Summary
展示了使用流式细胞术对药物载体-细胞相互作用进行绝对定量的工作流程，以便更好地合理评估新型给药系统。此工作流程适用于任何类型的药物载体。
Abstract
设计药物递送系统的一个主要组成部分涉及如何放大或减弱与特定细胞类型的相互作用。例如，化疗药物可能用抗体功能化以增强与癌细胞的结合（“靶向”），或者用聚乙二醇功能化以帮助逃避免疫细胞识别（“隐形”）。即使在细胞水平上，优化药物载体的结合和摄取也是一个复杂的生物学设计问题。因此，将新承运人与细胞的相互作用程度与承运人货物一旦交付到该单元的功能功效区分开来是有价值的。
为了继续化学治疗的例子，“它与癌细胞的结合程度”与“它杀死癌细胞的程度”是一个单独的问题。后者的定量体 外 测定已经建立，通常依赖于测量活力。然而，大多数已发表的关于细胞载体相互作用的研究都是定性的或半定量的。通常，这些测量依赖于载体的荧光标记，因此以相对或任意单位报告与细胞的相互作用。然而，这项工作可以标准化，并且可以通过少量的表征实验实现绝对定量。这种绝对定量是有价值的，因为它有助于对各种药物递送系统（纳米颗粒、微粒、病毒、抗体-药物偶联物、工程治疗细胞或细胞外囊泡）进行合理的类间和类内比较。
此外，定量是后续meta分析或计算机建模方法 的 先决条件。在本文中，介绍了视频指南以及如何实现载体药物递送系统的 体外 定量的决策树，其中考虑了载体尺寸和标记方式的差异。此外，还讨论了对先进给药系统进行定量评估的进一步考虑因素。这旨在作为改善下一代医学的合理评估和设计的宝贵资源。
Introduction
药物递送结构的设计，根据它们遇到的细胞类型表现出特定的设计行为，引起了大量的研究兴趣。潜在的药物递送构建体或“载体”包括脂质制剂、纳米生长的无机物、聚合物组装体、细胞外囊泡、功能化细菌细胞或修饰的病毒。由于物理性质、表面特性或工程化学功能化（如抗体附着1，2），所有这些都可以表现出器官、组织或细胞特异性。
体外载体评估中几乎无处不在的步骤是用含有所述载药载体的悬浮液孵育细胞。孵育后，通过药物货物性能的功能读数来测量载体性能，例如转染效率或毒性。功能读数很有用，因为它们是载体有效性的下游衡量标准。然而，对于更复杂的药物递送结构，超越功能读数并单独量化载体与目标细胞的相互作用程度变得越来越重要。这有几个原因。
首先，人们对发现（并迭代改进）可以运载各种货物的“平台”承运人技术越来越感兴趣。例如，设计用于封装RNA的脂质纳米颗粒（LNP）可以将一个RNA序列交换为另一个RNA序列，几乎没有警告3。因此，为了迭代改进承运人技术，独立于货物功能量化其性能至关重要。其次，对于感兴趣的货物，功能读数可能并不简单，从而影响了快速迭代和评估载体配方的能力。虽然可以使用具有直接功能读数（例如荧光）的模型货物进行 体外 优化，但改变货物可以改变对载体4 的生物反应，因此可能不会产生代表性结果。第三，许多载体被设计为与特定细胞类型相互作用并被特定细胞类型吸收。承运人的这种 瞄准能力 可以而且应当与其 治疗性货物岗位目标的绩效区分开来。为了继续LNP的例子，RNA货物可能非常有效，但如果LNP无法与细胞结合，被内化并释放RNA，则不会观察到下游功能效应。对于旨在靶向难以转染的细胞类型（例如T细胞5）的载体来说，这可能是一个问题。相反，LNP可以非常有效地靶向，但RNA货物可能无法发挥作用。仅测量货物功能的下游检测将无法区分这两种情况，从而使载体药物输送系统的开发和优化复杂化。
在这项工作中，讨论了如何绝对量化载体 关联 。关联是一个术语，指的是实验测量的载体和细胞之间的相互作用程度。关联不区分膜结合和内化 - 载体可能被关联，因为它与细胞表面结合或因为细胞已经内化了它。关联通常作为细胞载体孵育实验的一部分进行测量。从历史上看，关联报告以任意荧光单位（通常是“中位荧光强度”或MFI）或“百分比关联”（其局限性之前已讨论过6）。简而言之，由于实验方案、流式细胞仪设置和不同载体的标记强度的差异，这些测量在实验、实验室和药物载体之间没有可比性。已经努力通过校准细胞仪来克服前者，从而将MFI的相对测量值转换为荧光的绝对定量测量值7。然而，该方法不考虑各种载体标记强度的可变性，因此不允许合理比较所选目标细胞8中的各种载体性能。
在这里，如何通过进行少量额外的表征实验来演示如何从相对的任意荧光单元实际转换为“每个细胞的载流子数”的绝对定量度量。如果需要另一个载体浓度指标（例如，每个细胞的载流子质量或每个细胞的载流子体积），则只要已完成载流子表征，就可以直接从每个细胞的载流子进行转换。为了简洁起见并避免行话，在这项工作中使用了“载体”一词来指代种类繁多的药物输送结构。这些定量技术同样适用，无论是应用于纳米工程金颗粒还是生物工程细菌。
一些事实使每个细胞从任意荧光单位转换为载体成为可能。首先，测量的荧光强度与荧光团9 （或荧光标记载体）的浓度成正比，假设荧光在仪器的检测限内，并且仪器设置相同。因此，如果已知载体的荧光和样品的荧光，则可以确定该样品中存在多少个载体，如果所有测量都是在相同的设置和条件下进行的。然而，特别是对于较小的载体，可能无法在具有相同设置的同一仪器上测量载体荧光、细胞自发荧光和细胞与载体相关的荧光。在这种情况下，还有第二个要求，可以在一台仪器上测量的荧光和另一台仪器上测量的荧光之间进行转换。为此，可以利用等效可溶性荧光染料分子（MESF）标准品9建立荧光团浓度的标准曲线来测量两种仪器上的荧光强度。然后，这允许在非细胞仪上批量测量载体荧光，该测量可以在任何大小或特征的载体上进行。当对已知浓度的载体悬浮液进行这种批量定量时，可以再次计算样品中每个细胞的载体数量。
虽然这项工作展示了测量载体关联的过程（由测量的荧光强度确定），但可以对细胞 - 载体相互作用的其他测量进行类似的协议（例如，区分内化和膜结合载体的实验方案）。此外，如果通过非荧光测定（例如，通过质谱细胞术）测量关联，则该协议将大致相同。
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Protocol
1. 选择合适的流
- 按照图 1 中概述的决策树确定所用实验设置的最佳工作流程（流）（图 2）。有关此流选择的进一步评论，请参阅讨论。
- 如果遵循细胞仪流，请继续执行步骤2.1.1-2.2.7。如果遵循批量流，请继续执行步骤 3.1.1.1-3.1.5.7。
图 1：工作流决策树。 关于使用哪个流的决定主要取决于感兴趣的运营商类型。较大的载体和具有高散射特性的载体可以在流式细胞仪上更容易地单独检测，因此适合使用流式细胞仪进行定量。批量流适用于所有其他运营商类型。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：工作流概述。 此协议分为两个不同的流。细胞仪流使用灵敏的细胞仪对悬浮载体进行计数，测量其各自的荧光，然后确定与载体孵育的细胞的荧光。Bulk Stream使用非基于细胞术的技术，例如纳米颗粒跟踪分析，对悬浮液中的载体进行计数。然后使用酶标仪或分光荧光计对单个载体荧光进行定量。因此，流式细胞仪的使用仅限于测量与载体一起孵育的细胞的最终荧光，该测量可以在更广泛的细胞仪上进行，并且与所使用的载体类型无关。缩写：MESF = 等效可溶性荧光染料分子;MFI = 荧光强度中位数。 请点击此处查看此图的大图。
2. 细胞仪流
- 载波计数
注意：任何流式细胞仪都可用于此测量，前提是流速（μL/s）已知。如果流速未知且无法确定，请不要继续此步骤。相反，请继续执行步骤 3.1。对悬浮载体进行计数可以准确且可重现地测定每个细胞实验中孵育的载体数量。- 设置细胞仪以通过光散射通道（通常是侧向散射 [SSC]）和荧光检测载体。确保调整阈值以允许检测载体。
注意：如果SSC不提供清晰的信号（例如，前向散射[FSC]），则可能需要通过不同的光散射通道进行迭代。 - 运行仅稀释剂样品以量化SSC和荧光通道中的背景事件计数。
注意：理想的后台事件计数为 <100 个事件/秒。 - 准备流式细胞术的载体。
- 确保载体通过涡旋或超声处理很好地悬挂，具体取决于所涉及的载体系统。
- 如果可能，确保载体浓度在 1，000 个载体/μL 和 10，000 个载体/μL 之间。事件计数比背景高一到两个数量级是一个良好的开端。如果载体浓度的数量级未知，一个好的开始是从库存中制备 1：1，000 稀释液。使用初始结果作为反馈，为将来的样品稀释提供信息。
注意：混浊悬浮液通常过于集中。
- 将第一个载体样品加载到细胞仪上并开始记录。
- 比较SSC和荧光通道产生的事件计数;这些应该大致相等（<10% 的差异）。如果没有，请检查细胞仪设置，例如光电倍增管（PMT）设置和荧光通道的激光强度。或者，使用其他方法（例如共聚焦显微镜）来验证载体的荧光标记是否存在且均匀。
- 重复步骤2.1.3-2.1.5两次或更多次，使用不同的原液稀释度。确保每个样本中的事件计数至少比后台事件计数高一个数量级。
- 验证三个或更多样品是否显示线性趋势，即两倍样品稀释应导致测量的载体浓度相应降低两倍。
- 使用线性范围内的样品、相应的稀释因子和已知的细胞仪流速，根据公式（1）计算原液载体浓度：
（1）
其中 C 是以载体/mL 为单位的储备载体浓度。建议使用从光散射检测而不是荧光中得出的事件计数。
- 设置细胞仪以通过光散射通道（通常是侧向散射 [SSC]）和荧光检测载体。确保调整阈值以允许检测载体。
- 流式细胞术读取载体细胞实验，包括测定每个载体的荧光强度
注意：理想情况下，每个载体的荧光强度将尽可能接近载体细胞实验。这是为了确保为单个载体获得的MFI可以直接与与载体相关的细胞的MFI进行比较。在实践中，当使用相同的PMT电压连续使用细胞仪时，通常会产生类似的结果，但不能保证这一点。- 设计载体细胞实验。使用步骤2.1中确定的载体浓度施用所需剂量的载体。
- 通过确定相关通道中的最佳PMT电压设置，为最终的载体细胞实验设置流式细胞仪。设置阈值以允许运营商检测。
- 悬浮运行载体以确定当前PMT设置下每个载体的荧光强度。
- 如果需要，更改细胞仪阈值以检测细胞而不是载体。
- 运行阴性对照样品 - 未与载体孵育的细胞 - 以确定细胞的背景荧光（自发荧光）。
- 运行载体细胞样品以确定每个细胞的荧光强度。这种荧光是细胞自发荧光和荧光载体存在的线性组合。
- 使用以下公式（2）计算每个细胞的载流子数：
（二）
其中Passoc是每个细胞相关的载体数，FI细胞是与载体一起孵育的细胞的MFI，FI背景是未与载体孵育的细胞的MFI，FI载体是悬浮载体的MFI。
（1）
（二）3. 批量流
- 载流子计数：纳米颗粒跟踪分析
注意：在大流中，载流子计数是量化每个载体绝对荧光强度的必要步骤（参见步骤3.1.4）。此外，对悬浮载体进行计数可以准确且可重现地确定每个细胞实验中孵育的载体数量。- 制备
- 将流通池安装到激光模块上，并将整个激光模块锁定在仪器内。
- 缓慢（不快于 0.1 mL/s）用 ~1 mL 蒸馏水冲洗流通池。如果在流通池内形成气泡，请部分缩回悬浮液以将气泡与气液界面合并，然后再继续。
- 大约在冲洗中途启动相机;请务必确认载体碎片已冲洗掉。选择拍摄以打开拍摄设置选项卡，然后单击启动相机。
- 用 1 mL 空气干燥系统。如果屏幕上可见任何静电载体，请按照制造商的说明清洁流通池。
- 根据所涉及的载体系统，确保载体通过涡旋或超声 处理良好 悬浮，为纳米颗粒跟踪分析做好准备。如果原液浓度的数量级未知，请从原液中制备 1：100 稀释液，并使用初始结果作为反馈，以告知未来的样品稀释度。用水而不是磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 稀释载体，以制备至少 ~0.6-1 mL 的每个样品，载体浓度在 1 × 107 载体/mL 和 1 ×10 9 载体/mL 之间。
注意：混浊悬浮液通常过于集中。缓冲液和盐会产生高背景噪声。
- 测量
- 取出激光模块并将其直立放置。
- 将第一个载体样品抽取到 1 mL 注射器中。将注射器连接到试管入口，并小心地将样品装入流通池中。如果在流通池内形成气泡，请部分缩回悬浮液以将气泡与气液界面合并，然后再继续。确保整个流通池充满液体，然后暂停。
- 如果需要，调整相机对焦以可视化各个载体。使用仪器右侧的旋转旋钮进行粗焦调整。通过选择 硬件 选项卡 | 泵/级。通过调整“焦点”滑块来更改 焦点 。
- 调整摄像机电平以确保没有过饱和。在 “捕获 ”选项卡中，通过调整滑块来选择最佳 摄像机级别 。
- 如果仪器配备了此附件，请将装有载体样品的注射器装入 注射泵 ，以确保测量期间样品连续流动。
- 在 SOP 选项卡下，选择 标准测量 以拍摄五次，每次 30 秒。输入 “基本文件名 ”，如果需要，通过单击 “高级 ”按钮（打开包含各种选项的模式对话框）添加其他示例信息。
注意：如果输入稀释因子，软件将自动调整最终的载流子浓度测量值。建议不要输入此系数。相反，手动执行调整，这有助于分析并允许评估每种稀释度是否在仪器的动态范围内（步骤3.1.3.4）。 - 按创建和运行脚本，然后等待出现一个弹出窗口，要求请提前示例。
- 如果使用 注射泵， 请选择 硬件 选项卡 | 注射泵 标签 |将 输注速率 设置为 30-80 ，然后按 输注。如果不使用 注射泵，请手动推进样品。
- 在弹出窗口中，选择“确定”开始捕获。在五次捕获之后，当“请提前样品”弹出窗口再次出现时，检查样品是否仍在手动或通过注射泵在流通池中移动。然后，选择“确定”以继续下一次捕获。
注意：捕获五次后，软件会自动打开“进程”选项卡并打开一个弹出窗口，要求调整进程设置。
- 分析
- 在 “处理 ”选项卡中，调整 “检测阈值 ”滑块（ 介于 4 和 8 之间）以正确识别屏幕上可见的不同载体。调整 屏幕增益 也以帮助可视化;它不会影响下游分析。使用捕获屏幕下方的滑块滚动浏览视频的多个帧，以帮助设置检测阈值。
注意：检测阈值应设置一次，随后不应在测量或样品之间更改。 - 在弹出窗口中（注意步骤 3.1.2.9 之后的注释），按 确定 启动跟踪分析。通过单击“ 分析 ”选项卡 | 单个分析 选项卡。
- 分析完成后，查找“ 导出设置 ”提示，其中默认情况下应选择“包括 PDF ”和“包括 实验摘要 ”。根据需要选择任何其他导出格式。
- 在 PDF 数据导出的结果部分，为确保测量的浓度可靠，请验证测量的载流子浓度是否介于 1 × 107 载流器/mL 和 1 × 109 载流器/mL（仪器的动态范围）之间，并检查浓度测量结果下方是否有任何错误消息或警告信息。
- 重复步骤3.1.2.1-3.1.3.4两次或更多次，用不同的原液稀释度。确保每个样品的浓度在仪器的线性范围内。
- 选择三个或更多显示线性趋势的样品，即两倍样品稀释应导致测量的载体浓度相应降低两倍。使用所选样品和相应的稀释因子计算原液载体浓度。
- 在 “处理 ”选项卡中，调整 “检测阈值 ”滑块（ 介于 4 和 8 之间）以正确识别屏幕上可见的不同载体。调整 屏幕增益 也以帮助可视化;它不会影响下游分析。使用捕获屏幕下方的滑块滚动浏览视频的多个帧，以帮助设置检测阈值。
- 测定每个载体的绝对荧光强度
注意：由于无法直接表征该流中单个载体的荧光，因此可以批量量化荧光强度。该方法依赖于根据朗伯-比尔定律荧光强度与荧光染料浓度线性相关的事实。当在已知载体浓度的悬浮液上进行悬浮液中的载体的这种批量定量时（参见步骤3.1），可以得出每个载体的荧光。此步骤可以在荧光板读数仪或分光荧光计上完成。将荧光强度与具有已知绝对荧光的样品的标准曲线进行比较，以MESF的数量表示。- 使用游离荧光染料溶液标记载体：将染料重悬于适当的缓冲液（例如DMSO）中，并在与载体稀释剂相同的缓冲液中进行进一步稀释。或者，使用与荧光染料偶联的抗体溶液。使用公式（3）根据以mg/mL为单位的浓度，以mg/mole为单位的分子量和阿伏伽德罗数计算储备溶液的浓度（MESF/mL）。在载体稀释剂中进行连续稀释以生成标准曲线样品。
（三）
注意：仅当标记程度（即溶液中荧光染料和抗体之间的摩尔比）已知时，才使用荧光染料偶联抗体。最初，生成宽范围的标准曲线，因为载体样品的荧光强度仍然未知。从这里开始，缩小范围以包括所需的范围。 - 准备载体样品。
注意：最佳做法是测试两个或多个载流子稀释液，以验证测量值是否线性且落在标准曲线范围内。 - 测量每个样品等体积的荧光，即载体和标准曲线。
- 生成标准曲线并扣除所测量载体样品的体积绝对荧光强度（以 MESF/mL 为单位）。
- 通过将体积荧光（MESF/mL）除以载体浓度（载体/ mL）来计算每个载体（MESF /载体）的绝对荧光强度，如公式（4）所示：
（四）
- 使用游离荧光染料溶液标记载体：将染料重悬于适当的缓冲液（例如DMSO）中，并在与载体稀释剂相同的缓冲液中进行进一步稀释。或者，使用与荧光染料偶联的抗体溶液。使用公式（3）根据以mg/mL为单位的浓度，以mg/mole为单位的分子量和阿伏伽德罗数计算储备溶液的浓度（MESF/mL）。在载体稀释剂中进行连续稀释以生成标准曲线样品。
- 细胞实验（包括确定每个载体的等效荧光强度）
注意：在此步骤中，流式细胞术定量珠用于生成MESF和MFI之间关系的标准曲线。这些定量微球由多个磁珠群组成，每个微球具有已知数量的MESF，并且这些单独的微球可以通过任何细胞仪检测到。理想情况下，MESF标准曲线与载体细胞实验的读数同时确定。这是为了确保为单个载体计算的MFI值可以直接与与载体相关的细胞的MFI进行比较。在实践中，当使用相同的PMT电压连续使用细胞仪时，通常会产生类似的结果，但不能保证这一点。- 设计载体细胞实验。使用第3.1.3节中确定的载体浓度来施用所需剂量的载体。
- 通过确定相关通道中的最佳PMT电压设置，为最终的载体细胞实验设置流式细胞仪。
- 运行阴性对照样品，即未与载体孵育的细胞，以确定背景荧光。
- 制备并重悬流式细胞术定量微球。使用与细胞样品相同的缓冲液（例如PBS）。如果单独提供磁珠群，请将它们合并在一起。
- 运行流式细胞术定量微球样品。
- 运行载体细胞样品以确定每个细胞的荧光强度。
- 使用定量微球样品生成标准曲线，将绝对荧光强度（MESF）转换为MFI。使用此标准曲线和步骤3.1.4的结果来计算载流子的理论MFI。使用公式（5）计算每个细胞的载流子数：
（五）
其中Passoc是每个细胞相关的载体数量，FI细胞是与载体一起孵育的细胞的MFI，FI背景是未与载体孵育的细胞的MFI，FI载体是悬浮载体的计算MFI（步骤3.1.4）。
- 制备
（三）
（四）
（五）Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
如前所述，不同的药物载体类型需要使用不同的技术来绝对定量细胞-载体关联。例如，633 nm二硫化物稳定的聚甲基丙烯酸（PMASH）核壳颗粒大且密度足以使用灵敏的流式细胞仪进行检测。因此，这些颗粒被荧光标记，然后使用侧角光散射（SALS，类似于SSC）以及适当的荧光通道进行门控和计数（图3）。两个通道中的事件计数差异为 1.98%，完全在可接受的范围内。
相比之下，100 nm超顺磁性氧化铁纳米颗粒太小而无法单独检测，因此使用Bulk Stream进行分析。使用纳米颗粒跟踪分析对这些纳米颗粒进行计数和表征（图4）。136 nm的平均纳米颗粒尺寸反映了纳米颗粒在水中的流体动力学直径。测量的纳米颗粒浓度 - 仍未校正所执行的稀释 - 落在仪器的动态范围内，表明成功和准确地测定纳米颗粒浓度。
继续在大容量流中，载体悬浮液的绝对荧光强度将在用于最终细胞载体孵育的流式细胞仪上转换为MFI值。在该实验中，使用与载体相同的荧光染料标记的定量微球在多天内在流式细胞仪上生成标准曲线（图5）。测量的MFI与定量微球的MESF值之间的相关性是线性的，并且在测量日期之间基本相似。但是，可以观察到日期之间的细微差异，因此，建议再生标准曲线作为载体细胞实验读数的一部分。
一旦确定了单个载体的MFI，就可以绝对量化细胞-载体关联数据并更准确地解释。建议进行时程实验，例如，用235nm PMASH 胶囊孵育荧光标记的HeLa细胞，用于0小时至24小时之间的不同时间点（图6）。正如预期的那样，中位细胞荧光随着时间的推移而增加，表明胶囊与HeLa细胞相关。虽然此类实验可用于比较不同时间点的相对载流子性能，但这些结果并不是绝对定量的。
无论是通过细胞仪流还是大容量流进行绝对定量，在比较两种载体类型的关联时，绝对定量的重要性都变得清晰起来。图7描述了通过相对定量（图7A）或绝对定量分析的相同两个实验。对携带者的表观细胞反应差异是明显的，这取决于所执行的分析;使用相对定量时，不应直接比较载体（图7A），而绝对定量与标记强度无关，因此更具可比性（图7B）。
图 3：使用流式细胞仪（细胞仪流）计数颗粒。使用远地点流式细胞仪。 （A）使用光通道（SALS）进行粒子计数，导致事件计数为200，659。（B）使用载体的荧光通道进行载流子计数，导致事件计数为204，636。在这两种情况下，都应用了弧线变换，然后应用了门控（分别为6和4）。根据 Faria 等人首次发表的 633 nm 核壳颗粒的原始数据创建的数字10。缩写：SALS = 小角度光散射。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：使用纳米颗粒跟踪分析（大批量流）计数载流子。 使用纳米颗粒跟踪分析对尺寸为100 nm的超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行表征和计数。左，五次重复测量的单个结果的浓度/大小直方图。右图，SEM±五个重复的平均浓度/大小分布。在该特定样品中，从库存中进行了1：2，000稀释，以获得仪器动态范围内的浓度。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用流式细胞仪上的定量微球将 MESF 转换为 MFI（大容量流）。 在不同日期在流式细胞仪上分析具有四种不同MESF值的荧光珠，并绘制标准曲线。缩写：MESF = 等效可溶性荧光染料分子;MFI = 荧光强度中位数。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：流式细胞仪时间过程系列（细胞仪流和体积流）的最终细胞实验。 来自时程实验的流式细胞术数据的代表性图像。将THP-1细胞与235nm聚合物胶囊孵育0小时，1小时，2小时，4小时，8小时，16小时和24小时（从左到右）。载体荧光显示在x轴上，而光学通道显示在y轴上。在所有情况下，都执行了反弧变换。没有执行门控（除了选择图形的限制）。根据 Faria 等人的原始数据创建10。缩写：SALS = 小角度光散射。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：载体-细胞结合的相对与绝对定量（细胞仪流和体积流）。 两个图都可视化了来自相同两个实验的数据，RAW264.7巨噬细胞与150nm（蓝色）或633nm核壳载体（橙色）之间的24小时孵育，由Faria等人的原始数据创建10。绘制两个技术仿行的中位数。（A）相对定量，在a.u中报告为MFI （B）绝对定量，报告为每个细胞的载体数。缩写：MFI = 荧光强度中位数;a.u. = 任意单位。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
表征药物载体和细胞之间的相互作用在新型药物输送系统的开发中变得越来越重要。具体而言，为了能够合理评估和比较各种载体结构，所述载体与靶标和非靶细胞相互作用的性能的绝对定量至关重要。该协议描述了一种双流方法，允许任何与药物载体合作的研究人员将细胞 - 载体关联的相对半定量流式细胞术数据转换为绝对定量结果。概述的过程适用于任何类型的载体 - 小型，大型，有机，无机 - 只要它们被荧光标记。然而，不同的载流子需要不同的方法来计算每个细胞的载流子。这是由于用于所需表征测量的各种仪器的限制。
因此，该协议分为两个流：细胞仪流和批量流。第一种是细胞仪流，是更直接的方法，只需要一个流式细胞仪，但这种细胞仪需要足够灵敏才能检测所使用的单个载体，或者换句话说，感兴趣的药物载体需要足够大和密集才能被检测。Bulk Stream与任何载体类型兼容，因为通过使用替代仪器可以避免检测单个载体的需要。但是，批量流需要更多的表征实验才能完成。
为了帮助选择合适的 Stream（以及相应的技术），上述注意事项已汇总为决策树（图 1）。重申一下，无论使用何种载体类型，Bulk Stream都适用于所有研究人员，因此始终可以恢复为备份。 图 2 概述了两个流的工作流。值得注意的是，随着流式细胞仪灵敏度的不断进步，流式细胞仪流可用于更多<300 nm载流子。
关于这一程序，应作几点说明。首先，所描述的将细胞荧光转换为每个细胞的绝对载流子数的策略依赖于对悬浮液中单个载流子荧光的测量。然而，荧光受荧光染料的直接化学环境（例如，载体稀释剂、细胞表面或各种细胞内区室）的影响。特别是，已知内体区室的酸性环境会影响某些主要基于蛋白质的染料的荧光强度11。因此，无论研究的载体类型如何，都建议使用pH不敏感且高度光稳定的染料范围来标记药物载体（有关建议，请参见 材料表 ）。该染料系列的另一个优点是其一般亮度，这提高了药物载体检测的灵敏度。
其次，上面讨论的方法旨在提供指导，但绝不是可用于执行定量工作流程中各个步骤的专有技术列表。特别是，存在各种技术来计数较小或低散射载流子（如散装流中的载流子）。这些包括能够执行相同纳米颗粒跟踪分析12的其他仪器，以及其他方法，例如多角度动态光散射，质谱，电子显微镜13，重量法或光密度测量（由Shang和Gao14进一步审查）。此外，这种实验定量 - 从任意荧光单位移动到每个细胞的绝对数量的载体 - 只是所谓的“定量生物学工作流程”的一部分。绝对的实验定量是 必要的 ，但 还不够。 仅定量和报告载体关联并不能解释由于实验设置引起的颗粒关联差异，例如添加的药物载体的孵育时间、剂量和浓度，或每个实验容器使用的细胞数。
此外，具有不同物理化学性质的载体可能具有非常不同的剂量递送到细胞，即使实验设置相同15。如果不考虑所有这些因素，就无法确定载体性能 - 即使是 体外。换句话说，仅仅量化载体 - 细胞关联通常不允许研究人员和实验室之间的载体进行无偏比较。有鉴于此，已经事先讨论了进行载体细胞结合时程实验的重要性，以及随后的计算机数学建模 ， 以推导出动力学参数（即速率常数），作为特定载体-细胞对之间亲和力的无偏定量测量10。实验定量也是应用其他 计算机 技术的先决条件，例如识别生物异质性的潜在来源16 或确定复杂生物模型中的渗透动力学17。结合生物纳米实验文献中标准化报告的最低信息报告指南18，载体性能的定量评估可以加速新型纳米药物的发展。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（NHMRC;计划拨款编号GNT1149990），澳大利亚艾滋病毒和肝炎病毒学研究中心（ACH2），以及Réjane Louise Langlois遗产的礼物。F.C.承认国家卫生和医学研究委员会（NHMRC）高级首席研究奖学金（GNT1135806）的授予。图 1 和 图 2 是使用 BioRender.com 创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
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