  2. Transfektion
    1. Der fremstilles en 40 mM stamopløsning af AZP i 0,1 M NaOH.
    2. Forbered AZP-supplerede medier til dyrkning af celler og mGluR2-ekspression. Suppler standardmedier (+ FBS, pen/strep, 15 mM HEPES) ved hjælp af 40 mM AZP-stamopløsning. Den endelige AZP-koncentration bringes op på 0,6 mM. Der tilsættes 1 M HEPES-opløsning (halvdelen af volumenet af 40 mM AZP-stamopløsning tilsat). For eksempel for at forberede 10 ml AZP suppleret medie kombineres 9.775 ml standardmedier, 150 μL 40 mM AZP-stamopløsning og 75 μL 1 M HEPES-opløsning.
    3. Filtrer (steriliser) mediet ved hjælp af et sprøjtefilter (0,2 μm, PES).
    4. Udskift standardmediet med medier, der indeholder AZP-supplerede medier før transfektion.
      BEMÆRK: Pas på ikke at tørre cellerne under udskiftning af mediet.
    5. Transficer cellerne med transfektionsreagens (materialetabel) i henhold til producentens manual. Transfict HEK293T-celler på en 18 mm dækslip ved hjælp af i alt 2 μg DNA (1000 ng tRNA / syntetase + 1000 ng ravkodonholdigt proteinplasmid). Der henvises til tabel 1 for koncentrationen og mængden af anvendte komponenter.
    6. Skift mediet 24 timer efter transfektion til friske AZP-supplerede medier, og lad cellerne vokse i yderligere 24 timer.
  3. Mærkning med alkyn cyanin farvestoffer
    1. 20 minutter før mærkning vaskes coversedlerne med varm (37 °C) optagebuffer (RB) (supplerende fil 1) to gange, og de flyttes til varme (37 °C) standardmedier uden AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Forbered mærkningsopløsningen indeholdende Cy3-alkyn, Cy5-alkyn, BTTES, kobber (II) sulfat (CuSO4), (+) natrium L-ascorbat og aminoguanidin.
    3. Følg rækkefølgen for fremstilling og tilføjelse af løsninger (tabel 2):
      1. Forbered 50 mM BTTES.
      2. Forbered 100 mM aminoguanidin.
      3. Forbered 100 mM Na-ascorbate.
      4. Forbered 655,5 μL RB.
      5. Tilsæt Cy3/Cy5 alkynfarvestof (10 mM i DMSO-lager) til RB.
        BEMÆRK: Tilsæt aminoguanidin til RB.
      6. Forbered 20 mM CuSO4.
      7. Bland CuSO4 og BTTES i et nyt rør (opløsningen bliver blå).
      8. CuSO4- og BTTES-blandingen tilsættes RB (2.3.3.6.)
      9. Tilføj Na-Ascorbate.
      10. Følg lydstyrken i tabel 2 nedenfor for en 18 mm dækslip.
    4. Bland opløsningen grundigt og inkuber på is og i mørke i 10 minutter før mærkning af celler.
    5. Før du tilføjer mærkningsopløsningen til dækslerne, skal du fjerne mediet og vaske dem med RB. Tilsæt mærkningsopløsningen og inkuber i 15 minutter ved 37 °C under mørke forhold.
    6. BEMÆRK: For at forbedre mærkningen tilsættes glutamat (endelig koncentration ~ 0,5 mM) efter 10 minutter og inkuberes i yderligere 5 minutter. Kobber er meget giftigt for cellerne, og mærkningsreaktionen bør ikke fortsætte i mere end 15 minutter in vivo. Forbered alle komponenterne friske. Tilføj Na-Ascorbate sidst. Hold reaktionen ved 4 °C under forberedelsen. Ved tilsætning af mærkningsopløsning skal cellerne imidlertid opbevares ved 37 °C inde i inkubatoren.
  4. Høstning af cellerne og ekstraktion af proteinerne (cellelyse)
    1. Mærkningsopløsningen fjernes, og dækslippet (18 mm) indeholdende de mGluR2-transinficerede celler vaskes to gange med RB.
    2. Brug en pipet til at vaske cellerne af dækslippet og resuspendere i RB (1 ml).
      BEMÆRK: Minimer prøvens eksponering for lys så meget som muligt efter dette punkt.
    3. Pellets cellerne ved at dreje ved 1.000 x g ved 4 °C i 5 minutter, og supernatanten fjernes. Cellepelleten gensuspenderes i 80-130 μL af lysisopløsningen.
      BEMÆRK: Cellepillen skal være synlig med øjet. Lysisvolumenet afhænger af mængden af prøve, der går tabt under mærknings- og vaskeprocessen.
    4. Bland forsigtigt ved pipettering for at bryde pelleten op. Pak folien ind og læg den på vipperen ved 4 °C i 0,5-1 time for at lyse cellerne.
    5. Pellets den uopløselige fraktion ved centrifugering ved 20.000 x g og 4 °C i 20 min. Overfør supernatanten til et frisk koldt rør (det lyserede protein, der indeholder det fluorescerende mærkede protein af interesse) og opbevar det på is til eksperimenter.

3. Enkeltmolekyle flowkammersamling og funktionalisering

  1. Fjern rutsjebanen og dækslet fra fryseren, og lad dem varme ved RT i mørke (~ 30 min).
  2. Saml kammeret ved hjælp af dobbeltsidet tape ved at klemme strimler af dobbeltsidet tape mellem glideren og dækslip. Sørg for, at PEGylated overfladerne danner det indre af flowkammeret.
  3. Brug en pipetspids til at trykke på dækslippet for at sikre, at båndet kommer i fuld kontakt med både dækslip og dias; Pas på ikke at bryde dækslip. Påfør epoxy på kanterne af diasene.
    BEMÆRK: Tilsæt ikke så meget, at epoxy fylder i de borede huller.
  4. Placer flowkammeret med dæksiden nedad i en befugtet mørk kasse, så epoxyen kan tørre (~30 min).
    BEMÆRK: Tilsæt T50-buffer (supplerende fil 1) gennem de borede huller for at forhindre epoxy i at dække hullerne (10-15 μL) i tørreperioden.
  5. Inkubere hver kammerbane med 500 nM Neutravidin (fortyndet i T50) ved langsomt at påføre ~ 40 μL på hver bane.
  6. Inkuber ved RT i 2 minutter inde i en befugtet mørk kasse. Vask med ~100 μL T50 buffer pr. bane.
  7. Inkuber hver kammerbane med 20 nM biotinyleret antistof11. Valget af antistof afhænger af mærket på proteinet.
    BEMÆRK: Hvis det primære antistof ikke er biotinyleret, inkuberes først med det biotinylerede sekundære antistof i 30 minutter og inkuberes derefter med det primære antistof.
  8. Inkuberes ved RT i 30 minutter inde i en befugtet mørk kasse. Vask med ~200 μL T50 pr. bane.
    BEMÆRK: Sørg for, at banerne aldrig tørrer ud under forberedelsesprocessen.

4. Buffere med et enkelt molekyle

  1. Trolox buffer
    BEMÆRK: Trolox-buffer er startbufferen til fremstilling af billedbuffer. Bufferens komponenter er afhængige af eksperimentet og kan variere afhængigt af proteinet af interesse. Bufferen, der anvendes i protokollen beskrevet her, inkluderer salte (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), buffermiddel (HEPES) og Trolox (pH ~ 7,35).
    1. 9-10 mg Trolox opløses i 10 ml enkeltmolekyleoptagelsesbuffer (SRB, supplerende fil 1)
      BEMÆRK: Trolox gør bufferen lidt sur. Juster pH på dette stadium ved hjælp af natriumhydroxid (NaOH) opløsning, 10 M (pH 7,35). Den fine pH-justering foretages, når Trolox er helt opløst; men at øge pH på dette tidspunkt øger troloxens opløselighed.
    2. Bland opløsningen ved RT ved hjælp af en bordplade i 4-8 timer (pakket ind i aluminiumsfolie) for at opløse Trolox helt.
    3. Kontroller pH-værdien, og juster om nødvendigt.
    4. Sørg for, at Trolox er helt opløst. Opløsningen steriliseres med et sprøjtefilter, og den opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: Bufferen skal bruges efter 2-10 dages aldring. Trolox hjælper med at undertrykke blinkende og bruges almindeligvis i enkeltmolekyleundersøgelser17. De blinkende egenskaber kommer fra et oxideret derivat af Trolox18; derfor anbefales det at holde det på RT i mindst et par timer for at modnes. Derudover fremskynder UV-stråling af frisk Trolox-opløsning oxidationsprocessen og kan bruges til at fremskynde "aldring" af Trolox-buffer18.
  2. Billedbufferopskrift: Bland Trolox-buffer + vaskemiddel (~ 2 gange vaskemidlets CMC-værdi) + 4 mM protocatechuinsyre (PCA).
    BEMÆRK: Vaskemiddelkoncentrationen holdes i nærheden af CMC, da høje koncentrationer af vaskemidler kan resultere i øget proteindenaturering. For eksempel kan følgende blanding anvendes 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + kolesterol (W%, 10:1) + 40 μL 100 mM PCA-stamopløsning. Her fungerer PCA som et antioxidantmiddel og blev tidligere brugt i smFRET-undersøgelser19. DDM er ikke-ionisk, bruges almindeligvis til at opløse membranproteiner20,21 og er blevet anvendt i enkeltmolekyleundersøgelser. DDM er et godt førstevalg vaskemiddel; Vi anbefaler dog at teste flere vaskemidler og sikre, at resultaterne er konsistente.

5. Mikroskop opsætning og smFRET dataindsamling

  1. Tænd computeren og mikroskopet. Tænd for laserne for at varme op (532 nm for Cy3 excitation og 640 nm for Cy5 excitation).
    BEMÆRK: Her blev der brugt et omvendt mikroskop udstyret med et 100x TIRF-mål (NA 1.49), billedsplitter og EMCCD-kamera. Opsætningen er udstyret med en fire-line laserkombinerer, et dikroisk spejl, et langt pass emissionsfilter, et emission dikroisk filter og et hakfilter.
  2. Tænd EMCCD-kameraet, og åbn kamerasoftwaren. Vent 20 minutter på, at kameraet når -69 °C og stabiliseres.
  3. Monter prøvekammeret på mikroskoptrinnet. Tilsæt proteinprøven gradvist for at opnå ~400 molekyler pr. synsfelt (trin 2.4.5). Kammeret vaskes med 100 μL af billedbufferen.
  4. Juster forstærkning, anskaffelseshastighed og laserkræfter, så enkeltmolekyle fluorescenssignaler detekteres i både donor- og acceptorkanalerne. Juster koncentrationen af proteinerne inde i prøvekammeret, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Med mere end 400 molekyler i synsfeltet bliver det vanskeligere at skelne individuelle molekyler, og baggrundsstøjen vil være højere.
  5. Ophidse donoren og få tidsspor, indtil mindst 80% af donormolekylerne i synsfeltet er fotobleget.
  6. I slutningen af filmen skal du tænde 640 nm laseren for direkte at ophidse acceptoren, indtil nogle af acceptormolekylerne fotobleach, hvilket letter enkeltmolekyle fra multimerdiskrimination.
  7. Gå over til et andet synsfelt, og gentag ovenstående trin for at indsamle mindst tre film (tekniske replikater) pr. betingelse.
    BEMÆRK: Brug den lavest mulige lasereffekt, når du vælger et nyt interesseområde (ROI) og fokuserer for at minimere fotoblegning. Vær opmærksom på scenedriften under erhvervelsen. Hvis der observeres mærkbar drift efter flytning til et nyt investeringsafkast, skal du vente i 3 minutter, før du starter erhvervelsen.

6. Analyse af data

  1. Justering af donor- og acceptorkanal (filmkortlægning)
    1. Optag de fluorescerende perlebilleder i donor- og acceptorkanalerne.
    2. Generer kortlægningsfilen ved hjælp af perledataene for at korrelere donor- og acceptorfluorescensen fra hvert molekyle22,23.
      BEMÆRK: Emissionssignalet fra et enkelt molekyle opdeles i donor- og acceptorsignaler af emissions-dikroic-filteret inde i billedsplitteren. Donor- og acceptorbillederne projiceres på kameraet side om side. For nøjagtigt at forbinde donor- og acceptorintensiteten af et enkelt molekyle mellem de to områder genereres en kortlægningsfil ofte ved hjælp af fluorescerende perleprøver. Ved hjælp af denne kortlægningsfil kortlægges alle de molekyler, der opdages i donor- og acceptorkanalerne, på hinanden. Analysen genererer derefter tidssporene, som er donor- og acceptorintensiteterne over tid, for hvert molekyle.
  2. Udvælgelse af enkeltmolekyle FRET-spor (partikelplukning)
    BEMÆRK: Individuelle partikelspor undersøges og udvælges til downstream-analyse ved hjælp af MATLAB. De nøjagtige udvælgelseskriterier afhænger af systemet. Generelle retningslinjer for, hvad der udgør en kvalitetspartikel, er skitseret her. Alle de brugerdefinerede modificerede koder er tilgængelige på GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Vælg de spor, hvor den samlede intensitet af sporene (donor + acceptor) er stabil over tid. Vælg sporene med antikorrelerede ændringer i donor- og acceptorintensiteter.
    2. Vælg donor- og acceptormolekylerne, der viser enkelttrins fotoblegning. Vælg de spor, der er >5 s lange.
      BEMÆRK: Baggrunden i hver kanal efter blegning skal gå til nul. Sporene bør ikke have mange blinkende begivenheder; Dette vil øge analysevanskeligheden.
    3. Beregn FRET-effektiviteten ved hjælp af ligningen E = (I A- 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])24,25,26, hvor I D og I A er henholdsvis rå donor- og acceptorintensiteter.
      BEMÆRK: Lækagen af donoremission i acceptorkanalen bestemmes ved hjælp af donormærket prøve exciteret ved hjælp af en 532 nm laser26. Lækagekorrektionsfaktoren, 0,088, kan variere for forskellige opsætninger afhængigt af de anvendte filtersæt. Det er vigtigt at bemærke, at kvantitativ og robust konvertering af FRET-effektivitet til absolutte afstande kræver korrektion af donor- og acceptorintensiteter for flere faktorer og er blevet grundigt diskuteret før27.
  3. Identificer konformationstilstanden ved hjælp af Hidden Markov Modeling (HMM)
    1. Udfør vbFRET28-programmet i MATLAB, og importer de valgte spor for en given tilstand. Angiv begrænsningerne for antallet af potentielle tilstande og gentagelser, der skal udføres.
      BEMÆRK: Baseret på de rå data fra de repræsentative resultater blev det antaget, at der var op til fire diskrete FRET-tilstande optaget af konformationssensoren; således blev en række på en til fire stater udpeget. Forbedringer i tilpasning blev tidligere bestemt til ubetydeligt at stige med >25 iterationer; Således blev 25 iterationer brugt til at tilpasse de repræsentative data.
    2. Analyser smFRET-sporene, og eksporter de idealiserede spor og analysesession. Gem de idealiserede spor i en separat mappe til downstream-analyse.
      BEMÆRK: De programmer, der blev brugt til at udtrække tilstandsovergangs- og opholdstidsdata fra idealiserede spor, blev gjort tilgængelige i tidligere offentliggjort arbejde29.
    3. Brug MATLAB-programmer til at udtrække tilstandsovergange og plotte dem som et varmekort med X-koordinaten, der angiver startkonformation og Y-koordinaten, der angiver slutkonformation.
      BEMÆRK: Overgange defineres som ændringer i FRET-værdi >0,1 i de repræsentative resultater, der diskuteres her. Tærsklen for overgange er afhængig af de hypotetiske konformationstilstande, som et protein af interesse optager (sæt overgangstærskel til at være mindre end forskellen mellem de nærmeste FRET-tilstande) samt den opløsning, der er tilladt af den eksperimentelle opsætning. Undersøgelsen af varmekort for flere forhold muliggør identifikation af de mest almindelige konformationstilstande, som en sensor overgår gennem og dermed optager. Fire FRET-stater blev identificeret for de repræsentative resultater (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 og 0,89).
    4. Brug MATLAB-programmer til at udtrække opholdstiderne for hver identificeret konformationstilstand. Angiv en række FRET-værdier, der afgrænser hver tilstand og tidsopløsning under dataindsamling. FRET-intervaller er jævnt fordelt med tilstødende FRET-tilstande. Eksportér opholdstiderne for givne behandlingsbetingelser.
      BEMÆRK: I de fleste tilfælde kan opholdstidsdata estimeres godt ved hjælp af en enkelt eksponentiel henfaldsfunktion. Denne analyse kan udføres i en dataanalyse- og grafsoftware.
  4. Gaussisk tilpasning af smFRET-populationshistogrammer til kvantificering af statsbelægning
    1. Importer population FRET-histogrammer for betingelser af interesse i dataanalyse- og grafsoftwaren til flere peak fitting-analyser.
    2. Angiv antallet af toppe til stede (fire toppe eller tilstande baseret på HMM-analyse). Tilpasning blev udført ved hjælp af flere gaussiske fordelinger30 defineret som Equation 1, hvor A er topområdet, xc er topcentret, og w er topbredden for hver top.
    3. Begræns tilpasningsparametrene som A > 0, xc = FRET ± 0,02 og 0,1 ≤w≤ 0,24. Fire FRET-toppe for individuelle populationer FRET-histogrammer blev tilpasset samtidigt. Anvend de definerede begrænsninger for fittings af alle forhold.
    4. Beregn belægningstilstanden (procentdel) som det maksimale område af interesse divideret med det samlede areal, defineret som summen af alle toppe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ekspression og fluorescerende mærkning af UAA-baseret FRET-sensor
Heri diskuteres eksemplariske resultater af indsættelse og fluorescerende mærkning af en UAA (AZP) inden for CRD for mGluR2 (548UAA)11. Som tidligere nævnt er det nødvendigt at indsætte AZP i mGluR2 samtidig ekspression af det konstruerede translationelle maskineri, som omfatter en modificeret tRNA-syntetase og komplementært tRNA (pIRE4-Azi) og mGluR2 indeholdende et ravkodon i position 548, skabt ved hjælp af mutagenese (figur 2A, B). Mærkning af AZP med cyaninfarvestoffer opnås ved en kobberkatalyseret cycloadditionsreaktion (figur 2C) og resulterer i effektiv plasmamembranmærkning af 548UAA (figur 2D). For at verificere oversættelsen af fuld længde 548UAA og integriteten af den dimere receptor blev SDS-PAGE elektroforese udført på cellelysatet fra HEK293T-celler, der udtrykker 548UAA mærket med Cy5. Et enkelt bånd ved 250KDa blev observeret, hvilket faldt sammen med den fulde længde dimeriske mGluR2 (figur 2E).

Dataindsamling og analyse
Celler, der udtrykte 548UAA med C-terminal FLAG-tag, blev mærket med Cy3 (donor) og Cy5 (acceptor) og derefter lyset med vaskemiddel31 i nærværelse af en proteasehæmmer til in vitro-undersøgelse. Efter afslutningen af cellelysis og fjernelse af den uopløselige fraktion ved centrifugering blev supernatanten påført en polyethylenglycol (PEG) -passiveret dækslip funktionaliseret med et anti-FLAG-tag antistof til total intern refleksionsfluorescens (TIRF) billeddannelse (figur 3). Prøven blev belyst ved hjælp af en 532 nm laser, og partikler blev udvalgt til downstream-analyse ved hjælp af smCamera-software. Rå donor-, acceptor- og FRET-spor blev genereret for alle udvalgte molekyler i smCamera og udvalgt ved hjælp af MATLAB (afsnit 6; Figur 4). En 8,8% donorblødningskorrektion blev anvendt på acceptorintensiteter for den eksperimentelle opsætning, der blev brugt her. Denne korrektionsfaktor vil variere med den anvendte eksperimentelle opsætning, dikroiske filtre og emissionsfiltre og bør bestemmes ved at måle donor- og acceptorsignalerne under standard eksperimentelle betingelser ved hjælp af celler, der kun er mærket med donorfluorophore, og beregne gennemblødningen ([acceptorintensitet] / [donorintensitet]). Figur 4 viser flere repræsentative FRET-spor og tilsvarende donor- og acceptorsignaler. Disse spor blev udvalgt ved hjælp af kriterier, der tidligere er beskrevet i protokollen (afsnit 6). Repræsentative udvalgte spor, der viser overgange mellem flere stater og donor- og acceptorblegningshændelser, er vist i figur 4B-D.

Identifikation af konformationstilstande
For at identificere de konformationelle tilstande 548UAA besat og forholdet mellem disse stater i forhold til hinanden, blev Hidden Markov modellering (HMM) analyse udført. HMM-analysen blev udført ved hjælp af vbFRET-programmet udført på MATLAB28 (figur 5A). Figur 5 bruger data fra en mellemliggende glutamatkoncentration (5μM) til at illustrere processen med statsidentifikation. Baseret på rå smFRET-spor blev det antaget, at der eksisterede op til fire potentielle FRET-stater for CRD. Således blev antallet af stater begrænset til en til fire. Samlet set blev der udført 25 iterationer af tilpasning for hvert spor for at bestemme antallet af tilstedeværende tilstande. Fra disse idealiserede pasformer kan overgange mellem diskrete FRET-tilstande udvindes og plottes som et overgangstæthedsvarmekort (figur 5B). Varmekortet fremhæver fire diskrete FRET-tilstande ved 0,31, 0,51, 0,71 og 0,89, angivet med stiplede linjer. Overgange blev defineret som ændringer i FRET >0.1. De idealiserede FRET-spor giver også oplysninger om opholdstid for hver identificeret konformation (figur 5C).

Population FRET histogram generation og peak fitting
Repræsentative enkeltmolekylespor for 548UAA i nærvær af varierende glutamatkoncentrationer, der manuelt blev udvalgt til yderligere analyse, er vist i figur 6A, B. En generel analyse for smFRET-eksperimenter er at generere populationshistogrammer fra hundredvis af smFRET-spor for hver eksperimentel tilstand (figur 6C). Population FRET-histogrammer oprettes ud fra segmentet af spor før blegning. For at undgå at skævvride histogrammet mod adfærden af længere spor, er det nødvendigt at generere et normaliseret FRET-histogram fra hvert spor inden gennemsnittet. Dette sikrer, at hvert spor bidrager ligeligt til det endelige histogram. I dette system viser FRET-histogrammerne et generelt skift mod højere FRET med stigende glutamatkoncentration, hvilket indikerer en reduktion i afstanden mellem CRD'erne og et skift mod den aktive konformation. Uanset glutamatkoncentrationen forbliver FRET-signalet imidlertid ret sporadisk, hvilket indikerer en høj grad af iboende dynamik for CRD. Ud over det generelle skift mod højere FRET bliver en omfordeling af konformationsensemblet tydelig i histogrammet (farvekurver). Individuelle molekyler kan også ses besøge disse konformationstilstande (stiplede linjer) (figur 6B). For at bestemme sandsynligheden for statsbelægning skal man dividere toppen af toppen med det samlede areal, defineret som summen af alle fire individuelle topområder. SmFRET-histogrammet, der blev genereret fra smFRET-eksperimentet med CRD af mGluR2, viste fire dynamiske tilstande med toppe på henholdsvis 0,31, 0,51, 0,71 og 0,89 (mærket ved tilstand 1-4).

Figure 1
Figur 1: Rutediagram over arbejdsprotokollen og dataanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Stedsspecifik mærkning af mGluR2 ved klikkemi . (A) Skematisk af den unaturlige aminosyre 4-azido-L-phenylalanin inkorporeringsproces i celler. (B) Skematisk visning af stedsspecifik fluorescerende mærkning af mGluR2 med den unaturlige aminosyre i position 548 ved kobberkatalyseret azid-alkynklikreaktion. (C) Tredimensionel struktur af fluorescerende mærket mGluR2 (donormolekyle i grønt, acceptormolekyle i rødt) med Cy3- og Cy5-molekyler forankret. (D) Repræsentativt konfokalmikroskopbillede af HEK293T-celler, der udtrykker 548UAA med celleoverfladepopulationen mærket med donor (grøn: Cy3) og acceptor (rød: Cy5) fluorophorer gennem klikkemi. Skalastænger = 10 μm. (E) Billede af ikke-reducerende 4% -20% polyacrylamid gelelektroforese af cellelysat fra HEK293T-celler, der udtrykker 548UAA og mærket med Cy5-alkyn. Gelen er afbildet med en 633 nm excitation bølgelængde og 670-BP30 emissionsfilter-Lane a: protein stige; Bane B: cellelysat; bane c: Cy5-alkynfarvestof. Resultaterne er repræsentative for et individuelt eksperiment. Panelerne B, D og E genbruges fra Liauw et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk repræsentation af smFRET-eksperimenterne og mikroskopopsætningen (TIRF). Enkeltmolekylets fluorescensbillede af donoren er vist med grønt (skala bar = 1000 nm) og acceptoren i rødt. Donoren var begejstret ved 532 nm ved hjælp af en laser. Acceptoren er begejstret for FRET fra donoren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Intensitetsspor af donor (grøn) og acceptor (rød) mærket mGluR2. (A) Tegneserie, der viser receptordynamikken og ændringen i afstanden mellem FRET-sonder. (B) Langlivet høj FRET-tilstand. (C) Flere FRET-tilstande med acceptorfotoblegning først efterfulgt af donorfotoblegning. (D) Kortvarig FRET-tilstand med acceptorfotoblegning. (E) Langlivet stabil FRET-tilstand med acceptorfotoblegning. Dette tal er gengivet med minimal modifikation fra Liauw et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Identifikation af konformationstilstand . (A) Repræsentativt FRET-spor med idealiseret pasform overlejret (rødt) sammen med det tilsvarende donor- og acceptorsignal. (B) Overgangstæthedsvarmekort, der fremhæver de hyppigste konformationsovergange, der gennemgås af 548UAA. Stiplede linjer angiver FRET-tilstande. (C) Gennemsnitlige opholdstider for hver konformationstilstand. Dette tal er gengivet med en minimal ændring fra Liauw et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Enkeltmolekyle FRET afslører fire konformationstilstande af mGluR2 CRD . (A) Repræsentativ ramme fra en enkeltmolekylefilm med donorkanalen (Cy3) til venstre og acceptorkanalen (Cy5) til højre. Molekyler valgt af analysesoftware til downstream-behandling er angivet med grønne cirkler. Skalabar = 3 μm. (B) Eksempel på enkeltmolekyletidsspor af 548UAA ved forskellige glutamatkoncentrationer. Donorintensiteter (grøn) og acceptor (rød) og den tilsvarende FRET (blå) vises. Stiplede linjer repræsenterer fire forskellige FRET-tilstande. C) smFRET-populationshistogrammer i en række glutamatkoncentrationer. Data repræsenterer middelværdi ± SEM. af N = 3 uafhængige eksperimenter. Dette tal er gengivet med en minimal ændring fra Liauw et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Resumé af den samlede protokol . (A) Arbejdsgang til dyrkning og mærkning af celler, der udtrykker et protein indeholdende en unaturlig aminosyre. (B) Enkeltmolekyle FRET eksperimentel og analyse workflow, der anvendes til at identificere konformationstilstande og karakterisere de dynamiske egenskaber af CRD-domænet i mGluR2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Komponent Volumen/reaktion (μL)
Reduceret serummedium 100
Transfektion reagens 4.4
Komponent Volumen/reaktion (μL)
Reduceret serummedium 100
P3000 4
Konstruktion/komponentnavn Koncentration (ng/μL) Volumen/brønd (12-brønd) (μL) Brønde (#) DNA tilføjet (μL)
tRNA/syntetase 1000 1 1 1
Amber codon indeholdende protein 1000 1 1 1

Tabel 1: Reagenser til transfektion af HEK 293 T-cellen.

Reagenser Volumen, der skal tilføjes (μL) Lager conc (mM) Endelig conc (mM)
1x RB 655.5
BTTES 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
NaAsc 17.5 100 2.5
AminoG 8.75 100 1.25
Cy3-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018

Tabel 2: Sammensætning af mærkningsopløsningen (klik kemi).

Supplerende fil 1: Sammensætning af forskellige buffere, der anvendes i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GPCR'er er proteiner, der fungerer på cellemembranen for at initiere signaltransduktion. Mange GPCR'er består af flere domæner, hvor signalering er afhængig af den kooperative interaktion mellem domænerne. For at modulere egenskaberne af disse membranreceptorer er det vigtigt at forstå den dynamiske opførsel af de flere domæner. Enkeltmolekyle fluorescens resonans energioverførsel (smFRET) er en fluorescensteknik, der muliggør måling af proteinkonformation og dynamik i realtid11,32. Her beskrives en tilgang, der kombinerer smFRET, single-molecule pull-down (SiMPull) og total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi for direkte at visualisere omlejringen af individuelle proteiner immobiliseret på en passiveret overflade 5,11,33. FRET er meget følsom over for afstand og fungerer effektivt som en nanoskala lineal, der er egnet til at undersøge intramolekylære ændringer (3-8 nm). Sammenlignet med traditionelle biofysiske tilgange er smFRET særligt velegnet til undersøgelse af stor konformationsdynamik ved en ~ 10 ms tidsskala og kræver et lille prøvevolumen (ca. 1 fmole pr. Eksperiment). I modsætning til ensemblemålinger af konformationsdynamik, såsom dem, der leveres af kernemagnetisk resonans (NMR)34 eller dobbelt elektronelektronresonans (DEER) spektroskopi35, tillader smFRET eksplicit tildeling af både konformationstilstande og deres tidsbestilling samt direkte detektion af sjældne og forbigående mellemtilstande.

I øjeblikket udgør begrænsningerne ved stedsspecifik fluorescerende mærkning en teknisk udfordring, der forhindrer den bredere anvendelse af smFRET til at studere proteinernes konformationsdynamik. Desuden er det vanskeligt at rense membranproteiner i store mængder og bevare deres aktivitet. Almindelige mærkningsstrategier bruger store proteinmærker eller kræver generering af minimale cysteinmutanter, hvilket ofte begrænser fluorophorkonjugation til termini af proteiner uden udsatte cysteinrester. For at omgå disse begrænsninger blev en unaturlig aminosyre (UAA) inkorporeringsstrategi tilpasset og optimeret, hvilket muliggjorde ikke-forstyrrende, restspecifik mærkning ved hjælp af en kobberkatalyseret klikreaktion11,12,14. Denne strategi gør det muligt at konjugere fluoroforer i de opløsningsmiddeleksponerede områder af membranreceptoren og gør det muligt at generere et bredere udvalg af konformationssensorer. I denne protokol anvendes en enkelt type konjugationskemi. Dette resulterer i populationer kun for donordonorer og acceptoracceptorer, som udelades under downstream-analyse. Alternativt kan to ortogonale mærkningsstrategier bruges til at undgå dette eller overvinde mulig heterogenitet, når proteinet af interesse ikke er symmetrisk.

Den direkte indfangning af protein hjælper med at omgå traditionelle rensningstrin, der er tidskrævende og teknisk udfordrende. På grund af cytotoksiciteten af kobber anvendes også kobberfri klikkemi baseret på transcyklooktan36 eller methyltetrazin37 . Disse reagenser er imidlertid dyre, og reaktionens ikke-regiospecifikke38-karakter resulterer i et lavt udbytte af fluorescerende mærket protein af interesse.

Her blev der præsenteret grundige retningslinjer for in vitro smFRET-eksperimenter, startende fra flowkammerforberedelse til dataanalyse. SMFRET-dataene blev indsamlet ved hjælp af en TIRF-opsætning, og analysen blev udført ved hjælp af en specialskrevet MATLAB-kode.

Et par vigtige overvejelser bør bemærkes. For det første bør man forberede PEG-passiveret overflade til at være homogen og mindre tæt med biotin-PEG. Overskydende biotin-PEG kan resultere i overdreven proteinudtrækning, hvilket gør det vanskeligt at løse fluorescerende signaler fra individuelle molekyler. For det andet skal proteinprøven (cellelysatsupernatant) fortyndes grundigt, inden den tilsættes til prøvekammeret for at undgå overflademætning. Udbyttet af protein afhænger af celletætheden, det valgte vaskemiddel og vaskemiddelkoncentrationen. For at optimere antallet af enkeltdonor- og acceptorpar skal man målrette mod en tæthed på ~ 400 molekyler i et 256 x 512 pixel synsfelt. For det tredje skal Trolox-bufferen opbevares ved -20 °C til langvarig brug (måneder). Troloxbufferen forbliver stabil i 2 uger, når den opbevares ved 4 °C. Endelig skal man passe på ikke at indføre luftbobler i flowkammeret efter funktionalisering med antistoffet. Tørring af flowkammeret vil resultere i reduceret effektivitet af proteinimmobilisering og prøveproteindenaturering.

Konformationsdynamikken i mGluR2-sensoren, der er beskrevet her, blev med succes undersøgt på det enkelte receptorniveau ved hjælp af smFRET og gav indsigt i mekanismen for receptoraktivering. CRD viste sig at demonstrere et højt niveau af iboende dynamik, der eksisterede i en ligevægt mellem fire konformationelle FRET-tilstande uanset tilstedeværelsen eller fraværet af glutamat. Et skift mod højere FRET-tilstande eller en mere kompakt receptor viste sig at forekomme på en glutamatkoncentrationsafhængig måde (figur 6). Interessant nok, selv ved mættende niveauer af glutamat, forblev CRD dynamisk. Metoden præsenteret her (opsummeret i figur 7) til at forstå konformationsdynamikken gælder for andre klasse C GPCR'er såvel som andre membranproteiner såsom ionkanaler, ionotropiske receptorer og receptortyrosinkinaser (RTK'er)32,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer af Reza Vafabakhsh-laboratoriet for diskussioner. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-bevillingen R01GM140272 (til R.V.), af The Searle Leadership Fund for the Life Sciences ved Northwestern University og af Chicago Biomedical Consortium med støtte fra Searle Funds på Chicago Community Trust (til R.V.). B.W.L. blev støttet af National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Biokemi udgave 186 G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) konformationsdynamik membranreceptorer unaturlige aminosyrer smFRET
Visualisering af konformationsdynamikken i membranreceptorer ved hjælp af enkeltmolekyle FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banerjee, C., Liauw, B. W. H.,More

Banerjee, C., Liauw, B. W. H., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter