Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Brug af In Vivo-billeddannelse til screening for morfogenesefænotyper i Candida albicans mutante stammer under aktiv infektion i en pattedyrvært

Published: October 12, 2022 doi: 10.3791/64258

Summary

Dette manuskript beskriver en metode til screening af moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefænotyper under aktiv infektion i en pattedyrsvært ved hjælp af ikke-invasiv konfokal mikroskopi.

Abstract

Candida albicans er et vigtigt humant patogen. Dens evne til at skifte mellem morfologiske former er central for dens patogenese; Disse morfologiske ændringer reguleres af et komplekst signalnetværk, der styres som reaktion på miljømæssige stimuli. Disse regulatoriske komponenter er blevet stærkt undersøgt, men næsten alle undersøgelser bruger en række in vitro-stimuli til at udløse filamentering. For at bestemme, hvordan morfogenese reguleres under patogeneseprocessen, udviklede vi et in vivo-mikroskopisystem for at opnå billeder med høj rumlig opløsning af organismer, der gennemgår hyphaldannelse i pattedyrsværten. Protokollen, der præsenteres her, beskriver brugen af dette system til at screene små samlinger af C. albicans mutante stammer, så vi kan identificere nøgleregulatorer af morfogenese, som det forekommer på infektionsstedet. Repræsentative resultater præsenteres, hvilket viser, at nogle regulatorer af morfogenese, såsom transkriptionsregulatoren Efg1, har konsistente fænotyper in vitro og in vivo, mens andre regulatorer, såsom adenylcyklase (Cyr1), har signifikant forskellige fænotyper in vivo sammenlignet med in vitro.

Introduction

Candida albicans er et almindeligt humant svampepatogen, der forårsager mucokutan sygdom, dissemineret sygdom og lokaliserede vævsinfektioner1. Et centralt træk ved C. albicans fysiologi er dens komplekse polymorfe vækst, som er knyttet til dens rolle som både en kommensal og et patogen 2,3,4. Under rige næringsstofforhold in vitro ved 30 °C vokser den typisk som en ovoid spirende gær. En række miljømæssige udløsere, herunder næringsstofmangel, pH-ændringer, vækst ved 37 °C, eksponering for serum og vækst, når de er indlejret i agar, resulterer i overgangen til et polariseret vækstmønster, hvilket resulterer i dannelse af ægte hyfer og / eller pseudohyphae5. Initieringen af polariseret vækst og den resulterende vækst af filamentøse organismer kaldes morfogenese.

På grund af betydningen af morfogenese i organismens virulens er reguleringen af hyphaldannelse blevet grundigt undersøgt 6,7. Der er et komplekst netværk af signalveje og transkriptionel regulering, der udløser morfogenese. På trods af forholdet mellem C. albicans morfogenese og patogenese har de fleste undersøgelser, der undersøger morfogenese, brugt in vitro-stimuli til at udløse hyphaldannelse. Det bliver mere og mere klart, at de forskellige in vitro-modeller for filamentering ikke er identiske med hensyn til de enkelte reguleringsveje, der stimuleres. Desuden svarer ingen in vitro-vækstbetingelser tæt til værtens komplekse miljø. I betragtning af betydningen af C. albicans som et humant patogen er målet med denne protokol at undersøge dets morfogenese under aktiv infektion i en pattedyrvært ved hjælp af et system med moderat gennemstrømning, hvilket gør det muligt for en efterforsker at screene C. albicans mutantbiblioteker.

For at lette disse undersøgelser blev der udviklet et in vivo-billeddannelsessystem, der giver os mulighed for at opnå billeder med høj rumlig opløsning af C. albicans-celler under infektion af pinna fra en bedøvet mus ved hjælp af et omvendt konfokalt mikroskop 8,9,10. Fordi pinnaens hud er ret tynd, kan disse billeder opnås uden behov for vævsdissektion. Således kan kvantitative fænotypedata måles på stedet for aktive infektioner i værtsvævet. Den her beskrevne protokol indebærer omdannelse af en referencestamme og en eller flere mutante stammer med forskellige fluorescerende proteinekspressionskassetter11,12. De fluorescerende proteinekspressive stammer blandes derefter og co-injiceres intradermalt. Efter at infektionen er etableret, anvendes konfokal billeddannelse til at kvantificere både hyppigheden af filamentering og længden af de dannede filamenter. De data, der opnås fra de mutante stammer, normaliseres til dem, der opnås fra referencestammen, som er til stede i samme vævsområde, hvilket giver en intern kontrol. Dette system har gjort det muligt for os med succes at screene flere serier af C. albicans mutantstammer, hvoraf mange har morfogenesefejl in vitro 9,10. Mange af disse stammer filament let in vivo, hvilket fremhæver betydningen af in vivo-modeller til undersøgelse af morfogenese.

Protocol

Undersøgelserne i denne protokol blev godkendt af University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Se CDC's retningslinjer for udstyr og procedurer for arbejde med BSL2-organismer13.

1. Forberedelse af Candida albicans stammer

  1. Identificer en passende referencestamme til brug som en positiv kontrol. Sørg for, at denne stamme nøje matcher de eksperimentelle stammer med hensyn til dens afstamning og genetiske manipulationer.
    BEMÆRK: For de repræsentative eksperimenter, der præsenteres her, blev mutanterne skabt af stammerne beskrevet i Homann, et al.14, som blev konstrueret af SN152. Disse mutanter er Arg-. Derfor var den valgte referencestamme SN250, som også blev oprettet fra SN152 og også er Arg-. Ernæringsmæssige stressorer er kritiske i reguleringen af polariseret vækst i gæren Saccharomyces cerevisiae15; de har også været impliceret i filamentation i C. albicans og andre svampe16,17,18. Referencestammen bør derfor matches for auxotrofier med forsøgsstammerne, når det er muligt, for at undgå potentielle forstyrrende virkninger af ernæringsstress.
  2. Vælg fluorescerende proteinekspressionskonstruktioner. Når du screener en række eksperimentelle stammer, skal du oprette en referencestamme, der udtrykker et fluorescerende protein og bruge andre fluorescerende proteiner til at markere de mutante stammer.
    BEMÆRK: De repræsentative data, der præsenteres her, bruger NEON til referencestammen og iRFP til de mutante stammer. Ethvert fluorescerende protein kan bruges, hvis det er stærkt udtrykt, relativt lyst og i stand til at blive ophidset / detekteret af det mikroskop, der bruges. Kontroleksperimenter, der sammenligner referencestammer, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner, har ikke vist nogen indvirkning af fluorescerende proteinekspression på morfogenese.
  3. Transformer stammerne med fluorescerende proteinekspressionskonstruktioner.
    BEMÆRK: Mange institutioner kræver brug af biologiske sikkerhedsniveau 2 forholdsregler for arbejde med C. albicans. Alt arbejde skal følge lokale sikkerhedsforskrifter. Uanset lokale regler skal efterforskere, der arbejder med C. albicans, trænes i sikker håndtering af organismen.
    1. Transformér reference- og forsøgsstammerne ved hjælp af standard lithiumacetatprotokoller19.
      BEMÆRK: De her beskrevne eksperimenter bruger pENO1-NEON-NAT R og pENO1-iRFP-NATR plasmider, generøst leveret af Dr. Robert Wheeler11,12. Plasmider blev lineariseret ved hjælp af NotI9.
    2. Vælg transformanterne baseret på vækst på nourseothricin eller andet relevant udvælgelsesmedium.
    3. Identificer succesfulde transformanter. Vælg en lille klat celler fra hver koloni ved hjælp af et tandstikker, og bland dem derefter i en 2,5 μL dråbe vand på et mikroskopglas. Påfør en dækslip og undersøg ved 10x-40x forstørrelse. Undersøg med et konfokalt billeddannelsessystem (brugt til resten af protokollen) eller et hvilket som helst standard vidvinkelfluorescensmikroskop. Passende transformanter vil have et lyst signal med passende excitations- og emissionsbølgelængder.
      BEMÆRK: For de repræsentative resultater blev NEON-ekspressionsstammer visualiseret ved hjælp af et opretstående fluorescensmikroskop med et langt passfiltersæt med et 472/30 nm båndpas-excitationsfilter, et 520/35 nm båndpasemissionsfilter og en 495 nm enkantet dikroisk strålesplitter. Fordi iRFP ikke er synlig for øjet, blev iRFP-ekspressionsstammer visualiseret ved hjælp af det konfokale mikroskopisystem, der blev brugt til in vivo-billeddannelse , ved hjælp af en 638 nm laser til excitation og detektering af emissionslys fra 655-755 nm.
      1. Alternativt kan du evaluere makroskopisk kolonifluorescens ved hjælp af fluorescensstereomikroskopi, håndholdte fluorescens-exciteringssystemer eller fluorescensdetekteringssystemer, der typisk bruges til geler og Western blots.
      2. Opret fryselagre af udvalgte transformanter.
  4. Inokuler YPD (gærekstrakt pepton dextrose) faste medier med en fluorescerende proteinudtrykkende reference og eksperimentelle stammer fra fryselagre 3 dage før injektion ved hjælp af et tandstikker til at overføre en dab af organismer fra frysebestanden til YPD faste medier. Inkuberes ved 30 °C i 2 dage.
  5. For hver stamme podes en kolbe indeholdende 25 ml YPD med C. albicansceller taget fra flere kolonier 1 dag før injektion. Gør dette ved at bruge et tandstikker til at overføre en dab af organismer fra en koloni til YPD; Gentag flere gange for at få celler fra flere forskellige kolonier. Inkuberes natten over ved 30 °C i en orbital shaker-inkubator ved 175 o / min.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge flere kolonier som kilde til podningen, fordi C. albicans har en høj frekvens af spontane genetiske ændringer. Brug af flere kolonier, når du starter inokulumkulturen, minimerer chancen for, at alle organismer i inokulumet stammer fra en forælder med betydelige spontane ændringer.
  6. På injektionsdagen:
    1. Centrifuge 1 ml af kulturen i 2 min ved 500 x g.
    2. Dyrkningen vaskes tre gange med 1 ml sterilt Dulbeccos fosfatbufferede saltvand (dPBS). Efter den sidste vask suspenderes pelleten i 1 ml steril dPBS.
    3. Fortynd en prøve af den vaskede kultur kl. 1:100 og tæl ved hjælp af et hæmocytometer.
    4. Tætheden af den vaskede kultur justeres til 1 x 108 organismer pr. ml ved hjælp af dPBS.
    5. For hvert sæt stammer, der skal injiceres, skabes podemuskulaturen ved at blande lige store mængder referencestamme og forsøgsstamme(r). Dette opretholder inokulumets tæthed ved 1 x 108 organismer pr. ml.
      BEMÆRK: Antallet af stammer, der kan evalueres pr. øre, er begrænset af mikroskopisystemets evne til klart at skelne signalet fra hvert fluorescerende protein.
    6. Når podet er forberedt, fortsæt direkte til dyreinjektionerne. Opbevar ikke podemuskulaturen før brug.

2. Tilberedning af dyr

  1. Få godkendelse fra det lokale institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg eller det relevante lokale styrende organ.
  2. Få 6-12 uger gamle mus fra en leverandør eller et avlsprogram. Hus mus i anlægget, hvor de vil leve under hele eksperimentet i mindst 1 uge før podning.
    BEMÆRK: Til de repræsentative resultater blev der anvendt 6 uger gamle hunmus med DBA2/N.
  3. Foder dyr klorofylfri chow i mindst 7 dage før podning.

3. Hårfjerning og podning

  1. Inducer et kirurgisk anæstesiplan (figur 1).
    FORSIGTIG: Inhalerede bedøvelsesmidler er farlige materialer og kan forårsage øjen- eller hudirritation samt toksicitet i nervesystemet. Alle institutionelle politikker og procedurer og generel laboratoriesikkerhedspraksis for brug af inhalerede anæstetika skal følges. Kun personer, der er uddannet i brugen af inhalerede anæstetika, kan udføre disse trin. Standardpraksis omfatter iført handsker, en laboratoriefrakke, øjenbeskyttelse, brug af et anæstesi-scavenger-system og omhyggelig registrering i henhold til institutionelle retningslinjer.
    1. Placer en mus i et forvarmet anæstesiinduktionskammer. Hold dyret i et varmt miljø gennem generel anæstesi. Opnå dette ved hjælp af varmepuder designet til dette formål og et opvarmet mikroskoptrin. Brug ikke en over-the-counter varmepude, da den kan overophedes og forårsage forbrændinger.
    2. Giv 2%-3% isofluran til induktionskammeret, indtil musen har mistet sin retrefleks, og åndedrættet er langsomt og stabilt. Rens anæstesiens induktionskammer og overfør dyret til en ikke-rebreather næsekegle, der giver 1% -2% isofluran.
    3. Valider anæstesiplanet ved hjælp af tåspidsrefleksen eller andre verifikationsmekanismer. I løbet af eksperimentet skal du overvåge dyrets åndedrætsmønster og bedøvelsesplan og justere bedøvelseskoncentrationen efter behov.
    4. Påfør øjensmøremiddel for at forhindre udtørring af hornhinden.
  2. Hårfjerning (figur 1C, D)
    1. Påfør en over-the-counter hårfjerningscreme liberalt på den indre og ydre overflade af begge ører ved hjælp af en vatpind med bomuldsspids.
    2. Efter 2-3 minutter (eller i henhold til producentens anvisninger) skal du forsigtigt tørre øret med en tør gazebind for at fjerne al creme og hår. Tør to gange mere af med gazepuder mættet i sterilt vand for helt at fjerne hårfjerningscremerester. Manglende fjernelse af al hårfjerningscreme vil resultere i hudirritation / betændelse.
  3. Injektion (figur 1E, F)
    1. Tør ørets overflade af for at blive injiceret med en gasbind mættet i 70% ethanol og lad lufttørre.
    2. Bland podekulturen godt ved at vende flere gange eller hvirvle.
    3. Tegn 20-30 μL inokulum i en insulinsprøjte. Hold nålen pegende opad, og bank forsigtigt på sprøjten for at sikre, at der er luft i tønden øverst. Skub forsigtigt luft og overskydende pode ud i poderøret eller et affaldsrør, så stemplet er ved 10 μL-mærket.
    4. Brug et fingerbøl på en finger eller tommelfinger på den ikke-dominerende hånd, stabiliser øret ved at vikle det hen over fingerbøl. Alternativt kan du anvende over-the-counter dobbeltsidet hudtape (modetape) på et lille konisk eller rundbundet plastrør og drapere øret over båndet. Pas på ikke at løsne anæstesinæsekeglen, mens du gør dette. Det kan være nyttigt at tape næsekeglen til arbejdsfladen.
      BEMÆRK: Enten den indre eller ydre side af øret kan injiceres baseret på efterforskerens fysiske komfort. For mikroskopi skal du sørge for at placere musen, så den side af øret, der injiceres, vender mod objektivlinsen.
    5. Hold sprøjtenålen næsten helt parallelt med huden og undgå store vener, indsæt nålens spids i det yderste lag af huden, indtil skrånen er lige dækket.
    6. Indsprøjt langsomt inokulumet intradermalt. En god intradermal injektion vil hæve en lille boble i huden. Hold nålen på plads i 15-20 sekunder, før du fjerner den fra øret for at minimere lækage.
      1. Hvis undersiden af dyrets øre bliver fugtig, var nålen for dyb og passerede gennem øret helt. I så fald gentages injektionen i et andet område af øret.
    7. Gentag processen ved hjælp af dyrets andet øre. Dette kan gøres med de samme C. albicans stammer til en replikat eller med et andet sæt C. albicans stammer.
    8. Hvis du ikke afbilder med det samme, skal du placere dyret i et opvarmet genopretningskammer. Overhold dyret, indtil det er kommet sig efter anæstesi, og returner det derefter til dets husbur.
    9. I henhold til institutionelle protokoller skal du tydeligt markere buret med biohazard-etiketter og angive, at dyr i buret er inficeret med Candida albicans.
    10. Gennemfør al påkrævet registrering i forbindelse med dyrebedøvelse og enhver anden påkrævet institutionel praksis.
    11. Hus dyret i dyrefacilitetsforhold ved hjælp af dyrebiologisk sikkerhedsniveau 2 forholdsregler.

4. Kvantificer in vitro morfogenese til sammenligning med in vivo-resultater

  1. Ved hjælp af de samme vaskede kulturer, der blev brugt til at forberede podningen, skabes en 1:50 fortynding af organismer i RPMI1640 + 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og inkuberes ved 37 ° C med tumling i 4 timer. Alternativt kan andre medier, der stimulerer morfogenese in vitro , anvendes.
  2. Prøven centrifugeres i 5 minutter ved 500 x g , og prøven resuspenderes i 0,5 ml dPBS.
  3. Prøven fortyndes i forholdet 1:10, 2,5 μL af den fortyndede prøve anbringes på et mikroskopglas, og den dækkes med en dæksel.
  4. Prøven undersøges ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Tæl mindst 100 celler, og registrer antallet af gær- og trådceller for hver stamme. I de repræsentative resultater, der præsenteres her, defineres en trådcelle som enhver celle med en længde på mere end dobbelt så lang som modercellen.
    BEMÆRK: Kvantificering af in vitro-morfogenese kan ske samme dag som podning af dyrene. Det er muligt at indlede in vitro-morfogeneseassayeten under forberedelse af podekulturen til injektion og udføre podning af dyrene i løbet af 4 timers inkubationsperioden. Hvis alle dyreforsøg er afsluttet inden udgangen af inkubationstiden på 4 timer, undersøges de in vitro-stimulerede celler direkte. Alternativt kan celler resuspenderes i 3,7% formaldehyd i dPBS (i trin 4.2) og opbevares ved 4 °C i flere dage. De faste organismer kan derefter kvantificeres, når tiden tillader det. Podningen af dyrene må ikke forsinkes med henblik på in vitro-kvantificeringsanalysen.

5. Forberedelse til in vivo-billeddannelse

  1. Forbered mikroskopet (figur 2A).
    1. Tænd for alt mikroskopiudstyr, og start billedbehandlingssoftwaren.
      1. Hvis det er tilgængeligt, skal du indlæse eventuelle forudbestemte billedindstillinger.
      2. Aktiver de lasere og detektorer, der er nødvendige for at detektere de fluorescerende proteiner, der anvendes.
    2. Tænd for det opvarmede mikroskoptrin, og lad det varme op til 37 °C.
      BEMÆRK: Det er muligt at bruge et mikroskop med et helt lukket miljøkammer i stedet for et opvarmet trin.
    3. Indstil et z-akse referencepunkt med fokusplanet på den øverste overflade af dækslippen.  Dette kan gøres ved at tape en dækseddel på plads over sceneåbningen og sætte en dråbe vand på dækslip.  Brug et lavere forstørrelsesmål (10x) "tørt" til at fokusere på kanten af vanddråben, og indstil derefter z-aksens referencepunkt.  Brug et stykke håndklæde til at absorbere vandet fra dækslet, før du fjerner det fra scenen.
    4. Drej det meget lange arbejdsdistancemål på plads, og læg en dråbe nedsænkningsvæske på linsen. Sænk objektivet for at undgå mulig skade, når dækslet placeres.
    5. Placer en #1.5 coverslip over sceneåbningen og tape den på plads. Sørg for, at tapen dækker alle kanter af dækslippet helt for at forhindre, at væske transporteres under dækslippet ind i mikroskopet. Hæv målet til z-aksens referencepunkt, så nedsænkningsvæsken er i kontakt med både objektivlinsen og dækslippen.
    6. Forbered flere stykker trykfølsom tape, så de er klar til brug, når næsekeglen og musen placeres.
  2. Inducer generel anæstesi i musen, der skal afbildes som ovenfor (trin 3.1).
  3. Placer musen (figur 2B-D).
    1. Fastgør en anæstesi næsekegle på mikroskopstadiet med næsekeglen placeret, så den dækker dyrets næse helt, når dyret er i position til billeddannelse. Dette kan lettere opnås med to efterforskere. Få den første efterforsker til at placere den bedøvede mus næse i næsekeglen og flytte musen i position til billeddannelse, mens du fortsætter med at holde næsekeglen over dyrets næse. Få den anden efterforsker til at tape næsekeglen og slangen på plads, så den sidder stabilt over musens næse. Når næsekeglen er tapet på plads, skal du lade den være der resten af billeddannelsessessionen.
    2. Når du har etableret det bedste sted at placere næsekeglen, skal du notere dens position. Til efterfølgende billeddannelsessessioner kan næsekoglen fastgøres til scenen, inden et dyr bringes til mikroskopet.
    3. Placer en dråbe sterilt vand på dækslippet over objektivlinsen.
    4. Placer musen på mikroskoptrinnet. Sørg for, at øret er oven på vanddråben og fladt mod dækslippen.
    5. Brug en anden (top) dæksel til at flade øret.
      1. Placer kanten af dækslet parallelt med musens krop, hvor kanten rører musen, hvor øret møder hovedet.
      2. Sænk dækslipens frie kant til mikroskoptrinnet med en hængselbevægelse. Da dækslippet kommer mod mikroskoptrinnet, vil det flade øret ud. Pas på ikke at skabe folder eller kamme i øret.
      3. Tape topdækslet sikkert på plads, så det holder lige nok tryk til at holde øret fladt. Pas på ikke at fange musens hår eller knurhår i båndet.
    6. Medmindre der anvendes et mikroskop med et miljøkammer, skal du løse musens krop med en steril drapering for at opretholde et normotermisk miljø.
  4. Identificer et interesseområde.
    1. Sørg for, at målet er ved z-aksens referencepunkt.
    2. Brug hvidt lys/bredfeltsbilleddannelse til at justere fokusplanet ind i ørevævet. En god strategi er at fokusere på blodkarrene - hvis man kan se røde blodlegemer bevæge sig i blodkarrene, er fokusplanet i vævet.
    3. Hvis mikroskopet er udstyret med bredfeltfluorescensfunktion, skal du bruge det til at identificere et interesseområde. Hvis ikke, skal du bruge konfokal billeddannelse. Generelt er det hurtigere at bruge bredfeltmikroskopi til at identificere interesseområder og kræver mindre bestråling af ørevævet.
      1. Ved hjælp af en filterterning til påvisning af det fluorescerende protein udtrykt i referencestammen identificeres et synsfelt, der har et fluorescerende signal fra referencestammen. Husk, at lys, der ikke er i fokus, sandsynligvis vil forhindre evnen til at fokusere på individuelle organismer. Målet med dette trin er at identificere et interesseområde for konfokal billeddannelse.
      2. Skift til en filterterning, der registrerer det fluorescerende protein udtrykt ved forsøgsstammen/-stammerne, og verificerer deres tilstedeværelse i det valgte synsfelt.

6. Billedbehandling

  1. Bestem indstillingerne.
    1. Mens billedbehandlingssoftwaren er i live konfokal tilstand, skal du undersøge interessefeltet, når fokusplanet bevæges gennem z-aksen. Vælg et z-akseplan med et stærkt signal fra alle de fluorescerende proteiner, der bruges.
    2. Juster lasereffekten og / eller billeddannelseshastigheden for at opnå et stærkt nok signal, således at morfologi kan bestemmes for alle celler i synsfeltet. For at undgå vævsskade skal du bruge den lavest mulige lasereffekt.
      BEMÆRK: Som med al billeddannelse er der en balance mellem laserkraft, anskaffelseshastighed og opløsning. Identificer indstillinger, der tydeligt identificerer organismens morfologi, mens du balancerer hastighed og laserkraft for at minimere bestråling af ørevævet. Fordi billeddannelse forekommer gennem den ydre dermis, kræves der højere lasereffekt til excitation, end det typisk er nødvendigt for konfokal billeddannelse af traditionelle prøver monteret på dias. Heldigvis er niveauet af rumlig opløsning, der kræves til analyse af morfologi, ikke ekstremt. Således er det let opnåeligt at opnå billeder med et tilstrækkeligt signal til at bestemme organismens morfologi uden at forårsage vævsskade.
    3. Når disse parametre er etableret, skal du bruge disse under hele billedbehandlingssessionen til at tjene som udgangspunkt for efterfølgende billedbehandlingssessioner. Det er således nyttigt at gemme billedindstillingerne.
      BEMÆRK: Individuelle infektionsområder kan være lavere eller dybere i vævet. Dybere områder kan kræve en stigning i laserkraften. Da dette assay er afhængigt af signalets rumlige fordeling snarere end dets intensitet, er det acceptabelt at ændre billedindstillinger mellem felter efter behov.
  2. Hent billederne.
    1. Vælg et synsfelt, der har klar filamentdannelse i referencestammen, og hvor de fleste organismer er spredt nok til, at deres morfologi kan bestemmes.
    2. Indstil de øverste og nederste fokusplaner for en z-stack. Det er ikke nødvendigt at dække hele dybden af det inficerede område, men husk på, at organismer øverst eller nederst i det afbildede volumen typisk udelukkes fra analysen.
    3. Anskaf z-stack-billeder, pseudofarve hver kanal for at skelne mellem hver stamme og overlejre kanalerne. Gem billederne.
    4. Gentag for andre synsfelter. Morfogenese kan variere fra sted til sted; Derfor er det vigtigt at erhverve og analysere mindst tre felter fra hvert øre.

7. Manuel todimensionel analyse: Frekvens af filamentation

  1. Brug billedbehandlingssoftware til at udføre en maksimal projektion af z-stakken til et todimensionelt billede. Instruktioner her er til FIJI / Billede J.
    1. Åbn mikroskopibilleder ved hjælp af ImageJ-software.
    2. Anvend om nødvendigt en pseudofarve på hver kanal for at muliggøre ligetil identifikation af hver C. albicans-stamme. For dette skal du klikke på Billede > opslagstabel > LUT-farve og vælge den valgte pseudofarve.
    3. Konverter stakfilen til et todimensionelt billede med maksimal intensitetsprojektion:
      1. Vælg z-stack-filen. Klik på Billede > stakke > Z-projektion.
      2. Vælg det øverste og nederste plan, og vælg projektionstypen Maks. intensitet.
  2. Tæl hver organisme set i de maksimale projektionsbilleder efter stammetype (kendetegnet ved kanalfarve) og morfologi.
    1. Organismer, der overlapper hinanden betydeligt eller områder med meget høj organismetæthed, vil være vanskelige at tælle nøjagtigt. Udeluk disse fra tællingen, men pas på ikke at indføre bias mod trådformede former, som er mere tilbøjelige til at overlappe hinanden.
    2. Trådformede former, der projicerer direkte ind i eller ud af z-stakken, vises som små runde objekter i en maksimal projektion. Ligeledes kan organismer, der er afskåret af billedets kant, synes at være gær, fordi filamentet er ude af synsfeltet. Således vil todimensionel analyse altid overvurdere procentdelen af gærformer. Da dette vil ske på lige fod med reference- og forsøgsstammen/-stammerne, skal du altid sammenligne forsøgsresultaterne med resultaterne for en referencestamme.
  3. Udfør statistiske sammenligninger af resultaterne som dikteret af det eksperimentelle design.

8. Manuel todimensionel analyse: Filamentlængde

  1. For C. albicans kan afvigende filamentdannelse forekomme, fordi: a) færre "moder" gærceller gennemgår morfogenese, b) filamenter vokser langsommere, eller c) filamentøs vækst initieres, men opretholdes ikke. For at evaluere disse muligheder skal du kvantificere kurvebanelængden for hvert filament i det maksimale projektionsbillede som et surrogat for den sande tredimensionelle længde (diskuteret nedenfor).
    1. Når en knopp udvikler sig på en modercelle, er det ikke muligt at se, om det bliver et filament eller en gær. For at sikre, at kun trådceller indgår i denne analyse, måles kun organismer, hvor dattercellen er mindst dobbelt så lang som modercellen.
  2. Åbn det maksimale projektionsbillede, der blev oprettet i trin 7.
  3. På ImageJ-værktøjssættet skal du højreklikke på værktøjet Lige / segmenteret linje og vælge indstillingen Segmenteret linje. Den segmenterede linjeindstilling giver brugeren mulighed for at måle filamentlængden langs en buet sti, en nødvendighed i betragtning af plasticiteten af C. albicans filamenter.
  4. Mål filamentlængden fra knoppehalsen til den voksende ende af filamentet. Venstreklik på knoppehalsen; markøren ændres til en lille firkant. Spor filamentet langs dets længde, og klik på midten af filamentet, hver gang der er en kurve, drejning eller ændring af filamentets lange akse. Dobbeltklik på glødetrådens voksende spids.
  5. Tryk på Control + M. Dette åbner et pop op-vindue, der tabulerer målingerne Område, Middelværdi, Min, Max og Længde. Når du har målt hvert filament, skal du trykke på Control + M igen for at tilføje den aktuelle måling til måletabellen.
  6. Når alle filamenter er blevet målt, skal du kopiere og indsætte længdemålingerne i en dataanalysefil.
  7. Udfør statistisk analyse for at evaluere fordelingen af filamentlængder i referencestammen og mutantstammen.

9. Manuel tredimensionel analyse

  1. For at opnå en mere præcis måling af morfogenese, der undgår overvurdering af gærformer og kan tillade diskrimination mellem pseudohyphae og hyfer, skal du manuelt rulle op og ned gennem z-stakken, mens du evaluerer morfologien for hver organisme i tre dimensioner.
  2. Alternativt kan du oprette et tredimensionelt billede af hver z-stak og analysere formen på hver organisme, mens du roterer billedet.

10. Automatiseret analyse

  1. Brug billedbehandlingssoftwaren til at automatisere optællingen af organismer og deres morfologi i to eller tre dimensioner.
    BEMÆRK: Nogle algoritmer til diskrimination af morfologityper kan introducere bias. Automatiseringsstrategier skal således valideres omhyggeligt i forhold til det eksperimentelle design. Veldesignet og valideret automatiseret billedanalyse kan øge gennemstrømningen af analysetrinnet.

Representative Results

De resultater, der præsenteres her, er baseret på tidligere offentliggjorte rapporter 9,10. Målet med denne analyse er kvantitativt at evaluere mutant C. albicans stammers evne til at gennemgå morfogenese under aktive infektioner. De typiske parametre, der adskiller pseudohyphae fra hyfer, kan være vanskelige at evaluere i organismer, der vokser i tre dimensioner i et komplekst in vivo-miljø. Dette gælder især, når man ser på de todimensionelle tværsnit skabt af konfokal billeddannelse. Derfor er denne screeningsanalyse fokuseret på at identificere organismer, der vokser som trådformede versus gær. Til opfølgende undersøgelser ved hjælp af en mere dybtgående analyse, herunder tredimensionelle rekonstruktioner, kan denne metode tilpasses til at diskriminere gær, hyfer og pseudohyphae.

Ekspressionen af et fluorescerende protein i en reference- eller mutantstamme af C. albicans muliggør ligefrem påvisning af stammemorfologi in vivo (figur 3 og figur 4). Generelt udføres kvantitativ lysmikroskopianalyse bedst, når få eller ingen af pixels i billedet er mættede. For denne protokol forenkler en mætning af billedet imidlertid ofte analysen. Fluorescerende proteinlokalisering er ikke ensartet i hele cellen og er ofte højere i modergæren end i filamenter. Heldigvis definerer signalets rumlige fordeling snarere end dets intensitet resultatet til undersøgelse af morfogenese. Derfor forbedrer opnåelse af billeder, hvor mange pixels er mættede, evnen til at kvantificere morfogenese i dette assay.

For at illustrere vigtigheden af at evaluere morfogenese in vivo præsenteres repræsentative resultater for referencestammen (SN250) og to mutanter: den ene mangler transkriptionsfaktoren Efg1 og den anden mangler adenylylcyklase Cyr1. In vitro vokser ingen af disse stammer som filamenter20,21. Når den dyrkes in vitro i RPMI-medium suppleret med 10% serum, danner referencestammen hurtigt filamenter, mens efg1ΔΔ- og cyr1ΔΔ-stammerne ikke gør det (figur 3 og figur 4). Under disse forhold udviser efg1ΔΔ-mutanten noget polariseret vækst, hvor dattercellerne er lidt aflange sammenlignet med modercellerne. Dette understreger vigtigheden af at bruge en klar definition af filamentering. Enhver sådan definition er som standard vilkårlig, men det er nødvendigt for konsekvent evaluering af fænotypen. Til disse undersøgelser defineres et trådformet vækstmønster som en organisme med den længste dimension af en dattercelle mere end dobbelt så stor som modercellen. Ved hjælp af denne definition er de aflange efg1ΔΔ-celler ikke trådformede.

I overensstemmelse med sin in vitro-fænotype udviser efg1 ΔΔ en signifikant filamentationsfejl in vivo: ca. 9% af efg1ΔΔ-cellerne voksede som filamenter in vivo (figur 3). I modsætning hertil voksede 53% af cyr1ΔΔ-mutantcellerne som filamenter in vivo (figur 4). Selvom antallet af cyr1 ΔΔ-mutante celler, der gennemgår filamentation in vivo, var signifikant lavere end referencestammen, repræsenterer cyr1ΔΔ-mutantens evne til at danne filamenter in vivo en væsentlig ændring fra dens fuldstændige mangel på morfogenese in vitro. Visuelt syntes filamenterne dannet af cyr1ΔΔ-mutanten at være kortere end referencestammen. For at evaluere dette kvantitativt blev kurvebanelængden af de trådformede celler målt ved hjælp af en todimensionel projektion af in vivo-billederne (figur 4E). Medianlængden af cyr1ΔΔ-filamenter var 29% kortere end filamenter af referencestammen.

Figure 1
Figur 1: Anæstesi og podning . (A) Induktion af anæstesi ved hjælp af et induktionskammer. (B) Anæstesi opretholdes ved hjælp af en næsekegle, så musen kan omplaceres efter behov. (C) Hårfjerningscreme påføres ved hjælp af en applikator med bomuldsspids. Øjensmøregel er blevet påført for at beskytte øjnene under anæstesi. (D) Effektiv hårfjerning af højre øre. Sammenlign med det ubehandlede venstre øre. (E) Intradermal injektion af C. albicans i museøret. Øret holdes på plads ved hjælp af spidsen af et konisk rør indpakket med dobbeltsidet hudbånd (modebånd). (F) Nærbillede af intradermal injektion. En bleg boble dannes i huden, hvilket er et tegn på en vellykket intradermal placering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse til billeddannelse. (A) Mikroskopfase forberedt til billeddannelse. Anæstesi næsekeglen er fastgjort på plads. En dæksel er tapet til scenen, der dækker linseåbningen. Yderligere stykker tape er tilgængelige. Det opvarmede trin forvarmes til 37 °C (vises ikke). (B) Placering af den bedøvede mus i anæstesinæsekeglen. (C) Musen drejes lidt, så den side af øret, der blev podet, vender mod den nederste dæksel/objektivlinse. Øret flades derefter mod bunddækslet og fastgøres på plads ved at placere en anden dæksel oven på øret. (D) Den øverste dæksel tapes til trinnet for at fastgøre øret på plads i forhold til mikroskoptrinnet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: In vitro - og in vivo-morfologi af efg1ΔΔ-mutantstammen. (A) Widefield-billede af WT- og efg1ΔΔ-mutantstammer efter in vitro-induktion af filamentation ved dyrkning af celler i RPMI + 10% serum ved 37 °C i 4 timer. Skalabjælker repræsenterer 10 μm. Billedkontrast blev justeret ved hjælp af fotoredigeringssoftware for at lette visningen. (B) Procentdel af filamentation in vitro observeret i WT- og efg1ΔΔ-mutantstammerne. Und = ikke detekterbar (der blev ikke påvist filamenter). Bjælkehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra tre uafhængige eksperimenter, hvor mindst 100 celler blev kvantificeret. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). C) Konfokal mikrograf af WT (grøn) og efg1ΔΔ-mutanten (rød), der vokser in vivo 24 timer efter podning. Pile angiver eksempler på efg1ΔΔ mutante celler, der opfylder vores definition af "trådformet". Skalabjælken repræsenterer 50 μm. (D) Procentdel af filamentation in vivo observeret i WT- og efg1ΔΔ-mutantstammerne. Søjlehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra to uafhængige eksperimenter. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: In vitro og in vivo morfologi af cyr1 ΔΔ mutantstammen. (A) Widefield-billede af cyr1ΔΔ-mutantstammen efter in vitro-induktion af filamentation ved at dyrke celler i RPMI + 10% serum ved 37 °C i 4 timer. Skalabjælken repræsenterer 10 μm. Billedkontrast blev justeret ved hjælp af fotoredigeringssoftware for at lette visningen. (B) Procentdel af filamentation in vitro observeret i WT- og cyr1ΔΔ-mutantstammerne. Und = ikke detekterbar (der blev ikke påvist filamenter). Bjælkehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra tre uafhængige eksperimenter, hvor mindst 100 celler blev kvantificeret. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). (C) Konfokal mikrograf af WT (grøn) og cyr1ΔΔ-mutanten (rød), der vokser in vivo 24 timer efter podning. Skalabjælken repræsenterer 50 μm. (D) Procentdel af filamentation in vivo observeret i WT- og cyr1ΔΔ-mutantstammerne. Søjlehøjde repræsenterer medianprocenten af trådceller fra to uafhængige eksperimenter. Fejlbjælkerne angiver standardafvigelse (resultater sammenlignet med elevens t-test, p < 0,001). (E) Fordeling af glødetrådslængde in vivo målt ved kurvebanelængde i en todimensionel projektion af z-stakken. Hver prik repræsenterer længden af et filament. Celler, der voksede som gær, blev ikke inkluderet i denne analyse. Bar angiver median filament længde. Fordelingen af længder er signifikant anderledes, når den analyseres ved hjælp af en Mann-Whitney U-test (p < 0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Denne model bruger konfokal mikroskopi til at opnå billeder af C. albicans organismer, når de vokser i vævet hos en pattedyrsvært, hvilket giver os mulighed for at evaluere morfogenesefænotyper under aktiv infektion. Morfogeneseprocessen er central for C. albicans patogenese og er blevet bredt undersøgt ved hjælp af en række in vitro-assays 2,3,4. Imidlertid kan intet in vitro-assay fuldt ud modellere værtens komplekse biokemiske og strukturelle miljø.

Protokollen beskrevet her er fokuseret på brugen af dette in vivo-billeddannelsessystem til at screene en serie / bibliotek af C. albicans mutanter for at identificere de gener, der er involveret i morfogenese under infektion. Brugen af C. albicans stammer, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner, giver os mulighed for at kvantificere in vivo morfogenese af C. albicans mutante stammer sammenlignet med en referencestamme. Sammenligning af morfogenese i mutanten med referencestammen inden for samme infektionsområde sikrer, at organismerne udsættes for identiske miljøer. Dette giver mulighed for kvantitativ måling af procentdelen af celler, der gennemgår filamentering, samt omfanget af filamentering. Normalisering af målingerne af mutantstammen/mutantstammerne til målingerne af referencestammen giver os mulighed for bedre at sammenligne en mutants ydeevne med en anden.

De repræsentative resultater, der præsenteres her, viser potentialet for en betydelig uoverensstemmelse mellem in vitro- og in vivo-fænotyper. C. albicans efg1ΔΔ mutant stamme bruges ofte som en negativ kontrol for morfogenese assays, da den ikke filament i næsten alle in vitro betingelser20. Selv om in vivo-resultaterne var meget lig in vitro-resultaterne, dannede selv denne stærkt hæmmede stamme lejlighedsvis filamenter i værtsvævsmiljøet (figur 3). Dette understreger værtsmiljøets styrke ved at udløse morfogenese.

I modsætning hertil viser cyr1ΔΔ mutantstammen en betydelig uoverensstemmelse mellem in vitro og in vivo vækst; selvom ingen af de mutante celler gennemgår filamentation in vitro, vokser ca. halvdelen af cellerne som filamenter in vivo (figur 4)10,21. Interessant nok var disse filamenter signifikant kortere end dem, der blev dannet af referencestammen, hvilket tyder på, at CYR1 bidrager til enten filamentvæksthastigheden eller evnen til at opretholde en filamentøs fænotype. For at lette analysen af filamentlængden blev filamenternes kurvebanelængde målt ved hjælp af en todimensionel projektion af billederne. I todimensionale fremskrivninger af filamenter, der vokser i tre dimensioner, vil ethvert filament, der vokser på en akse, der ikke er parallelt med xy-planet, projicere som kortere end dets sande længde. Da denne forkortning også forekommer for referencestammen, tillader evaluering af fordelingen af filamentlængder i en todimensionel projektion stadig en kvantitativ sammenligning mellem reference- og mutantstammerne. Analyse af filamentlængde i to snarere end tre dimensioner kræver mindre intensiv billedanalyse; Således kan det udføres relativt hurtigt på en typisk stationær computer. Brug af denne enklere analyse gør det muligt at inkludere filamentlængdefordeling som en del af en screeningsprotokol, hvilket giver en mere nuanceret forståelse af hver mutants evne til at gennemgå morfogenese uden at forårsage væsentlige forsinkelser i gennemstrømningen.

De repræsentative undersøgelser, der præsenteres her, blev udført ved hjælp af DBA2/N-mus, som har en defekt i deres komplementsystem, der forårsager manglende rekruttering af neutrofiler til stedet for C. albicans-infektion 22. Målet med disse undersøgelser var at undersøge mekanismer til regulering af C. albicans filamentation i værtsvævet. Derfor blev DBA2/N-mus brugt til at undgå at forvirre resultaterne på grund af en individuel stammes modtagelighed eller resistens over for neutrofiler. Da det neutrofile anti-C. albicans-respons kan påvirke filamentation23, kan neutrofilrekruttering til infektionsstedet påvirke resultaterne af et morfogeneseassay. Hvis en stamme er i stand til at filamentere in vivo , men hæmmes kraftigt fra filamentering, når neutrofiler er til stede, vil filamentation blive påvist i DBA2/N-mus, men det vil sandsynligvis ikke ses, når mus med intakt neutrofil kemotaxis anvendes. Således er belastningen af musen, der bruges som vært, en vigtig faktor, når du bruger denne protokol.

Observationen af, at efg1ΔΔ-mutantstammen ikke filamenterer in vivo , er sandsynligvis ikke relateret til værtsneutrofile reaktioner, fordi denne stamme heller ikke filamenterer in vitro. Filamentationen, der observeres in vivo med cyr1ΔΔ-stammen, er uoverensstemmende med dens manglende filamentation in vitro. Data fra zebrafiskmodellen af C. albicans infektion indikerer, at reagerende neutrofiler er vigtige i forebyggelsen af morfogenese24. Derfor er det usandsynligt, at brugen af DBA2/N-mus, som mangler neutrofilresponser, vil forklare stigningen i filamentation af cyr1ΔΔ in vivo sammenlignet med in vitro. Ikke desto mindre påvirker in vivo-miljøet klart morfogenesen af cyr1ΔΔ-stammen; yderligere undersøgelse af denne stamme kan således give vigtige oplysninger om reguleringen af C. albicans morfogenese under aktive infektioner. Protokollen, der er beskrevet her, er designet som et screeningsassay for at identificere stammer såsom cyr1ΔΔ-stammen, der skal bruges i fremtidige undersøgelser.

Brugen af et lavstrømsgasbedøvelsessystem er meget nyttigt for denne protokol (figur 1A, B). Under den indledende udvikling af denne protokol blev mus bedøvet ved hjælp af en injicerbar bedøvelsescocktail af ketamin blandet med xylazin. Mens det var muligt at udføre begrænset billeddannelse med den bedøvelsesmetode, var varigheden af anæstesi uforudsigelig, hvilket krævede, at billeddannelsessessioner blev afsluttet hurtigt for at undgå, at musen kom sig efter anæstesi under billeddannelse. Traditionelle inhalerede bedøvelsessystemer er omfangsrige og kræver høje strømningshastigheder af bedøvelsesgasser, hvilket ofte kræver, at de bruges i en røghætte. Således ville traditionelle inhalerede bedøvelsessystemer være meget vanskelige at bruge med pladsbegrænsningerne i et konfokalmikroskop uden utilsigtet at udsætte efterforskerne for bedøvelsesmidlerne. Brugen af et inhaleret bedøvelsessystem med lav strømning muliggør ensartet anæstesi af dyret, samtidig med at der opretholdes et sikkert miljø for efterforskeren. Den lavstrøms næsekegle muliggør nem positionering af dyret til både podning og mikroskopi. Den lille kaliber, lavvolumen leveringsrør tillader brug af relativt lange rør, hvilket gør det muligt at placere anæstesimaskinen i en tilstrækkelig afstand for ikke at forstyrre mikroskopi.

Klorofyl til stede i typisk musechow fører til signifikant vævsautofluorescens25. Dette skaber betydelig støj i billederne, hvilket gør det vanskeligt at få billeder af høj kvalitet og høj rumlig opløsning. Når dyr blev fodret med klorofylfri chow i 7 dage før billeddannelse, blev baggrunden fra autofluorescens væsentligt reduceret i væv, men klorofyl deponeret i håret fortsatte med at være problematisk. Fjernelse af håret på pinnae ved hjælp af en over-the-counter kemisk hårfjerningscreme er effektiv til at minimere autofluorescens i håret (figur 1C, D). Således reducerede kombinationen af klorofylfri chow og tilstrækkelig hårfjerning væsentligt autofluorescens og forbedrede billedkvaliteten dramatisk. Fordi håret fjernes fra øret inden billeddannelse, påvirker farven på dyrets hår ikke dette system. Denne protokol er blevet brugt med succes til at studere C. albicans infektioner i BALB / c (hvid), C57BL / 6 (sort) og DBA2 / N (brun) mus. Protokollen kan også bruges med C57BL/6 knockout-mus, der mangler forskellige værtsgener; Dette vil muliggøre fremtidige undersøgelser af, hvordan pattedyrets værtsimmunsystem påvirker filamentering. Et træk ved denne model, der ikke er diskuteret i denne protokol, er, at fordi dette billeddannelsessystem er ikke-invasivt, kan det samme dyr afbildes gentagne gange over flere dage, hvilket gør det muligt at følge udviklingen af individuel infektion over tid. Denne funktion vil sandsynligvis spille en central rolle i fremtidige undersøgelser af værtspatogeninteraktionen.

Sammenfattende resulterer denne protokol i billeder med høj rumlig opløsning af C. albicans, der vokser i vævet hos en levende pattedyrvært, hvilket muliggør nøjagtig evaluering af morfogenese i mutante stammer 8,9,10. Resultaterne, der præsenteres her, viser, hvordan denne protokol kan bruges til at screene et bibliotek af C. albicans mutanter. Af de C. albicans mutanter, der er testet til dato, gennemgår en stor del af mutanter med kendte defekter i morfogenese in vitro let filamentation in vivo 9,10. Dette understreger vigtigheden af at inkludere et in vivo-system som dette i eksperimenter designet til at belyse mekanismerne i C. albicans patogenese.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud 1R01AI33409 og Institut for Pædiatri, Carver College of Medicine, University of Iowa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#1.5 coverslips Thermo-Fisher 20811 large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes EXELint 26018 Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS Sigma-Aldrich SHBJ5734
70% Ethanol/30% water Decon Laboratories A05061001A
Alcohol prep pads Covidien 5110 Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains SN250 FGSC Online Catalog The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow Envigo 2920x
Computer Dell Optiplex 7050 Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator Pro Advantage 76200
DBA2/N (6-12 week old mice) BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.  The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) local pharmacy or grocery store Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.  This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.  It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. 
Examples: 
https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords
=fashion+tape&qid=1649174406&sprefix=
fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40
https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords
=fashion+tape&qid=1649174320&sprefix=
fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26
https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords
=fashion+tape&qid=1649174406&sprefix=
fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline Gibco / Thermo-Fisher 14190-144 Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum Gibco / Thermo-Fisher 26140-079
Gauze pad Pro Advantage P157112
Gel eye lurbicant local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software NIH ImageJ (FIJI)
Isoflurane Akorn J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens Leica DMi8 (SP8) The objective lens  (Leica 11506375) used here  is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue.
The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free  spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light.
The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer Kent Scientific International SomnoSuite
Nair hair remover lotion local pharmacy or grocery store Over the counter depilatory cream
Nourseothricin Jena Bioscience AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids Fluorescent protein expression transformation constructs  generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape Tape & Label Graphic Systems Inc 1007910
RPMI1640 cell culture medium Gibco / Thermo-Fisher 11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes Falcon 352196 To safely hold the animals ear during injectinos

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  2. Saville, S. P., Lazzell, A. L., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. Engineered control of cell morphology in vivo reveals distinct roles for yeast and filamentous forms of Candida albicans during infection. Eukaryotic Cell. 2 (5), 1053-1060 (2003).
  3. Arita, G. S., et al. Cell wall associated proteins involved in filamentation with impact on the virulence of Candida albicans. Microbiological Research. 258, 126996 (2022).
  4. Rai, L. S., Wijlick, L. V., Bougnoux, M. E., Bachellier-Bassi, S., d'Enfert, C. Regulators of commensal and pathogenic life-styles of an opportunistic fungus-Candida albicans. Yeast. 38 (4), 243-250 (2021).
  5. Sudbery, P. E. Growth of Candida albicans hyphae. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 737-748 (2011).
  6. Basso, V., d'Enfert, C., Znaidi, S., Bachellier-Bassi, S. From genes to networks: The regulatory circuitry controlling candida albicans morphogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology. 422, 61-99 (2019).
  7. Mancera, E., et al. Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in Candida species. Elife. 10, 64682 (2021).
  8. Mitra, S., Dolan, K., Foster, T. H., Wellington, M. Imaging morphogenesis of Candida albicans during infection in a live animal. Journal of Biomedical Optics. 15 (1), 010504 (2010).
  9. Wakade, R. S., Huang, M., Mitchell, A. P., Wellington, M., Krysan, D. J. Intravital imaging of Candida albicans identifies differential in vitro and in vivo filamentation phenotypes for transcription factor deletion mutants. mSphere. 6 (3), 0043621 (2021).
  10. Wakade, R. S., Kramara, J., Wellington, M., Krysan, D. J. Candida albicans filamentation does not require the cAMP-PKA pathway in vivo. mBio. 13 (3), 0085122 (2022).
  11. Bergeron, A. C., et al. Candida albicans and Pseudomonas aeruginosa interact to enhance virulence of mucosal infection in transparent zebrafish. Infection and Immunity. 85 (11), 00475 (2017).
  12. Seman, B. G., et al. Yeast and filaments have specialized, independent activities in a zebrafish model of Candida albicans infection. Infection and Immunity. 86 (10), 00415-00418 (2018).
  13. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 6th edition. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html (2020).
  14. Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network. Plos Genetics. 5 (12), 1000783 (2009).
  15. Cullen, P. J., Sprague, G. F. The regulation of filamentous growth in yeast. Genetics. 190 (1), 23-49 (2012).
  16. Herrero, A. B., et al. Control of filament formation in Candida albicans by polyamine levels. Infection and Immunity. 67 (9), 4870-4878 (1999).
  17. Ahmad Hussin, N., et al. Biotin auxotrophy and biotin enhanced germ tube formation in Candida albicans. Microorganisms. 4 (3), 37 (2016).
  18. Nantel, A., et al. Transcription profiling of Candida albicans cells undergoing the yeast-to-hyphal transition. Molecular Biology of the Cell. 13 (10), 3452-3465 (2002).
  19. Noble, S. M., Johnson, A. D. Strains and strategies for large-scale gene deletion studies of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. Eukaryotic Cell. 4 (2), 298-309 (2005).
  20. Glazier, V. E. EFG1, Everyone's favorite gene in Candida albicans: A comprehensive literature review. Frontiers in Cellular Infection and Microbiology. 12, 855229 (2022).
  21. Huang, G., Huang, Q., Wei, Y., Wang, Y., Du, H. Multiple roles and diverse regulation of the Ras/cAMP/protein kinase A pathway in Candida albicans. Molecular Microbiology. 111 (1), 6-16 (2019).
  22. Saville, S. P., Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Monteagudo, C., Lopez-Ribot, J. L. Use of a genetically engineered strain to evaluate the pathogenic potential of yeast cell and filamentous forms during Candida albicans systemic infection in immunodeficient mice. Infection and Immunity. 76 (1), 97-102 (2008).
  23. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryotic Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  24. Brothers, K. M., et al. NADPH oxidase-driven phagocyte recruitment controls Candida albicans filamentous growth and prevents mortality. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003634 (2013).
  25. Holmes, H., Kennedy, J. C., Pottier, R., Rossi, R., Weagle, G. A recipe for the preparation of a rodent food that eliminates chlorophyll-based tissue fluorescence. Journal of Photochemistry and Photobiology. B: Biology. 29 (2-3), 199 (1995).

Tags

Immunologi og infektion udgave 188
Brug af <em>In Vivo-billeddannelse</em> til screening for morfogenesefænotyper i <em>Candida albicans</em> mutante stammer under aktiv infektion i en pattedyrvært
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wakade, R. S., Krysan, D. J.,More

Wakade, R. S., Krysan, D. J., Wellington, M. Use of In Vivo Imaging to Screen for Morphogenesis Phenotypes in Candida albicans Mutant Strains During Active Infection in a Mammalian Host. J. Vis. Exp. (188), e64258, doi:10.3791/64258 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter