Summary
이 연구는 비천연 아미노산(UAA) 통합을 통한 부위 특이적 표지를 사용하여 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에 대한 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET) 실험을 수행하는 자세한 절차를 제시합니다. 이 프로토콜은 smFRET 샘플 준비, 실험 및 데이터 분석을 위한 단계별 가이드를 제공합니다.
Abstract
외부 신호에 반응하는 세포의 능력은 세포 발달, 성장 및 생존에 필수적입니다. 환경의 신호에 응답하려면 세포가이를 인식하고 처리 할 수 있어야합니다. 이 작업은 주로 신호를 세포의 생화학 적 언어로 변환하는 역할을하는 막 수용체의 기능에 의존합니다. G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 단백질 계열을 구성합니다. GPCR 중에서 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 절대 이량 체로 기능하고 리간드 결합 부위를 포함하는 큰 세포 외 도메인을 보유하는 고유 한 하위 클래스입니다. mGluR의 구조 연구의 최근 발전은 활성화 과정에 대한 이해를 향상 시켰습니다. 그러나 활성화 및 변조 중에 mGluR을 통한 대규모 구조적 변화의 전파는 제대로 이해되지 않습니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단일 단백질 수준에서 생체 분자의 구조 역학을 시각화하고 정량화하는 강력한 기술입니다. mGluR2 활성화의 동적 과정을 시각화하기 위해 비천연 아미노산(UAA) 통합을 기반으로 하는 형광 입체 추적 센서가 개발되어 수용체의 고유 구조를 교란하지 않고 부위 특이적 단백질 표지를 수행할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 새로운 UAA 라벨링 접근법, 샘플 준비, smFRET 데이터 수집 및 분석을 포함하여 이러한 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이러한 전략은 일반화 가능하며 다양한 막 단백질의 구조적 역학을 조사하기 위해 확장 될 수 있습니다.
Introduction
원형질막을 통한 정보의 전달은 막 수용체1의 기능에 크게 의존합니다. 수용체에 대한 리간드 결합은 구조적 변화 및 수용체 활성화를 유도한다. 이 과정은 종종 자연에서 알로 스테 릭입니다2. 800명 이상의 구성원을 보유한 G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 인간에서 가장 큰 막 수용체 계열입니다3. 거의 모든 세포 과정에서의 역할로 인해 GPCR은 치료 개발의 중요한 표적이되었습니다. GPCR 신호전달의 표준 모델에서, 작용제 활성화는 G α의 뉴클레오티드 결합 포켓에서 GDP를 GTP로 교환함으로써 이종 삼량 체 G 단백질 복합체를 활성화시키는 수용체의 구조적 변화를 초래한다. 활성화 된 Gα-GTP 및 Gβγ 서브 유닛은 다운 스트림 이펙터 단백질의 활성을 제어하고 신호 전달 캐스케이드 4,5를 전파합니다. 이 신호 전달 과정은 본질적으로 수용체의 3 차원 모양을 변경하는 리간드의 능력에 의존합니다. 리간드가 이를 달성하는 방법에 대한 기계론적 이해는 새로운 치료제를 개발하고 합성 수용체 및 센서를 설계하는 데 중요합니다.
대사성 글루타메이트 수용체 (mGluRs)는 클래스 C GPCR 계열의 구성원이며 글루타메이트의 느린 신경 조절 효과 및 신경 흥분성 튜닝에 중요합니다 6,7. 모든 GPCR 중에서 클래스 C GPCR은 절대 이량체로 기능한다는 점에서 구조적으로 독특합니다. mGluR은 금성 파리 통 (VFT) 도메인, 시스테인이 풍부한 도메인 (CRD) 및 막 횡단 도메인 (TMD)의 세 가지 구조 도메인을 포함합니다 8. 활성화 과정 동안의 구조적 변화는 복잡하며 12nm 거리에 걸쳐 전파되는 국소 및 글로벌 구조적 결합과 이량체 협력성을 포함합니다. 중간 형태, 상태의 시간적 순서 및 상태 간의 전환 속도는 알려져 있지 않습니다. 개별 수용체의 형태를 실시간으로 추적함으로써 일시적인 중간 상태와 활성화 중 구조적 변화의 순서를 식별 할 수 있습니다. 이는 mGluR2 11의 활성화 동안 구조적 변화의 전파를 시각화하기 위해 최근에 적용된 것처럼 단일 분자 형광 공명 에너지 전달 9,10(smFRET)을 적용하여 달성할 수 있습니다. FRET 실험의 핵심 단계는 공여체 및 수용체 형광단을 관심 단백질에 부위 특이적으로 삽입하여 FRET 센서를 생성하는 것입니다. 비천연 아미노산(UAA) 혼입 전략이 채택되었습니다 12,13,14,15 시스테인이 없는 돌연변이를 생성하거나 유전적으로 암호화된 큰 태그를 삽입해야 하는 일반적인 부위 특이적 형광 표지 기술의 한계를 극복하기 위해. 이를 통해 mGluR2의 리간드 결합 및 신호 전달 도메인에 합류하는 필수 콤팩트 알로스테릭 링커의 구조적 재배열을 관찰할 수 있었습니다. 이 프로토콜에서는 구리 촉매 아지드 고리화 반응을 사용하여 형광단을 부착하기 위해 UAA로 mGluR2의 부위별 라벨링에 대한 접근 방식을 포함하여 mGluR2에 대한 smFRET 실험을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제시됩니다. 또한, 이 프로토콜은 막 단백질의 직접 포획 및 데이터 분석을 위한 방법론을 설명합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 막 단백질의 구조적 역학을 연구하는 데에도 적용 할 수 있습니다.
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Protocol
프로토콜의 전체 워크플로는 그림 1에 설명되어 있습니다.
1. 샘플 챔버의 준비
- 슬라이드 및 커버슬립 청소
알림: 이 단계는 슬라이드의 표면과 커버슬립을 청소하고 아미노실란화를 준비하는 것을 목표로 합니다. 표면 결합 분자에 대한 단일 분자 형광 실험을 수행하기 위한 한 가지 중요한 요구 사항은 부동태화 표면입니다. 가장 신뢰할 수 있고 재현 가능한 패시베이션 기술은 불활성 폴리머 사슬을 유리 표면에 조밀 한 층으로 공유 결합시키는 것을 포함합니다. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 표면 패시베이션에 사용되는 가장 효율적인 폴리머입니다16. PEG(PEGylation)를 이용한 패시베이션 절차의 세부사항은 다음과 같다.- 마커로 슬라이드에 뚫을 구멍을 표시하십시오 (~ 6mm 떨어져 가장자리에서 멀리 떨어져 있음). Dremel을 사용하여 유리 슬라이드에 작은 구멍(직경 1mm)을 뚫습니다. 드릴링 과정에서 슬라이드를 물에 담그십시오.
- 슬라이드를 아세톤으로 세척하여 마커에서 남은 잉크를 제거합니다.
- 아세톤에서 꺼내 슬라이드를 물로 헹군 다음 전자레인지에 5분 동안 고출력(700W)의 물에서 돌립니다.
- 초음파 처리 할 유리 얼룩 병에 넣기 전에 슬라이드를 물로 청소하십시오. 커버 슬립을 다른 염색 병에 넣으십시오.
- 슬라이드 및 커버슬립을 23°C의 욕조 초음파 처리기에서 30분 동안 아세톤으로 초음파 처리합니다.
- 그 동안 다음 단계에서 사용되는 아미노실란화 용액을 제조하기 위해 유리 플라스크를 세척합니다. 플라스크를 1M KOH로 채우고 플라스크를 30분 동안 초음파 처리하고 KOH를 물로 완전히 헹구고 메탄올에서 추가로 30분 동안 초음파 처리합니다. 플라스크를 아미노실란화 단계의 시점까지 메탄올에 방치한다.
- 그 동안 냉동고(-20°C)에서 아미노실란, mPEG 및 비오틴-PEG를 제거하고 어둠 속에서 실온(RT)에 도달하도록 합니다.
- 슬라이드와 커버슬립 용기에서 아세톤을 적절한 화학 폐기물 용기에 버리고 물로 완전히 헹군 다음 슬라이드를 5M KOH에서 30분 동안 초음파 처리합니다.
- 슬라이드와 커버 슬립을 물로 헹구고 메탄올로 2 분 동안 초음파 처리합니다 (두 번 반복). 아미노실란화 단계까지 메탄올로 채워진 항아리를 그대로 두십시오.
알림: 이 연구에서는 달리 언급되지 않는 한 탈이온수가 사용됩니다. 23 °C에서 작동하는 목욕 초음파 처리기가 사용됩니다.
- 아미노실란화
알림: 이 단계는 아미노실란을 깨끗한 슬라이드 및 커버슬립 표면에 공유 연결하는 것을 목표로 합니다. 기능화된 mPEG 및 비오틴-PEG는 다음 단계에서 이 표면에 공유결합할 것이다.- 깨끗한 플라스크에서 아미노실란화 혼합물을 준비한다(단계 1.6). 메탄올(150 mL), 아세트산(7.5 mL, 유리 피펫 사용) 및 아미노실란(2.5 mL)을 혼합하여 용액을 준비한다.
- 화학 흄 후드에 용액을 부드럽게 섞은 다음 슬라이드와 커버 슬립 병에 붓습니다. 커버슬립에는 50mL, 슬라이드에는 100mL를 사용합니다. 슬라이드와 커버슬립이 용액에 완전히 잠겼는지 확인합니다.
- 10 분 동안 배양 한 다음 항아리를 1 분 동안 초음파 처리 (초음파 처리는 표면에서 불순물을 제거함)하고 10 분 동안 더 배양합니다.
- 아미노실란화 용액은 폐기물 수집 용기에 폐기한다. 항아리에 메탄올을 넣고 뚜껑으로 항아리를 닫고 손으로 부드럽게 흔 듭니다. 메탄올을 폐기하고 항아리에 물을 채 웁니다.
- 아미노 실란 병을 냉동실 (-20 ° C)로 되돌립니다.
- 페길화
참고: 이 단계에서는 PEGylation 절차를 설명합니다.- 아미노실란화 동안, 페길화 완충액을 준비한다. 84mg의 중탄산나트륨(NaHCO3)의 무게를 달아 10mL의 물(10mM)에 첨가합니다. 또한 mPEG와 비오틴-PEG의 무게를 측정하여 따로 보관하십시오. 6 개의 슬라이드와 커버 슬립의 경우 96mg의 mPEG와 1.2-2.4mg의 비오틴 -PEG를 사용하십시오.
알림: 비오틴-PEG는 배경 반점의 수를 늘릴 수 있으므로 너무 많이 추가하지 않는 것이 중요합니다. 슬라이드에 적용하기 직전까지 PEG 혼합물을 용해시키지 마십시오. - 슬라이드를 물로 헹구고 부드러운 바람으로 말린 다음 가습 조립 상자에 넣습니다.
참고: 깨끗한 항공사를 이용하는 것은 필수입니다. 유리에 잔류물을 남길 수 있는 압축 통조림 공기를 사용하지 마십시오. - PEG 분말 혼합물에 페길화 완충액을 추가하고 피펫을 위아래로 부드럽게 여러 번 올려 녹입니다. 슬라이드당 55μL의 페길화 버퍼를 추가합니다(6개의 슬라이드의 경우 330μL의 페길화 버퍼 추가).
- 23°C에서 1분 동안 9,600 x g 로 원심분리하여 용해되지 않은 입자를 침전시킵니다. 다음 단계에서 사용할 상청액을 수집합니다.
참고 : 비오틴 -PEG는 NHS 그룹의 존재로 인해 빠르게 가수 분해됩니다. 혼합 및 원심분리 단계를 신속하게 수행하는 것이 중요합니다. - 각 슬라이드에 60μL의 PEG화 용액을 도포한 다음 PEGylation 용액이 슬라이드와 커버슬립 사이에 끼워지도록 커버슬립을 맨 위에 놓습니다.
알림: 슬라이드와 커버슬립 사이에 기포가 생기면 패시베이션 효율이 감소하므로 피하십시오. 피펫 팁으로 커버슬립과 슬라이드를 조정하여 기포를 제거합니다. - 슬라이드를 평평하고 어두운 서랍에 놓습니다. 슬라이드는 밤새 보관할 수 있습니다. 그러나 4-6 시간 동안 배양하면 최적의 패시베이션이 발생합니다.
참고: 어느 쪽이 페길화되었는지 기억하는 것이 중요합니다. - 보관하기 전에 페길화되지 않은면을 표시하십시오. 배양 후 슬라이드와 커버 슬립을 부드럽게 분해하고 물로 완전히 헹굽니다.
- 공기를 불어 슬라이드와 커버 슬립을 말리십시오. 슬라이드와 커버슬립을 멸균 튜브(50mL)에 보관하고 PEG화된 표면이 서로 반대쪽을 향하도록 합니다. 실험 당일까지 -20 °C에서 보관하십시오.
알림: 준비 후 4주 이내에 슬라이드와 커버슬립을 사용하는 것이 가장 좋습니다. PEG화 된 표면은 서로 마주 봐야합니다. PEG화된 슬라이드와 커버슬립을 진공 밀봉 백에 보관하면 유통 기한을 늘릴 수 있습니다.
- 아미노실란화 동안, 페길화 완충액을 준비한다. 84mg의 중탄산나트륨(NaHCO3)의 무게를 달아 10mL의 물(10mM)에 첨가합니다. 또한 mPEG와 비오틴-PEG의 무게를 측정하여 따로 보관하십시오. 6 개의 슬라이드와 커버 슬립의 경우 96mg의 mPEG와 1.2-2.4mg의 비오틴 -PEG를 사용하십시오.
2. 비천연 아미노산이 혼입된 mGluR2 발현, 형광 표지 및 추출
참고: 이 프로토콜은 UAA 4-아지도-L-페닐알라닌(AZP)을 포함하는 mGluR2를 발현하기 위한 세포의 준비, 시약 및 치료를 간략하게 설명합니다. 절차는 293mm 유리 커버슬립에서 성장한 HEK18T 세포를 위한 것입니다. 필요에 따라 절차를 확장할 수 있습니다.
- 시드
참고: HEK293T 세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청, 100단위·mL-1 페니실린- 스트렙토마이신 및 15mM HEPES 완충액(보충 파일 1)(pH 7.4)이 보충된 DMEM에서 37% CO2 하에 37°C에서 유지합니다.- 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 계대배양한다. HEK293T 세포를 폴리 -L / D- 라이신 (PLL / PDL) 유리 커버 슬립에 파종하여 형질 주입시 ≥80 % 컨플루언시에 도달합니다.
- 형질주입
- 0.1 M NaOH에서 AZP의 40 mM 저장 용액을 준비한다.
- 세포 성장 및 mGluR2 발현을 위해 AZP 보충 배지를 준비합니다. 40 mM AZP 스톡 용액을 사용하여 표준 배지 (+ FBS, 펜 / 스트렙, 15 mM HEPES)를 보충하십시오. 최종 AZP 농도를 0.6mM로 가져옵니다. 1 M hepes 용액을 추가합니다 (40 mM AZP 스톡 용액의 절반 부피 추가). 예를 들어, 10mL의 AZP 보충 배지를 준비하려면 9.775mL의 표준 배지, 150μL의 40mM AZP 원액 및 75μL의 1M Hepes 용액을 결합합니다.
- 주사기 필터(0.2 μm, PES)를 사용하여 매체를 여과(살균)합니다.
- 형질주입 전에 표준 배지를 AZP 보충 배지가 포함된 배지로 교체하십시오.
참고: 미디어를 교체하는 동안 셀을 건조시키지 않도록 주의하십시오. - 제조자의 매뉴얼에 따라 형질주입 시약(재료 표)으로 세포를 형질감염시킨다. 총 2μg의 DNA(tRNA/신테타제 1000ng + 호박색 코돈 함유 단백질 플라스미드 1000ng)를 사용하여 18mm 커버슬립에 HEK293T 세포를 형질주입합니다. 사용된 성분의 농도와 부피에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
- 형질주입 후 24시간 후에 배지를 새로운 AZP 보충 배지로 변경하고 세포가 추가로 24시간 동안 성장하도록 합니다.
- 알킨 시아닌 염료로 라벨링
- 라벨을 부착하기 20분 전에 커버슬립을 따뜻한(37°C) 기록 버퍼(RB)(보충 파일 1)로 두 번 세척하고 AZP가 없는 따뜻한(37°C) 표준 미디어(+FBS, Pen/Strep, 15mM Hepes)로 옮깁니다.
- Cy3- 알킨, Cy5- 알킨, BTTES, 구리 (II) 설페이트 (CuSO4), (+) 나트륨 L- 아스 코르 베이트 및 아미노 구아니딘을 포함하는 표지 용액을 준비합니다.
- 솔루션을 만들고 추가하는 순서를 따르십시오(표 2).
- 50mM BTTES를 준비하십시오.
- 100 mM 아미노구아니딘을 준비합니다.
- 100 mM Na- 아스 코르 베이트를 준비하십시오.
- 655.5 μL의 RB를 준비합니다.
- Cy3 / Cy5 알킨 염료 (DMSO 스톡 중 10mM)를 RB에 첨가하십시오.
참고: RB에 아미노구아니딘을 첨가하십시오. - 20 mM CuSO4를 준비한다.
- 새 튜브에 CuSO4와 BTTES를 혼합합니다 (용액이 파란색으로 바뀝니다).
- CuSO4 및 BTTES 혼합물을 RB (2.3.3.6.)
- Na-아스 코르 베이트를 추가하십시오.
- 2mm 커버슬립의 경우 아래 표 18 에 제공된 부피를 따르십시오.
- 용액을 완전히 혼합하고 세포를 표지하기 전에 얼음과 어둠 속에서 10 분 동안 배양하십시오.
- 커버슬립에 라벨링 용액을 추가하기 전에 미디어를 제거하고 RB로 세척하십시오. 라벨링 용액을 첨가하고 어두운 조건에서 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 알림: 라벨링을 개선하려면 10분 후에 글루타메이트(최종 농도 ~0.5mM)를 추가하고 추가로 5분 동안 배양합니다. 구리는 세포에 매우 독성이 있으며 표지 반응은 생체 내에서 15 분 이상 지속되어서는 안됩니다. 모든 구성 요소를 신선하게 준비하십시오. 마지막으로 Na-아스 코르 베이트를 추가하십시오. 준비하는 동안 반응물을 4°C로 유지하십시오. 그러나, 표지 용액의 첨가시, 세포는 배양기 내부에 37°C에서 저장되어야 한다.
- 세포 수확 및 단백질 추출 (세포 용해)
- 표지 용액을 제거하고, mGluR2 형질감염된 세포를 함유하는 커버슬립(18 mm)을 RB로 2회 세척한다.
- 피펫을 사용하여 커버슬립에서 세포를 씻어내고 RB(1mL)에 재현탁합니다.
알림: 이 시점 이후에는 샘플이 빛에 노출되는 것을 최대한 최소화하십시오. - 세포를 펠렛화하여 4°C에서 5분 동안 1,000 x g 에서 방사하고 상청액을 제거한다. 세포 펠릿을 80-130 μL의 용해 용액에 재현탁시킨다.
알림: 셀 펠릿은 눈으로 볼 수 있어야 합니다. 용해 부피는 라벨링 및 세척 과정에서 손실되는 샘플의 양에 따라 다릅니다. - 펠릿을 분해하기 위해 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다. 호일로 싸서 4 ° C에서 0.5-1 시간 동안 로커에 올려 세포를 용해시킵니다.
- 불용성 분획을 20분 동안 20,000 x g 및 4°C에서 원심분리하여 펠렛화한다. 상청액을 신선한 콜드 튜브(형광 태그가 붙은 관심 단백질을 포함하는 용해된 단백질)로 옮기고 실험을 위해 얼음에 저장합니다.
3. 단일 분자 흐름 챔버 조립 및 기능화
- 냉동실에서 슬라이드와 커버슬립을 제거하고 어둠 속에서 RT에서 따뜻하게 합니다(~30분).
- 슬라이드와 커버슬립 사이에 양면 테이프 스트립을 끼워 양면 테이프를 사용하여 챔버를 조립합니다. PEG화된 표면이 유동 챔버의 내부를 형성하는지 확인하십시오.
- 피펫 팁을 사용하여 커버슬립을 눌러 테이프가 커버슬립과 슬라이드 모두에 완전히 접촉하는지 확인합니다. 커버슬립이 파손되지 않도록 주의하십시오. 슬라이드 가장자리에 에폭시를 바르십시오.
알림: 뚫린 구멍에 에폭시가 채워질 정도로 많이 추가하지 마십시오. - 덮개슬립 쪽이 아래를 향하도록 흐름 챔버를 가습된 어두운 상자에 넣어 에폭시가 건조되도록 합니다(~30분).
알림: 건조 기간 동안 에폭시가 구멍(10-15μL)을 덮지 않도록 천공된 구멍을 통해 T50 버퍼(보충 파일 1)를 추가합니다. - 각 레인에 ~40μL를 천천히 적용하여 500nM Neutravidin(T50으로 희석)으로 각 챔버 레인을 인큐베이션합니다.
- 가습 된 다크 박스 안에서 2 분 동안 RT에서 배양하십시오. 레인당 ~100μL의 T50 버퍼로 세척합니다.
- 각각의 챔버 레인을 20 nM 비오티닐화 항체11로 인큐베이션한다. 항체의 선택은 단백질의 태그에 달려 있습니다.
참고: 1차 항체가 비오티닐화되지 않은 경우 먼저 비오틴화된 2차 항체와 함께 30분 동안 배양한 다음 1차 항체와 함께 인큐베이션합니다. - 가습 된 어두운 상자 안에서 30 분 동안 RT에서 배양하십시오. 레인당 ~200μL의 T50으로 세척하십시오.
알림: 준비 과정에서 차선이 마르지 않도록하십시오.
4. 단일 분자 완충액
- 트롤록스 버퍼
알림: Trolox 버퍼는 이미징 버퍼를 만들기 위한 시작 버퍼입니다. 완충액의 성분은 실험에 의존적이고, 관심있는 단백질에 따라 달라질 수 있다. 여기에 설명 된 프로토콜에 사용되는 완충액에는 염 (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), 완충제 (HEPES) 및 Trolox (pH ~ 7.35)가 포함됩니다.- 10 mL의 단일 분자 기록 완충액(SRB, 보충 파일 1)에 9-10 mg의 Trolox를 녹입니다.
알림: Trolox는 버퍼를 약산성으로 만듭니다. 이 단계에서 수산화나트륨(NaOH) 용액 10 M(pH 7.35)을 사용하여 pH를 조정한다. 미세한 pH 조정은 Trolox가 완전히 용해 된 후에 이루어집니다. 그러나이 시점에서 pH를 높이면 Trolox의 용해도가 증가합니다. - 트롤록스를 완전히 용해시키기 위해 4-8 시간 동안 벤치 탑 로커 (알루미늄 호일로 싸인)를 사용하여 RT에서 용액을 혼합하십시오.
- pH를 확인하고 필요한 경우 조정하십시오.
- 트롤록스가 완전히 용해되었는지 확인하십시오. 주사기 필터로 용액을 멸균하고 4 ° C에서 보관하십시오.
알림: 버퍼는 2-10 일 숙성 후에 사용해야합니다. Trolox는 깜박임을 억제하는 데 도움이되며 단일 분자 연구에서 일반적으로 사용됩니다17. 깜박임 방지 특성은 Trolox18의 산화 된 유도체에서 비롯됩니다. 따라서 성숙하기 위해 최소 몇 시간 동안 RT에 보관하는 것이 좋습니다. 추가적으로, 신선한 Trolox 용액의 UV 방사선은 산화 과정을 가속화하고, Trolox 완충액(18)의 "노화"를 가속화하는데 사용될 수 있다.
- 10 mL의 단일 분자 기록 완충액(SRB, 보충 파일 1)에 9-10 mg의 Trolox를 녹입니다.
- 이미징 버퍼 레시피: Trolox 버퍼 + 세제(세제 CMC 값의 ~2배) + 4mM 프로토카테추산(PCA)을 혼합합니다.
알림: 세제 농도가 높으면 단백질 변성이 증가할 수 있으므로 세제 농도는 CMC 근처에 유지됩니다. 예를 들어, 다음 혼합물은 100 mM PCA 원액의 955 μL 트롤록스 + 5 μL 10% DDM + 콜레스테롤 (W%, 10:1) + 40 μL를 사용할 수 있다. 여기서, PCA는 항산화제로서 작용하며, 이전에 smFRET 연구19에서 사용되었다. DDM은 비이온성이며 일반적으로 막 단백질20,21을 가용화하는 데 사용되며 단일 분자 연구에 사용되었습니다. DDM은 좋은 첫 번째 선택 세제입니다. 그러나 여러 세제를 테스트하고 결과가 일관되는지 확인하는 것이 좋습니다.
5. 현미경 설정 및 smFRET 데이터 수집
- 컴퓨터와 현미경을 켭니다. 레이저를 켜서 예열합니다 (Cy532 여기의 경우 3nm, Cy640 여기의 경우 5nm).
참고: 여기에서는 100x TIRF 대물렌즈(N.A. 1.49), 이미지 분배기 및 EMCCD 카메라가 장착된 도립 현미경이 사용되었습니다. 설정에는 4라인 레이저 결합기, 다이크로익 미러, 롱 패스 방출 필터, 방출 다이크로익 필터 및 노치 필터가 장착되어 있습니다. - EMCCD 카메라를 켜고 카메라 소프트웨어를 엽니다. 카메라가 -69 °C에 도달하고 안정화될 때까지 20분 동안 기다립니다.
- 샘플 챔버를 현미경 스테이지에 장착합니다. 시야당 ~400개의 분자를 달성하기 위해 단백질 샘플을 점진적으로 추가합니다(단계 2.4.5). 100 μL의 이미징 버퍼로 챔버를 세척합니다.
- 게인, 획득 속도 및 레이저 출력을 조정하여 단일 분자 형광 신호가 도너 및 수용체 채널 모두에서 감지되도록 합니다. 필요한 경우 샘플 챔버 내부의 단백질 농도를 조정합니다.
참고: 시야에 400개 이상의 분자가 있으면 개별 분자를 구별하기가 더 어려워지고 배경 소음이 높아집니다. - 기증자를 흥분시키고 시야에있는 기증자 분자의 80 % 이상이 광 표백 될 때까지 시간 흔적을 얻습니다.
- 영화가 끝나면 640nm 레이저를 켜서 일부 수용체 분자가 광퇴색될 때까지 수용체를 직접 여기시켜 단일 분자가 다량체 식별을 용이하게 합니다.
- 다른 시야로 이동하고 위의 단계를 반복하여 조건당 최소 3개의 동영상(기술 복제)을 수집합니다.
알림: 새로운 관심 영역(ROI)을 선택하고 초점을 맞추면서 가능한 가장 낮은 레이저 출력을 사용하여 광퇴색을 최소화하십시오. 획득 중 스테이지 드리프트에주의하십시오. 새로운 ROI로 이동한 후 눈에 띄는 드리프트가 관찰되면 획득을 시작하기 전에 3분 동안 기다리십시오.
6. 데이터 분석
- 기증자 및 수용체 채널 정렬(동영상 매핑)
- 형광 비드 이미지를 공여체 및 수용체 채널에 기록합니다.
- 비드 데이터를 사용하여 맵핑 파일을 생성하여 각 분자(22, 23)로부터의 공여체 및 수용체 형광을 상관시킨다.
알림: 단일 분자의 방출 신호는 이미지 분배기 내부의 방출 이색성 필터에 의해 공여체와 수용체 신호로 분할됩니다. 기증자와 수용체 이미지는 카메라에 나란히 투사됩니다. 두 영역 사이의 단일 분자의 공여체 및 수용체 강도를 정확하게 연관시키기 위해 형광 비드 샘플을 사용하여 매핑 파일이 생성되는 경우가 많습니다. 이 매핑 파일을 사용하여 공여체 및 수용체 채널에서 검출되는 모든 분자가 서로 매핑됩니다. 그런 다음 분석은 각 분자에 대해 시간 경과에 따른 기증자 및 수용체 강도인 시간 추적을 생성합니다.
- 단일 분자 FRET 트레이스 선택(입자 피킹)
참고: 개별 입자 트레이스는 MATLAB을 사용하여 다운스트림 분석을 위해 검사되고 선택됩니다. 정확한 선택 기준은 시스템에 따라 다릅니다. 품질 입자를 구성하는 요소에 대한 일반적인 지침은 여기에 요약되어 있습니다. 모든 사용자 지정 수정 코드는 GitHub(https://github.com/vafabakhsh-lab)에서 사용할 수 있습니다.- 추적의 총 강도(기증자 + 수용체)가 시간이 지남에 따라 안정적인 추적을 선택합니다. 기증자 및 수용체 강도의 상관 관계 변화가 없는 추적을 선택합니다.
- 단일 단계 광퇴색을 보여주는 공여체 및 수용체 분자를 선택하십시오. >5초 길이의 트레이스를 선택합니다.
알림: 표백 후 각 채널의 배경은 0으로 이동해야 합니다. 추적에는 깜박이는 이벤트가 많지 않아야 합니다. 이것은 분석의 어려움을 증가시킬 것입니다. - 방정식 E = (IA− 0.088 × ID)/(ID + [IA− 0.088 ×ID])24,25,26을 사용하여 FRET 효율을 계산 하고, 여기서 ID 및 IA는 각각 원시 공여체 및 수용체 강도입니다.
참고: 수용체 채널로의 공여체 방출의 누출은 532nm 레이저(26)를 사용하여 여기된 공여체-표지된 샘플을 사용하여 결정된다. 누설 보정 계수 0.088은 사용된 필터 세트에 따라 설정마다 다를 수 있습니다. FRET 효율을 절대 거리로 정량적이고 강력하게 변환하려면 여러 요인에 대한 공여체 및 수용체 강도의 수정이 필요하며27 이전에 광범위하게 논의되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
- 히든 마르코프 모델링(HMM)으로 구조적 상태 식별
- MATLAB에서 vbFRET28 프로그램을 실행하고 주어진 조건에 대해 선택한 트레이스를 가져옵니다. 실행할 잠재적 상태 및 반복 수에 대한 제약 조건을 설정합니다.
참고: 대표 결과의 원시 데이터를 기반으로 구조 센서가 차지하는 최대 4개의 개별 FRET 상태가 있다는 가설을 세웠습니다. 따라서 1에서 4까지의 범위가 지정되었습니다. 피팅의 개선은 이전에 >25회 반복으로 무시할 수 있을 정도로 증가하는 것으로 결정되었습니다. 따라서 대표 데이터를 피팅하기 위해 25 회 반복이 사용되었습니다. - smFRET 추적을 분석하고 이상적인 추적 및 분석 세션을 내보냅니다. 다운스트림 분석을 위해 이상적인 추적을 별도의 폴더에 저장합니다.
참고: 이상화된 추적으로부터 상태 전이 및 체류 시간 데이터를 추출하는데 사용된 프로그램들은 이전에 공개된 작업(29)에서 이용가능하게 되었다. - MATLAB 프로그램을 사용하여 상태 전이를 추출하고 시작 형태를 나타내는 X 좌표와 종료 형태를 나타내는 Y 좌표를 사용하여 히트맵으로 플로팅합니다.
참고: 전환은 여기에 설명된 대표 결과에서 FRET 값 >0.1의 변경으로 정의됩니다. 전이에 대한 임계값은 관심 단백질이 차지하는 가설된 구조적 상태(가장 가까운 FRET 상태 간의 차이보다 작게 전이 임계값 설정)와 실험 설정에서 허용하는 분해능에 따라 달라집니다. 여러 조건에 대한 히트맵을 검사하면 센서가 전환하여 차지하는 가장 일반적인 구조적 상태를 식별할 수 있습니다. 대표적인 결과에 대해 4개의 FRET 상태가 확인되었습니다(FRET = 0.31, 0.51, 0.71 및 0.89). - MATLAB 프로그램을 사용하여 식별된 각 형태 상태에 대한 체류 시간을 추출합니다. 데이터 수집 중 각 상태 및 시간 분해능을 설명하는 FRET 값 범위를 지정합니다. FRET 범위는 인접한 FRET 상태로 균등하게 나뉩니다. 지정된 처리 조건에 대한 체류 시간을 내보냅니다.
참고: 대부분의 경우 체류 시간 데이터는 단일 지수 감쇠 함수로 잘 추정할 수 있습니다. 이 분석은 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어에서 수행할 수 있습니다.
- MATLAB에서 vbFRET28 프로그램을 실행하고 주어진 조건에 대해 선택한 트레이스를 가져옵니다. 실행할 잠재적 상태 및 반복 수에 대한 제약 조건을 설정합니다.
- 상태 점유를 정량화하기 위한 smFRET 모집단 히스토그램의 가우스 피팅
- 관심 조건에 대한 모집단 FRET 히스토그램을 데이터 분석 및 다중 피크 피팅 분석을 위한 그래프 소프트웨어로 가져옵니다.
- 존재하는 피크의 수를 나타냅니다(HMM 분석을 기반으로 한 4개의 피크 또는 상태). 피팅은 로 정의된 다중 가우시안 분포(30 )를
사용하여 수행되었으며, 여기서 A 는 피크 면적, xc 는 피크 중심, w 는 각 피크에 대한 피크 폭이다. - 피팅 파라미터를 A > 0, xc = FRET ± 0.02 및 0.1≤w≤ 0.24로 제한합니다. 개별 집단 FRET 히스토그램에 대한 4개의 FRET 피크가 동시에 적합하였다. 정의된 구속조건을 모든 조건의 피팅에 적용합니다.
- 점유 상태(백분율)를 관심 피크 영역을 전체 영역으로 나눈 값으로 계산하고 모든 피크의 합으로 정의합니다.
사용하여 수행되었으며, 여기서 A 는 피크 면적, xc 는 피크 중심, w 는 각 피크에 대한 피크 폭이다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UAA 기반 FRET 센서의 발현 및 형광 표지
본원에서, mGluR2(548UAA)의 CRD 내 UAA(AZP)의 삽입 및 형광 표지의 예시적인 결과가 논의된다 도11에 논의된다. 앞서 언급했듯이 AZP를 mGluR2에 삽입하려면 변형된 tRNA 신테타제 및 상보성 tRNA(pIRE4-Azi)와 돌연변이 유발을 사용하여 생성된 위치 548에 호박색 코돈을 포함하는 mGluR2를 포함하는 조작된 번역 기계의 동시 발현이 필요합니다(그림 2A,B). 시아닌 염료에 의한 AZP의 라벨링은 구리 촉매 고리 첨가 반응 (그림 2C)에 의해 달성되며 548UAA의 효과적인 원형질막 라벨링 (그림 2D)을 초래합니다. 전장 548UAA의 번역 및 이량체 수용체의 완전성을 확인하기 위해, Cy5로 표지된 548UAA를 발현하는 HEK293T 세포로부터의 세포 용해물에 대해 SDS-PAGE 전기영동을 수행하였다. 250KDa에서 단일 대역이 관찰되었으며, 이는 전장 이량체 mGluR2와 일치했습니다(그림 2E).
데이터 수집 및 분석
C-말단 FLAG-태그로 548UAA를 발현하는 세포를 Cy3 (공여체) 및 Cy5 (수용체)로 표지한 다음, 시험관내 연구를 위해 프로테아제 억제제의 존재하에 세제31로 용해시켰다. 세포 용해가 완료되고 원심분리에 의한 불용성 분획의 제거가 이루어지면, 상청액을 전반사 형광(TIRF) 이미징을 위해 항-FLAG-태그 항체로 기능화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부동태화 커버슬립 상에 도포하였다(그림 3). 샘플은 532nm 레이저를 사용하여 조명되었으며 입자는 smCamera 소프트웨어를 사용하여 다운스트림 분석을 위해 선택되었습니다. 원시 공여체, 수용체 및 FRET 트레이스를 smCamera에서 선택된 모든 분자에 대해 생성하고 MATLAB을 사용하여 선택하였다(섹션 6; 그림 4). 8.8% 공여체 블리드스루 보정이 여기에 사용된 실험 설정에 대한 수용체 강도에 적용되었습니다. 이 보정 계수는 사용된 실험 설정, 이색성 필터 및 방출 필터에 따라 달라지며 공여 형광단으로만 표지된 세포를 사용하여 표준 실험 조건에서 공여체 및 수용체 신호를 측정하고 블리드스루([수용체 강도]/[공여체 강도])를 계산하여 결정해야 합니다. 그림 4는 몇 가지 대표적인 FRET 트레이스와 해당 공여 및 수용체 신호를 보여줍니다. 이러한 추적은 이전에 프로토콜에 설명된 기준을 사용하여 선택되었습니다(섹션 6). 다중 상태와 공여자 및 수용체 표백 이벤트 사이의 전환을 보여주는 대표적인 선택된 트레이스가 그림 4B-D에 나와 있습니다.
구조적 상태 식별
548UAA가 점유한 구조적 상태와 이들 상태들의 관계를 서로 연관시키는 것을 확인하기 위해, 히든 마르코프 모델링(HMM) 분석이 수행되었다. HMM 분석은 MATLAB28 에서 실행된 vbFRET 프로그램을 사용하여 수행하였다(도 5A). 그림 5 는 중간 글루타메이트 농도 (5μM)의 데이터를 사용하여 상태 식별 프로세스를 보여줍니다. 원시 smFRET 트레이스를 기반으로 CRD에 대해 최대 4개의 잠재적 FRET 상태가 존재한다는 가설이 세워졌습니다. 따라서 주 수는 1에서 4로 제한되었습니다. 전체적으로 존재하는 상태의 수를 결정하기 위해 각 추적에 대해 25번의 피팅 반복이 수행되었습니다. 이러한 이상적인 피팅에서 이산 FRET 상태 간의 전환을 추출하고 전이 밀도 히트맵으로 플로팅할 수 있습니다(그림 5B). 히트맵은 점선으로 표시된 0.31, 0.51, 0.71 및 0.89에서 4개의 개별 FRET 상태를 강조 표시합니다. 전환은 FRET >0.1의 변경으로 정의되었습니다. 이상적인 FRET 트레이스는 식별된 각 형태에 대한 체류 시간에 대한 정보도 제공합니다(그림 5C).
모집단 FRET 히스토그램 생성 및 피크 피팅
추가 분석을 위해 수동으로 선택된 다양한 글루타메이트 농도가있는 548UAA에 대한 대표적인 단일 분자 트레이스는 그림 6A, B에 나와 있습니다. smFRET 실험에 대한 일반적인 분석은 각 실험 조건에 대한 수백 개의 smFRET 추적에서 모집단 히스토그램을 생성하는 것입니다(그림 6C). 인구 FRET 히스토그램은 표백 전의 흔적 세그먼트에서 생성됩니다. 히스토그램이 더 긴 트레이스의 동작으로 편향되는 것을 방지하려면 평균화하기 전에 각 트레이스에서 정규화된 FRET 히스토그램을 생성해야 합니다. 이렇게 하면 각 추적이 최종 히스토그램에 동일하게 기여할 수 있습니다. 이 시스템에서 FRET 히스토그램은 글루타메이트 농도가 증가함에 따라 더 높은 FRET로의 일반적인 이동을 보여 주며, 이는 CRD 사이의 거리 감소와 활성 형태로의 이동을 나타냅니다. 그러나 글루타메이트 농도에 관계없이 FRET 신호는 매우 산발적으로 유지되어 CRD에 대한 높은 수준의 고유 역학을 나타냅니다. 더 높은 FRET로의 일반적인 변화 외에도 구조적 앙상블의 재분배가 히스토그램 (색상 곡선)에서 분명해집니다. 개별 분자는 또한 이러한 구조적 상태 (점선)를 방문하는 것을 볼 수 있습니다 (그림 6B). 주 점유 확률을 결정하려면 피크의 면적을 4 개의 개별 피크 영역의 합으로 정의 된 전체 면적으로 나누어야합니다. mGluR2의 CRD의 smFRET 실험에서 생성된 smFRET 히스토그램은 각각 0.31, 0.51, 0.71 및 0.89(상태 1-4에서 레이블이 지정됨)에 피크가 있는 4개의 동적 상태를 표시했습니다.
그림 1: 작업 프로토콜 및 데이터 분석의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 클릭 화학에 의한 mGluR2의 부위별 표지 . (A) 세포에서 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌 혼입 과정의 개략도. (B) 구리 촉매 아자이드-알킨 클릭 반응에 의한 위치 548에 비천연 아미노산이 있는 mGluR2의 부위별 형광 표지를 보여주는 개략도. (C) Cy3 및 Cy5 분자가 도킹된 형광 표지된 mGluR2(녹색의 공여체 분자, 빨간색의 수용체 분자)의 3차원 구조. (D) 클릭 화학을 통해 공여체(녹색: Cy3) 및 수용체(빨간색: Cy5) 형광단으로 표지된 세포 표면 집단과 함께 548UAA를 발현하는 HEK293T 세포의 대표적인 컨포칼 현미경 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (E) 548UAA를 발현하고 Cy5- 알킨으로 표지 된 HEK293T 세포로부터의 세포 용해물의 비 환원 4 % -20 % 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 이미지. 겔은 633 nm 여기 파장 및 670-BP30 방출 필터로 이미징된다-레인: 단백질 사다리; 레인 B: 세포 용해물; 레인 c: Cy5-알킨 염료. 결과는 개별 실험을 대표합니다. 패널 B, D 및 E 는 Liauw et al.11로부터 재사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: smFRET 실험 및 현미경 설정(TIRF)의 개략적인 표현. 공여체의 단일 분자 형광 이미지는 녹색 (스케일 바 = 1000 nm)으로 표시되고 수용체는 빨간색으로 표시됩니다. 공여체는 레이저를 사용하여 532nm에서 여기시켰다. 수용체는 기증자의 FRET에 흥분합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: mGluR2로 표시된 기증자(녹색) 및 수용체(빨간색)의 강도 흔적. (A) 수용체 역학 및 FRET 프로브 사이의 거리 변화를 보여주는 만화. (B) 수명이 긴 높은 FRET 상태. (C) 수용체 광퇴색이 먼저 있는 다중 FRET 상태에 이어 공여자 광퇴색이 뒤따른다. (D) 수용체 광퇴색이 있는 수명이 짧은 FRET 상태. (E) 수용체 광퇴색을 갖는 수명이 긴 안정한 FRET 상태. 이 그림은 Liauw et al.11에서 최소한의 수정으로 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 구조적 상태 식별 . (A) 해당 공여체 및 수용체 신호와 함께 이상적인 맞춤(빨간색)이 오버레이된 대표적인 FRET 추적. (B) 548UAA가 겪은 가장 빈번한 구조적 전환을 강조하는 전이 밀도 히트맵. 파선은 FRET 상태를 나타냅니다. (C) 각 구조적 상태의 평균 체류 시간. 이 그림은 Liauw et al.11의 최소한의 수정으로 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 단일 분자 FRET는 mGluR2 CRD의 4가지 구조적 상태를 나타냅니다. (A) 왼쪽에 공여 채널(Cy3)이 있고 오른쪽에 수용체 채널(Cy5)이 있는 단일 분자 영화의 대표 프레임. 다운스트림 처리를 위해 분석 소프트웨어에서 선택한 분자는 녹색 원으로 표시됩니다. 스케일 바 = 3 μm. (B) 다양한 글루타메이트 농도에서 548UAA의 단일 분자 시간 추적의 예. 공여체(녹색) 및 수용체(빨간색) 강도와 해당 FRET(파란색)가 표시됩니다. 파선은 네 개의 별개의 FRET 상태를 나타냅니다. (C) 글루타메이트 농도 범위의 smFRET 집단 히스토그램. 데이터는 N=3의 독립적인 실험의 평균± SEM을 나타낸다. 이 그림은 Liauw et al.11의 최소한의 수정으로 재현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 전체 프로토콜 요약 . (A) 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 발현하는 세포를 성장 및 표지하기 위한 워크플로우. (B) mGluR2에서 구조적 상태를 식별하고 CRD 도메인의 동적 특성을 특성화하는 데 사용되는 단일 분자 FRET 실험 및 분석 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 구성 요소 | 부피 / 반응 (μL) |
| 감소 된 혈청 배지 | 100 |
| 형질주입 시약 | 4.4 |
| 구성 요소 | 부피 / 반응 (μL) |
| 감소 된 혈청 배지 | 100 |
| P3000 | 4 |
| 구성/구성요소 이름 | 농도 (초당 밀리엘) | 부피 / 웰 (12 웰) (μL) | 웰스 (#) | DNA 첨가 (μL) |
| tRNA/합성효소 | 1000 | 1 | 1 | 1 |
| 호박 코돈 함유 단백질 | 1000 | 1 | 1 | 1 |
표 1: HEK 293 T 세포의 형질감염을 위한 시약.
| 시약 | 추가할 용량(μL) | 스톡 콘 (mM) | 최종 콘크 (mM) |
| 1x RB | 655.5 | ||
| BTTES | 10.5 | 50 | 0.75 |
| 큐소4 | 5.25 | 20 | 0.15 |
| NaAsc | 17.5 | 100 | 2.5 |
| 아미노G | 8.75 | 100 | 1.25 |
| Cy3- 알킨 (10 mM) | 1.25 | 10 | 0.018 |
| Cy5- 알킨 (10 mM) | 1.25 | 10 | 0.018 |
표 2: 표지 용액의 조성(클릭 화학).
보충 파일 1: 본 연구에 사용된 다양한 완충액의 조성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
GPCR은 신호 전달을 시작하기 위해 세포막에서 작동하는 단백질입니다. 많은 GPCR은 여러 도메인으로 구성되며 신호는 도메인 간의 협력 상호 작용에 의존합니다. 이러한 막 수용체의 특성을 조절하려면 여러 도메인의 동적 거동을 이해하는 것이 필수적입니다. 단일 분자 형광 공명 에너지 전달(smFRET)은 단백질 형태 및 역학을 실시간으로 측정할 수 있는 형광 기술입니다(11,32). 여기에서는 smFRET, 단일 분자 풀다운(SiMPull) 및 전반사 형광(TIRF) 현미경을 결합하여 부동태화 표면에 고정된 개별 단백질의 재배열을 직접 시각화하는 접근방식이 5,11,33에 설명되어 있습니다. FRET는 거리에 매우 민감하며 분자 내 변화(3-8nm)를 조사하는 데 적합한 나노스케일 눈금자로 효과적으로 기능합니다. 기존의 생물 물리학 적 접근법과 비교하여 smFRET는 ~ 10ms 시간 척도에서 큰 구조적 역학 연구에 특히 적합하며 적은 샘플 부피 (실험 당 약 1 fmole)가 필요합니다. 또한, 핵자기 공명 (NMR) 34 또는 이중 전자 전자 공명 (DEER) 분광법35에 의해 제공되는 것과 같은 구조적 역학의 앙상블 측정과는 달리, smFRET는 구조적 상태와 시간 순서를 명시 적으로 할당 할 수있을뿐만 아니라 희귀하고 일시적인 중간 상태를 직접 감지 할 수 있습니다.
현재 부위 특이적 형광 표지의 한계는 단백질의 형태 역학을 연구하기 위해 smFRET를 광범위하게 적용하는 것을 방해하는 기술적 과제를 제기합니다. 또한, 막 단백질을 대량으로 정제하고 그 활성을 보존하는 것은 어렵다. 일반적인 라벨링 전략은 큰 단백질 태그를 사용하거나 최소 시스테인 돌연변이체의 생성을 요구하며, 종종 형광단 접합을 노출된 시스테인 잔기가 없는 단백질의 말단으로 제한합니다. 이러한 한계를 피하기 위해 비천연 아미노산(UAA) 혼입 전략을 조정하고 최적화하여 구리 촉매 클릭 반응11,12,14를 사용하여 교란되지 않는 잔류물 특이적 표지를 가능하게 했습니다. 이 전략은 막 수용체의 용매 노출 영역 전체에 형광단을 접합하는 것을 가능하게 하고 더 광범위한 구조 센서를 생성할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜에서는 단일 유형의 접합 화학이 사용됩니다. 그 결과 공여자-기증자 및 수용체-수용체 전용 집단이 생성되며, 이는 다운스트림 분석 중에 생략됩니다. 대안적으로, 2개의 직교 표지 전략이 이를 피하거나 관심 단백질이 대칭이 아닐 때 가능한 이질성을 극복하기 위해 사용될 수 있다.
단백질의 직접 포획은 시간이 많이 걸리고 기술적으로 어려운 기존의 정제 단계를 우회하는 데 도움이 됩니다. 구리의 세포 독성으로 인해, 트랜스-사이클로옥탄36 또는 메틸-테트라진37 에 기초한 무구리 클릭 화학도 사용된다. 그러나, 이들 시약은 고가이고, 비-위치특이적38 반응의 성질은 관심있는 형광 태그된 단백질의 낮은 수율을 초래한다.
유동 챔버 준비에서 데이터 분석에 이르기까지 in vitro smFRET 실험에 대한 철저한 지침이 여기에 제시되었습니다. smFRET 데이터는 TIRF 설정을 사용하여 수집되었으며 분석은 사용자 정의 작성된 MATLAB 코드를 사용하여 수행되었습니다.
몇 가지 주요 고려 사항에 유의해야 합니다. 먼저, PEG 부동태화 표면을 비오틴-PEG로 균질하고 밀도가 낮도록 준비해야 합니다. 과도한 비오틴-PEG는 과도한 단백질 풀다운을 초래하여 개별 분자의 형광 신호를 해결하기 어렵게 만들 수 있습니다. 둘째, 단백질 샘플 (세포 용해물 상청액)은 표면 포화를 피하기 위해 샘플 챔버에 첨가되기 전에 완전히 희석되어야합니다. 단백질의 수율은 세포 밀도, 선택한 세제 및 세제 농도에 따라 다릅니다. 단일 기증자 및 수용체 쌍의 수를 최적화하려면 256 x 512 픽셀 시야에서 ~ 400 분자의 밀도를 목표로해야합니다. 셋째, Trolox 버퍼는 장기간 사용을 위해 -20 ° C에서 보관해야합니다 (개월). 트롤록스 완충액은 4°C에서 보관시 2주 동안 안정하게 유지된다. 마지막으로, 항체로 기능화 한 후 유동 챔버에 기포가 유입되지 않도록주의해야합니다. 유동 챔버의 건조는 단백질 고정화 및 샘플 단백질 변성의 효율을 감소시킵니다.
여기에 설명된 mGluR2 센서의 구조적 역학은 smFRET를 사용하여 개별 수용체 수준에서 성공적으로 검사되었으며 수용체 활성화 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했습니다. CRD는 글루타메이트의 유무에 관계없이 4 가지 구조적 FRET 상태 사이의 평형에 존재하는 높은 수준의 고유 역학을 입증하는 것으로 밝혀졌습니다. 더 높은 FRET 상태 또는 더 조밀한 수용체로의 이동은 글루타메이트 농도 의존적 방식으로 발생하는 것으로 나타났습니다(그림 6). 흥미롭게도 글루타메이트의 포화 수준에서도 CRD는 역동적으로 유지되었습니다. 구조적 역학을 이해하기 위해 여기에 제시된 방법(그림 7에 요약됨)은 다른 클래스 C GPCR뿐만 아니라 이온 채널, 이온성 수용체 및 수용체 티로신 키나제(RTK)와 같은 다른 막 단백질에도 적용할 수 있습니다.32,39.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
토론을 위해 Reza Vafabakhsh 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작업은 국립 보건원 보조금 R01GM140272 (RV), 노스 웨스턴 대학의 생명 과학을위한 Searle 리더십 기금 및 시카고 커뮤니티 트러스트의 Searle Funds의 지원을 받아 시카고 생물 의학 컨소시엄 (RV). BWL은 국립 일반 의학 연구소 (NIGMS) 교육 보조금 T32GM-008061의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
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