Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Visualisering av konformasjonsdynamikken til membranreseptorer ved bruk av enkeltmolekyl FRET

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64254
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Biosciences, Northwestern University

Summary

Denne studien presenterer en detaljert prosedyre for å utføre enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføringseksperimenter (smFRET) på G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) ved bruk av stedsspesifikk merking via unaturlig aminosyre (UAA) inkorporering. Protokollen gir en trinnvis veiledning for smFRET-prøvepreparering, eksperimenter og dataanalyse.

Abstract

Cellens evne til å reagere på eksterne signaler er avgjørende for cellulær utvikling, vekst og overlevelse. For å svare på et signal fra miljøet, må en celle kunne gjenkjenne og behandle det. Denne oppgaven er hovedsakelig avhengig av funksjonen til membranreseptorer, hvis rolle er å konvertere signaler til cellens biokjemiske språk. G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) utgjør den største familien av membranreseptorproteiner hos mennesker. Blant GPCR er metabotrope glutamatreseptorer (mGluRs) en unik underklasse som fungerer som obligatoriske dimerer og har et stort ekstracellulært domene som inneholder ligandbindingsstedet. Nylige fremskritt innen strukturelle studier av mGluRs har forbedret forståelsen av aktiveringsprosessen. Imidlertid er forplantningen av store konformasjonsendringer gjennom mGluRs under aktivering og modulering dårlig forstått. Enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføring (smFRET) er en kraftig teknikk for å visualisere og kvantifisere den strukturelle dynamikken til biomolekyler på enkeltproteinnivå. For å visualisere den dynamiske prosessen med mGluR2-aktivering ble fluorescerende konformasjonssensorer basert på unaturlig aminosyre (UAA) inkorporering utviklet som tillot stedsspesifikk proteinmerking uten forstyrrelse av den opprinnelige strukturen til reseptorer. Protokollen beskrevet her forklarer hvordan du utfører disse eksperimentene, inkludert den nye UAA-merkingsmetoden, prøvepreparering og smFRET-datainnsamling og analyse. Disse strategiene er generaliserbare og kan utvides for å undersøke konformasjonsdynamikken til en rekke membranproteiner.

Introduction

Overføringen av informasjon over plasmamembranen er sterkt avhengig av funksjonen til membranreseptorer1. Ligandbinding til en reseptor fører til konformasjonsendring og reseptoraktivering. Denne prosessen er ofte allosterisk i naturen2. Med over 800 medlemmer er G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) den største familien av membranreseptorer hos mennesker3. På grunn av deres rolle i nesten alle cellulære prosesser, har GPCR blitt viktige mål for terapeutisk utvikling. I den kanoniske modellen for GPCR-signalering resulterer agonistaktivering i konformasjonsendringer av reseptoren som deretter aktiverer det heterotrimere G-proteinkomplekset via utveksling av BNP for GTP ved nukleotidbindingslommen til Gα. De aktiverteG-α-GTP- og Gβγ-underenhetene styrer deretter aktiviteten til nedstrøms effektorproteiner og forplanter signalkaskaden 4,5. Denne signalprosessen avhenger i hovedsak av ligandens evne til å endre den tredimensjonale formen på reseptoren. En mekanistisk forståelse av hvordan ligander oppnår dette er avgjørende for å utvikle nye terapier og designe syntetiske reseptorer og sensorer.

Metabotrope glutamatreseptorer (mGluRs) er medlemmer av klasse C GPCR-familien og er viktige for de langsomme nevromodulerende effektene av glutamat og tuning neuronal excitability 6,7. Blant alle GPCR-er er GPCR-er i klasse C strukturelt unike ved at de fungerer som obligatoriske dimere. mGluRs inneholder tre strukturelle domener: Venus flytrap (VFT) domene, cysteinrikt domene (CRD) og transmembrandomene (TMD)8. Konformasjonsendringene under aktiveringsprosessen er komplekse og involverer lokal og global konformasjonskobling som forplanter seg over en avstand på 12 nm, samt dimerkooperativitet. De mellomliggende konformasjonene, tidsmessig rekkefølge av stater og overgangshastighet mellom stater er ukjente. Ved å følge konformasjonen av individuelle reseptorer i sanntid, er det mulig å identifisere de forbigående mellomtilstandene og sekvensen av konformasjonsendringer under aktivering. Dette kan oppnås ved å bruke enkeltmolekylfluorescensresonansenergioverføring 9,10 (smFRET), som nylig ble brukt for å visualisere forplantningen av konformasjonsendringer under aktiveringen av mGluR2 11. Et viktig trinn i FRET-eksperimenter er generering av FRET-sensorer ved stedsspesifikk innsetting av donor- og akseptorfluoroforer i proteinet av interesse. En unaturlig aminosyre (UAA) inkorporeringsstrategi ble vedtatt12,13,14,15 for å overvinne begrensningene i typiske stedsspesifikke fluorescerende merkingsteknologier som krever opprettelse av cysteinfrie mutanter eller innsetting av en stor genetisk kodet tag. Dette gjorde det mulig å observere konformasjonsomleggingen av den essensielle kompakte allosteriske linkeren, som sluttet seg til ligandbindings- og signaldomenene til mGluR2. I denne protokollen presenteres en trinnvis veiledning for å utføre smFRET-eksperimenter på mGluR2, inkludert tilnærmingen for stedsspesifikk merking av mGluR2 med UAA for å feste fluoroforer ved hjelp av den kobberkatalyserte azidsykliseringsreaksjonen. Videre beskriver denne protokollen metodikken for direkte fangst av membranproteiner og dataanalyse. Protokollen som er skissert her, gjelder også for å studere konformasjonsdynamikken til andre membranproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den generelle arbeidsflyten til protokollen er beskrevet i figur 1.

1. Klargjøring av prøvekammeret

  1. Skyve- og dekselrengjøring
    MERK: Disse trinnene tar sikte på å rengjøre overflatene på lysbildene så vel som dekslene og forberede dem på aminosilanisering. Et kritisk krav for å gjennomføre enkeltmolekylfluorescenseksperimenter på overflatebundne molekyler er en passivert overflate. Den mest pålitelige og reproduserbare passiveringsteknikken innebærer kovalent å feste inerte polymerkjeder til glassoverflaten som et tett lag. Polyetylenglykol (PEG) er den mest effektive polymeren som brukes til overflatepassivering16. Detaljene i passiveringsprosedyren ved bruk av PEG (PEGylering) er beskrevet nedenfor:
    1. Merk hull som skal bores på lysbildene med en markør (~ 6 mm fra hverandre og vekk fra kanten). Bruk en Dremel til å bore små hull (1 mm diameter) på glassglasset. Senk skliene i vann under boreprosessen.
    2. Vask lysbildene med aceton for å fjerne gjenværende blekk fra markøren.
    3. Fjern fra aceton og skyll lysbildene med vann, og mikrobølgeovn dem i 5 minutter i vann med høy effekt (700 W).
    4. Rengjør lysbildene med vann før du plasserer dem i en glassfarget krukke som skal sonikeres. Plasser dekslene i en annen fargekrukke.
    5. Sonicate lysbildene og dekslene i aceton i 30 minutter i en badsonikator ved 23 ° C.
    6. I mellomtiden rengjør du en glassflaske for å forberede aminosilaniseringsløsningen som brukes i neste trinn. Fyll kolben med 1 M KOH, soniser kolben i 30 minutter, skyll KOH grundig med vann, og sonikat deretter i ytterligere 30 minutter i metanol. La kolben ligge i metanol til tidspunktet for aminosilaniseringstrinnet.
    7. I mellomtiden fjerner du aminosilan, mPEG og biotin-PEG fra fryseren (-20 ° C) og lar dem komme til romtemperatur (RT) i mørket.
    8. Kast aceton fra lysbildet og dekselglassene i riktig kjemisk avfallsbeholder, skyll grundig med vann, og soniker deretter lysbildene i 5 M KOH i 30 minutter.
    9. Skyll lysbildene og dekslene med vann, og sonikat deretter i metanol i 2 minutter (gjenta to ganger). La glassene fylles med metanol til aminosilaniseringstrinnet.
      MERK: I denne studien brukes avionisert vann med mindre annet er nevnt. En badsonikator som arbeider ved 23 ° C brukes.
  2. Aminosilanisering
    MERK: Dette trinnet tar sikte på å kovalent knytte aminosilane til den rene lysbilde- og dekseloverflaten. Funksjonalisert mPEG og biotin-PEG vil kovalent binde seg til denne overflaten i neste trinn.
    1. Forbered en aminosilaniseringsblanding i en ren kolbe (trinn 1.6). Forbered løsningen ved å blande metanol (150 ml), eddiksyre (7,5 ml, bruk glasspipette) og aminosilane (2,5 ml).
    2. Bland løsningen forsiktig i den kjemiske røykhetten, hell den deretter i lysbildet og dekselglassene. Bruk 50 ml til dekslene og 100 ml til lysbildene. Sørg for at sklier og deksler er helt nedsenket i løsningen.
    3. Inkuber i 10 minutter, sonikerer deretter glassene i 1 min (sonikering fjerner urenheter fra overflaten), og inkuberer i ytterligere 10 minutter.
    4. Kast aminosilaniseringsløsningen i avfallsbeholderen. Tilsett metanol i glassene, lukk glassene med lokk og rist forsiktig for hånd. Kast metanolen, og fyll glassene med vann.
    5. Sett aminosilanflasken tilbake i fryseren (−20 °C).
  3. PEGylering
    MERK: Disse trinnene beskriver PEGyleringsprosedyren.
    1. Under aminosilanisering, klargjør pegyleringsbufferen. Vei 84 mg natriumbikarbonat (NaHCO3) og legg det til 10 ml vann (10 mM). I tillegg veier du mPEG og biotin-PEG og setter dem til side. For seks lysbilder og deksler, bruk 96 mg mPEG og 1,2-2,4 mg biotin-PEG.
      MERK: Det er viktig å ikke legge til for mye biotin-PEG siden det kan øke antall bakgrunnsflekker. Ikke løs opp PEG-blandingen før rett før påføring på lysbilder.
    2. Skyll lysbildene med vann, tørk dem med et forsiktig luftslag, og legg dem deretter i de fuktede monteringsboksene.
      MERK: Det er viktig å bruke et rent flyselskap. Unngå å bruke komprimert hermetikk, som kan etterlate rester på glasset.
    3. Tilsett pegyleringsbuffer til PEG-pulverblanding og pipett forsiktig opp og ned flere ganger for å løse opp. Legg til 55 μL pegyleringsbuffer per lysbilde (for seks lysbilder, legg til 330 μL pegyleringsbuffer).
    4. Sentrifuge ved 9 600 x g i 1 minutt ved 23 °C for å utfelle uoppløste partikler. Samle supernatanten som skal brukes i neste trinn.
      MERK: Biotin-PEG hydrolyserer raskt på grunn av tilstedeværelsen av NHS-gruppen. Det er viktig å gjøre blandings- og sentrifugeringstrinnene raskt.
    5. Påfør 60 μL PEGyleringsoppløsning på hvert lysbilde, og legg deretter dekselet på toppen slik at PEGyleringsløsningen klemmes mellom lysbildet og dekselet.
      MERK: Unngå å introdusere bobler mellom lysbildet og dekselet, da dette vil redusere passiveringseffektiviteten. Fjern eventuelle bobler ved å justere dekselet og lysbildet med en pipetspiss.
    6. Plasser lysbildene i en skuff som er flat og mørk. Lysbilder kan lagres over natten; Inkubasjon i 4-6 timer resulterer imidlertid i optimal passivering.
      MERK: Det er viktig å huske hvilken side som er pegylert.
    7. Merk den ikke-pegylerte siden før lagring. Etter inkubasjon, demonter forsiktig og skyll lysbildene og dekslene grundig med vann
    8. Tørk lysbildene og dekslene ved å blåse luft. Hold lysbildene og dekslene i et sterilt rør (50 ml), med PEGylated overflaten vendt bort fra hverandre. Oppbevares ved −20 °C til forsøksdagen.
      MERK: Det er best å bruke lysbilder og deksler innen 4 uker etter forberedelse. PEGylated overflater skal vende bort fra hverandre. Lagring av PEGylated lysbilder og coverslips i vakuumforseglede poser kan øke holdbarheten.

2. mGluR2-uttrykk med innlemmet unaturlig aminosyre, fluorescerende merking og ekstraksjon

MERK: Denne protokollen skisserer fremstilling, reagenser og behandling av celler for å uttrykke mGluR2 som inneholder UAA 4-azido-L-fenylalanin (AZP). Prosedyren er for HEK293T-celler dyrket på 18 mm glassdeksler. Prosedyren kan skaleres opp etter behov.

  1. Seeding
    MERK: Oppretthold HEK293T-cellene i DMEM supplert med 10 % (v/v) føtalt bovint serum, 100 enhet·ml−1 penicillin-streptomycin og 15 mM HEPES-buffer (tilleggsfil 1) (pH 7,4) ved 37 °C under 5 % CO2.
    1. Passasje cellene med 0, 05% trypsin-EDTA. Frø HEK293T-celler på poly-L / D-lysin (PLL / PDL) glassbelegg slik at de når ≥80% sammenløp i transfeksjonstidspunktet.
  2. Transfeksjon
    1. Forbered en 40 mM lagerløsning av AZP i 0,1 M NaOH.
    2. Forbered AZP-supplerte medier for dyrking av celler og mGluR2-uttrykk. Suppler standardmedier (+ FBS, penn/streptokokker, 15 mM HEPES) med 40 mM AZP lagerløsning. Ta den endelige AZP-konsentrasjonen til 0,6 mM. Legg til 1 M HEPES-løsning (halvparten av volumet av 40 mM AZP lagerløsning lagt til). For eksempel, for å klargjøre 10 ml AZP-supplerte medier, kombiner 9,775 ml standardmedier, 150 μL 40 mM AZP lagerløsning og 75 μL 1 M HEPES-løsning.
    3. Filtrer (steriliser) mediet ved hjelp av et sprøytefilter (0,2 μm, PES).
    4. Bytt ut standardmediet med medier som inneholder AZP-supplerte medier før transfeksjon.
      MERK: Vær forsiktig så du ikke tørker cellene under utskifting av mediet.
    5. Transfekter cellene med transfeksjonsreagens (materialtabell) etter produsentens håndbok. Transfekt HEK293T-celler på en 18 mm coverslip ved bruk av totalt 2 μg DNA (1000 ng tRNA / syntetase + 1000 ng ravkodonholdig proteinplasmid). Se tabell 1 for konsentrasjon og volum av komponenter som brukes.
    6. Bytt media 24 timer etter transfeksjon til friske AZP-supplerte medier og la cellene vokse i ytterligere 24 timer.
  3. Merking med alkyn cyanin fargestoffer
    1. 20 minutter før merking, vask dekslene med varm (37 °C) opptaksbuffer (RB) (tilleggsfil 1) to ganger, og flytt dem til varme (37 °C) standardmedier uten AZP (+ FBS, penn/strep, 15 mM HEPES).
    2. Forbered merkeløsningen som inneholder Cy3-alkyn, Cy5-alkyn, BTTES, kobber (II) sulfat (CuSO4), (+) natrium L-askorbat og aminoguanidin.
    3. Følg rekkefølgen for å lage og legge til løsninger (tabell 2):
      1. Forbered 50 mM BTTES.
      2. Forbered 100 mM aminoguanidin.
      3. Forbered 100 mM Na-askorbat.
      4. Forbered 655,5 μL RB.
      5. Tilsett Cy3/Cy5 alkynfargestoff (10 mM i DMSO-lager) til RB.
        MERK: Tilsett aminoguanidin til RB.
      6. Forbered 20 mM CuSO4.
      7. Bland CuSO4 og BTTES i et nytt rør (løsningen blir blå).
      8. Tilsett CuSO4- og BTTES-blandingen til RB (2.3.3.6.)
      9. Legg til Na-Ascorbate.
      10. Følg volumet gitt i tabell 2 nedenfor for en 18 mm deksel.
    4. Bland løsningen grundig og rug på is og i mørket i 10 minutter før merking av celler.
    5. Før du legger merkeløsningen til dekslene, fjern mediet og vask dem med RB. Tilsett merkeløsningen og rug i 15 minutter ved 37 °C under mørke forhold.
    6. MERK: For å forbedre merkingen, tilsett glutamat (endelig konsentrasjon ~ 0,5 mM) etter 10 minutter og inkuber i ytterligere 5 minutter. Kobber er svært giftig for cellene, og merkereaksjonen bør ikke fortsette i mer enn 15 minutter in vivo. Forbered alle komponentene friske. Legg til Na-Ascorbate sist. Hold reaksjonen ved 4 °C mens du forbereder deg. Ved tilsetning av merkeløsning skal cellene imidlertid lagres ved 37 °C inne i inkubatoren.
  4. Høsting av cellene og utvinning av proteiner (cellelyse)
    1. Fjern merkeløsningen og vask dekselet (18 mm) som inneholder mGluR2-transfiserte celler to ganger med RB.
    2. Bruk en pipet, vask cellene av dekselet og resuspender i RB (1 ml).
      MERK: Minimer prøveeksponeringen for lys så mye som mulig etter dette punktet.
    3. Pellet cellene ved å spinne ved 1000 x g ved 4 °C i 5 minutter og fjerne supernatanten. Resuspender cellepelleten i 80-130 μL av lysisoppløsningen.
      MERK: Cellepelleten skal være synlig for øyet. Lysisvolumet avhenger av mengden prøve som går tapt under merkings- og vaskeprosessen.
    4. Bland forsiktig ved pipettering for å bryte opp pelleten. Pakk inn folie og legg på vippemaskinen ved 4 °C i 0,5-1 time for å lyse cellene.
    5. Pellet den uoppløselige fraksjonen ved sentrifugering ved 20 000 x g og 4 °C i 20 minutter. Overfør supernatanten til et friskt kaldt rør (det lyse proteinet som inneholder det fluorescerende merkede proteinet av interesse) og lagre det på is for eksperimenter.

3. Enkeltmolekyl strømningskammermontering og funksjonalisering

  1. Fjern lysbildet og dekselet fra fryseren og la dem varme ved RT i mørket (~ 30 min).
  2. Monter kammeret ved hjelp av dobbeltsidig tape ved å klemme strimler av dobbeltsidig tape mellom lysbildet og dekselet. Forsikre deg om at PEGylated overflater danner det indre av strømningskammeret.
  3. Bruk en pipetspiss til å trykke på dekselet for å sikre at båndet kommer i full kontakt med både deksel og lysbilde; Pass på at du ikke bryter dekselet. Påfør epoksy på kantene på lysbildene.
    MERK: Ikke tilsett så mye at epoksy fyller ut de borede hullene.
  4. Plasser strømningskammeret med dekselsiden vendt nedover i en fuktet mørk boks for å la epoksyen tørke (~ 30 min).
    MERK: Tilsett T50-buffer (tilleggsfil 1) gjennom de borede hullene for å forhindre at epoksyen dekker hullene (10-15 μL) i tørkeperioden.
  5. Inkuber hver kammerbane med 500 nM Neutravidin (fortynnet i T50) ved sakte å bruke ~ 40 μL på hvert kjørefelt.
  6. Inkuber på RT i 2 minutter inne i en fuktet mørk boks. Vask med ~ 100 μL T50 buffer per kjørefelt.
  7. Inkuber hvert kammerfelt med 20 nM biotinylert antistoff11. Valget av antistoff avhenger av taggen på proteinet.
    MERK: Hvis det primære antistoffet ikke er biotinylert, må du først inkubere med det biotinylerte sekundære antistoffet i 30 minutter og deretter inkubere med det primære antistoffet.
  8. Inkuber på RT i 30 minutter inne i en fuktet mørk boks. Vask med ~ 200 μL T50 per kjørefelt.
    MERK: Sørg for at banene aldri tørker ut under forberedelsesprosessen.

4. Enkeltmolekylbuffere

  1. Trolox buffer
    MERK: Trolox buffer er startbufferen for å lage bildebuffer. Komponenter i bufferen er avhengig av eksperimentet og kan variere avhengig av proteinet av interesse. Bufferen som brukes i protokollen beskrevet her inkluderer salter (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), buffermiddel (HEPES) og Trolox (pH ~ 7,35).
    1. Oppløs 9-10 mg Trolox i 10 ml enkeltmolekylopptaksbuffer (SRB, tilleggsfil 1)
      MERK: Trolox gjør bufferen litt sur. Juster pH på dette stadiet ved hjelp av natriumhydroksid (NaOH) løsning, 10 M (pH 7,35). Den fine pH-justeringen vil bli gjort etter at Trolox er fullstendig oppløst; Å øke pH på dette tidspunktet øker imidlertid oppløseligheten til Trolox.
    2. Bland løsningen ved RT ved hjelp av en stasjonær rocker i 4-8 timer (innpakket i aluminiumsfolie) for å oppløse Trolox helt.
    3. Kontroller pH og juster om nødvendig.
    4. Forsikre deg om at Trolox er fullstendig oppløst. Steriliser oppløsningen med et sprøytefilter og oppbevar den ved 4 °C.
      MERK: Bufferen skal brukes etter 2-10 dager med aldring. Trolox bidrar til å undertrykke blinking og brukes ofte i enkeltmolekylstudier17. De antiblinkende egenskapene kommer fra et oksidert derivat av Trolox18; Derfor anbefales det å holde det på RT i minst noen timer for å modnes. I tillegg øker UV-stråling av fersk Trolox-løsning oksidasjonsprosessen og kan brukes til å akselerere "aldring" av Trolox-buffer18.
  2. Imaging buffer oppskrift: Bland Trolox buffer + vaskemiddel (~ 2 ganger vaskemiddelets CMC-verdi) + 4 mM protocatechuic acid (PCA).
    MERK: Vaskemiddelkonsentrasjonen holdes nær CMC, da høye vaskemiddelkonsentrasjoner kan føre til økt proteindenaturering. For eksempel kan følgende blanding brukes 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + kolesterol (W%, 10:1) + 40 μL 100 mM PCA lagerløsning. Her fungerer PCA som et antioksidantmiddel og ble tidligere brukt i smFRET-studier19. DDM er ikke-ionisk, brukes ofte til å oppløse membranproteiner20,21, og har blitt brukt i enkeltmolekylstudier. DDM er et godt førstevalg vaskemiddel; Vi anbefaler imidlertid å teste flere vaskemidler og sørge for at resultatene er konsistente.

5. Mikroskopoppsett og smFRET-datainnsamling

  1. Slå på datamaskinen og mikroskopet. Slå på laserne for å varme opp (532 nm for Cy3-eksitasjon og 640 nm for Cy5-eksitasjon).
    MERK: Her ble et omvendt mikroskop utstyrt med et 100x TIRF-mål (N.A. 1.49), bildesplitter og EMCCD-kamera brukt. Oppsettet er utstyrt med en fire-linjers laserkombinator, et dikroisk speil, et langpassutslippsfilter, et utslippsdikroisk filter og et hakkfilter.
  2. Slå på EMCCD-kameraet og åpne kameraprogramvaren. Vent 20 min til kameraet når −69 °C og stabiliserer seg.
  3. Monter prøvekammeret på mikroskoptrinnet. Legg til proteinprøven gradvis for å oppnå ~ 400 molekyler per synsfelt (trinn 2.4.5). Vask kammeret med 100 μL bildebuffer.
  4. Juster forsterkningen, anskaffelseshastigheten og laserkreftene slik at enkeltmolekylfluorescenssignaler oppdages i både donor- og akseptorkanaler. Juster konsentrasjonen av proteinene inne i prøvekammeret om nødvendig.
    MERK: Med mer enn 400 molekyler i synsfeltet blir det vanskeligere å skille mellom individuelle molekyler, og bakgrunnsstøyen blir høyere.
  5. Opphisse giveren og skaff deg tidsspor til minst 80% av donormolekylene i synsfeltet er fotobleket.
  6. På slutten av filmen, slå på 640 nm-laseren for å direkte opphisse akseptoren til noen av akseptormolekylene fotobleker, noe som letter enkeltmolekylet fra multimerdiskriminering.
  7. Gå over til et annet synsfelt, og gjenta trinnene ovenfor for å samle inn minst tre filmer (tekniske replikasjoner) per betingelse.
    MERK: Bruk lavest mulig lasereffekt når du velger et nytt interesseområde (ROI) og fokuserer for å minimere fotobleking. Vær oppmerksom på scenen drift under oppkjøpet. Hvis merkbar drift observeres etter å ha flyttet til en ny avkastning, vent i 3 minutter før du starter oppkjøpet.

6. Analyse av data

  1. Justering av giver- og akseptorkanal (filmtilordning)
    1. Ta opp fluorescerende perlebilder i donor- og akseptorkanaler.
    2. Generer kartleggingsfilen ved hjelp av perledataene for å korrelere donor- og akseptorfluorescensen fra hvert molekyl22,23.
      MERK: Utslippssignalet fra et enkelt molekyl deles inn i donor- og akseptorsignaler av emisjonsdikroisk filter inne i bildesplitteren. Donor- og akseptorbildene projiseres på kameraet side om side. For å nøyaktig knytte donor- og akseptorintensitetene til et enkelt molekyl mellom de to områdene, genereres en kartleggingsfil ofte ved hjelp av fluorescerende perleprøver. Ved hjelp av denne kartleggingsfilen kartlegges alle molekylene som oppdages i donor- og akseptorkanalene på hverandre. Analysen genererer deretter tidssporene, som er donor- og akseptorintensitetene over tid, for hvert molekyl.
  2. Utvalg av enkeltmolekylære FRET-spor (partikkelplukking)
    MERK: Individuelle partikkelspor undersøkes og velges ut for nedstrømsanalyse ved hjelp av MATLAB. De nøyaktige utvalgskriteriene avhenger av systemet. Generelle retningslinjer for hva som utgjør en kvalitetspartikkel er skissert her. Alle de spesialtilpassede kodene er tilgjengelige på GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).
    1. Velg sporene der den totale intensiteten av sporene (donor + akseptor) er stabil over tid. Velg sporene med antikorrelerte endringer i donor- og akseptorintensiteter.
    2. Velg donor- og akseptormolekylene som viser enkelttrinns fotobleking. Velg sporene som er >5 s lange.
      MERK: Bakgrunnen i hver kanal etter bleking skal gå til null. Sporene skal ikke ha mange blinkende hendelser; Dette vil øke vanskeligheten med analyse.
    3. Beregn FRET-effektiviteten ved hjelp av ligningen E = (I A− 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])24,25,26, hvor I D og I A er henholdsvis rå donor- og akseptorintensiteter.
      MERK: Lekkasjen av donorutslipp til akseptorkanalen bestemmes ved bruk av donormerket prøve eksitert ved hjelp av en 532 nm laser26. Lekkasjekorreksjonsfaktoren, 0,088, kan variere for forskjellige oppsett, avhengig av filtersettene som brukes. Det er viktig å merke seg at kvantitativ og robust konvertering av FRET-effektivitet til absolutte avstander krever korreksjon av donor- og akseptorintensiteter for flere faktorer og har blitt diskutert mye før27.
  3. Identifiser konformasjonstilstanden ved Hidden Markov Modeling (HMM)
    1. Utfør vbFRET28-programmet i MATLAB og importer de valgte sporene for en gitt tilstand. Angi begrensningene for antall potensielle tilstander og gjentakelser som skal utføres.
      MERK: Basert på rådata fra de representative resultatene, ble det antatt at det var opptil fire diskrete FRET-tilstander okkupert av konformasjonssensoren; dermed ble en rekkevidde på en til fire stater utpekt. Forbedringer i tilpasning ble tidligere bestemt å øke ubetydelig med >25 iterasjoner; dermed ble 25 iterasjoner brukt for å tilpasse representative data.
    2. Analyser smFRET-sporene og eksporter de idealiserte sporene og analyseøkten. Lagre de idealiserte sporene i en egen mappe for analyse nedstrøms.
      MERK: Programmene som brukes til å trekke ut tilstandsovergangs- og oppholdstidsdata fra idealiserte spor ble gjort tilgjengelig i tidligere publisert arbeid29.
    3. Ved hjelp av MATLAB-programmer, trekk ut tilstandsoverganger og plott dem som et varmekart med X-koordinaten som indikerer startkonformasjon og Y-koordinaten som indikerer sluttkonformasjon.
      MERK: Overganger er definert som endringer i FRET-verdi >0.1 i de representative resultatene som er omtalt her. Terskelen for overganger er avhengig av de hypotetiske konformasjonstilstandene et protein av interesse opptar (sett overgangsgrensen til å være mindre enn forskjellen mellom de nærmeste FRET-tilstandene), samt oppløsningen tillatt av det eksperimentelle oppsettet. Undersøkelsen av varmekart for flere forhold gjør det mulig å identifisere de vanligste konformasjonstilstandene en sensor overganger gjennom og dermed opptar. Fire FRET-tilstander ble identifisert for de representative resultatene (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 og 0,89).
    4. Ved hjelp av MATLAB-programmer trekker du ut oppholdstidene for hver identifiserte konformasjonstilstand. Angi en rekke FRET-verdier som avgrenser hver tilstand og tidsoppløsning under datainnsamling. FRET-områder er jevnt delt med tilstøtende FRET-stater. Eksporter oppholdstidene for gitte behandlingsforhold.
      MERK: I de fleste tilfeller kan oppholdstidsdata estimeres godt av en enkelt eksponentiell forfallsfunksjon. Denne analysen kan utføres i en dataanalyse og grafisk programvare.
  4. Gaussisk tilpasning av smFRET-populasjonshistogrammer for å kvantifisere statlig belegg
    1. Importer populasjon FRET-histogrammer for interesseforhold til dataanalyse- og grafprogramvare for flere topptilpasningsanalyser.
    2. Angi antall topper tilstede (fire topper eller tilstander basert på HMM-analyse). Tilpasning ble utført ved hjelp av flere Gaussiske fordelinger30 definert som Equation 1, hvor A er toppområdet, xc er toppsenteret, og w er toppbredden for hver topp.
    3. Begrens tilpasningsparametrene som A > 0, xc = FRET ± 0,02 og 0,1 ≤w≤ 0,24. Fire FRET-topper for den enkelte populasjon FRET-histogrammer passet samtidig. Bruk de definerte begrensningene for tilpasninger av alle forhold.
    4. Beregn belegget (prosentandel) som arealet av topp av interesse delt på det totale arealet, definert som summen av alle topper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Uttrykk og fluorescerende merking av UAA-basert FRET-sensor
Her diskuteres eksempler på innsetting og fluorescerende merking av en UAA (AZP) i CRD av mGluR2 (548UAA)11. Som nevnt tidligere, for å sette inn AZP i mGluR2, er samuttrykk av det konstruerte translasjonsmaskineriet, som inkluderer en modifisert tRNA-syntetase og komplementær tRNA (pIRE4-Azi), og mGluR2 som inneholder et ravkodon i posisjon 548, opprettet ved hjelp av mutagenese, nødvendig (figur 2A, B). Merkingen av AZP med cyaninfargestoffer oppnås ved en kobberkatalysert cykloaddisjonsreaksjon (figur 2C) og resulterer i effektiv plasmamembranmerking av 548UAA (figur 2D). For å verifisere oversettelsen av full lengde 548UAA og integriteten til den dimeriske reseptoren, ble SDS-PAGE-elektroforese utført på cellelysatet fra HEK293T-celler som uttrykker 548UAA merket med Cy5. Et enkelt bånd ved 250KDa ble observert, som sammenfalt med full lengde dimeric mGluR2 (figur 2E).

Datainnsamling og analyse
Celler som uttrykker 548UAA med C-terminal FLAG-tag ble merket med Cy3 (donor) og Cy5 (akseptor) og deretter lysset med vaskemiddel31 i nærvær av en proteasehemmer for in vitro-studie. Etter fullført cellelyse og fjerning av den uoppløselige fraksjonen ved sentrifugering, ble supernatanten påført en polyetylenglykol (PEG)-passivert deksel funksjonalisert med et anti-FLAG-tag antistoff for total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) avbildning (figur 3). Prøven ble belyst ved hjelp av en 532 nm laser, og partikler ble valgt for nedstrøms analyse ved hjelp av smCamera-programvare. Rå donor-, akseptor- og FRET-spor ble generert for alle utvalgte molekyler i smCamera og valgt ved hjelp av MATLAB (avsnitt 6; Figur 4). En 8,8% donor bleed-through korreksjon ble brukt på akseptorintensiteter for det eksperimentelle oppsettet som brukes her. Denne korreksjonsfaktoren vil variere med det eksperimentelle oppsettet, dikroiske filtre og utslippsfiltre som brukes, og bør bestemmes ved å måle donor- og akseptorsignalene under standard eksperimentelle forhold ved bruk av celler merket kun med donorfluorofor og beregne gjennomblødningen ([akseptorintensitet] / [donorintensitet]). Figur 4 viser flere representative FRET-spor og tilsvarende donor- og akseptorsignaler. Disse sporene ble valgt ut etter kriterier som tidligere er beskrevet i protokollen (avsnitt 6). Representative utvalgte spor som viser overganger mellom flere tilstander og donor- og akseptorblekingshendelser, er vist i figur 4B-D.

Identifisering av konformasjonstilstander
For å identifisere konformasjonstilstandene 548UAA okkuperte og forholdet mellom disse statene i forhold til hverandre, ble Hidden Markov modellering (HMM) analyse utført. HMM-analyse ble utført med vbFRET-programmet utført på MATLAB28 (figur 5A). Figur 5 bruker data fra en mellomliggende glutamatkonsentrasjon (5μM) for å illustrere prosessen med tilstandsidentifikasjon. Basert på rå smFRET-spor ble det antatt at opptil fire potensielle FRET-tilstander eksisterte for CRD. Dermed ble antall stater begrenset til en til fire. Totalt ble det utført 25 iterasjoner av tilpasning for hvert spor for å bestemme antall stater som var til stede. Fra disse idealiserte tilpasningene kan overganger mellom diskrete FRET-tilstander ekstraheres og plottes som et overgangstetthetsvarmekart (figur 5B). Varmekartet fremhever fire diskrete FRET-tilstander på 0,31, 0,51, 0,71 og 0,89, indikert med stiplede linjer. Overganger ble definert som endringer i FRET >0.1. De idealiserte FRET-sporene gir også informasjon om oppholdstid for hver identifisert konformasjon (figur 5C).

Populasjon FRET histogram generasjon og topp montering
Representative enkeltmolekylspor for 548UAA i nærvær av varierende glutamatkonsentrasjoner som ble manuelt valgt for videre analyse, er vist i figur 6A, B. En generell analyse for smFRET-eksperimenter er å generere populasjonhistogrammer fra hundrevis av smFRET-spor for hver eksperimentell tilstand (figur 6C). Populasjon FRET histogrammer er opprettet fra segmentet av spor før bleking. For å unngå skjevhet i histogrammet mot oppførselen til lengre spor, er det nødvendig å generere et normalisert FRET-histogram fra hvert spor før gjennomsnittet. Dette sikrer at hvert spor bidrar likt til det endelige histogrammet. I dette systemet viser FRET-histogrammene et generelt skifte mot høyere FRET med økende glutamatkonsentrasjon, noe som indikerer en reduksjon i avstanden mellom CRD-ene og et skifte mot den aktive konformasjonen. Uavhengig av glutamatkonsentrasjonen forblir FRET-signalet imidlertid ganske sporadisk, noe som indikerer en høy grad av egendynamikk for CRD. I tillegg til det generelle skiftet mot høyere FRET, blir en omfordeling av konformasjonsensemblet tydelig i histogrammet (fargekurver). Individuelle molekyler kan også sees besøke disse konformasjonstilstandene (stiplede linjer) (figur 6B). For å bestemme sannsynligheten for statlig belegg, må man dele arealet av toppen med det totale arealet, definert som summen av alle fire individuelle toppområder. smFRET-histogrammet generert fra smFRET-eksperimentet med CRD for mGluR2 viste fire dynamiske tilstander med topper på henholdsvis 0,31, 0,51, 0,71 og 0,89 (merket ved tilstandene 1-4).

Figure 1
Figur 1: Arbeidsprotokollens flytskjema og dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Stedsspesifikk merking av mGluR2 ved klikkkjemi . (A) Skjematisk av den unaturlige aminosyren 4-azido-L-fenylalanin inkorporeringsprosess i celler. (B) Skjematisk som viser stedsspesifikk fluorescerende merking av mGluR2, med den unaturlige aminosyren i posisjon 548, ved kobberkatalysert azid-alkynklikkreaksjon. (C) Tredimensjonal struktur av fluorescerende merket mGluR2 (donormolekyl i grønt, akseptormolekyl i rødt) med Cy3- og Cy5-molekyler forankret. (D) Representativt konfokalt mikroskopbilde av HEK293T-celler som uttrykker 548UAA med celleoverflatepopulasjonen merket med donor (grønn: Cy3) og akseptor (rød: Cy5) fluoroforer gjennom klikkkjemi. Skalastenger = 10 μm. (E) Bilde av ikke-reduserende 4% -20% polyakrylamidgelelektroforese av cellelysat fra HEK293T-celler som uttrykker 548UAA og merket med Cy5-alkyn. Gelen er avbildet med en 633 nm eksitasjonsbølgelengde og 670-BP30 utslippsfilter-Lane a: proteinstige; Lane B: cellelysat; Lane c: Cy5-alkyne fargestoff. Resultatene er representative for et individuelt eksperiment. Panelene B, D og E er gjenbrukt fra Liauw et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk fremstilling av smFRET-eksperimenter og mikroskopoppsett (TIRF). Enkeltmolekylfluorescensbildet av giveren er vist i grønt (skalalinje = 1000 nm) og akseptoren i rødt. Donoren var spent på 532 nm ved hjelp av en laser. Akseptoren er begeistret av FRET fra giveren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Intensitetsspor av donor (grønn) og akseptor (rød) merket mGluR2. (A) Tegneserie som viser reseptordynamikken og endring i avstand mellom FRET-prober. (B) Langvarig høy FRET-tilstand. (C) Flere FRET-tilstander med akseptorfotobleking først etterfulgt av donorfotobleking. (D) Kortvarig FRET-tilstand med akseptorfotobleking. (E) Langvarig stabil FRET-tilstand med akseptorfotobleking. Dette tallet er gjengitt med minimal modifikasjon fra Liauw et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Konformasjonstilstandsidentifikasjon . (A) Representativt FRET-spor med idealisert passform overlaid (rød) sammen med tilsvarende donor- og akseptorsignal. (B) Varmekart for overgangstetthet som fremhever de hyppigste konformasjonsovergangene gjennomgått av 548UAA. Stiplede linjer angir FRET-tilstander. (C) Gjennomsnittlig oppholdstid for hver konformasjonstilstand. Dette tallet er gjengitt med en minimal modifikasjon fra Liauw et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Enkeltmolekyl FRET avslører fire konformasjonstilstander av mGluR2 CRD . (A) Representativ ramme fra en enkeltmolekylfilm med donorkanalen (Cy3) til venstre og akseptorkanalen (Cy5) til høyre. Molekyler valgt av analyseprogramvare for nedstrøms prosessering er indikert med grønne sirkler. Skala bar = 3 μm. (B) Eksempel enkeltmolekyl tidsspor av 548UAA ved forskjellige glutamatkonsentrasjoner. Giver (grønn) og akseptor (rød) intensitet og tilsvarende FRET (blå) vises. Stiplede linjer representerer fire forskjellige FRET-tilstander. (C) histogrammer for smsFRET-populasjonen i en rekke glutamatkonsentrasjoner. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. av N = 3 uavhengige eksperimenter. Dette tallet er gjengitt med en minimal modifikasjon fra Liauw et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Sammendrag av den overordnede protokollen . (A) Arbeidsflyt for dyrking og merking av celler som uttrykker et protein som inneholder en unaturlig aminosyre. (B) Enkeltmolekyl FRET eksperimentell og analyse arbeidsflyt som brukes til å identifisere konformasjonstilstander og karakterisere de dynamiske egenskapene til CRD-domenet i mGluR2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Komponent Volum/reaksjon (μL)
Redusert serummedium 100
Transfeksjon reagens 4.4
Komponent Volum/reaksjon (μL)
Redusert serummedium 100
P3000 4
Navn på konstruksjon/komponent Konsentrasjon (ng/μL) Volum/brønn (12-brønn) (μL) Brønner (#) DNA tilsatt (μL)
tRNA/syntetase 1000 1 1 1
Amber kodon som inneholder protein 1000 1 1 1

Tabell 1: Reagenser for transfeksjon av HEK 293 T-cellen.

Reagenser Volum som skal tilsettes (μL) Lager conc (mM) Endelig Conc (mM)
1x RB 655.5
BTTES 10.5 50 0.75
CuSO4 5.25 20 0.15
NaAsc 17.5 100 2.5
AminoG 8.75 100 1.25
Cy3-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018
Cy5-Alkyne (10 mM) 1.25 10 0.018

Tabell 2: Sammensetning av merkeløsningen (klikk kjemi).

Tilleggsfil 1: Sammensetning av ulike buffere brukt i denne studien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

GPCR er proteiner som opererer på cellemembranen for å initiere signaltransduksjon. Mange GPCR-er består av flere domener, med signalering avhengig av samarbeidsinteraksjonen mellom domenene. For å modulere egenskapene til disse membranreseptorene, er det viktig å forstå den dynamiske oppførselen til de mange domenene. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) er en fluorescensteknikk som muliggjør måling av proteinkonformasjon og dynamikk i sanntid11,32. Her beskrives en tilnærming som kombinerer smFRET, enkeltmolekyl-nedtrekking (SiMPull) og total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi for direkte å visualisere omorganiseringen av individuelle proteiner immobilisert på en passivert overflate 5,11,33. FRET er svært følsom for avstand og fungerer effektivt som en nanoskala linjal som er egnet for sondering av intramolekylære endringer (3-8 nm). Sammenlignet med tradisjonelle biofysiske tilnærminger er smFRET spesielt godt egnet for studier av stor konformasjonsdynamikk på ~ 10 ms tidsskala og krever et lite prøvevolum (ca. 1 fmol per eksperiment). Videre, i motsetning til ensemblemålinger av konformasjonsdynamikk, som de som tilbys av kjernemagnetisk resonans (NMR) 34 eller dobbeltelektron-elektronresonans (DEER) spektroskopi35, tillater smFRET eksplisitt tildeling av både konformasjonstilstander og deres tidsbestilling, samt direkte påvisning av sjeldne og forbigående mellomtilstander.

For tiden utgjør begrensningene ved stedsspesifikk fluorescerende merking en teknisk utfordring som forhindrer bredere anvendelse av smFRET for å studere konformasjonsdynamikken til proteiner. Videre er det vanskelig å rense membranproteiner i store mengder og bevare deres aktivitet. Vanlige merkingsstrategier bruker store proteinkoder eller krever generering av minimale cysteinmutanter, og begrenser ofte fluoroforkonjugering til enden av proteiner uten eksponerte cysteinrester. For å omgå disse begrensningene ble en unaturlig aminosyre (UAA) inkorporeringsstrategi tilpasset og optimalisert, noe som muliggjorde ikke-forstyrrende, restspesifikk merking ved hjelp av en kobberkatalysert klikkreaksjon11,12,14. Denne strategien gjør det mulig å konjugere fluoroforer i de løsningsmiddeleksponerte områdene av membranreseptoren og gjør det mulig å generere et bredere utvalg av konformasjonssensorer. I denne protokollen brukes en enkelt type konjugeringskjemi. Dette resulterer i donor-donor og acceptor-acceptor bare populasjoner, som utelates under nedstrøms analyse. Alternativt kan to ortogonale merkingsstrategier brukes til å unngå dette eller overvinne mulig heterogenitet når proteinet av interesse ikke er symmetrisk.

Direkte fangst av protein bidrar til å omgå tradisjonelle rensetrinn som er tidkrevende og teknisk utfordrende. På grunn av cytotoksisiteten til kobber, brukes også kobberfri klikkkjemi basert på trans-cyklooktan36 eller metyltetrazin37 . Imidlertid er disse reagensene dyre, og reaksjonens ikke-regiospesifikke38-natur resulterer i et lavt utbytte av fluorescerende merket protein av interesse.

Grundige retningslinjer for in vitro smFRET-eksperimenter, fra preparering av strømningskammer til dataanalyse, ble presentert her. smFRET-dataene ble samlet inn ved hjelp av et TIRF-oppsett, og analysen ble utført ved hjelp av en spesialskrevet MATLAB-kode.

Noen viktige hensyn bør bemerkes. Først bør man forberede PEG-passivert overflate for å være homogen og mindre tett med biotin-PEG. Overflødig biotin-PEG kan føre til overdreven proteinavtrekk, noe som gjør det vanskelig å løse fluorescerende signaler fra individuelle molekyler. For det andre bør proteinprøven (cellelysatsupernatant) fortynnes grundig før den tilsettes prøvekammeret for å unngå overflatemetning. Utbyttet av protein avhenger av celletettheten, det valgte vaskemiddelet og vaskemiddelkonsentrasjonen. For å optimalisere antall enkeltdonor- og akseptorpar, bør man målrette mot en tetthet på ~ 400 molekyler i et synsfelt på 256 x 512 piksler. For det tredje bør Trolox-bufferen lagres ved -20 ° C for langvarig bruk (måneder). Troloxbufferen forblir stabil i 2 uker ved oppbevaring ved 4 °C. Til slutt bør det tas hensyn til ikke å introdusere luftbobler i strømningskammeret etter funksjonalisering med antistoffet. Tørking av strømningskammeret vil resultere i redusert effektivitet av protein immobilisering og prøveprotein denaturering.

Konformasjonsdynamikken til mGluR2-sensoren beskrevet her ble vellykket undersøkt på individreseptornivå ved bruk av smFRET og ga innsikt i mekanismen for reseptoraktivering. CRD ble funnet å demonstrere et høyt nivå av inneboende dynamikk, som eksisterer i en likevekt mellom fire konformasjonelle FRET-tilstander uavhengig av tilstedeværelse eller fravær av glutamat. En dreining mot høyere FRET-tilstander eller en mer kompakt reseptor ble vist å forekomme på en glutamatkonsentrasjonsavhengig måte (figur 6). Interessant, selv ved mettende nivåer av glutamat, forblir CRD dynamisk. Metoden som presenteres her (oppsummert i figur 7) for å forstå konformasjonsdynamikken, gjelder for andre GPCR-er i klasse C, samt andre membranproteiner som ionekanaler, ionotrope reseptorer og reseptortyrosinkinaser (RTK)32,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Reza Vafabakhsh-laboratoriet for diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health-tilskuddet R01GM140272 (til R.V.), av The Searle Leadership Fund for the Life Sciences ved Northwestern University, og av Chicago Biomedical Consortium med støtte fra Searle Funds ved Chicago Community Trust (til R.V.). BWL ble støttet av National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich Cat # 11140-250G
4-azido-L-phenylalanine Chem-Impex International Cat # 06162
548UAA Liauw et al. 2021 Transfected construct
Acetic Acid Fisher Chemical 64-19-7
Acetone Fisher Chemical 67-64-1
Adobe Illustrator (2022) https://www.adobe.com/ RRID:SCR_010279 Software, algorithm
Aminoguanidine (hydrochloride) Cayman Chemical 81530
Aminosilane Aldrich 919-30-2
Bath Sonicator 2.8 L Fisher Scientific Ultrasonic Bath 2.8 L
Biotin-PEG Laysan Bio Inc Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg
BTTES Click Chemistry Tools 1237-500
Copper (II) sulfate Sigma Aldrich Cat # 451657-10G
Cover slip VWR 16004-306 Sample chamber
Cy3 Alkyne Click Chemistry Tools TA117-5
Cy5 Alkyne Click Chemistry Tools TA116-5
DDM Anatrace Part# D310 1 GM Detergent
DDM-CHS (10:1) Anatrace Part# D310-CH210 1 ML Detergent with cholecterol
Defined Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific SH30070.03
Di01-R405/488/561/635 Semrock Notch filter
DMEM Corning 10-013-CV
EMCCD Andor DU-897U Camera
ET542lp Chroma Long pass emission filter
FF640-FDi01 Semrock Emission dichroic filter
FLAG-tag antibody Genscript A01429
Fluorescent bead Invitrogen T7279 TetraSpeck microspheres Spherical bead
Glass slides Fisherfinest 12-544-4 sample chamber
Glutamate Sigma Aldrich Cat # 6106-04-3
HEK 293T Sigma Aldrich Cat # 12022001 Cell line
HEPES FisherBioReagents 7365-45-9
Image splitter OptoSplit II
KOH Fluka 1310-58-3
Laser Oxxius 4-line laser combiner
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000015 Transfection Reagent
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
Microscope Olympus Olympus IX83
Milli-Q water Barnstead Water Deionizer
m-PEG Laysan Bio Inc Item# MPEG-SIL-5000-1g
NF03-405/488/532/635 Semrock Dichroic mirror
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 51985091 Reduced Serum Medium
OptiMEM/Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific
OriginPro (2020b) https://www.originlab.com/ RRID:SCR_014212 Data analysis and graphing software
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pIRE4-Azi Addgene Plasmid # 105829 Transfected construct
Poly-L-lysine hydrobromide Sigma Aldrich Cat # P2636
Protocatechuic acid (PCA) HWI group 99-50-3
smCamera (Version 1.0) http://ha.med.jhmi.edu/resources/ Camera software
Sodium bicarbonate FisherBioReagents 144-55-8
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma 1310-73-2
Syringe filter Whatman UNIFLO Cat#9914-2502 Liquid filtration
Trolox Sigma 53188-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
  2. Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
  3. Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
  4. Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
  5. Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
  6. Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
  7. Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
  8. Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
  9. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  10. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  11. Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
  12. Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
  13. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
  14. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
  15. Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
  16. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  17. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  18. Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
  19. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  20. Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
  21. Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
  22. Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
  23. Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
  24. Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
  25. Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
  26. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  27. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  28. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  29. Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
  30. Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
  31. Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
  32. Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
  33. Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
  34. Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
  35. Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
  36. Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
  37. Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
  38. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
  39. Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).

Tags

Biokjemi utgave 186 G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) konformasjonsdynamikk membranreseptorer unaturlige aminosyrer smFRET
Visualisering av konformasjonsdynamikken til membranreseptorer ved bruk av enkeltmolekyl FRET
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Banerjee, C., Liauw, B. W. H.,… More

Banerjee, C., Liauw, B. W. H., Vafabakhsh, R. Visualizing the Conformational Dynamics of Membrane Receptors Using Single-Molecule FRET. J. Vis. Exp. (186), e64254, doi:10.3791/64254 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter