Summary
В этом исследовании представлена подробная процедура проведения экспериментов по переносу энергии одномолекулярного флуоресцентного резонанса (smFRET) на рецепторах, связанных с G-белком (GPCR), с использованием сайт-специфической маркировки через включение неестественных аминокислот (UAA). Протокол содержит пошаговое руководство по подготовке образцов smFRET, экспериментам и анализу данных.
Abstract
Способность клеток реагировать на внешние сигналы имеет важное значение для клеточного развития, роста и выживания. Чтобы реагировать на сигнал из окружающей среды, клетка должна уметь распознавать и обрабатывать его. Эта задача в основном опирается на функцию мембранных рецепторов, роль которых заключается в преобразовании сигналов в биохимический язык клетки. Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), составляют крупнейшее семейство мембранных рецепторных белков у людей. Среди GPCR метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются уникальным подклассом, которые функционируют как облигатные димеры и обладают большим внеклеточным доменом, содержащим лиганд-связывающий сайт. Последние достижения в структурных исследованиях mGluRs улучшили понимание процесса их активации. Однако распространение крупномасштабных конформационных изменений через mGluRs во время активации и модуляции плохо изучено. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) является мощным методом визуализации и количественной оценки структурной динамики биомолекул на уровне одного белка. Для визуализации динамического процесса активации mGluR2 были разработаны флуоресцентные конформационные датчики на основе включения неестественных аминокислот (UAA), которые позволили маркировать сайт-специфический белок без возмущения нативной структуры рецепторов. Протокол, описанный здесь, объясняет, как выполнять эти эксперименты, включая новый подход к маркировке UAA, подготовку образцов и сбор и анализ данных smFRET. Эти стратегии являются обобщаемыми и могут быть расширены для исследования конформационной динамики различных мембранных белков.
Introduction
Передача информации через плазматическую мембрану сильно зависит от функции мембранных рецепторов1. Связывание лиганда с рецептором приводит к конформационному изменению и активации рецептора. Этот процесс часто носит аллостерический характер2. С более чем 800 членами, рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), являются крупнейшим семейством мембранных рецепторов у людей3. Благодаря своей роли почти во всех клеточных процессах, GPCR стали важными мишенями для терапевтического развития. В канонической модели передачи сигналов GPCR активация агониста приводит к конформационным изменениям рецептора, которые впоследствии активируют гетеротримерный G-белковый комплекс путем обмена GDP на GTP в нуклеотидном карманеG-α. Активированные субъединицы Gα-GTP и Gβγ затем контролируют активность последующих эффекторных белков и распространяют сигнальный каскад 4,5. Этот сигнальный процесс существенно зависит от способности лигандов изменять трехмерную форму рецептора. Механистическое понимание того, как лиганды достигают этого, имеет решающее значение для разработки новых терапевтических средств и проектирования синтетических рецепторов и датчиков.
Метаботропные глутаматные рецепторы (mGluRs) являются членами семейства GPCR класса C и важны для медленных нейромодулирующих эффектов глутамата и настройки возбудимости нейронов 6,7. Среди всех GPCR GPCR класса C являются структурно уникальными в том смысле, что они функционируют как облигатные димеры. mGluRs содержат три структурных домена: домен венериной мухоловки (VFT), богатый цистеином домен (CRD) и трансмембранный домен (TMD)8. Конформационные изменения в процессе активации являются сложными и включают локальную и глобальную конформационную связь, которая распространяется на расстояние 12 нм, а также димерную кооперативность. Промежуточные конформации, временное упорядочение состояний и скорость перехода между состояниями неизвестны. Следуя конформации отдельных рецепторов в режиме реального времени, можно идентифицировать переходные промежуточные состояния и последовательность конформационных изменений во время активации. Это может быть достигнуто путем применения одномолекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии 9,10 (smFRET), как это было недавно применено для визуализации распространения конформационных изменений при активации mGluR211. Ключевым шагом в экспериментах FRET является генерация датчиков FRET путем специфической для сайта вставки донорских и акцепторных флуорофоров в интересующий белок. Стратегия включения неестественных аминокислот (UAA) была принята 12,13,14,15 для преодоления ограничений типичных технологий флуоресцентной маркировки, которые требуют создания мутантов без цистеина или вставки большой генетически закодированной метки. Это позволило наблюдать конформационную перестройку существенного компактного аллостерического линкера, который соединял лигандсвязывающий и сигнальный домены mGluR2. В этом протоколе представлено пошаговое руководство по проведению экспериментов smFRET на mGluR2, включая подход к маркировке mGluR2 с помощью UAA для присоединения флуорофоров с использованием катализируемой медью реакции циклизации азида. Более того, этот протокол описывает методологию прямого захвата мембранных белков и анализа данных. Протокол, изложенный здесь, также применим к изучению конформационной динамики других мембранных белков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Общий рабочий процесс протокола описан на рисунке 1.
1. Подготовка пробоотборной камеры
- Очистка слайдов и крышек
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги направлены на очистку поверхностей слайдов, а также обшивки и подготовку их к аминосиланизации. Одним из важнейших требований для проведения одномолекулярных флуоресцентных экспериментов на поверхностно-привязанных молекулах является пассивированная поверхность. Наиболее надежный и воспроизводимый метод пассивации предполагает ковалентное прикрепление инертных полимерных цепей к поверхности стекла в виде плотного слоя. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) является наиболее эффективным полимером, используемым для пассивации поверхности16. Подробности процедуры пассивации с использованием ПЭГ (ПЭГилирования) описаны ниже:- Отметьте отверстия, которые необходимо просверлить на слайдах маркером (~6 мм друг от друга и в стороне от края). Используйте Dremel для сверления небольших отверстий (диаметром 1 мм) на стеклянной горке. Погружайте горки в воду во время процесса бурения.
- Промойте слайды ацетоном, чтобы удалить остатки чернил с маркера.
- Снимите с ацетона и промойте горки водой, затем разогрейте их в микроволновой печи в течение 5 минут в воде на высокой мощности (700 Вт).
- Очистите горки водой, прежде чем поместить их в стеклянную витражную банку для обработки ультразвуком. Поместите крышки в другую банку для окрашивания.
- Обрабатывайте слайды и крышки в ацетоне в течение 30 мин в ультразвуковом аппарате ванны при 23 °C.
- Тем временем очистите стеклянную колбу для приготовления раствора аминосиланизации, используемого на следующем этапе. Наполните колбу 1 М КОН, обжайте колбу ультразвуком в течение 30 мин, тщательно промойте КОХ водой, а затем в течение дополнительных 30 мин в метаноле нанесите ультразвук. Оставьте колбу в метаноле до момента стадии аминосиланизации.
- Тем временем удалите аминосилан, mPEG и биотин-ПЭГ из морозильной камеры (-20 ° C) и дайте им достичь комнатной температуры (RT) в темноте.
- Утилизируйте ацетон из слайда и закрывающих банок в соответствующем контейнере для химических отходов, тщательно промойте водой, а затем обработайте горки ультразвуком в 5 М КОН в течение 30 минут.
- Промойте горки и крышки водой, а затем обработайте метанол ультразвуком в течение 2 мин (повторите дважды). Оставьте банки, наполненные метанолом, до стадии аминосиланизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании используется деионизированная вода, если не указано иное. Используется звуковой аппарат для ванны, работающий при 23 °C.
- Аминосиланизация
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг направлен на ковалентное связывание аминосилана с чистой поверхностью слайда и крышки. Функционализированные mPEG и биотин-ПЭГ будут ковалентно связываться с этой поверхностью на следующем этапе.- Приготовьте аминосиланизационную смесь в чистой колбе (этап 1.6). Готовят раствор, смешивая метанол (150 мл), уксусную кислоту (7,5 мл, используйте стеклянную пипетку) и аминосилан (2,5 мл).
- Аккуратно перемешайте раствор в химической вытяжке, затем вылейте его в горку и закрывайте банки. Используйте 50 мл для обшивки и 100 мл для слайдов. Убедитесь, что слайды и крышки полностью погружены в решение.
- Инкубировать в течение 10 мин, затем обрабатывать банки ультразвуком в течение 1 мин (обработка ультразвуком удаляет примеси с поверхности) и инкубировать еще 10 мин.
- Утилизируйте раствор аминосиланизации в контейнер для сбора отходов. Добавьте метанол в банки, закройте банки крышками и аккуратно встряхните вручную. Утилизируйте метанол и наполните банки водой.
- Верните флакон с аминосиланом в морозильную камеру (−20 °C).
- ПЕГИЛИРОВАНИЕ
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги описывают процедуру ПЕГилирования.- Во время аминосиланизации подготавливают пегилационный буфер. Взвесьте 84 мг бикарбоната натрия (NaHCO3) и добавьте его в 10 мл воды (10 мМ). Кроме того, взвесьте mPEG и биотин-PEG и отложите их в сторону. Для шести слайдов и обложек используйте 96 мг mPEG и 1,2-2,4 мг биотина-PEG.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не добавлять слишком много биотина-ПЭГ, так как это может увеличить количество фоновых пятен. Не растворяйте смесь ПЭГ до непосредственного нанесения на слайды. - Промойте горки водой, высушите их легким воздушным ударом, а затем поместите в увлажненные сборочные коробки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать чистую авиакомпанию. Избегайте использования сжатого консервированного воздуха, который может оставить остатки на стекле. - Добавьте пегилационный буфер в порошковую смесь ПЭГ и пипетку вверх и вниз осторожно несколько раз, чтобы растворить. Добавьте 55 мкл пегилационного буфера на слайд (для шести слайдов добавьте 330 мкл пегилационного буфера).
- Центрифуга при 9 600 х г в течение 1 мин при 23 °C для осаждения нерастворенных частиц. Соберите супернатант для использования на следующем шаге.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биотин-ПЭГ быстро гидролизуется из-за присутствия группы NHS. Важно быстро выполнить этапы смешивания и центрифугирования. - Нанесите 60 мкл раствора ПЭГилирования на каждый слайд, а затем поместите крышку сверху так, чтобы раствор ПЕГилирования был зажат между слайдом и крышкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте введения пузырьков между слайдом и крышкой, так как это снизит эффективность пассивации. Удалите все пузырьки, отрегулировав крышку и слайд с помощью наконечника пипетки. - Поместите слайды в плоский и темный ящик. Слайды можно хранить в течение ночи; однако инкубация в течение 4-6 ч приводит к оптимальной пассивации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно помнить, какая сторона пегилирована. - Перед хранением отметьте непегилированную сторону. После инкубации аккуратно разберите и тщательно промойте горки и крышки водой.
- Высушите горки и крышки, обдувая воздухом. Держите слайды и крышки в стерильной трубке (50 мл), при этом полиэтиленовая поверхность обращена друг к другу. Хранить при −20 °C до дня эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать слайды и обложки в течение 4 недель после подготовки. ПЭГилированные поверхности должны быть обращены в сторону друг от друга. Хранение полиэтиленовых слайдов и чехлов в вакуумных пакетах может увеличить срок их хранения.
- Во время аминосиланизации подготавливают пегилационный буфер. Взвесьте 84 мг бикарбоната натрия (NaHCO3) и добавьте его в 10 мл воды (10 мМ). Кроме того, взвесьте mPEG и биотин-PEG и отложите их в сторону. Для шести слайдов и обложек используйте 96 мг mPEG и 1,2-2,4 мг биотина-PEG.
2. экспрессия mGluR2 с включенной неестественной аминокислотой, флуоресцентной маркировкой и экстракцией
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает препарат, реагенты и лечение клеток для экспрессии mGluR2, содержащих UAA 4-азидо-L-фенилаланин (AZP). Процедура предназначена для клеток HEK293T, выращенных на стеклянных покровах толщиной 18 мм. Процедура может быть расширена по мере необходимости.
- Посев
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать клетки HEK293T в ДМЭМ, дополненные 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой, 100 единиц·мл−1 пенициллин-стрептомицин и 15 мМ буфера HEPES (дополнительный файл 1) (рН 7,4) при 37 °C при 5% CO2.- Пропускают клетки с 0,05% трипсина-ЭДТА. Семена heK293T клеток на стеклянных крышках из поли-L/D-лизина (PLL/PDL) таким образом, чтобы они достигали ≥80% конфюляции во время трансфекции.
- Трансфекция
- Приготовьте 40 мМ запасного раствора АЗП в 0,1 М NaOH.
- Подготовка среды, дополненной AZP, для выращивания клеток и экспрессии mGluR2. Дополняйте стандартные носители (+ FBS, ручка/стрептококк, 15 мМ HEPES) с использованием 40 мМ АЗП. Доведите конечную концентрацию AZP до 0,6 мМ. Добавьте 1 M раствора HEPES (добавлена половина объема 40 мМ раствора AZP). Например, для получения 10 мл АЗП, дополненной средой, смешайте 9,775 мл стандартной среды, 150 мкл 40 мМ раствора AZP и 75 мкл 1 M РАСТВОРА HEPES.
- Фильтруйте (стерилизуйте) среду с помощью шприцевого фильтра (0,2 мкм, PES).
- Замените стандартный носитель носителем, содержащим носитель, дополненный AZP, перед трансфекцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не высушить клетки во время замены среды. - Трансфектируйте клетки трансфекционным реагентом (Таблица материалов) в соответствии с руководством производителя. Трансфектируйте клетки HEK293T на 18-миллиметровом покровном листе, используя в общей сложности 2 мкг ДНК (1000 нг тРНК/синтетазы + 1000 нг янтарной кодон-содержащей белковой плазмиды). В таблице 1 приведены сведения о концентрации и объеме используемых компонентов.
- Измените среду через 24 ч после трансфекции на свежую среду, дополненную AZP, и позвольте клеткам расти в течение дополнительных 24 ч.
- Маркировка алкиновыми цианиновыми красителями
- За 20 мин до маркировки дважды вымойте крышки теплым (37 °C) буфером записи (RB) (Дополнительный файл 1) и переместите их на теплый (37 °C) стандартный носитель без AZP (+ FBS, Pen/Strep, 15 мМ HEPES).
- Готовят маркировочный раствор, содержащий Cy3-алкин, Cy5-алкин, BTTES, сульфат меди (II) (CuSO4), (+) L-аскорбат натрия и аминогуанидин.
- Следуйте порядку создания и добавления решений (таблица 2):
- Подготовьте 50 мМ BTTES.
- Готовят 100 мМ аминогуанидина.
- Приготовить 100 мМ Na-аскорбата.
- Приготовить 655,5 мкл РБ.
- Добавьте алкиновый краситель Cy3/Cy5 (10 мМ в запасе DMSO) в RB.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте аминогуанидин в RB. - Приготовьте 20 мМ CuSO4.
- Смешайте CuSO4 и BTTES в новой пробирке (раствор станет синим).
- Добавьте смесь CuSO4 и BTTES в RB (2.3.3.6.)
- Добавьте На-Аскорбат.
- Следуйте объему, приведенному в таблице 2 ниже, для 18-мм крышки.
- Тщательно перемешайте раствор и инкубируйте на льду и в темноте в течение 10 мин перед маркировкой клеток.
- Перед добавлением раствора для маркировки в обшивки извлеките носитель и промойте их RB. Добавляют маркировочный раствор и инкубируют в течение 15 мин при 37 °C в темных условиях.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения маркировки добавляют глутамат (конечная концентрация ~0,5 мМ) через 10 мин и инкубируют еще 5 мин. Медь очень токсична для клеток, и реакция маркировки не должна продолжаться более 15 мин in vivo. Приготовьте все компоненты свежими. Добавьте Na-аскорбат последним. Во время приготовления держите реакцию при температуре 4°C. Однако после добавления маркировочного раствора клетки должны храниться при температуре 37 °C внутри инкубатора.
- Сбор клеток и извлечение белков (лизис клеток)
- Удалите раствор для маркировки и дважды промойте крышку (18 мм), содержащую трансфектированные клетки mGluR2, RB.
- Используя пипетку, смойте ячейки с крышки и повторно суспендируйте в RB (1 мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимально сведите к минимуму воздействие света на образец после этого момента. - Гранулируйте клетки, вращая при 1000 х г при 4 °C в течение 5 мин и удаляйте супернатант. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 80-130 мкл раствора лизиса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула клетки должна быть видна на глаз. Объем лизиса зависит от количества образца, потерянного в процессе маркировки и промывки. - Аккуратно перемешайте путем пипетки, чтобы разбить гранулу. Заверните в фольгу и поместите на коромысло при 4 °C в течение 0,5-1 ч для лизирования клеток.
- Гранулируют нерастворимую фракцию центрифугированием при 20 000 х г и 4 °С в течение 20 мин. Перенесите супернатант в свежую холодную трубку (лизированный белок, который содержит интересующий флуоресцентно помеченный белок) и храните его на льду для экспериментов.
3. Сборка и функционализация одномолекулярной проточной камеры
- Извлеките слайд и крышку из морозильной камеры и дайте им нагреться в RT в темноте (~30 мин).
- Соберите камеру с помощью двусторонней ленты, зажав полоски двусторонней ленты между слайдом и крышкой. Убедитесь, что ПЭГилированные поверхности образуют внутреннюю часть проточной камеры.
- Используя наконечник пипетки, нажмите на крышку, чтобы убедиться, что лента полностью соприкасается как с крышкой, так и со слайдом; позаботьтесь о том, чтобы не сломать крышку. Нанесите эпоксидную смолу на края слайдов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте столько, чтобы эпоксидная смола заполняла просверленные отверстия. - Поместите проточную камеру стороной крышки вниз в увлажненную темную коробку, чтобы эпоксидная смола высохла (~30 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте буфер T50 (дополнительный файл 1) через просверленные отверстия, чтобы предотвратить покрытие эпоксидной смолой отверстий (10-15 мкл) в период сушки. - Инкубируйте каждую полосу камеры с 500 нМ нейтравидина (разбавленного в Т50), медленно применяя ~ 40 мкл к каждой полосе.
- Инкубировать на RT в течение 2 мин внутри увлажненного темного ящика. Промывка с ~100 мкл буфера T50 на полосу.
- Инкубируйте каждую полосу камеры с 20 нМ биотинилированным антителом11. Выбор антитела зависит от метки на белке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если первичное антитело не биотинилировано, сначала инкубируют с биотинилированным вторичным антителом в течение 30 мин, а затем инкубируют с первичным антителом. - Инкубировать на RT в течение 30 мин внутри увлажненного темного ящика. Мойка с ~200 мкл T50 на полосу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что полосы никогда не высыхают в процессе подготовки.
4. Одномолекулярные буферы
- Буфер тролокса
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер Trolox является начальным буфером для создания буфера изображений. Компоненты буфера зависят от эксперимента и могут варьироваться в зависимости от интересующего белка. Буфер, используемый в описанном здесь протоколе, включает соли (NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2), буферный агент (HEPES) и тролокс (pH ~ 7,35).- Растворите 9-10 мг Тролокса в 10 мл одномолекулярного регистрирующего буфера (SRB, Дополнительный файл 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Тролокс делает буфер слегка кислым. Регулируют рН на этом этапе с помощью раствора гидроксида натрия (NaOH), 10 М (рН 7,35). Тонкая регулировка pH будет произведена после полного растворения Тролокса; однако повышение рН в этой точке увеличивает растворимость тролокса. - Перемешайте раствор на RT с помощью настольного коромысла в течение 4-8 ч (завернутого в алюминиевую фольгу) до полного растворения Тролокса.
- Проверьте pH и при необходимости отрегулируйте его.
- Убедитесь, что Тролокс полностью растворен. Стерилизовать раствор шприцевым фильтром и хранить при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер следует использовать после 2-10 дней выдержки. Тролокс помогает подавить моргание и обычно используется в одномолекулярных исследованиях17. Антимигающие свойства получены из окисленного производного Тролокса18; следовательно, рекомендуется держать его на RT в течение как минимум нескольких часов, чтобы созреть. Кроме того, УФ-излучение свежего раствора Тролокса ускоряет процесс окисления и может быть использовано для ускорения «старения» буфера Тролокса18.
- Растворите 9-10 мг Тролокса в 10 мл одномолекулярного регистрирующего буфера (SRB, Дополнительный файл 1)
- Рецепт буфера визуализации: смешайте буфер Trolox + моющее средство (~ в 2 раза превышающее значение CMC моющего средства) + 4 мМ протокатеховой кислоты (PCA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация моющего средства держится вблизи КМЦ, так как высокие концентрации моющих средств могут привести к увеличению денатурации белка. Например, в следующей смеси можно использовать 955 мкл Тролокса + 5 мкл 10% ДДМ + холестерин (W%, 10:1) + 40 мкл 100 мМ раствора ПЦА. Здесь PCA действует как антиоксидантный агент и ранее использовался в исследованиях smFRET19. DDM является неионным, обычно используется для солюбилизации мембранных белков20,21 и используется в одномолекулярных исследованиях. DDM является хорошим моющим средством первого выбора; Тем не менее, мы рекомендуем протестировать несколько моющих средств и убедиться, что результаты одинаковы.
5. Настройка микроскопа и сбор данных smFRET
- Включите компьютер и микроскоп. Включите лазеры для разогрева (532 нм для возбуждения Cy3 и 640 нм для возбуждения Cy5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовался перевернутый микроскоп, оснащенный объективом 100x TIRF (N.A. 1.49), разделителем изображения и камерой EMCCD. Установка оснащена четырехлинейным лазерным комбайнером, дихроичным зеркалом, фильтром излучения длинных проходов, эмиссионным дихроичным фильтром и фильтром с насечкой. - Включите камеру EMCCD и откройте программное обеспечение камеры. Подождите 20 минут, пока камера достигнет −69 °C и стабилизируется.
- Установите камеру для образцов на ступень микроскопа. Добавляйте образец белка постепенно, чтобы достичь ~400 молекул на поле зрения (шаг 2.4.5). Промывайте камеру 100 мкл буфера визуализации.
- Отрегулируйте коэффициент усиления, скорость захвата и мощность лазера таким образом, чтобы одномолекулярные флуоресцентные сигналы обнаруживались как в донорском, так и в акцепторном каналах. При необходимости отрегулируйте концентрацию белков внутри пробной камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: С более чем 400 молекулами в поле зрения различать отдельные молекулы становится сложнее, а фоновый шум будет выше. - Возбуждают донора и приобретают временные следы до тех пор, пока не будет фотоотбелено по меньшей мере 80% молекул донора в поле зрения.
- В конце фильма включите лазер 640 нм, чтобы непосредственно возбуждать акцептор до тех пор, пока некоторые из молекул акцептора не отбелеют, облегчая одну молекулу от мультимерной дискриминации.
- Перейдите в другое поле зрения и повторите описанные выше шаги, чтобы собрать не менее трех фильмов (технических реплик) для каждого условия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте минимально возможную мощность лазера при выборе новой интересующей области (ROI) и фокусировке, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание. Обратите внимание на дрейф стадии во время приобретения. Если после перехода на новый ROI наблюдается заметный дрейф, подождите 3 минуты перед началом приобретения.
6. Анализ данных
- Выравнивание каналов донора и акцептора (сопоставление фильмов)
- Записывайте флуоресцентные изображения шариков в донорском и акцепторном каналах.
- Сгенерируйте файл сопоставления, используя данные шарика, чтобы соотнести донорскую и акцепторную флуоресценцию от каждой молекулы22,23.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмиссионный сигнал от одной молекулы разбивается на донорский и акцепторный сигналы эмиссионным дихроичным фильтром внутри сплиттера изображения. Изображения донора и акцептора проецируются на камеру бок о бок. Чтобы точно связать интенсивность донора и акцептора одной молекулы между двумя областями, файл картирования часто генерируется с использованием флуоресцентных образцов шариков. Используя этот файл сопоставления, все молекулы, которые обнаруживаются в донорском и акцепторном каналах, сопоставляются друг на друга. Затем анализ генерирует временные следы, которые являются интенсивностью донора и акцептора с течением времени, для каждой молекулы.
- Подбор одномолекулярных следов FRET (подбор частиц)
ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные следы частиц исследуются и отбираются для последующего анализа с использованием MATLAB. Точные критерии отбора зависят от системы. Общие рекомендации о том, что представляет собой частица качества, изложены здесь. Все пользовательские коды доступны на GitHub (https://github.com/vafabakhsh-lab).- Выберите следы, где общая интенсивность следов (донор + акцептор) стабильна с течением времени. Выберите следы с антикоррелированными изменениями донорской и акцепторной интенсивности.
- Выберите донорские и акцепторные молекулы, которые показывают одноступенчатое фотоотбеливание. Выберите трассировки длиной >5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фон в каждом канале после отбеливания должен быть равен нулю. Следы не должны иметь много мигающих событий; это повысит сложность анализа. - Рассчитайте эффективность FRET с помощью уравнения E = (IA− 0,088 × ID)/(ID + [IA− 0,088 × ID])24,25,26, где I D и IA — необработанные донорские и акцепторные интенсивности соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Утечка донорского излучения в акцепторный канал определяется с использованием только донорского меченого образца, возбужденного с помощью лазера26 532 нм. Поправочный коэффициент утечки, 0,088, может отличаться для разных настроек в зависимости от используемых наборов фильтров. Важно отметить, что количественное и надежное преобразование эффективности FRET в абсолютные расстояния требует коррекции интенсивности донора и акцептора для нескольких факторов и широко обсуждалось до27.
- Идентификация конформационного состояния с помощью скрытого марковского моделирования (HMM)
- Запустите программу vbFRET28 в MATLAB и импортируйте выбранные трассировки для заданного условия. Задайте ограничения для числа потенциальных состояний и итераций, которые необходимо выполнить.
ПРИМЕЧАНИЕ: На основе исходных данных репрезентативных результатов была выдвинута гипотеза о том, что конформационным датчиком занято до четырех дискретных состояний FRET; таким образом, был обозначен диапазон от одного до четырех государств. Ранее было установлено, что улучшения в подгонке незначительно увеличатся с итерациями >25; таким образом, для подгонки репрезентативных данных было использовано 25 итераций. - Анализ трассировок smFRET и экспорт идеализированных трассировок и сеанса анализа. Сохраните идеализированные трассировки в отдельную папку для последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программы, используемые для извлечения данных о переходе состояний и времени ожидания из идеализированных следов, были доступны в ранее опубликованной работе29. - Используя программы MATLAB, извлекайте переходы состояний и стройте их в виде тепловой карты с координатой X, указывающей начальную конформацию, и координатой Y, указывающей на конечную конформацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Переходы определяются как изменения значения FRET >0,1 в репрезентативных результатах, обсуждаемых здесь. Порог переходов зависит от гипотетических конформационных состояний, занимаемых интересующим белком (установленный порог перехода меньше разницы между ближайшими состояниями FRET), а также разрешения, допускаемого экспериментальной установкой. Исследование тепловых карт для нескольких условий позволяет идентифицировать наиболее распространенные конформационные состояния, через которые датчик переходит и, таким образом, занимает. Для репрезентативных результатов были определены четыре состояния FRET (FRET = 0,31, 0,51, 0,71 и 0,89). - Используя программы MATLAB, извлеките время ожидания для каждого идентифицированного конформационного состояния. Обозначьте диапазон значений FRET, определяющих каждое состояние и время разрешения во время сбора данных. Диапазоны FRET равномерно делятся на соседние состояния FRET. Экспортируйте время пребывания для данных условий лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В большинстве случаев данные о времени ожидания могут быть хорошо оценены одной экспоненциальной функцией распада. Этот анализ может быть выполнен в программном обеспечении для анализа данных и графиков.
- Запустите программу vbFRET28 в MATLAB и импортируйте выбранные трассировки для заданного условия. Задайте ограничения для числа потенциальных состояний и итераций, которые необходимо выполнить.
- Гауссовская подгонка гистограмм популяции smFRET для количественной оценки занятости состояния
- Импортируйте гистограммы FRET популяции для условий, представляющих интерес, в программное обеспечение для анализа данных и построения графиков для анализа нескольких пиковых фитингов.
- Укажите количество присутствующих пиков (четыре пика или состояния на основе анализа HMM). Подгонка была выполнена с использованием нескольких гауссовских распределений30 , определяемых как
, где A — площадь пика, xc — пиковый центр, а w — ширина пика для каждого пика. - Ограничьте параметры подгонки как A > 0, xc = FRET ± 0,02 и 0,1 ≤w≤ 0,24. Четыре пика FRET для индивидуальных популяционных гистограмм FRET были установлены одновременно. Применяйте определенные ограничения для фитингов всех условий.
- Вычислите состояние заполняемости (в процентах) как область пика интереса, деленную на общую площадь, определенную как сумма всех пиков.
, где A — площадь пика, xc — пиковый центр, а w — ширина пика для каждого пика.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспрессия и флуоресцентная маркировка датчика FRET на основе UAA
В настоящем документе обсуждаются примерные результаты введения и флуоресцентной маркировки УАА (АЗП) в crD mGluR2 (548UAA). Как упоминалось ранее, для вставки AZP в mGluR2 необходима коэкспрессия инженерного трансляционного механизма, который включает модифицированную тРНК-синтетазу и комплементарную тРНК (pIRE4-Azi), и mGluR2, содержащий янтарный кодон в положении 548, созданный с использованием мутагенеза (рисунок 2A,B). Маркировка AZP цианиновыми красителями достигается реакцией циклоприсоединения, катализируемой медью (рисунок 2C), и приводит к эффективной маркировке плазматической мембраны 548UAA (рисунок 2D). Для проверки трансляции полноразмерного 548UAA и целостности димерного рецептора проводили электрофорез SDS-PAGE на клеточном лизате из клеток HEK293T, экспрессирующих 548UAA, помеченных Cy5. Наблюдалась одна полоса при 250 кДа, которая совпала с полноразмерным димерным mGluR2 (рисунок 2E).
Сбор и анализ данных
Клетки, экспрессирующие 548UAA с C-концевой FLAG-меткой, маркировали Cy3 (донором) и Cy5 (акцептором), а затем лизировали моющим средством31 в присутствии ингибитора протеазы для исследования in vitro. После завершения лизиса клеток и удаления нерастворимой фракции центрифугированием супернатант наносили на пассивированный покров с полиэтиленгликолем (ПЭГ), функционализированный антителом против flag-метки для визуализации полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF) (рисунок 3). Образец освещали с помощью лазера 532 нм, а частицы отбирали для последующего анализа с использованием программного обеспечения smCamera. Следы сырого донора, акцептора и FRET были сгенерированы для всех выбранных молекул в smCamera и отобраны с использованием MATLAB (раздел 6; Рисунок 4). 8,8% донорская коррекция кровотечения была применена к интенсивности акцепторов для экспериментальной установки, используемой здесь. Этот поправочный коэффициент будет варьироваться в зависимости от используемой экспериментальной установки, дихроичных фильтров и эмиссионных фильтров и должен определяться путем измерения донорских и акцепторных сигналов в стандартных экспериментальных условиях с использованием клеток, помеченных только донорским флуорофором, и расчета пропускания ([интенсивность акцептора]/[интенсивность донора]). На рисунке 4 показано несколько репрезентативных следов FRET и соответствующих донорских и акцепторных сигналов. Эти следы были отобраны с использованием критериев, ранее описанных в протоколе (раздел 6). Репрезентативные выбранные следы, которые показывают переходы между несколькими состояниями и событиями донорского и акцепторного отбеливания, показаны на рисунке 4B-D.
Идентификация конформационных состояний
Для выявления конформационных состояний, занятых 548UAA, и взаимосвязи этих состояний относительно друг друга был проведен анализ скрытого марковского моделирования (HMM). Анализ HMM проводился с помощью программы vbFRET, выполненной на MATLAB28 (рисунок 5A). На рисунке 5 используются данные промежуточной концентрации глутамата (5 мкМ) для иллюстрации процесса идентификации состояния. Основываясь на необработанных следах smFRET, было выдвинуто предположение, что для CRD существует до четырех потенциальных состояний FRET. Таким образом, число государств было ограничено до одного-четырех. В целом, для каждого следа было выполнено 25 итераций подгонки, чтобы определить количество присутствующих состояний. Из этих идеализированных соответствий переходы между дискретными состояниями FRET могут быть извлечены и построены в виде тепловой карты плотности перехода (рисунок 5B). Тепловая карта выделяет четыре дискретных состояния FRET с частотой 0,31, 0,51, 0,71 и 0,89, обозначенные пунктирными линиями. Переходы были определены как изменения в FRET >0.1. Идеализированные следы FRET также дают информацию о времени ожидания для каждой идентифицированной конформации (рисунок 5C).
Генерация гистограммы FRET популяции и пиковая подгонка
Репрезентативные одномолекулярные следы для 548UAA в присутствии изменяющихся концентраций глутамата, которые были выбраны вручную для дальнейшего анализа, показаны на фиг.6A,B. Общий анализ экспериментов smFRET заключается в создании гистограмм популяции из сотен следов smFRET для каждого экспериментального состояния (рисунок 6C). Популяционные гистограммы FRET создаются из сегмента следов перед отбеливанием. Чтобы избежать смещения гистограммы в сторону поведения более длинных следов, необходимо создать нормализованную гистограмму FRET из каждого следа до усреднения. Это гарантирует, что каждая трассировка вносит равный вклад в конечную гистограмму. В этой системе гистограммы FRET показывают общий сдвиг в сторону более высокого FRET с увеличением концентрации глутамата, что указывает на уменьшение расстояния между CRD и сдвиг в сторону активной конформации. Однако, независимо от концентрации глутамата, сигнал FRET остается довольно спорадическим, что указывает на высокую степень внутренней динамики для CRD. Помимо общего сдвига в сторону более высокого FRET, в гистограмме (цветовых кривых) становится очевидным перераспределение конформационного ансамбля. Отдельные молекулы также могут быть замечены в этих конформационных состояниях (пунктирные линии) (рисунок 6B). Чтобы определить вероятность заселения штата, необходимо разделить площадь пика на общую площадь, определяемую как сумма всех четырех отдельных пиковых областей. Гистограмма smFRET, сгенерированная из эксперимента smFRET CRD mGluR2, отображала четыре динамических состояния с пиками в 0,31, 0,51, 0,71 и 0,89 (обозначенные в состояниях 1-4) соответственно.
Рисунок 1: Блок-схема рабочего протокола и анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сайт-специфическая маркировка mGluR2 путем щелчка химии. (A) Схема процесса инкорпорации неестественной аминокислоты 4-азидо-L-фенилаланина в клетки. (B) Схема, показывающая сайт-специфическую флуоресцентную маркировку mGluR2 с неестественной аминокислотой в положении 548 с помощью катализируемой медью реакции азид-алкина щелчка. (C) Трехмерная структура флуоресцентно меченого mGluR2 (донорская молекула зеленого цвета, акцепторная молекула красного цвета) с состыкованными молекулами Cy3 и Cy5. (D) Репрезентативное изображение конфокального микроскопа клеток HEK293T, экспрессирующих 548UAA, с популяцией клеточной поверхности, помеченной донорскими (зеленый: Cy3) и акцепторными (красный: Cy5) флуорофорами посредством щелочной химии. Шкала стержней = 10 мкм. (E) Изображение невосстанавливающего 4%-20% полиакриламидного гелевого электрофореза клеточного лизата из клеток HEK293T, экспрессирующих 548UAA и меченых Cy5-алкином. Гель изображен с длиной волны возбуждения 633 нм и эмиссионным фильтром 670-BP30-Lane a: белковая лестница; полоса b: клеточный лизат; полоса c: Cy5-алкиновый краситель. Результаты репрезентативны для индивидуального эксперимента. Панели B, D и E повторно используются из Liauw et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схематическое изображение экспериментов smFRET и настройки микроскопа (TIRF). Одномолекулярное флуоресцентное изображение донора показано зеленым цветом (шкала = 1000 нм), а акцептор — красным. Донор был возбужден на 532 нм с помощью лазера. Акцептант взволнован FRET от донора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Интенсивность следов донора (зеленый) и акцептора (красный) с маркировкой mGluR2. (A) Карикатура, показывающая динамику рецепторов и изменение расстояния между зондами FRET. (B) Долгоживущее состояние с высоким FRET. (C) Несколько состояний FRET с акцепторным фотоотбеливанием сначала с последующим донорским фотоотбеливанием. (D) Кратковременное состояние FRET с фотоотбеливанием акцептора. (E) Долгоживущее стабильное состояние ЛАД с акцепторным фотоотбеливанием. Эта цифра воспроизводится с минимальной модификацией из Liauw et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Идентификация конформационного состояния. (A) Репрезентативный след FRET с идеализированным прилеганием (красным) вместе с соответствующим донорским и акцепторным сигналом. (B) Тепловая карта плотности перехода, выделяющая наиболее частые конформационные переходы, претерпеваемые 548UAA. Пунктирные линии обозначают состояния FRET. (C) Среднее время пребывания каждого конформационного состояния. Эта цифра воспроизводится с минимальной модификацией из Liauw et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Одномолекулярный FRET показывает четыре конформационных состояния mGluR2 CRD. (A) Репрезентативный кадр из одномолекулярного фильма с донорским каналом (Cy3) слева и акцепторным каналом (Cy5) справа. Молекулы, выбранные аналитическим программным обеспечением для последующей обработки, обозначаются зелеными кругами. Шкала bar = 3 мкм. (B) Пример одномолекулярных временных следов 548UAA при различных концентрациях глутамата. Показаны донорская (зеленая) и акцепторная (красная) интенсивности и соответствующий FRET (синий). Пунктирные линии представляют четыре различных состояния FRET. (C) гистограммы популяции smFRET в диапазоне концентраций глутамата. Данные представляют собой среднее ± SEM. из N = 3 независимых эксперимента. Эта цифра воспроизводится с минимальной модификацией из Liauw et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Краткое изложение общего протокола. (A) Рабочий процесс для выращивания и маркировки клеток, экспрессирующих белок, содержащий неестественную аминокислоту. (B) Одномолекулярный экспериментальный и аналитический рабочий процесс FRET, используемый для идентификации конформационных состояний и характеристики динамических свойств домена CRD в mGluR2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Компонент | Объем/Реакция (мкл) |
| Уменьшенная сывороточная среда | 100 |
| Трансфекционный реагент | 4.4 |
| Компонент | Объем/Реакция (мкл) |
| Уменьшенная сывороточная среда | 100 |
| П3000 | 4 |
| Имя конструкции/компонента | Концентрация (нг/мкл) | Объем/скважина (12 скважин) (мкл) | Уэллс (#) | Добавленная ДНК (мкл) |
| тРНК/синтетаза | 1000 | 1 | 1 | 1 |
| Янтарный кодон, содержащий белок | 1000 | 1 | 1 | 1 |
Таблица 1: Реагенты для трансфекции ГЕК 293 Т-клетки.
| Реагентов | Добавляемый объем (мкл) | Стоковый конт (мМ) | Финальный конк (мМ) |
| 1x RB | 655.5 | ||
| БТТЕС | 10.5 | 50 | 0.75 |
| CuSO4 | 5.25 | 20 | 0.15 |
| НаАск | 17.5 | 100 | 2.5 |
| АминоГ | 8.75 | 100 | 1.25 |
| Cy3-Алкин (10 мМ) | 1.25 | 10 | 0.018 |
| Cy5-Алкин (10 мМ) | 1.25 | 10 | 0.018 |
Таблица 2: Состав раствора для маркировки (нажмите химия).
Дополнительный файл 1: Состав различных буферов, используемых в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GPCR - это белки, которые действуют на клеточную мембрану, чтобы инициировать трансдукцию сигнала. Многие GPCR состоят из нескольких доменов, причем сигнализация зависит от совместного взаимодействия между доменами. Чтобы модулировать свойства этих мембранных рецепторов, важно понять динамическое поведение нескольких доменов. Одномолекулярный флуоресцентный резонансный перенос энергии (smFRET) - это метод флуоресценции, который позволяет измерять конформацию и динамику белка в режиме реального времени11,32. Здесь описан подход, сочетающий smFRET, одномолекулярное вытягивание (SiMPull) и флуоресцентную микроскопию полного внутреннего отражения (TIRF) для непосредственной визуализации перегруппировки отдельных белков, иммобилизованных на пассивированной поверхности, 5,11,33. FRET очень чувствителен к расстоянию и эффективно функционирует как наноразмерная линейка, подходящая для зондирования внутримолекулярных изменений (3-8 нм). По сравнению с традиционными биофизическими подходами, smFRET особенно хорошо подходит для изучения большой конформационной динамики в масштабе времени ~ 10 мс и требует небольшого объема выборки (примерно 1 фмоле за эксперимент). Кроме того, в отличие от ансамблевых измерений конформационной динамики, таких как измерения, обеспечиваемые спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР)34 или двойного электронно-электронного резонанса (DEER)35, smFRET позволяет явно присваивать как конформационные состояния, так и их упорядочение по времени, а также непосредственно обнаруживать редкие и переходные промежуточные состояния.
В настоящее время ограничения сайт-специфической флуоресцентной маркировки представляют собой техническую проблему, которая препятствует более широкому применению smFRET для изучения динамики конформации белков. Более того, трудно очистить мембранные белки в больших количествах и сохранить их активность. Общие стратегии маркировки используют большие белковые метки или требуют генерации минимальных цистеиновых мутантов, часто ограничивая конъюгацию флуорофоров терминами белков без открытых остатков цистеина. Чтобы обойти эти ограничения, была адаптирована и оптимизирована стратегия включения неестественных аминокислот (UAA), позволяющая проводить непертурбативную маркировку, специфичную для остатков, с использованием катализируемой медью реакции щелчка 11,12,14. Эта стратегия позволяет конъюгировать флуорофоры во всех областях мембранного рецептора, подверженных воздействию растворителей, и позволяет генерировать более широкий спектр конформационных датчиков. В этом протоколе используется один тип химии сопряжения. Это приводит к тому, что популяции донор-донор и акцептор-акцептор только опускаются во время последующего анализа. Альтернативно, можно использовать две стратегии ортогональной маркировки, чтобы избежать этого или преодолеть возможную гетерогенность, когда интересующий белок не симметричен.
Прямой захват белка помогает обойти традиционные этапы очистки, которые являются трудоемкими и технически сложными. Из-за цитотоксичности меди также используется химия без меди на основе трансциклооктана36 или метил-тетразина37 . Однако эти реагенты являются дорогостоящими, а нерегиоспецифическая38-я природа реакции приводит к низкому выходу интересующего флуоресцентно меченого белка.
Здесь были представлены подробные рекомендации по экспериментам in vitro smFRET, начиная с подготовки проточной камеры и заканчивая анализом данных. Данные smFRET были собраны с использованием настройки TIRF, а анализ проводился с использованием специально написанного кода MATLAB.
Следует отметить несколько ключевых соображений. Во-первых, следует подготовить пассивированную поверхность ПЭГ, чтобы она была однородной и менее плотной с биотин-ПЭГ. Избыток биотина-ПЭГ может привести к чрезмерному стягиванию белка, что затрудняет разрешение флуоресцентных сигналов от отдельных молекул. Во-вторых, образец белка (супернатант лизата клеток) должен быть тщательно разбавлен перед добавлением в камеру образца, чтобы избежать насыщения поверхности. Выход белка зависит от плотности клеток, выбора моющего средства и концентрации моющего средства. Чтобы оптимизировать количество пар донора и акцептора, следует ориентироваться на плотность ~ 400 молекул в поле зрения 256 x 512 пикселей. В-третьих, буфер Тролокса следует хранить при −20 °C для длительного использования (месяцы). Буфер тролокса остается стабильным в течение 2 недель при хранении при 4 °C. Наконец, следует соблюдать осторожность, чтобы не вводить пузырьки воздуха в проточную камеру после функционализации с антителом. Сушка проточной камеры приведет к снижению эффективности иммобилизации белка и денатурации белка образца.
Конформационная динамика датчика mGluR2, описанная здесь, была успешно изучена на уровне отдельных рецепторов с использованием smFRET и дала представление о механизме активации рецептора. Было обнаружено, что CRD демонстрирует высокий уровень внутренней динамики, существующий в равновесии между четырьмя конформационными состояниями FRET независимо от наличия или отсутствия глутамата. Было показано, что сдвиг в сторону более высоких состояний FRET или более компактного рецептора происходит в зависимости от концентрации глутамата (рисунок 6). Интересно, что даже при насыщенных уровнях глутамата CRD оставался динамичным. Метод, представленный здесь (обобщенный на рисунке 7) для понимания конформационной динамики применим к другим GPCR класса C, а также к другим мембранным белкам, таким как ионные каналы, ионотропные рецепторы и рецепторные тирозинкиназы (RTKs)32,39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Резы Вафабахша за обсуждения. Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01GM140272 (для R.V.), Фондом лидерства Searle для наук о жизни в Северо-Западном университете и Чикагским биомедицинским консорциумом при поддержке фондов Searle в The Chicago Community Trust (для R.V.). B.W.L. был поддержан грантом Национального института общих медицинских наук (NIGMS) T32GM-008061.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (+)-Sodium L-Ascorbate | Sigma Aldrich | Cat # 11140-250G | |
| 4-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | Cat # 06162 | |
| 548UAA | Liauw et al. 2021 | Transfected construct | |
| Acetic Acid | Fisher Chemical | 64-19-7 | |
| Acetone | Fisher Chemical | 67-64-1 | |
| Adobe Illustrator (2022) | https://www.adobe.com/ | RRID:SCR_010279 | Software, algorithm |
| Aminoguanidine (hydrochloride) | Cayman Chemical | 81530 | |
| Aminosilane | Aldrich | 919-30-2 | |
| Bath Sonicator 2.8 L | Fisher Scientific | Ultrasonic Bath 2.8 L | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio Inc | Item# Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | |
| BTTES | Click Chemistry Tools | 1237-500 | |
| Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | Cat # 451657-10G | |
| Cover slip | VWR | 16004-306 | Sample chamber |
| Cy3 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA117-5 | |
| Cy5 Alkyne | Click Chemistry Tools | TA116-5 | |
| DDM | Anatrace | Part# D310 1 GM | Detergent |
| DDM-CHS (10:1) | Anatrace | Part# D310-CH210 1 ML | Detergent with cholecterol |
| Defined Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH30070.03 | |
| Di01-R405/488/561/635 | Semrock | Notch filter | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| EMCCD | Andor | DU-897U | Camera |
| ET542lp | Chroma | Long pass emission filter | |
| FF640-FDi01 | Semrock | Emission dichroic filter | |
| FLAG-tag antibody | Genscript | A01429 | |
| Fluorescent bead | Invitrogen T7279 | TetraSpeck microspheres | Spherical bead |
| Glass slides | Fisherfinest | 12-544-4 | sample chamber |
| Glutamate | Sigma Aldrich | Cat # 6106-04-3 | |
| HEK 293T | Sigma Aldrich | Cat # 12022001 | Cell line |
| HEPES | FisherBioReagents | 7365-45-9 | |
| Image splitter | OptoSplit II | ||
| KOH | Fluka | 1310-58-3 | |
| Laser | Oxxius | 4-line laser combiner | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection Reagent |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Milli-Q water | Barnstead | Water Deionizer | |
| m-PEG | Laysan Bio Inc | Item# MPEG-SIL-5000-1g | |
| NF03-405/488/532/635 | Semrock | Dichroic mirror | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 51985091 | Reduced Serum Medium |
| OptiMEM/Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | ||
| OriginPro (2020b) | https://www.originlab.com/ | RRID:SCR_014212 | Data analysis and graphing software |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pIRE4-Azi | Addgene | Plasmid # 105829 | Transfected construct |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma Aldrich | Cat # P2636 | |
| Protocatechuic acid (PCA) | HWI group | 99-50-3 | |
| smCamera (Version 1.0) | http://ha.med.jhmi.edu/resources/ | Camera software | |
| Sodium bicarbonate | FisherBioReagents | 144-55-8 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 1310-73-2 | |
| Syringe filter | Whatman UNIFLO | Cat#9914-2502 | Liquid filtration |
| Trolox | Sigma | 53188-07 |
References
- Smock, R. G., Gierasch, L. M. Sending signals dynamically. Science. 324 (5924), 198-203 (2009).
- Changeux, J. P., Christopoulos, A. Allosteric modulation as a unifying mechanism for receptor function and regulation. Cell. 166 (5), 1084-1102 (2016).
- Tang, X. -l, Wang, Y., Li, D. -l, Luo, J., Liu, M. -Y. Orphan G protein-coupled receptors (GPCRs): biological functions and potential drug targets. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 363-371 (2012).
- Chung, K. Y., et al. Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor. Nature. 477 (7366), 611-615 (2011).
- Vafabakhsh, R., Levitz, J., Isacoff, E. Y. Conformational dynamics of a class C G-protein-coupled receptor. Nature. 524 (7566), 497-501 (2015).
- Niswender, C. M., Conn, P. J. Metabotropic glutamate receptors: Physiology, pharmacology, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 50, 295-322 (2010).
- Pin, J. P., Bettler, B. Organization and functions of mGlu and GABA(B) receptor complexes. Nature. 540 (7631), 60-68 (2016).
- Kniazeff, J., et al. Closed state of both binding domains of homodimeric mGlu receptors is required for full activity. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (8), 706-713 (2004).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
- Liauw, B. W. -H., Afsari, H. S., Vafabakhsh, R. Conformational rearrangement during activation of a metabotropic glutamate receptor. Nature Chemical Biology. 17 (3), 291-297 (2021).
- Noren, C. J., Anthonycahill, S. J., Griffith, M. C., Schultz, P. G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins. Science. 244 (4901), 182-188 (1989).
- Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Current Protocols in Chemical Biology. 3 (4), 153-162 (2011).
- Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S. X., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. G Protein Coupled Receptors: Structure. 520, 281-305 (2013).
- Serfling, R., Coin, I. Chapter Four - Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods in Enzymology. Pecoraro, V. 580, Academic Press. Cambridge, MA. 89-107 (2016).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Cordes, T., Vogelsang, J., Tinnefeld, P. On the mechanism of Trolox as antiblinking and antibleaching reagent. Journal of the American Chemical Society. 131 (14), 5018-5019 (2009).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Lee, S., et al. How do short chain nonionic detergents destabilize G-protein-coupled receptors. Journal of the American Chemical Society. 138 (47), 15425-15433 (2016).
- Cao, A. -M., et al. Allosteric modulators enhance agonist efficacy by increasing the residence time of a GPCR in the active state. Nature Communications. 12 (1), 1-13 (2021).
- Mancebo, A., Mehra, D., Banerjee, C., Kim, D. -H., Puchner, E. M. Efficient cross-correlation filtering of one-and two-color single molecule localization microscopy data. Frontiers in Bioinformatics. 1, 739769 (2021).
- Mehra, D., Adhikari, S., Banerjee, C., Puchner, E. M. Characterizing locus specific chromatin structure and dynamics with correlative conventional and super-resolution imaging in living cells. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Chen, H., Puhl, H. L., Koushik, S. V., Vogel, S. S., Ikeda, S. R. Measurement of FRET efficiency and ratio of donor to acceptor concentration in living cells. Biophysical Journal. 91 (5), 39-41 (2006).
- Gopich, I. V., Szabo, A. FRET efficiency distributions of multistate single molecules. The Journal of Physical Chemistry B. 114 (46), 15221-15226 (2010).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-A multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L., Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: A Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Zhang, J., et al. Specific structural elements of the T-box riboswitch drive the two-step binding of the tRNA ligand. Elife. 7, 39518 (2018).
- Goodman, N. R. Statistical analysis based on a certain multivariate complex Gaussian distribution (an introduction). The Annals of Mathematical Statistics. 34 (1), 152-177 (1963).
- Brown, R. B., Audet, J. Current techniques for single-cell lysis. Journal of the Royal Society Interface. 5, Suppl 2 131-138 (2008).
- Schamber, M. R., Vafabakhsh, R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning. Nature Communications. 13 (1), 2194 (2022).
- Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. Single-molecule pull-down for studying protein interactions. Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).
- Huang, S. K., et al. Delineating the conformational landscape of the adenosine A(2A) receptor during G protein coupling. Cell. 184 (7), 1884-1894 (2021).
- Wingler, L. M., et al. Angiotensin analogs with divergent bias stabilize distinct receptor conformations. Cell. 176 (3), 468-478 (2019).
- Gordon, C. G., et al. Reactivity of biarylazacyclooctynones in copper-free click chemistry. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9199-9208 (2012).
- Kim, E., Koo, H. Biomedical applications of copper-free click chemistry: In vitro, in vivo, and ex vivo. Chemical Science. 10 (34), 7835-7851 (2019).
- Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2018).
- Geng, Y., et al. Structural mechanism of ligand activation in human calcium-sensing receptor. Elife. 5, 13662 (2016).
