Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Abstract

Het vermogen van cellen om te reageren op externe signalen is essentieel voor cellulaire ontwikkeling, groei en overleving. Om te reageren op een signaal uit de omgeving moet een cel het kunnen herkennen en verwerken. Deze taak is voornamelijk afhankelijk van de functie van membraanreceptoren, waarvan de rol is om signalen om te zetten in de biochemische taal van de cel. G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) vormen de grootste familie van membraanreceptorgeiwitten bij de mens. Onder GPCR's zijn metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) een unieke subklasse die functioneren als obligate dimeren en een groot extracellulair domein bezitten dat de ligandbindingsplaats bevat. Recente ontwikkelingen in structurele studies van mGluRs hebben het begrip van hun activeringsproces verbeterd. De verspreiding van grootschalige conformatieveranderingen door mGluRs tijdens activering en modulatie is echter slecht begrepen. Single-molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) is een krachtige techniek om de structurele dynamiek van biomoleculen op het niveau van één eiwit te visualiseren en te kwantificeren. Om het dynamische proces van mGluR2-activering te visualiseren, werden fluorescerende conformatiesensoren op basis van onnatuurlijke aminozuur (OCG) -opname ontwikkeld die sitespecifieke eiwitetikettering mogelijk maakten zonder verstoring van de oorspronkelijke structuur van receptoren. Het hier beschreven protocol legt uit hoe deze experimenten moeten worden uitgevoerd, inclusief de nieuwe UAA-etiketteringsbenadering, monstervoorbereiding en smFRET-gegevensverzameling en -analyse. Deze strategieën zijn generaliseerbaar en kunnen worden uitgebreid om de conformatiedynamiek van een verscheidenheid aan membraaneiwitten te onderzoeken.

Introduction

De overdracht van informatie over het plasmamembraan is sterk afhankelijk van de functie van membraanreceptoren1. Ligandbinding aan een receptor leidt tot een conformatieverandering en receptoractivering. Dit proces is vaak allosterisch van aard2. Met meer dan 800 leden zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) de grootste familie van membraanreceptoren bij mensen3. Vanwege hun rol in bijna alle cellulaire processen zijn GPCR's belangrijke doelen geworden voor therapeutische ontwikkeling. In het canonieke model van GPCR-signalering resulteert agonistactivering in conformatieveranderingen van de receptor die vervolgens het heterotrimeer G-eiwitcomplex activeren via uitwisseling van GDP voor GTP in de nucleotidebindingszak van Gα. De geactiveerdeG-α-GTP en Gβγ subeenheden regelen vervolgens de activiteit van downstream effectoreiwitten en verspreiden de signaalcascade 4,5. Dit signaleringsproces hangt in wezen af van het vermogen van liganden om de driedimensionale vorm van de receptor te veranderen. Een mechanistisch begrip van hoe liganden dit bereiken, is van cruciaal belang voor het ontwikkelen van nieuwe therapieën en het ontwerpen van synthetische receptoren en sensoren.

Metabotrope glutamaatreceptoren (mGluRs) zijn leden van de klasse C GPCR-familie en zijn belangrijk voor de langzame neuromodulerende effecten van glutamaat en het afstemmen van neuronale prikkelbaarheid 6,7. Van alle GPCR's zijn klasse C GPCR's structureel uniek omdat ze functioneren als obligate dimeren. mGluRs bevatten drie structurele domeinen: het Venus flytrap (VFT) domein, cysteïne-rijk domein (CRD) en transmembraandomein (TMD)8. De conformatieveranderingen tijdens het activeringsproces zijn complex en omvatten lokale en globale conformatiekoppelingen die zich over een afstand van 12 nm voortplanten, evenals dimer cooperativiteit. De tussenliggende conformaties, temporele ordening van toestanden en de snelheid van overgang tussen toestanden zijn onbekend. Door de conformatie van individuele receptoren in realtime te volgen, is het mogelijk om de voorbijgaande tussentoestanden en de volgorde van conformatieveranderingen tijdens activering te identificeren. Dit kan worden bereikt door het toepassen van single-molecule fluorescentieresonantie-energieoverdracht 9,10 (smFRET), zoals onlangs werd toegepast om de voortplanting van conformatieveranderingen tijdens de activering van mGluR211 te visualiseren. Een belangrijke stap in FRET-experimenten is het genereren van FRET-sensoren door locatiespecifieke inbrenging van de donor- en acceptorfluorforen in het eiwit van belang. Een onnatuurlijke aminozuur (OCG) opnamestrategie werd aangenomen 12,13,14,15 om de beperkingen van typische site-specifieke fluorescerende etiketteringstechnologieën te overwinnen die de creatie van cysteïne-loze mutanten of het invoegen van een grote genetisch gecodeerde tag vereisen. Hierdoor kon de conformatieherschikking van de essentiële compacte allosterische linker, die zich bij de ligandbindende en signaleringsdomeinen van mGluR2 voegde, worden waargenomen. In dit protocol wordt een stapsgewijze handleiding gepresenteerd voor het uitvoeren van smFRET-experimenten op mGluR2, inclusief de aanpak voor locatiespecifieke etikettering van mGluR2 met OCG om fluoroforen te bevestigen met behulp van de kopergekatalyseerde azidecyclisatiereactie. Bovendien beschrijft dit protocol de methodologie voor het direct vastleggen van membraaneiwitten en data-analyse. Het hier geschetste protocol is ook van toepassing op het bestuderen van de conformatiedynamiek van andere membraaneiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De algemene workflow van het protocol wordt beschreven in figuur 1.

1. Voorbereiding van de monsterkamer

  1. Glij- en afdekplaatreiniging
    OPMERKING: Deze stappen zijn gericht op het reinigen van de oppervlakken van de dia's en de coverslips en deze voor te bereiden op aminosilanisatie. Een kritische vereiste voor het uitvoeren van fluorescentie-experimenten met één molecuul op aan het oppervlak gebonden moleculen is een gepassiveerd oppervlak. De meest betrouwbare en reproduceerbare passiveringstechniek omvat het covalent bevestigen van inerte polymeerketens aan het glasoppervlak als een dichte laag. Polyethyleenglycol (PEG) is het meest efficiënte polymeer dat wordt gebruikt voor oppervlaktepassivering16. De details van de passiveringsprocedure met PEG (PEGylation) worden hieronder beschreven:
    1. Markeer gaten die op de dia's moeten worden geboord met een marker (~ 6 mm uit elkaar en weg van de rand). Gebruik een Dremel om kleine gaatjes (1 mm diameter) op de glasplaat te boren. Dompel de glijbanen onder in water tijdens het boorproces.
    2. Was de dia's met aceton om resterende inkt van de marker te verwijderen.
    3. Haal uit aceton en spoel de dia's af met water en zet ze vervolgens 5 minuten in de magnetron in water op hoog vermogen (700 W).
    4. Reinig de dia's met water voordat u ze in een glazen pot plaatst om te worden gesoniseerd. Plaats de coverslips in een andere beitspot.
    5. Soniceer de dia's en coverslips in aceton gedurende 30 minuten in een bad sonicator bij 23 °C.
    6. Reinig ondertussen een glazen kolf voor het bereiden van de aminosilanisatie-oplossing die tijdens de volgende stap wordt gebruikt. Vul de kolf met 1 M KOH, soniceer de kolf gedurende 30 minuten, spoel de KOH grondig uit met water en soniceer vervolgens nog eens 30 minuten in methanol. Laat de kolf in methanol tot het moment van de aminosinlanisatiestap.
    7. Verwijder ondertussen de aminosilaan, mPEG en biotine-PEG uit de vriezer (−20 °C) en laat ze in het donker op kamertemperatuur komen (RT).
    8. Gooi aceton uit de glijbaan en dekpotten in de juiste chemische afvalcontainer, spoel grondig met water en soniceer de dia's vervolgens in 5 M KOH gedurende 30 minuten.
    9. Spoel de dia's en coverslips af met water en soniceer vervolgens gedurende 2 minuten in methanol (herhaal tweemaal). Laat de potten gevuld met methanol tot de aminosilanisatiestap.
      OPMERKING: In deze studie wordt gedeïoniseerd water gebruikt, tenzij anders vermeld. Er wordt een badsonator gebruikt die werkt bij 23 °C.
  2. Aminosilanisatie
    OPMERKING: Deze stap is bedoeld om aminosilaan covalent te koppelen aan het schone glij- en afdekvlakoppervlak. Gefunctionaliseerde mPEG en biotine-PEG zullen in de volgende stap covalent aan dit oppervlak binden.
    1. Bereid een aminosilanisatiemengsel in een schone kolf (stap 1.6). Bereid de oplossing door methanol (150 ml), azijnzuur (7,5 ml, gebruik een glazen pipet) en aminosilaan (2,5 ml) te mengen.
    2. Meng de oplossing voorzichtig in de chemische zuurkast en giet deze vervolgens in de schuif en dekselpotten. Gebruik 50 ml voor de coverslips en 100 ml voor de dia's. Zorg ervoor dat dia's en coverslips volledig in de oplossing worden ondergedompeld.
    3. Incubeer gedurende 10 minuten, soniceer de potten gedurende 1 minuut (ultrasoonapparaat verwijdert de onzuiverheden van het oppervlak) en incubeer nog eens 10 minuten.
    4. Gooi de aminosilanisatieoplossing weg in de afvalcontainer. Voeg methanol toe aan de potten, sluit de potten met deksels en schud voorzichtig met de hand. Gooi de methanol weg en vul potten met water.
    5. Breng de aminosilaanfles terug naar de vriezer (−20 °C).
  3. PEGylation
    OPMERKING: Deze stappen beschrijven de PEGylation-procedure.
    1. Bereid tijdens aminosilanisatie de pegyleringsbuffer voor. Weeg 84 mg natriumbicarbonaat (NaHCO3) en voeg dit toe aan 10 ml water (10 mM). Weeg bovendien mPEG en biotine-PEG en zet ze opzij. Gebruik voor zes dia's en coverslips 96 mg mPEG en 1,2-2,4 mg biotine-PEG.
      OPMERKING: Het is belangrijk om niet te veel biotine-PEG toe te voegen, omdat dit het aantal achtergrondvlekken kan verhogen. Los het PEG-mengsel niet op tot vlak voordat u het op dia's aanbrengt.
    2. Spoel de dia's af met water, droog ze met een zachte luchtslag en plaats ze vervolgens in de bevochtigde montagedozen.
      OPMERKING: Het is essentieel om een schone luchtvaartmaatschappij te gebruiken. Vermijd het gebruik van perslucht in blik, die resten op het glas kan achterlaten.
    3. Voeg pegylatiebuffer toe aan het PEG-poedermengsel en pipetteer meerdere keren voorzichtig op en neer om op te lossen. Voeg 55 μL pegylatiebuffer per dia toe (voeg voor zes dia's 330 μL pegylatiebuffer toe).
    4. Centrifugeer bij 9.600 x g gedurende 1 minuut bij 23 °C om onopgeloste deeltjes neer te slaan. Verzamel het supernatant om te gebruiken in de volgende stap.
      OPMERKING: Biotine-PEG hydrolyseert snel door de aanwezigheid van de NHS-groep. Het is belangrijk om de meng- en centrifugatiestappen snel uit te voeren.
    5. Breng 60 μL PEGylation-oplossing aan op elke dia en plaats vervolgens de coverslip erop zodat de PEGylation-oplossing tussen de dia en de coverslip wordt ingeklemd.
      OPMERKING: Vermijd het introduceren van bellen tussen de dia en de coverslip, omdat dit de passiveringsefficiëntie zal verminderen. Verwijder eventuele bubbels door de coverslip en de dia aan te passen met een pipetpunt.
    6. Plaats de dia's in een lade die plat en donker is. Dia's kunnen 's nachts worden opgeslagen; incubatie gedurende 4-6 uur resulteert echter in optimale passivering.
      OPMERKING: Het is essentieel om te onthouden welke kant gepegyleerd is.
    7. Markeer de niet-gepegyleerde zijde voordat u deze bewaart. Demonteer na incubatie voorzichtig en spoel de dia's en coverslips grondig af met water
    8. Droog de dia's en coverslips door lucht te blazen. Bewaar de dia's en deklips in een steriele buis (50 ml), met het PEGylated oppervlak van elkaar af gericht. Bewaren bij −20 °C tot de dag van het experiment.
      OPMERKING: Het is het beste om dia's en coverslips binnen 4 weken na voorbereiding te gebruiken. De PEGylated oppervlakken moeten van elkaar af staan. Het opslaan van de PEGylated slides en coverslips in vacuüm verzegelde zakken kan de houdbaarheid verlengen.

2. mGluR2-expressie met ingebouwd onnatuurlijk aminozuur, fluorescerende etikettering en extractie

OPMERKING: Dit protocol schetst de bereiding, reagentia en behandeling van cellen voor het tot expressie brengen van mGluR2 dat de UAA 4-azido-L-fenylalanine (AZP) bevat. De procedure is voor HEK293T-cellen gekweekt op 18 mm glazen afdekplaten. De procedure kan indien nodig worden opgeschaald.

  1. Zaaien
    OPMERKING: Onderhoud de HEK293T-cellen in DMEM aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum, 100 eenheid·ml−1 penicilline-streptomycine en 15 mM HEPES-buffer (aanvullend bestand 1) (pH 7,4) bij 37 °C onder 5% CO2.
    1. Passeer de cellen met 0,05% trypsine-EDTA. Zaad HEK293T cellen op poly-L/D-lysine (PLL/PDL) glazen coverslips zodat ze ≥80% confluency bereiken tijdens de tijd van transfectie.
  2. Transfectie
    1. Bereid een 40 mM stockoplossing van AZP in 0,1 M NaOH.
    2. Bereid AZP-aangevulde media voor groeicellen en mGluR2-expressie. Vul standaardmedia (+ FBS, pen/strep, 15 mM HEPES) aan met behulp van 40 mM AZP stockoplossing. Breng de uiteindelijke AZP-concentratie op 0,6 mM. Voeg 1 M HEPES-oplossing toe (de helft van het volume van 40 mM AZP-voorraadoplossing toegevoegd). Om bijvoorbeeld 10 ml azp-aangevulde media te bereiden, combineert u 9,775 ml standaardmedia, 150 μl 40 mM AZP-stamoplossing en 75 μl 1 M HEPES-oplossing.
    3. Filtreer (steriliseer) de media met behulp van een spuitfilter (0,2 μm, PES).
    4. Vervang de standaardmedia door media die AZP-aangevulde media bevatten voorafgaand aan transfectie.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de cellen niet droogt tijdens het vervangen van de media.
    5. Transfecteer de cellen met transfectiereagens (materiaaltabel) volgens de handleiding van de fabrikant. Transfecte HEK293T cellen op een 18 mm coverslip met in totaal 2 μg DNA (1000 ng tRNA/synthetase + 1000 ng amber codon-bevattend eiwitplasmide). Zie tabel 1 voor de concentratie en het volume van de gebruikte componenten.
    6. Verander de media 24 uur na transfectie in verse AZP-aangevulde media en laat de cellen nog eens 24 uur groeien.
  3. Etikettering met alkyncyaankleurstoffen
    1. Was de coverslips 20 min voor het etiketteren tweemaal met warme (37 °C) opnamebuffer (RB) (aanvullend bestand 1) en verplaats ze naar warme (37 °C) standaardmedia zonder AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
    2. Bereid de etiketteringsoplossing die Cy3-alkyn, Cy5-alkyn, BTTES, koper (II) sulfaat (CuSO4), (+) natrium L-ascorbaat en aminoguanidine bevat.
    3. Volg de volgorde van het maken en toevoegen van oplossingen (tabel 2):
      1. Bereid 50 mM BTTES voor.
      2. Bereid 100 mM aminoguanidine.
      3. Bereid 100 mM Na-ascorbaat.
      4. Bereid 655,5 μL RB.
      5. Voeg Cy3/Cy5 alkynkleurstof (10 mM in DMSO-voorraad) toe aan de RB.
        OPMERKING: Voeg aminoguanidine toe aan de RB.
      6. Bereid 20 mM CuSO4 voor.
      7. Meng CuSO4 en BTTES in een nieuwe buis (de oplossing wordt blauw).
      8. Voeg het CuSO4- en BTTES-mengsel toe aan RB (2.3.3.6).
      9. Voeg de Na-Ascorbate toe.
      10. Volg het volume in tabel 2 hieronder voor een afdekplaat van 18 mm.
    4. Meng de oplossing grondig en incubeer op ijs en in het donker gedurende 10 minuten voordat de cellen worden geëtiketteerd.
    5. Voordat u de etiketteeroplossing aan de coverslips toevoegt, verwijdert u de media en wast u ze met RB. Voeg de etiketteringsoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in donkere omstandigheden.
    6. OPMERKING: Om de etikettering te verbeteren, voegt u glutamaat (eindconcentratie ~ 0,5 mM) toe na 10 minuten en incubeert u nog eens 5 minuten. Koper is zeer giftig voor de cellen en de etiketteringsreactie mag niet langer dan 15 minuten in vivo aanhouden. Bereid alle componenten vers voor. Voeg Na-Ascorbate als laatste toe. Houd de reactie tijdens de bereiding op 4°C. Na toevoeging van een etiketteringsoplossing moeten de cellen echter bij 37 °C in de incubator worden bewaard.
  4. Het oogsten van de cellen en het extraheren van de eiwitten (cellyse)
    1. Verwijder de etiketteeroplossing en was de coverslip (18 mm) met de mGluR2 getransfecteerde cellen tweemaal met de RB.
    2. Was met behulp van een pipet de cellen van de coverslip en resuspendeer in RB (1 ml).
      OPMERKING: Minimaliseer de blootstelling van het monster aan licht zoveel mogelijk na dit punt.
    3. Pellet de cellen door gedurende 5 minuten te draaien bij 1.000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Resuspendeer de celpellet in 80-130 μL van de lysisoplossing.
      OPMERKING: De celpellet moet zichtbaar zijn met het oog. Het lysisvolume is afhankelijk van de hoeveelheid monster die verloren gaat tijdens het etiketteer- en wasproces.
    4. Meng voorzichtig door te pipetteren om de pellet te breken. Wikkel in folie en plaats op de rocker bij 4 °C gedurende 0,5-1 uur om de cellen te lyseren.
    5. Pelleteer de onoplosbare fractie door centrifugering bij 20.000 x g en 4 °C gedurende 20 min. Breng het supernatant over in een verse koude buis (het gelyseerde eiwit dat het fluorescerend gelabelde eiwit van belang bevat) en bewaar het op ijs voor experimenten.

3. Assemblage en functionalisatie van de stromingskamer met één molecuul

  1. Haal de schuif en de coverslip uit de vriezer en laat ze op RT opwarmen in het donker (~30 min).
  2. Monteer de kamer met dubbelzijdige tape door stroken dubbelzijdige tape tussen de schuif en de coverslip te plaatsen. Zorg ervoor dat de PEGylated oppervlakken de binnenkant van de stroomkamer vormen.
  3. Druk met behulp van een pipetpunt op de coverslip om ervoor te zorgen dat de tape volledig contact maakt met zowel coverslip als slide; zorg ervoor dat u de coverslip niet breekt. Breng epoxy aan op de randen van de dia's.
    LET OP: Voeg niet zoveel toe dat epoxy de geboorde gaten opvult.
  4. Plaats de stromingskamer met de coverlipzijde naar beneden gericht in een bevochtigde donkere doos om de epoxy te laten drogen (~ 30 min).
    OPMERKING: Voeg T50-buffer (aanvullend bestand 1) toe door de geboorde gaten om te voorkomen dat de epoxy de gaten (10-15 μL) bedekt tijdens de droogperiode.
  5. Incubeer elke kamerbaan met 500 nM Neutravidine (verdund in T50) door langzaam ~ 40 μL op elke baan aan te brengen.
  6. Incubeer bij RT gedurende 2 minuten in een bevochtigde donkere doos. Wassen met ~100 μL T50 buffer per baan.
  7. Incubeer elke kamerbaan met 20 nM gebiotinyleerd antilichaam11. De keuze van het antilichaam hangt af van de tag op het eiwit.
    OPMERKING: Als het primaire antilichaam niet gebiotinyleerd is, incubeer dan eerst met het gebiotinyleerde secundaire antilichaam gedurende 30 minuten en incubeer vervolgens met het primaire antilichaam.
  8. Incubeer bij RT gedurende 30 minuten in een bevochtigde donkere doos. Wassen met ~200 μL T50 per baan.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de rijstroken nooit uitdrogen tijdens het voorbereidingsproces.

4. Buffers met één molecuul

  1. Trolox buffer
    OPMERKING: Trolox buffer is de startbuffer voor het maken van imaging buffer. Componenten van de buffer zijn afhankelijk van het experiment en kunnen variëren afhankelijk van het eiwit van belang. De buffer die in het hier beschreven protocol wordt gebruikt, omvat zouten (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), buffermiddel (HEPES) en Trolox (pH ~ 7,35).
    1. Los 9-10 mg Trolox op in 10 ml single-molecule opnamebuffer (SRB, aanvullend bestand 1)
      OPMERKING: Trolox maakt de buffer licht zuur. Pas de pH in dit stadium aan met natriumhydroxide (NaOH) oplossing, 10 M (pH 7,35). De fijne pH-aanpassing zal worden gemaakt nadat Trolox volledig is opgelost; het verhogen van de pH op dit punt verhoogt echter de oplosbaarheid van de Trolox.
    2. Meng de oplossing bij RT met behulp van een benchtop rocker gedurende 4-8 uur (gewikkeld in aluminiumfolie) om de Trolox volledig op te lossen.
    3. Controleer de pH en pas deze indien nodig aan.
    4. Zorg ervoor dat de Trolox volledig is opgelost. Steriliseer de oplossing met een spuitfilter en bewaar bij 4 °C.
      OPMERKING: De buffer moet worden gebruikt na 2-10 dagen veroudering. Trolox helpt het knipperen te onderdrukken en wordt vaak gebruikt in studies met één molecuul17. De anti-knipperende eigenschappen zijn afkomstig van een geoxideerd derivaat van Trolox18; daarom wordt aanbevolen om het minstens een paar uur op RT te houden om te rijpen. Bovendien versnelt UV-straling van verse Trolox-oplossing het oxidatieproces en kan het worden gebruikt om de "veroudering" van Trolox-buffer18 te versnellen.
  2. Recept voor beeldvormingsbuffer: Meng Trolox-buffer + wasmiddel (~ 2 keer de CMC-waarde van het wasmiddel) + 4 mM protocatechuïnezuur (PCA).
    OPMERKING: De wasmiddelconcentratie wordt in de buurt van CMC gehouden, omdat hoge wasmiddelconcentraties kunnen leiden tot verhoogde eiwitdenaturatie. Het volgende mengsel kan bijvoorbeeld worden gebruikt 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + cholesterol (W%, 10:1) + 40 μL van 100 mM PCA-stamoplossing. Hier werkt PCA als een antioxidant en werd het eerder gebruikt in smFRET-studies19. DDM is niet-ionisch, wordt vaak gebruikt om membraaneiwitten20,21 op te lossen en is gebruikt in studies met één molecuul. DDM is een goed eerste keus wasmiddel; We raden echter aan om meerdere wasmiddelen te testen en ervoor te zorgen dat de resultaten consistent zijn.

5. Microscoopopopstelling en smFRET-gegevensverzameling

  1. Zet de computer en microscoop aan. Zet de lasers aan om op te warmen (532 nm voor Cy3 excitatie en 640 nm voor Cy5 excitatie).
    OPMERKING: Hier werd een omgekeerde microscoop gebruikt die was uitgerust met een 100x TIRF-objectief (N.A. 1.49), een beeldsplitter en een EMCCD-camera. De opstelling is uitgerust met een vierregelige laser combiner, een dichroïsche spiegel, een long pass emissiefilter, een emissie dichroïsch filter en een notch filter.
  2. Schakel de EMCCD-camera in en open de camerasoftware. Wacht 20 minuten totdat de camera −69 °C bereikt en stabiliseert.
  3. Monteer de monsterkamer op het microscoopstadium. Voeg het eiwitmonster geleidelijk toe om ~400 moleculen per gezichtsveld te bereiken (stap 2.4.5). Was de kamer met 100 μL van de beeldvormende buffer.
  4. Pas de versterking, acquisitiesnelheid en laservermogens zodanig aan dat fluorescentiesignalen met één molecuul worden gedetecteerd in zowel het donor- als het acceptorkanaal. Pas indien nodig de concentratie van de eiwitten in de monsterkamer aan.
    OPMERKING: Met meer dan 400 moleculen in het gezichtsveld wordt het onderscheiden van individuele moleculen moeilijker en zal de achtergrondruis hoger zijn.
  5. Prikkel de donor en verkrijg tijdsporen totdat ten minste 80% van de donormoleculen in het gezichtsveld fotobleached zijn.
  6. Aan het einde van de film schakelt u de 640 nm-laser in om de acceptor direct te prikkelen totdat sommige acceptormoleculen fotobleken, waardoor single-molecule van multimeerdiscriminatie wordt vergemakkelijkt.
  7. Ga naar een ander gezichtsveld en herhaal de bovenstaande stappen om ten minste drie films (technische replicaties) per voorwaarde te verzamelen.
    OPMERKING: Gebruik het laagst mogelijke laservermogen bij het selecteren van een nieuw interessegebied (ROI) en scherpstellen om fotobleaching te minimaliseren. Let op de stage drift tijdens de acquisitie. Als er een merkbare afwijking wordt waargenomen na het verplaatsen naar een nieuwe ROI, wacht dan 3 minuten voordat u begint met acquisitie.

6. Data-analyse

  1. Zenderuitlijning donor- en acceptorkanaal (filmtoewijzing)
    1. Neem de fluorescerende kraalbeelden op in de donor- en acceptorkanalen.
    2. Genereer het kaartbestand met behulp van de kraalgegevens om de donor- en acceptorfluorescentie van elk molecuul22,23 te correleren.
      OPMERKING: Het emissiesignaal van een enkel molecuul wordt gesplitst in donor- en acceptorsignalen door het emissiedichroïsche filter in de beeldsplitser. De beelden van donor en acceptant worden naast elkaar op de camera geprojecteerd. Om de donor- en acceptorintensiteiten van een enkel molecuul nauwkeurig te associëren tussen de twee gebieden, wordt vaak een mappingbestand gegenereerd met behulp van fluorescerende kraalmonsters. Met behulp van dit mappingbestand worden alle moleculen die in de donor- en acceptorkanalen worden gedetecteerd, op elkaar in kaart gebracht. De analyse genereert vervolgens de tijdsporen, die de donor- en acceptorintensiteiten in de loop van de tijd zijn, voor elk molecuul.
  2. Selectie van fretsporen met één molecuul (deeltjespluk)
    OPMERKING: Individuele deeltjessporen worden onderzocht en geselecteerd voor downstream-analyse met behulp van MATLAB. De exacte selectiecriteria zijn afhankelijk van het systeem. Algemene richtlijnen over wat een kwaliteitsdeeltje is, worden hier beschreven. Alle aangepaste gewijzigde codes zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Selecteer de sporen waarbij de totale intensiteit van de sporen (donor + acceptor) stabiel is in de tijd. Selecteer de sporen met anticorrele veranderingen in donor- en acceptorintensiteiten.
    2. Selecteer de donor- en acceptormoleculen die eenstapsfotobleaching vertonen. Selecteer de sporen die >5 s lang zijn.
      OPMERKING: De achtergrond in elk kanaal na het bleken moet naar nul gaan. De sporen mogen niet veel knipperende gebeurtenissen hebben; dit zal de moeilijkheidsgraad van de analyse vergroten.
    3. Bereken de FRET-efficiëntie met behulp van de vergelijking E = (IA− 0,088 × ID)/(ID + [IA− 0,088 × ID])24,25,26, waarbij I D en IA respectievelijk ruwe donor- en acceptorintensiteiten zijn.
      OPMERKING: De lekkage van donoremissie in het acceptorkanaal wordt bepaald met behulp van donor-only gelabeld monster geëxciteerd met behulp van een 532 nm laser26. De lekcorrectiefactor, 0,088, kan verschillen voor verschillende opstellingen, afhankelijk van de gebruikte filtersets. Het is belangrijk op te merken dat kwantitatieve en robuuste omzetting van FRET-efficiënties naar absolute afstanden de correctie van donor- en acceptorintensiteiten voor meerdere factoren vereist en vóór27 uitgebreid is besproken.
  3. Identificeer de conformatiestatus door Hidden Markov Modeling (HMM)
    1. Voer het vbFRET28-programma uit in MATLAB en importeer de geselecteerde traceringen voor een bepaalde voorwaarde. Stel de beperkingen in voor het aantal potentiële statussen en iteraties dat moet worden uitgevoerd.
      OPMERKING: Op basis van de ruwe gegevens van de representatieve resultaten werd verondersteld dat er maximaal vier discrete FRET-toestanden bezet waren door de conformatiesensor; zo werd een bereik van één tot vier staten aangewezen. Eerder werd vastgesteld dat verbeteringen in de montage verwaarloosbaar toenamen met >25 iteraties; zo werden 25 iteraties gebruikt voor het aanpassen van de representatieve gegevens.
    2. Analyseer de smFRET-sporen en exporteer de geïdealiseerde sporen en analysesessie. Sla de geïdealiseerde traceringen op in een aparte map voor downstream-analyse.
      OPMERKING: De programma's die worden gebruikt om toestandsovergangs- en verblijftijdgegevens uit geïdealiseerde sporen te extraheren, zijn beschikbaar gesteld in eerder gepubliceerd werk29.
    3. Gebruik MATLAB-programma's om statusovergangen te extraheren en ze te plotten als een heatmap waarbij de X-coördinaat de beginconformatie aangeeft en de Y-coördinaat de eindconformatie aangeeft.
      OPMERKING: Overgangen worden gedefinieerd als wijzigingen in de FRET-waarde >0.1 in de representatieve resultaten die hier worden besproken. De drempel voor overgangen is afhankelijk van de hypothetische conformatietoestanden die een eiwit van belang inneemt (stel de overgangsdrempel in om kleiner te zijn dan het verschil tussen de dichtstbijzijnde FRET-toestanden), evenals de resolutie die is toegestaan door de experimentele opstelling. Het onderzoek van heatmaps voor meerdere omstandigheden maakt het mogelijk om de meest voorkomende conformatietoestanden te identificeren waar een sensor doorheen gaat en dus inneemt. Vier FRET-staten werden geïdentificeerd voor de representatieve resultaten (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 en 0,89).
    4. Gebruik MATLAB-programma's om de verblijftijden voor elke geïdentificeerde conformatietoestand te extraheren. Wijs een reeks FRET-waarden aan die elke toestand en tijdresolutie tijdens gegevensverzameling afbakenen. FRET-bereiken zijn gelijkmatig verdeeld door aangrenzende FRET-toestanden. Exporteer de verblijftijden voor bepaalde behandelingsomstandigheden.
      OPMERKING: In de meeste gevallen kunnen verblijftijdgegevens goed worden geschat door een enkele exponentiële vervalfunctie. Deze analyse kan worden uitgevoerd in een data-analyse- en grafische software.
  4. Gaussische aanpassing van smFRET-populatiehistogrammen om de staatsbezetting te kwantificeren
    1. Importeer fret-histogrammen voor interessante omstandigheden in de data-analyse- en grafieksoftware voor analyse van meerdere piekaanpassingen.
    2. Geef het aantal aanwezige pieken aan (vier pieken of toestanden op basis van HMM-analyse). Aanpassing werd uitgevoerd met behulp van meerdere Gaussische verdelingen30 gedefinieerd als Equation 1, waarbij A het piekgebied is, xc het piekcentrum en w de piekbreedte voor elke piek.
    3. Beperk de aanpassingsparameters als A > 0, xc = FRET ± 0,02 en 0,1 ≤w≤ 0,24. Vier FRET-pieken voor individuele populatie FRET-histogrammen waren tegelijkertijd fit. Pas de gedefinieerde beperkingen toe voor de fittingen van alle omstandigheden.
    4. Bereken de staat van bezetting (percentage) als het gebied van de piek van de rente gedeeld door de totale oppervlakte, gedefinieerd als de som van alle pieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Expressie en fluorescerende etikettering van fret-sensor op basis van OCG
Hierin worden voorbeeldige resultaten van de insertie en fluorescerende etikettering van een OCG (AZP) binnen de CRD van mGluR2 (548UAA) besproken11. Zoals eerder vermeld, is het noodzakelijk om AZP in mGluR2 in te brengen, co-expressie van de gemanipuleerde translationele machinerie, die een gemodificeerd tRNA-synthetase en complementair tRNA (pIRE4-Azi) en mGluR2 bevat met een amberkleurig codon op positie 548, gemaakt met behulp van mutagenese (figuur 2A, B). De etikettering van AZP door cyaninekleurstoffen wordt bereikt door een kopergekatalyseerde cycloadditiereactie (figuur 2C) en resulteert in effectieve plasmamembraanetikettering van 548UAA (figuur 2D). Om de translatie van full-length 548UAA en de integriteit van de dimerische receptor te verifiëren, werd SDS-PAGE elektroforese uitgevoerd op het cellysaat van HEK293T-cellen die 548UAA tot expressie brengen, gelabeld met Cy5. Er werd een enkele band bij 250KDa waargenomen, die samenviel met de volledige lengte dimeric mGluR2 (figuur 2E).

Data-acquisitie en -analyse
Cellen die 548UAA tot expressie brachten met C-terminal FLAG-tag werden gelabeld met Cy3 (donor) en Cy5 (acceptor) en vervolgens gelyseerd met wasmiddel31 in aanwezigheid van een proteaseremmer voor in vitro onderzoek. Na voltooiing van de cellyse en verwijdering van de onoplosbare fractie door centrifugatie, werd het supernatant aangebracht op een polyethyleenglycol (PEG) -gepassiveerde coverslip gefunctionaliseerd met een anti-FLAG-tag antilichaam voor totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) beeldvorming (figuur 3). Het monster werd belicht met behulp van een 532 nm laser en deeltjes werden geselecteerd voor downstream analyse met behulp van smCamera-software. Ruwe donor-, acceptor- en FRET-sporen werden gegenereerd voor alle geselecteerde moleculen in smCamera en geselecteerd met MATLAB (sectie 6; Figuur 4). Een 8,8% donorbloedingscorrectie werd toegepast op acceptorintensiteiten voor de experimentele opstelling die hier wordt gebruikt. Deze correctiefactor zal variëren met de experimentele opstelling, dichroïsche filters en emissiefilters die worden gebruikt en moet worden bepaald door de donor- en acceptorsignalen te meten onder standaard experimentele omstandigheden met behulp van cellen die alleen met donorfluorfoor zijn gelabeld en de doorbloeding te berekenen ([acceptorintensiteit]/[donorintensiteit]). Figuur 4 toont verschillende representatieve FRET-sporen en bijbehorende donor- en acceptorsignalen. Deze sporen zijn geselecteerd aan de hand van criteria die eerder in het protocol zijn beschreven (paragraaf 6). Representatieve geselecteerde sporen die overgangen tussen meerdere toestanden en donor- en acceptorbleekgebeurtenissen laten zien, worden weergegeven in figuur 4B-D.

Identificatie van conformatietoestanden
Om de conformatietoestanden 548UAA bezet en de relatie van deze toestanden ten opzichte van elkaar te identificeren, werd Hidden Markov-modellering (HMM) -analyse uitgevoerd. HMM-analyse werd uitgevoerd met behulp van het vbFRET-programma uitgevoerd op MATLAB28 (figuur 5A). Figuur 5 gebruikt gegevens van een intermediaire glutamaatconcentratie (5μM) om het proces van toestandsidentificatie te illustreren. Op basis van ruwe smFRET-sporen werd verondersteld dat er tot vier potentiële FRET-toestanden bestonden voor de CRD. Het aantal staten was dus beperkt tot één tot vier. In totaal werden 25 iteraties van aanpassing uitgevoerd voor elk spoor om het aantal aanwezige toestanden te bepalen. Uit deze geïdealiseerde pasvormen kunnen overgangen tussen discrete FRET-toestanden worden geëxtraheerd en uitgezet als een heatmap met overgangsdichtheid (figuur 5B). De heatmap markeert vier discrete FRET-toestanden op 0,31, 0,51, 0,71 en 0,89, aangegeven met stippellijnen. Overgangen werden gedefinieerd als veranderingen in FRET >0.1. De geïdealiseerde FRET-sporen leveren ook informatie op over de verblijftijd voor elke geïdentificeerde conformatie (figuur 5C).

Populatie FRET histogram generatie en piekfitting
Representatieve sporen van één molecuul voor 548UAA in aanwezigheid van verschillende glutamaatconcentraties die handmatig werden geselecteerd voor verdere analyse, zijn weergegeven in figuur 6A,B. Een algemene analyse voor smFRET-experimenten is het genereren van populatiehitisogrammen uit honderden smFRET-sporen voor elke experimentele aandoening (figuur 6C). Populatie FRET histogrammen worden gemaakt van het segment van sporen voor het bleken. Om te voorkomen dat het histogram wordt vertekend in de richting van het gedrag van langere sporen, is het noodzakelijk om een genormaliseerd FRET-histogram te genereren van elk spoor voorafgaand aan het gemiddelde. Dit zorgt ervoor dat elk spoor evenveel bijdraagt aan het uiteindelijke histogram. In dit systeem tonen de FRET-histogrammen een algemene verschuiving naar hogere FRET met toenemende glutamaatconcentratie, wat wijst op een vermindering van de afstand tussen de centrale repro's en een verschuiving naar de actieve conformatie. Ongeacht de glutamaatconcentratie blijft het FRET-signaal echter vrij sporadisch, wat wijst op een hoge mate van intrinsieke dynamica voor de centrale repro. Naast de algemene verschuiving naar een hogere FRET, wordt een herverdeling van het conformatie-ensemble duidelijk in het histogram (kleurcurven). Individuele moleculen kunnen ook worden gezien die deze conformatietoestanden (stippellijnen) bezoeken (figuur 6B). Om de waarschijnlijkheid van staatsbezetting te bepalen, moet men het gebied van de piek delen door het totale gebied, gedefinieerd als de som van alle vier individuele piekgebieden. Het smFRET-histogram gegenereerd uit het smFRET-experiment van de CRD van mGluR2 vertoonde vier dynamische toestanden met pieken op respectievelijk 0,31, 0,51, 0,71 en 0,89 (gelabeld op toestanden 1-4).

Figure 1
Figuur 1: Stroomschema van het werkprotocol en de data-analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Plaatsspecifieke etikettering van mGluR2 door klikchemie. (A) Schematische weergave van het onnatuurlijke aminozuur 4-azido-L-fenylalanine-opnameproces in cellen. (B) Schematische weergave van plaatsspecifieke fluorescerende etikettering van mGluR2, met het onnatuurlijke aminozuur op positie 548, door koper-gekatalyseerde azide-alkyn klikreactie. (C) Driedimensionale structuur van fluorescerend gelabeld mGluR2 (donormolecuul in groen, acceptormolecuul in rood) met Cy3- en Cy5-moleculen gecoupeerd. (D) Representatieve confocale microscoopafbeelding van HEK293T-cellen die 548UAA tot expressie brengen met de celoppervlakpopulatie gelabeld met donor (groen: Cy3) en acceptor (rood: Cy5) fluoroforen door middel van klikchemie. Schaalstaven = 10 μm. (E) Afbeelding van niet-reducerende 4%-20% polyacrylamide gel elektroforese van cellysaat uit HEK293T cellen die 548UAA tot expressie brengen en gelabeld door Cy5-alkyn. De gel is afgebeeld met een excitatiegolflengte van 633 nm en een emissiefilter van 670 BP30-Lane a: eiwitladder; baan b: cellysaat; baan c: Cy5-alkyn kleurstof. De resultaten zijn representatief voor een individueel experiment. Panelen B, D en E worden hergebruikt van Liauw et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Schematische weergave van de smFRET experimenten en microscoopopstelling (TIRF). Het single-molecule fluorescentiebeeld van de donor wordt weergegeven in groen (schaalbalk = 1000 nm) en de acceptor in rood. De donor werd bij 532 nm opgewonden met behulp van een laser. De acceptant is enthousiast over FRET van de donor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Intensiteitssporen van donor (groen) en acceptor (rood) gelabeld mGluR2. (A) Cartoon met de receptordynamiek en verandering in afstand tussen FRET-sondes. (B) Langlevende hoge FRET-staat. (C) Meerdere FRET-staten met eerst acceptorfotobleaching gevolgd door donorfotobleaching. (D) Kortstondige FRET-toestand met acceptor photobleaching. (E) Langlevende stabiele FRET-toestand met acceptor fotobleaching. Deze figuur is met minimale modificatie gereproduceerd van Liauw et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Conformatietoestand identificatie. (A) Representatief FRET-spoor met geïdealiseerde pasvorm bedekt (rood) samen met het bijbehorende donor- en acceptorsignaal. (B) Heatmap met overgangsdichtheid die de meest voorkomende conformatieovergangen van 548UAA benadrukt. Stippellijnen geven FRET-statussen aan. (C) Gemiddelde verblijftijden van elke conformatietoestand. Deze figuur is gereproduceerd met een minimale wijziging van Liauw et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Single-molecule FRET onthult vier conformatietoestanden van mGluR2 CRD. (A) Representatief frame uit een film met één molecuul met het donorkanaal (Cy3) aan de linkerkant en het acceptorkanaal (Cy5) aan de rechterkant. Moleculen die door analysesoftware zijn geselecteerd voor downstream-verwerking worden aangegeven met groene cirkels. Schaalbalk = 3 μm. (B) Voorbeeld enkelmolecuulige tijdsporen van de 548UAA bij verschillende glutamaatconcentraties. Donor (groen) en acceptor (rood) intensiteiten en de bijbehorende FRET (blauw) worden getoond. Stippellijnen vertegenwoordigen vier verschillende FRET-toestanden. (C) smFRET-populatiehistogrammen in een reeks glutamaatconcentraties. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM. van N = 3 onafhankelijke experimenten. Deze figuur is gereproduceerd met een minimale wijziging van Liauw et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Samenvatting van het algemene protocol. (A) Workflow voor het kweken en labelen van cellen die een eiwit tot expressie brengen dat een onnatuurlijk aminozuur bevat. (B) Single-molecule FRET experimentele en analyseworkflow die wordt gebruikt om conformatietoestanden te identificeren en de dynamische eigenschappen van het CRD-domein in mGluR2 te karakteriseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bestanddeel Volume/reactie (μL)
Gereduceerd serummedium 100
Transfectiereagens 4.4
Bestanddeel Volume/reactie (μL)
Gereduceerd serummedium 100
P3000 4
Naam construct/component Concentratie (ng/μL) Volume/put (12-well) (μL) Putten (#) DNA toegevoegd (μL)
tRNA/synthetase 1000 1 1 1
Amber codon bevattende eiwitten 1000 1 1 1

Tabel 1: Reagentia voor de transfectie van de HEK 293 T-cel.

Reagentia Toe te voegen volume (μL) Voorraad conc (mM) Finale Conc (mM)
1x RB 655.5
Bttes 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
Naasc 17.5 100 2.5
Aminog 8.75 100 1.25
Cy3-Alkyne (10mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alkyne (10mM) 1.25 10 0.018

Tabel 2: Samenstelling van de etiketteeroplossing (klik chemie).

Aanvullend dossier 1: Samenstelling van verschillende buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GPCR's zijn eiwitten die op het celmembraan werken om signaaltransductie te initiëren. Veel GPCR's bestaan uit meerdere domeinen, waarbij signalering afhankelijk is van de coöperatieve interactie tussen de domeinen. Om de eigenschappen van deze membraanreceptoren te moduleren, is het essentieel om het dynamische gedrag van de meerdere domeinen te begrijpen. Single-molecule fluorescentie resonantie energieoverdracht (smFRET) is een fluorescentietechniek die het mogelijk maakt om eiwitconformatie en -dynamica in realtime te meten11,32. Hier wordt een benadering beschreven die smFRET, single-molecule pull-down (SiMPull) en total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie combineert om direct de herschikking van individuele eiwitten geïmmobiliseerd op een gepassiveerd oppervlak te visualiseren 5,11,33. FRET is zeer gevoelig voor afstand en functioneert effectief als een liniaal op nanoschaal die geschikt is voor het onderzoeken van intramoleculaire veranderingen (3-8 nm). In vergelijking met traditionele biofysische benaderingen is smFRET bijzonder geschikt voor de studie van grote conformatiedynamiek op een tijdschaal van ~ 10 ms en vereist het een klein monstervolume (ongeveer 1 fmole per experiment). Bovendien, in tegenstelling tot ensemblemetingen van conformatiedynamica, zoals die geleverd door nucleaire magnetische resonantie (NMR)34 of dubbele elektron-elektronenresonantie (DEER) spectroscopie35, maakt smFRET de expliciete toewijzing van zowel conformatietoestanden als hun tijdordening mogelijk, evenals de directe detectie van zeldzame en voorbijgaande tussentoestanden.

Momenteel vormen de beperkingen van locatiespecifieke fluorescerende etikettering een technische uitdaging die de bredere toepassing van smFRET verhindert om de conformatiedynamiek van eiwitten te bestuderen. Bovendien is het moeilijk om membraaneiwitten in grote hoeveelheden te zuiveren en hun activiteit te behouden. Gemeenschappelijke etiketteringsstrategieën maken gebruik van grote eiwitlabels of vereisen de generatie van minimale cysteïnemutanten, waardoor de fluorofoorconjugatie vaak wordt beperkt tot de termini van eiwitten zonder blootgestelde cysteïneresiduen. Om deze beperkingen te omzeilen, werd een onnatuurlijke aminozuur (OCG) opnamestrategie aangepast en geoptimaliseerd, waardoor niet-perturbatieve, residuspecifieke etikettering mogelijk werd met behulp van een koper-gekatalyseerde klikreactie 11,12,14. Deze strategie maakt het mogelijk om fluoroforen te conjugeren in de aan oplosmiddelen blootgestelde gebieden van de membraanreceptor en maakt het mogelijk een breder scala aan conformatiesensoren te genereren. In dit protocol wordt een enkel type conjugatiechemie gebruikt. Dit resulteert in donor-donor en acceptor-acceptor only populaties, die worden weggelaten tijdens downstream analyse. Als alternatief kunnen twee orthogonale etiketteringsstrategieën worden gebruikt om dit te voorkomen of mogelijke heterogeniteit te overwinnen wanneer het eiwit van belang niet symmetrisch is.

De directe vangst van eiwitten helpt om traditionele zuiveringsstappen te omzeilen die tijdrovend en technisch uitdagend zijn. Vanwege de cytotoxiciteit van koper wordt ook kopervrije klikchemie op basis van transcyclofluor36 of methyltetrazine37 gebruikt. Die reagentia zijn echter duur en de niet-regiospecifieke38-aard van de reactie resulteert in een lage opbrengst van fluorescerend gelabeld eiwit van belang.

Grondige richtlijnen voor in vitro smFRET-experimenten, van flowkamervoorbereiding tot data-analyse, werden hier gepresenteerd. De smFRET-gegevens werden verzameld met behulp van een TIRF-opstelling en de analyse werd uitgevoerd met behulp van een op maat geschreven MATLAB-code.

Een paar belangrijke overwegingen moeten worden opgemerkt. Ten eerste moet men het PEG-gepassiveerde oppervlak voorbereiden om homogeen en minder dicht te zijn met biotine-PEG. Overtollige biotine-PEG kan resulteren in overmatige eiwit pull-down, waardoor het moeilijk wordt om fluorescerende signalen van individuele moleculen op te lossen. Ten tweede moet het eiwitmonster (cellysaatsupernatant) grondig worden verdund voordat het aan de monsterkamer wordt toegevoegd om oppervlakteverzadiging te voorkomen. De opbrengst van eiwitten hangt af van de celdichtheid, het wasmiddel van keuze en de wasmiddelconcentratie. Om het aantal paren van enkele donoren en acceptoren te optimaliseren, moet men zich richten op een dichtheid van ~ 400 moleculen in een gezichtsveld van 256 x 512 pixels. Ten derde moet de Trolox-buffer worden bewaard bij −20 °C voor langdurig gebruik (maanden). Troloxbuffer blijft 2 weken stabiel bij opslag bij 4 °C. Ten slotte moet ervoor worden gezorgd dat er geen luchtbellen in de stroomkamer worden geïntroduceerd na functionalisatie met het antilichaam. Het drogen van de stroomkamer zal resulteren in een verminderde efficiëntie van eiwitimmobilisatie en monstereiwitdenaturatie.

De hier beschreven conformatiedynamiek van de hier beschreven mGluR2-sensor werd met succes onderzocht op individueel receptorniveau met behulp van smFRET en gaf inzicht in het mechanisme van receptoractivering. De CRD bleek een hoog niveau van intrinsieke dynamica aan te tonen, bestaande in een evenwicht tussen vier conformatie FRET-toestanden, ongeacht de aan- of afwezigheid van glutamaat. Een verschuiving naar hogere FRET-toestanden of een compactere receptor bleek op te treden op een glutamaatconcentratieafhankelijke manier (figuur 6). Interessant is dat zelfs bij verzadigde niveaus van glutamaat, de CRD dynamisch bleef. De hier gepresenteerde methode (samengevat in figuur 7) om de conformatiedynamica te begrijpen, is van toepassing op andere klasse C GPCR's, evenals andere membraaneiwitten zoals ionkanalen, ionotrope receptoren en receptor tyrosinekinasen (RTK's)32,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

We bedanken leden van het Reza Vafabakhsh lab voor de gesprekken. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant R01GM140272 (aan R.V.), door The Searle Leadership Fund for the Life Sciences aan de Northwestern University en door het Chicago Biomedical Consortium met steun van de Searle Funds van The Chicago Community Trust (aan R.V.). B.W.L. werd ondersteund door de National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Biochemie G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) conformatiedynamica membraanreceptoren onnatuurlijke aminozuren smFRET
Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banerjee, C., Liauw, B. W. H.,… More

Banerjee, C., Liauw, B. W. H., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter