Summary
Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.
Abstract
A capacidade das células de responder a sinais externos é essencial para o desenvolvimento, crescimento e sobrevivência celular. Para responder a um sinal do ambiente, uma célula deve ser capaz de reconhecê-lo e processá-lo. Esta tarefa baseia-se principalmente na função dos receptores de membrana, cujo papel é converter sinais na linguagem bioquímica da célula. Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) constituem a maior família de proteínas receptoras de membrana em humanos. Entre os GPCRs, os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são uma subclasse única que funcionam como dímeros obrigatórios e possuem um grande domínio extracelular que contém o sítio de ligação do ligante. Avanços recentes em estudos estruturais de mGluRs melhoraram a compreensão de seu processo de ativação. No entanto, a propagação de alterações conformacionais em larga escala através de mGluRs durante a ativação e modulação é pouco compreendida. A transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica poderosa para visualizar e quantificar a dinâmica estrutural de biomoléculas no nível de proteína única. Para visualizar o processo dinâmico de ativação do mGluR2, foram desenvolvidos sensores conformacionais fluorescentes baseados na incorporação de aminoácidos não naturais (UAA) que permitiram a marcação de proteínas site-specific sem perturbação da estrutura nativa dos receptores. O protocolo descrito aqui explica como realizar esses experimentos, incluindo a nova abordagem de rotulagem de UAA, preparação de amostras e aquisição e análise de dados smFET. Essas estratégias são generalizáveis e podem ser estendidas para investigar a dinâmica conformacional de uma variedade de proteínas de membrana.
Introduction
A transferência de informações através da membrana plasmática é fortemente dependente da função dos receptores de membrana1. A ligação do ligante a um receptor leva a uma alteração conformacional e à ativação do receptor. Este processo é muitas vezes alostérico na natureza2. Com mais de 800 membros, os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são a maior família de receptores de membrana em humanos3. Devido ao seu papel em quase todos os processos celulares, os GPCRs tornaram-se alvos importantes para o desenvolvimento terapêutico. No modelo canônico de sinalização GPCR, a ativação do agonista resulta em alterações conformacionais do receptor que subsequentemente ativam o complexo proteico G heterotrimérico via troca de PIB por GTP na bolsa de ligação de nucleotídeos de Gα. As subunidades G α-GTP e Gβγ ativadas controlam a atividade das proteínas efetoras a jusante e propagam a cascata de sinalização 4,5. Este processo de sinalização depende essencialmente da capacidade dos ligantes de alterar a forma tridimensional do receptor. Uma compreensão mecanicista de como os ligantes conseguem isso é fundamental para o desenvolvimento de novas terapêuticas e o design de receptores e sensores sintéticos.
Os receptores metabotrópicos de glutamato (mGluRs) são membros da família GPCR classe C e são importantes para os efeitos neuromoduladores lentos do glutamato e para a excitabilidade neuronal de sintonia 6,7. Entre todos os GPCRs, os GPCRs de classe C são estruturalmente únicos, pois funcionam como dímeros obrigatórios. Os mGluRs contêm três domínios estruturais: o domínio da armadilha de Vênus (VFT), o domínio rico em cisteína (CRD) e o domínio transmembrana (TMD)8. As mudanças conformacionais durante o processo de ativação são complexas e envolvem acoplamento conformacional local e global que se propagam a uma distância de 12 nm, bem como a cooperatividade do dímero. As conformações intermediárias, a ordenação temporal dos estados e a taxa de transição entre os estados são desconhecidas. Seguindo a conformação de receptores individuais em tempo real, é possível identificar os estados intermediários transitórios e a sequência de alterações conformacionais durante a ativação. Isso pode ser conseguido por meio da aplicação de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única 9,10 (smFRET), como foi recentemente aplicado para visualizar a propagação de alterações conformacionais durante a ativação do mGluR2 11. Um passo fundamental nos experimentos FRET é a geração de sensores FRET pela inserção site-specific dos fluoróforos doador e aceitador na proteína de interesse. Uma estratégia de incorporação de aminoácidos não naturais (AIA) foi adotada 12,13,14,15 para superar as limitações das tecnologias típicas de marcação fluorescente site-specific que exigem a criação de mutantes sem cisteína ou a inserção de uma grande etiqueta geneticamente codificada. Isso permitiu observar o rearranjo conformacional do essencial ligador alostérico compacto, que uniu os domínios de ligação e sinalização do ligante do mGluR2. Neste protocolo, um guia passo-a-passo para a realização de experimentos smFRET em mGluR2 é apresentado, incluindo a abordagem para marcação site-specific de mGluR2 com UAA para anexar fluoróforos usando a reação de ciclização azida catalisada por cobre. Além disso, este protocolo descreve a metodologia para a captura direta de proteínas de membrana e análise de dados. O protocolo descrito aqui também é aplicável ao estudo da dinâmica conformacional de outras proteínas de membrana.
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Protocol
O fluxo de trabalho geral do protocolo é descrito na Figura 1.
1. Preparação da câmara de amostra
- Limpeza de deslizamento e tampa
NOTA: Estas etapas visam limpar as superfícies das lâminas, bem como as coberturas e prepará-las para a aminossilanização. Um requisito crítico para a realização de experimentos de fluorescência de molécula única em moléculas ligadas à superfície é uma superfície passivada. A técnica de passivação mais confiável e reprodutível envolve a ligação covalente de cadeias poliméricas inertes à superfície do vidro como uma camada densa. O polietilenoglicol (PEG) é o polímero mais eficiente utilizado para passivação superficial16. Os detalhes do procedimento de passivação usando PEG (PEGylation) são descritos abaixo:- Marque os furos a serem perfurados nas lâminas com um marcador (~ 6 mm de distância e longe da borda). Use um Dremel para fazer pequenos furos (1 mm de diâmetro) na lâmina de vidro. Mergulhe as lâminas em água durante o processo de perfuração.
- Lave as lâminas com acetona para remover a tinta residual do marcador.
- Retire da acetona e lave as lâminas com água, em seguida, coloque-as no micro-ondas por 5 minutos em água em alta potência (700 W).
- Limpe as lâminas com água antes de colocá-las em um vitral de vidro para serem sonicadas. Coloque as tampas em um frasco de coloração diferente.
- Sonicate as lâminas e tampas em acetona durante 30 min num sonicator de banho a 23 °C.
- Entretanto, limpar um balão de vidro para preparar a solução de aminossilanização utilizada durante o passo seguinte. Encher o balão com 1 M KOH, sonicar o balão durante 30 min, enxaguar cuidadosamente o KOH com água e, em seguida, sonicate durante mais 30 min em metanol. Deixar o balão em metanol até ao momento da etapa de aminossilanização.
- Enquanto isso, remova o aminosilano, o mPEG e a biotina-PEG do freezer (-20 °C) e permita que eles cheguem à temperatura ambiente (RT) no escuro.
- Descarte a acetona dos frascos deslizantes e de tampa no recipiente apropriado de resíduos químicos, enxágue bem com água e, em seguida, sonice as lâminas em 5 M KOH por 30 min.
- Lave as lâminas e as tampas com água e, em seguida, sonicate em metanol por 2 min (repita duas vezes). Deixe os frascos cheios de metanol até a etapa de aminossilanização.
NOTA: Neste estudo, a água deionizada é usada, a menos que mencionado de outra forma. Um sonicator de banho trabalhando a 23 °C é usado.
- Aminossilanização
NOTA: Esta etapa visa ligar covalentemente o aminossilano à superfície limpa do slide e do deslizamento da tampa. O mPEG funcionalizado e o biotina-PEG se ligarão covalentemente a essa superfície na próxima etapa.- Preparar uma mistura de aminossilanização num balão limpo (passo 1.6). Prepare a solução misturando metanol (150 mL), ácido acético (7,5 mL, use pipeta de vidro) e aminosilano (2,5 mL).
- Misture a solução suavemente no exaustor químico e, em seguida, despeje-a nos frascos deslizantes e de tampa. Use 50 mL para as folhas de cobertura e 100 mL para as lâminas. Certifique-se de que as corrediças e as tampas estejam totalmente imersas na solução.
- Incubar por 10 min, em seguida, sonicate os frascos por 1 min (sonication remove as impurezas da superfície), e incubar por mais 10 min.
- Descarte a solução de aminossilanização no recipiente de coleta de resíduos. Adicione metanol aos frascos, feche os frascos com tampas e agite suavemente à mão. Descarte o metanol e encha os frascos com água.
- Devolver o frasco de aminosilano ao congelador (-20 °C).
- PEGilação
Observação : estas etapas descrevem o procedimento PEGylation.- Durante a aminossilanização, prepare o tampão de peguilação. Pesar 84 mg de bicarbonato de sódio (NaHCO3) e adicioná-lo a 10 mL de água (10 mM). Além disso, pese mPEG e biotina-PEG e reserve-os. Para seis lâminas e coberturas, use 96 mg de mPEG e 1,2-2,4 mg de biotina-PEG.
NOTA: É importante não adicionar muito biotina-PEG, uma vez que pode aumentar o número de manchas de fundo. Não dissolva a mistura de PEG até logo antes da aplicação em lâminas. - Lave as lâminas com água, seque-as com um suave sopro de ar e, em seguida, coloque-as nas caixas de montagem umidificadas.
NOTA: É essencial usar uma companhia aérea limpa. Evite usar ar enlatado comprimido, que pode deixar resíduos no vidro. - Adicione tampão de peguilação à mistura de pó PEG e pipeta para cima e para baixo suavemente várias vezes para dissolver. Adicionar 55 μL de tampão de peguilação por lâmina (para seis lâminas, adicionar 330 μL de tampão de peguilação).
- Centrifugar a 9,600 x g durante 1 min a 23 °C para precipitar partículas não dissolvidas. Colete o sobrenadante para usar na próxima etapa.
NOTA: A biotina-PEG hidrolisa rapidamente devido à presença do grupo NHS. É importante fazer as etapas de mistura e centrifugação rapidamente. - Aplicar 60 μL de solução de PEGilação em cada lâmina e, em seguida, colocar a folha de cobertura por cima, de modo a que a solução de PEGilação fique imprensada entre a lâmina e a folha de cobertura.
NOTA: Evite a introdução de bolhas entre o slide e o deslizamento da tampa, pois isso reduzirá a eficiência da passivação. Remova todas as bolhas ajustando a tampa e o deslizamento com uma ponta de pipeta. - Coloque os slides em uma gaveta plana e escura. As lâminas podem ser armazenadas durante a noite; no entanto, a incubação por 4-6 h resulta em passivação ótima.
NOTA: É essencial lembrar qual lado é pegilado. - Marque o lado não peguilado antes do armazenamento. Após a incubação, desmonte e lave suavemente as lâminas e cubra completamente com água
- Seque as corrediças e as tampas soprando ar. Manter as lâminas e as tampas num tubo estéril (50 ml), com a superfície PEGylated virada para longe uma da outra. Conservar a -20 °C até ao dia da experiência.
NOTA: É melhor usar lâminas e folhas de cobertura dentro de 4 semanas após a preparação. As superfícies PEGylated devem ficar de frente uma para a outra. Armazenar as lâminas PEGylated e as folhas de cobertura em sacos selados a vácuo pode aumentar sua vida útil.
- Durante a aminossilanização, prepare o tampão de peguilação. Pesar 84 mg de bicarbonato de sódio (NaHCO3) e adicioná-lo a 10 mL de água (10 mM). Além disso, pese mPEG e biotina-PEG e reserve-os. Para seis lâminas e coberturas, use 96 mg de mPEG e 1,2-2,4 mg de biotina-PEG.
2. Expressão de mGluR2 com aminoácidos não naturais incorporados, marcação fluorescente e extração
NOTA: Este protocolo descreve a preparação, reagentes e tratamento de células para expressar mGluR2 contendo a UAA 4-azido-L-fenilalanina (AZP). O procedimento é para células HEK293T cultivadas em coberturas de vidro de 18 mm. O procedimento pode ser ampliado conforme necessário.
- Semeadura
NOTA: Manter as células HEK293T em DMEM suplementadas com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 100 unidades·mL−1 de penicilina-estreptomicina e tampão HEPES de 15 mM (Arquivo Suplementar 1) (pH 7,4) a 37 °C sob 5% de CO2.- Passagem das células com tripsina-EDTA a 0,05%. Sementes de células HEK293T em tampas de vidro poli-L/D-lisina (PLL/PDL) para que atinjam ≥80% de confluência durante o tempo de transfecção.
- Transfecção
- Preparar uma solução-mãe de 40 mM de AZP em NaOH 0,1 M.
- Prepare meios suplementados com AZP para células em crescimento e expressão de mGluR2. Suplemento de mídia padrão (+ FBS, caneta/estreptococo, 15 mM HEPES) usando solução de estoque de AZP de 40 mM. Elevar a concentração final de AZP para 0,6 mM. Adicionar 1 M de solução de HEPES (metade do volume de solução de reserva de AZP de 40 mM adicionado). Por exemplo, para preparar 10 mL de meio suplementado com AZP, combine 9,775 mL de meio padrão, 150 μL de solução estoque de AZP de 40 mM e 75 μL de solução de HEPES 1 M.
- Filtrar (esterilizar) o meio utilizando um filtro de seringa (0,2 μm, PES).
- Substitua a mídia padrão por uma mídia que contenha mídia suplementada com AZP antes da transfecção.
NOTA: Tenha cuidado para não secar as células durante a substituição do meio. - Transfecte as células com reagente de transfecção (Tabela de Materiais) seguindo o manual do fabricante. Transfecte células HEK293T em uma folha de cobertura de 18 mm usando um total de 2 μg de DNA (1000 ng de tRNA/sintetase + 1000 ng de plasmídeo proteico contendo códon âmbar). Consulte o quadro 1 para a concentração e o volume dos componentes utilizados.
- Mude o meio 24 h após a transfecção para um meio fresco suplementado com AZP e permita que as células cresçam por mais 24 horas.
- Rotulagem com corantes alquinos cianina
- 20 min antes da rotulagem, lave as tampas com buffer de gravação (RB) quente (37 °C) (Arquivo Suplementar 1) duas vezes e mova-as para o meio padrão quente (37 °C) sem AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 mM HEPES).
- Preparar a solução de marcação contendo Cy3-alquino, Cy5-alquino, BTTES, sulfato de cobre (II) (CuSO4), (+) L-ascorbato de sódio e aminoguanidina.
- Siga a ordem de fabrico e adição das soluções (Quadro 2):
- Prepare 50 mM BTTES.
- Prepare 100 mM de aminoguanidina.
- Prepare 100 mM Na-ascorbate.
- Prepare 655,5 μL de RB.
- Adicione o corante alcino Cy3/Cy5 (10 mM em estoque de DMSO) ao RB.
NOTA: Adicione aminoguanidina ao RB. - Prepare 20 mM CuSO4.
- Misture CuSO4 e BTTES em um novo tubo (a solução ficará azul).
- Adicionar a mistura de CuSO4 e BTTES ao RB (2.3.3.6.)
- Adicione o Na-Ascorbate.
- Siga o volume indicado no quadro 2 infra para uma folha de cobertura de 18 mm.
- Misture bem a solução e incube no gelo e no escuro por 10 minutos antes de rotular as células.
- Antes de adicionar a solução de rotulagem às folhas de cobertura, retire o meio e lave-o com RB. Adicionar a solução de marcação e incubar durante 15 minutos a 37 °C em condições escuras.
- NOTA: Para melhorar a rotulagem, adicione glutamato (concentração final ~0,5 mM) após 10 minutos e incube por mais 5 minutos. O cobre é muito tóxico para as células, e a reação de marcação não deve continuar por mais de 15 minutos in vivo. Prepare todos os componentes frescos. Adicione Na-Ascorbate por último. Mantenha a reação a 4°C durante a preparação. No entanto, após a adição da solução de marcação, as células devem ser armazenadas a 37 °C no interior da incubadora.
- Colheita das células e extração das proteínas (lise celular)
- Retire a solução de rotulagem e lave a folha de cobertura (18 mm) que contém as células transfectadas mGluR2 duas vezes com o RB.
- Usando uma pipeta, lave as células da tampa e ressuspeite em RB (1 mL).
NOTA: Minimize a exposição da amostra à luz, tanto quanto possível após este ponto. - Pellet as células girando a 1.000 x g a 4 °C durante 5 min e remover o sobrenadante. Ressuspeite o pellet celular em 80-130 μL da solução de lise.
NOTA: A pastilha celular deve ser visível a olho nu. O volume de lise depende da quantidade de amostra perdida durante o processo de rotulagem e lavagem. - Misture suavemente pipetando para quebrar o pellet. Enrolar em papel alumínio e colocar sobre o balancim a 4 °C durante 0,5-1 h para lisar as células.
- Pellet a fracção insolúvel por centrifugação a 20.000 x g e 4 °C durante 20 min. Transfira o sobrenadante para um tubo frio fresco (a proteína lisada que contém a proteína fluorescente de interesse) e armazene-a no gelo para experimentos.
3. Montagem e funcionalização da câmara de fluxo de molécula única
- Remova o slide e o coverslip do congelador e deixe-os aquecer no RT na escuridão (~ 30 min).
- Monte a câmara usando fita dupla face colocando tiras de fita dupla face entre a lâmina e a tampa. Certifique-se de que as superfícies PEGylated formam o interior da câmara de fluxo.
- Usando uma ponta de pipeta, pressione a tampa para garantir que a fita esteja fazendo contato completo com a tampa e a corrediça; tome cuidado para não quebrar a tampa. Aplique epóxi nas bordas das lâminas.
NOTA: Não adicione tanto que o epóxi preencha os furos perfurados. - Coloque a câmara de fluxo com o lado da tampa voltado para baixo em uma caixa escura umidificada para permitir que o epóxi seque (~ 30 min).
NOTA: Adicione o tampão T50 (Arquivo Suplementar 1) através dos furos perfurados para evitar que o epóxi cubra os orifícios (10-15 μL) durante o período de secagem. - Incubar cada via de câmara com 500 nM de Neutravidina (diluída em T50) aplicando lentamente ~40 μL em cada faixa.
- Incubar em RT por 2 min dentro de uma caixa escura umidificada. Lave com ~100 μL de tampão T50 por faixa.
- Incubar cada via de câmara com o anticorpo biotinilado 20 nM11. A escolha do anticorpo depende da etiqueta na proteína.
NOTA: Se o anticorpo primário não for biotinilado, primeiro incubar com o anticorpo secundário biotinilado por 30 minutos e, em seguida, incubar com o anticorpo primário. - Incubar no RT por 30 min dentro de uma caixa escura umidificada. Lave com ~200 μL de T50 por pista.
NOTA: Certifique-se de que as faixas nunca sequem durante o processo de preparação.
4. Tampões de molécula única
- Buffer Trolox
NOTA: O buffer Trolox é o buffer inicial para criar o buffer de imagem. Os componentes do tampão dependem do experimento e podem variar dependendo da proteína de interesse. O tampão utilizado no protocolo aqui descrito inclui sais (NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl2), agente tamponante (HEPES) e Trolox (pH ~7,35).- Dissolver 9-10 mg de Trolox em 10 ml de tampão de registo de molécula única (SRB, Ficheiro Suplementar 1)
NOTA: Trolox torna o tampão ligeiramente ácido. Ajustar o pH nesta fase utilizando solução de hidróxido de sódio (NaOH), 10 M (pH 7,35). O ajuste fino do pH será feito após o Trolox estar totalmente dissolvido; no entanto, o aumento do pH neste ponto aumenta a solubilidade do Trolox. - Misture a solução no RT usando um balancim de bancada por 4-8 h (envolto em folha de alumínio) para dissolver completamente o Trolox.
- Verifique o pH e ajuste, se necessário.
- Certifique-se de que o Trolox esteja totalmente dissolvido. Esterilizar a solução com um filtro de seringa e conservar a 4 °C.
NOTA: O tampão deve ser usado após 2-10 dias de envelhecimento. O Trolox ajuda a suprimir o piscar e é comumente usado em estudos de molécula única17. As propriedades anti-piscar provêm de um derivado oxidado de Trolox18; portanto, recomenda-se mantê-lo em RT por pelo menos algumas horas para amadurecer. Além disso, a radiação UV da solução fresca de Trolox acelera o processo de oxidação e pode ser usada para acelerar o "envelhecimento" do tampão Trolox18.
- Dissolver 9-10 mg de Trolox em 10 ml de tampão de registo de molécula única (SRB, Ficheiro Suplementar 1)
- Receita de tampão de imagem: Misture o tampão Trolox + detergente (~2 vezes o valor CMC do detergente) + 4 mM de ácido protocatecúico (PCA).
NOTA: A concentração de detergente é mantida perto da CMC, uma vez que as elevadas concentrações de detergente podem resultar num aumento da desnaturação das proteínas. Por exemplo, a seguinte mistura pode ser usada 955 μL Trolox + 5 μL 10% DDM + colesterol (W%, 10:1) + 40 μL de solução de estoque de PCA de 100 mM. Aqui, a ACP atua como agente antioxidante e foi utilizada anteriormente em estudos de smFRET19. O DDM não é iônico, é comumente usado para solubilizar proteínas de membrana20,21 e tem sido usado em estudos de molécula única. DDM é um bom detergente de primeira escolha; no entanto, recomendamos testar vários detergentes e garantir que os resultados sejam consistentes.
5. Configuração do microscópio e aquisição de dados smFRET
- Ligue o computador e o microscópio. Ligue os lasers para aquecer (532 nm para excitação Cy3 e 640 nm para excitação Cy5).
NOTA: Aqui, um microscópio invertido equipado com uma objetiva TIRF 100x (N.A. 1.49), divisor de imagem e câmera EMCCD foi usado. A configuração é equipada com um combinador a laser de quatro linhas, um espelho dicroico, um filtro de emissão passa-longa, um filtro dicroico de emissão e um filtro de entalhe. - Ligue a câmera EMCCD e abra o software da câmera. Aguarde 20 minutos para que a câmera atinja -69 °C e estabilize.
- Monte a câmara de amostra no estágio do microscópio. Adicionar a amostra de proteína gradualmente para atingir ~400 moléculas por campo de visão (passo 2.4.5). Lave a câmara com 100 μL do tampão de imagem.
- Ajuste o ganho, a taxa de aquisição e as potências do laser de modo que os sinais de fluorescência de molécula única sejam detectados nos canais doador e aceptor. Ajustar a concentração das proteínas no interior da câmara de amostragem, se necessário.
NOTA: Com mais de 400 moléculas no campo de visão, distinguir moléculas individuais torna-se mais difícil e o ruído de fundo será maior. - Excite o doador e adquira vestígios de tempo até que pelo menos 80% das moléculas doadoras no campo de visão sejam fotobranqueadas.
- No final do filme, ligue o laser de 640 nm para excitar diretamente o aceptor até que algumas das moléculas aceitadoras se desintegrem, facilitando a discriminação de uma única molécula contra o multímero.
- Passe para um campo de visão diferente e repita as etapas acima para coletar pelo menos três filmes (replicações técnicas) por condição.
NOTA: Use a menor potência de laser possível ao selecionar uma nova região de interesse (ROI) e focar para minimizar o fotobranqueamento. Preste atenção à deriva do palco durante a aquisição. Se for observada uma deriva perceptível depois de passar para um novo ROI, aguarde 3 minutos antes de iniciar a aquisição.
6. Análise dos dados
- Alinhamento do canal doador e aceitador (mapeamento de filmes)
- Grave as imagens fluorescentes do grânulo nos canais doador e receptor.
- Gerar o arquivo de mapeamento utilizando os dados do grânulo para correlacionar a fluorescência do doador e do aceitador de cada molécula22,23.
NOTA: O sinal de emissão de uma única molécula é dividido em sinais de doador e aceitador pelo filtro dicroico de emissão dentro do divisor de imagem. As imagens do doador e do aceitador são projetadas na câmera lado a lado. Para associar com precisão as intensidades do doador e do aceitador de uma única molécula entre as duas áreas, um arquivo de mapeamento é frequentemente gerado usando amostras de contas fluorescentes. Usando esse arquivo de mapeamento, todas as moléculas que são detectadas nos canais doador e aceitador são mapeadas umas nas outras. A análise então gera os traços de tempo, que são as intensidades do doador e do aceitador ao longo do tempo, para cada molécula.
- Seleção de traços FRET de molécula única (coleta de partículas)
NOTA: Vestígios de partículas individuais são examinados e selecionados para análise a jusante usando o MATLAB. Os critérios exatos de seleção dependem do sistema. Diretrizes gerais sobre o que constitui uma partícula de qualidade são descritas aqui. Todos os códigos personalizados modificados estão disponíveis no GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).- Selecione os vestígios onde a intensidade total dos vestígios (doador + aceitador) é estável ao longo do tempo. Selecione os traços com alterações anti-correlacionadas nas intensidades do doador e do aceitador.
- Selecione as moléculas doadoras e aceitadoras que mostram o fotobranqueamento em uma única etapa. Selecione os rastreamentos com >5 s de comprimento.
NOTA: O plano de fundo em cada canal após o branqueamento deve ir a zero. Os vestígios não devem ter muitos eventos piscantes; isso aumentará a dificuldade de análise. - Calcule a eficiência do FRET usando a equação E = (I A− 0,088 × I D)/(I D + [I A− 0,088 × I D])24,25,26, onde I D e I A são intensidades brutas de doador e aceitador, respectivamente.
NOTA: O vazamento da emissão do doador para o canal aceitador é determinado usando amostra marcada apenas pelo doador excitada usando um laser de 532 nm26. O fator de correção de vazamento, 0,088, pode diferir para diferentes configurações, dependendo dos conjuntos de filtros usados. É importante notar que a conversão quantitativa e robusta de eficiências de FRET em distâncias absolutas requer a correção das intensidades do doador e do aceitador para múltiplos fatores e tem sido amplamente discutida antes27.
- Identificar o estado conformacional por Modelagem de Markov Oculta (HMM)
- Execute o programa vbFRET28 no MATLAB e importe os rastreamentos selecionados para uma determinada condição. Defina as restrições para o número de estados potenciais e iterações a serem executados.
NOTA: Com base nos dados brutos dos resultados representativos, foi levantada a hipótese de que havia até quatro estados FRET discretos ocupados pelo sensor conformacional; assim, foi designado um intervalo de um a quatro estados. Melhorias no ajuste foram previamente determinadas para aumentar insignificantemente com iterações >25; assim, foram utilizadas 25 iterações para o ajuste dos dados representativos. - Analise os traços smFRET e exporte os traços idealizados e a sessão de análise. Salve os rastreamentos idealizados em uma pasta separada para análise a jusante.
NOTA: Os programas utilizados para extrair dados de transição de estado e de tempo de permanência de traços idealizados foram disponibilizados em trabalhos publicados anteriormente29. - Usando programas MATLAB, extraia transições de estado e plote-as como um mapa de calor com a coordenada X indicando a conformação inicial e a coordenada Y indicando a conformação final.
NOTA: Transições são definidas como alterações no valor de FRET >0,1 nos resultados representativos discutidos aqui. O limiar para transições depende dos estados conformacionais hipotéticos que uma proteína de interesse ocupa (limite de transição definido para ser menor do que a diferença entre os estados FRET mais próximos), bem como da resolução permitida pela configuração experimental. O exame de mapas de calor para múltiplas condições permite a identificação dos estados conformacionais mais comuns pelos quais um sensor transita e, assim, ocupa. Quatro estados FRET foram identificados para os resultados representativos (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 e 0,89). - Usando os programas MATLAB, extraia os tempos de permanência para cada estado conformacional identificado. Designe um intervalo de valores FRET delineando cada estado e resolução de tempo durante a aquisição de dados. Os intervalos FRET são divididos uniformemente por estados FRET adjacentes. Exporte os tempos de permanência para determinadas condições de tratamento.
NOTA: Na maioria dos casos, os dados de tempo de permanência podem ser bem estimados por uma única função de decaimento exponencial. Essa análise pode ser realizada em um software de análise de dados e gráficos.
- Execute o programa vbFRET28 no MATLAB e importe os rastreamentos selecionados para uma determinada condição. Defina as restrições para o número de estados potenciais e iterações a serem executados.
- Ajuste gaussiano de histogramas populacionais smFRET para quantificar a ocupação do estado
- Importar histogramas FRET populacionais para condições de interesse para o software de análise de dados e gráficos para análise de múltiplos picos de ajuste.
- Indique o número de picos presentes (quatro picos ou estados com base na análise HMM). O ajuste foi realizado utilizando-se múltiplas distribuições gaussianas30 definidas como
, onde A é a área do pico, xc é o centro do pico e w é a largura do pico para cada pico. - Restrinja os parâmetros de ajuste como A > 0, xc = FRET ± 0,02 e 0,1 ≤w≤ 0,24. Quatro picos de FRET para histogramas de FRET de população individual foram ajustados simultaneamente. Aplique as restrições definidas para os ajustes de todas as condições.
- Calcule o estado de ocupação (porcentagem) como a área de pico de interesse dividida pela área total, definida como a soma de todos os picos.
, onde A é a área do pico, xc é o centro do pico e w é a largura do pico para cada pico.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Expressão e marcação fluorescente do sensor FRET baseado em EAU
Aqui, são discutidos resultados exemplares da inserção e marcação fluorescente de uma AIU (AZP) dentro da DRC de mGluR2 (548UAA)11. Como mencionado anteriormente, para inserir o AZP no mGluR2, é necessária a co-expressão do maquinário translacional projetado, que inclui uma tRNA sintetase modificada e um tRNA complementar (pIRE4-Azi) e mGluR2 contendo um códon âmbar na posição 548, criado usando mutagênese, (Figura 2A,B). A marcação do AZP por corantes cianinos é obtida por uma reação de cicloadição catalisada por cobre (Figura 2C) e resulta em marcação efetiva da membrana plasmática de 548UAA (Figura 2D). Para verificar a tradução de 548UAA de comprimento total e a integridade do receptor dimérico, a eletroforese SDS-PAGE foi realizada no lisado celular a partir de células HEK293T expressando 548UAA marcadas com Cy5. Observou-se uma única banda a 250KDa, que coincidiu com o mGluR2 dimérico de comprimento total (Figura 2E).
Aquisição e análise de dados
As células que expressaram 548UAA com C-terminal FLAG-tag foram marcadas com Cy3 (doador) e Cy5 (aceitador) e, em seguida, lisadas com detergente31 na presença de um inibidor de protease para estudo in vitro. Após a conclusão da lise celular e remoção da fração insolúvel por centrifugação, o sobrenadante foi aplicado em uma lâmina de cobertura passivada por polietilenoglicol (PEG) funcionalizada com um anticorpo anti-FLAG-tag para imagem de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) (Figura 3). A amostra foi iluminada com laser de 532 nm, e as partículas foram selecionadas para análise a jusante utilizando o software smCamera. Traços brutos de doador, aceitador e FRET foram gerados para todas as moléculas selecionadas no smCamera e selecionados usando o MATLAB (seção 6; Figura 4). Uma correção de sangramento do doador de 8,8% foi aplicada às intensidades do aceptor para a configuração experimental aqui utilizada. Este fator de correção variará com a configuração experimental, filtros dicroicos e filtros de emissão utilizados e deve ser determinado medindo os sinais do doador e do aceitador em condições experimentais padrão, usando células marcadas apenas com fluoróforo do doador e calculando o sangramento ([intensidade do aceitador]/[intensidade do doador]). A Figura 4 mostra vários traços representativos do FRET e os sinais correspondentes do doador e do aceptor. Esses vestígios foram selecionados utilizando-se critérios previamente descritos no protocolo (seção 6). Traços selecionados representativos que mostram transições entre vários estados e eventos de branqueamento de doadores e aceitadores são mostrados na Figura 4B-D.
Identificação de estados conformacionais
Para identificar os estados conformacionais ocupados pela 548UAA e a relação desses estados em relação uns aos outros, foi realizada a análise de modelagem de Hidden Markov (HMM). A análise do HMM foi realizada utilizando-se o programa vbFRET executado no MATLAB28 (Figura 5A). A Figura 5 utiliza dados de uma concentração intermediária de glutamato (5μM) para ilustrar o processo de identificação do estado. Com base em traços brutos de smFRET, foi levantada a hipótese de que existiam até quatro estados FRET potenciais para o CRD. Assim, o número de estados foi limitado a um a quatro. Ao todo, 25 iterações de ajuste foram realizadas para cada traço para determinar o número de estados presentes. A partir desses ajustes idealizados, as transições entre estados FRET discretos podem ser extraídas e plotadas como um mapa de calor de densidade de transição (Figura 5B). O mapa de calor destaca quatro estados FRET discretos em 0,31, 0,51, 0,71 e 0,89, indicados por linhas pontilhadas. As transições foram definidas como mudanças no FRET >0,1. Os traços idealizados do FRET também fornecem informações sobre o tempo de permanência para cada conformação identificada (Figura 5C).
Geração do histograma FRET populacional e pico de ajuste
Traços representativos de molécula única para 548UAA na presença de concentrações variáveis de glutamato que foram selecionadas manualmente para análise adicional são mostrados na Figura 6A,B. Uma análise geral para experimentos smFRET é gerar histogramas populacionais a partir de centenas de traços smFRET para cada condição experimental (Figura 6C). Os histogramas de FRET populacionais são criados a partir do segmento de vestígios antes do branqueamento. Para evitar o viés do histograma em direção ao comportamento de traços mais longos, é necessário gerar um histograma FRET normalizado a partir de cada traço antes da média. Isso garante que cada traço contribua igualmente para o histograma final. Neste sistema, os histogramas FRET mostram uma mudança geral em direção a FRET mais alta com o aumento da concentração de glutamato, indicando uma redução na distância entre os CRDs e um deslocamento para a conformação ativa. No entanto, independentemente da concentração de glutamato, o sinal FRET permanece bastante esporádico, indicando um alto grau de dinâmica intrínseca para a DRC. Além da mudança geral para um FRE mais alto, uma redistribuição do conjunto conformacional torna-se aparente no histograma (curvas de cor). Moléculas individuais também podem ser vistas visitando esses estados conformacionais (linhas tracejadas) (Figura 6B). Para determinar a probabilidade de ocupação do estado, deve-se dividir a área do pico pela área total, definida como a soma de todas as quatro áreas de pico individuais. O histograma smFRET gerado a partir do experimento smFRET do CRD de mGluR2 exibiu quatro estados dinâmicos com picos em 0,31, 0,51, 0,71 e 0,89 (rotulados nos estados 1-4), respectivamente.
Figura 1: Fluxograma do protocolo de trabalho e análise de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Marcação específica do local do mGluR2 por química de cliques . (A) Esquema do processo de incorporação do aminoácido não natural 4-azido-L-fenilalanina nas células. (B) Esquema mostrando marcação fluorescente site-specific de mGluR2, com o aminoácido não natural na posição 548, por reação de clique azida-alquina catalisada por cobre. (C) Estrutura tridimensional de mGluR2 marcada fluorescentemente (molécula doadora em verde, molécula aceptora em vermelho) com moléculas Cy3 e Cy5 encaixadas. (D) Imagem representativa do microscópio confocal de células HEK293T expressando 548UAA com a população da superfície celular marcada com fluoróforos doadores (verdes: Cy3) e aceitadores (vermelhos: Cy5) através de química de clique. Barras de escala = 10 μm. (E) Imagem de eletroforese em gel de poliacrilamida 4%-20% não redutora de lisado celular de células HEK293T expressando 548UAA e marcada por Cy5-alquina. O gel é fotografado com um comprimento de onda de excitação de 633 nm e filtro de emissão 670-BP30-Lane a: escada de proteína; faixa b: lisado celular; faixa c: Corante Cy5-alquino. Os resultados são representativos de um experimento individual. Os painéis B, D e E são reutilizados a partir de Liauw et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática dos experimentos smFRET e configuração do microscópio (TIRF). A imagem de fluorescência de molécula única do doador é mostrada em verde (barra de escala = 1000 nm) e o aceptor em vermelho. O doador estava excitado a 532 nm usando um laser. O aceitador é animado pelo FRET do doador. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Traços de intensidade do doador (verde) e do aceptor (vermelho) rotulados mGluR2 . (A) Desenho animado mostrando a dinâmica do receptor e a mudança na distância entre as sondas FET. (B) Estado de FRET elevado de longa duração. (C) Múltiplos estados FRET com fotobranqueamento do aceitador primeiro seguido de fotobranqueamento do doador. (D) Estado FRET de curta duração com fotobranqueamento do aceitador. (E) Estado de FRET estável de longa duração com fotobranqueamento aceptor. Essa figura é reproduzida com modificações mínimas de Liauw et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Identificação do estado conformacional . (A) Traço representativo do FRET com ajuste idealizado sobreposto (vermelho) juntamente com o sinal de doador e aceitador correspondente. (B) Mapa de calor de densidade de transição destacando as transições conformacionais mais frequentes sofridas por 548UAA. Linhas tracejadas indicam estados FET. (C) Tempos médios de permanência de cada estado conformacional. Essa figura é reproduzida com uma modificação mínima de Liauw et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: O FRET de molécula única revela quatro estados conformacionais de mGluR2 CRD . (A) Quadro representativo de um filme de molécula única com o canal doador (Cy3) à esquerda e o canal aceptor (Cy5) à direita. As moléculas selecionadas por software de análise para processamento a jusante são indicadas por círculos verdes. Barra de escala = 3 μm. (B) Exemplo de traços de tempo de molécula única do 548UAA em diferentes concentrações de glutamato. As intensidades do doador (verde) e do aceptor (vermelho) e o FRET (azul) correspondente são mostrados. Linhas tracejadas representam quatro estados FRET distintos. (C) histogramas populacionais smFRET em uma variedade de concentrações de glutamato. Os dados representam média ± MEV. de N = 3 experimentos independentes. Essa figura é reproduzida com uma modificação mínima de Liauw et al.11. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Resumo do protocolo geral . (A) Fluxo de trabalho para o crescimento e marcação de células que expressam uma proteína contendo um aminoácido não natural. (B) Fluxo de trabalho experimental e de análise FRET de molécula única usado para identificar estados conformacionais e caracterizar as propriedades dinâmicas do domínio CRD em mGluR2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente | Volume/Reação (μL) |
| Meio Sérico Reduzido | 100 |
| Reagente de transfecção | 4.4 |
| Componente | Volume/Reação (μL) |
| Meio Sérico Reduzido | 100 |
| P3000 | 4 |
| Nome da construção/componente | Concentração (ng/μL) | Volume/poço (12 poços) (μL) | Poços (#) | DNA adicionado (μL) |
| RNAt/sintetase | 1000 | 1 | 1 | 1 |
| Códon âmbar contendo proteína | 1000 | 1 | 1 | 1 |
Tabela 1: Reagentes para a transfecção da célula T HEK 293.
| Reagentes | Volume a adicionar (μL) | Estoque conc (mM) | Conc Final (mM) |
| 1x RB | 655.5 | ||
| BTTES | 10.5 | 50 | 0.75 |
| CuSO4 | 5.25 | 20 | 0.15 |
| NaAsc | 17.5 | 100 | 2.5 |
| AminoG | 8.75 | 100 | 1.25 |
| Cy3-Alquina (10 mM) | 1.25 | 10 | 0.018 |
| Cy5-Alquina (10 mM) | 1.25 | 10 | 0.018 |
Tabela 2: Composição da solução de marcação (clique em química).
Arquivo Suplementar 1: Composição de vários buffers utilizados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
GPCRs são proteínas que operam na membrana celular para iniciar a transdução de sinal. Muitos GPCRs consistem em vários domínios, com a sinalização sendo dependente da interação cooperativa entre os domínios. Para modular as propriedades desses receptores de membrana, é essencial entender o comportamento dinâmico dos múltiplos domínios. A transferência de energia por ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) é uma técnica de fluorescência que permite a medição da conformação e dinâmica de proteínas em tempo real11,32. Aqui, uma abordagem que combina smFRET, pull-down de molécula única (SiMPull) e microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar diretamente o rearranjo de proteínas individuais imobilizadas em uma superfície passivada é descrita 5,11,33. O FRET é altamente sensível à distância e funciona efetivamente como uma régua em nanoescala apropriada para sondar alterações intramoleculares (3-8 nm). Em comparação com as abordagens biofísicas tradicionais, o smFRET é particularmente adequado para o estudo de grandes dinâmicas conformacionais em uma escala de tempo de ~10 ms e requer um pequeno volume de amostra (aproximadamente 1 fmole por experimento). Além disso, em contraste com as medições de conjunto da dinâmica conformacional, como as fornecidas pela espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)34 ou ressonância dupla elétron-elétron-elétron (DEER)35, o smFRET permite a atribuição explícita de ambos os estados conformacionais e sua ordenação temporal, bem como a detecção direta de estados intermediários raros e transitórios.
Atualmente, as limitações da marcação fluorescente site-specific representam um desafio técnico que impede a aplicação mais ampla do smFRET para estudar a dinâmica de conformação de proteínas. Além disso, é difícil purificar as proteínas da membrana em grandes quantidades e preservar sua atividade. Estratégias comuns de marcação utilizam grandes marcas de proteína ou requerem a geração de mutantes mínimos de cisteína, muitas vezes restringindo a conjugação de fluoróforos ao termini de proteínas sem resíduos de cisteína expostos. Para contornar essas limitações, uma estratégia de incorporação de aminoácidos não naturais (AIA) foi adaptada e otimizada, permitindo a marcação não perturbativa, específica de resíduos, utilizando uma reação de clique catalisada por cobre11,12,14. Essa estratégia possibilita a conjugação de fluoróforos em todas as regiões expostas a solventes do receptor de membrana e permite que uma gama mais ampla de sensores conformacionais seja gerada. Neste protocolo, um único tipo de química de conjugação é usado. Isso resulta em populações apenas doador-doador e aceitador-aceitador, que são omitidas durante a análise a jusante. Alternativamente, duas estratégias de marcação ortogonal podem ser usadas para evitar isso ou superar possíveis heterogeneidades quando a proteína de interesse não é simétrica.
A captura direta de proteínas ajuda a contornar as etapas tradicionais de purificação que são demoradas e tecnicamente desafiadoras. Devido à citotoxicidade do cobre, a química de clique livre de cobre baseada em transciclooctano36 ou metil-tetrazina37 também é empregada. No entanto, esses reagentes são caros, e a natureza não regioespecífica38 da reação resulta em um baixo rendimento de proteína de interesse marcada fluorescentemente.
Diretrizes completas para experimentos smFRET in vitro , desde a preparação da câmara de fluxo até a análise dos dados, foram apresentadas aqui. Os dados do smFRET foram coletados por meio de uma configuração TIRF e a análise foi realizada usando um código MATLAB escrito sob medida.
Algumas considerações importantes devem ser observadas. Primeiro, deve-se preparar a superfície passivada pelo PEG para ser homogênea e menos densa com a biotina-PEG. O excesso de biotina-PEG pode resultar em desaceleração excessiva de proteínas, dificultando a resolução de sinais fluorescentes de moléculas individuais. Em segundo lugar, a amostra de proteína (sobrenadante de lisado celular) deve ser completamente diluída antes de ser adicionada à câmara de amostra para evitar a saturação superficial. O rendimento de proteína depende da densidade celular, do detergente de escolha e da concentração de detergente. Para otimizar o número de pares de doador único e aceitador, deve-se atingir uma densidade de ~ 400 moléculas em um campo de visão de 256 x 512 pixels. Em terceiro lugar, o tampão Trolox deve ser armazenado a -20 °C para uso a longo prazo (meses). O tampão Trolox permanece estável durante 2 semanas quando armazenado a 4 °C. Por fim, deve-se tomar cuidado para não introduzir bolhas de ar na câmara de fluxo após a funcionalização com o anticorpo. A secagem da câmara de fluxo resultará em redução da eficiência da imobilização de proteínas e na desnaturação de proteínas da amostra.
A dinâmica conformacional do sensor mGluR2 descrita aqui foi examinada com sucesso no nível do receptor individual usando smFRET e forneceu informações sobre o mecanismo de ativação do receptor. Verificou-se que a DRC demonstrou um alto nível de dinâmica intrínseca, existindo em um equilíbrio entre quatro estados conformacionais de FRET, independentemente da presença ou ausência de glutamato. Uma mudança para estados mais altos de FRET ou um receptor mais compacto mostrou ocorrer de maneira dependente da concentração de glutamato (Figura 6). Curiosamente, mesmo em níveis saturados de glutamato, a DRC permaneceu dinâmica. O método aqui apresentado (resumido na Figura 7) para compreender a dinâmica conformacional é aplicável a outros GPCRs classe C, bem como a outras proteínas de membrana, como canais iônicos, receptores ionotrópicos e receptores tirosina quinases (RTKs)32,39.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos aos membros do laboratório Reza Vafabakhsh pelas discussões. Este trabalho foi apoiado pelo subsídio R01GM140272 dos Institutos Nacionais de Saúde (para R.V.), pelo Searle Leadership Fund for the Life Sciences da Northwestern University e pelo Chicago Biomedical Consortium com o apoio dos Searle Funds no The Chicago Community Trust (para R.V.). B.W.L. foi apoiado pelo National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Training Grant T32GM-008061.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
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