Summary
유세포분석을 사용하여 약물 운반체-세포 상호 작용의 절대 정량화를 위한 워크플로우를 입증하여 새로운 약물 전달 시스템을 보다 합리적으로 평가할 수 있습니다. 이 워크 플로우는 모든 유형의 약물 운반자에게 적용 할 수 있습니다.
Abstract
약물 전달 시스템 설계의 주요 구성 요소는 특정 세포 유형과의 상호 작용을 증폭하거나 약화시키는 방법에 관한 것입니다. 예를 들어, 화학 요법은 암세포에 대한 결합을 향상시키는 항체로 기능화 ( "표적화") 또는 면역 세포 인식을 회피하는 데 도움이되는 폴리에틸렌 글리콜로 기능화 될 수 있습니다 ( "스텔스"). 세포 수준에서도 약물 운반체의 결합 및 흡수를 최적화하는 것은 복잡한 생물학적 설계 문제입니다. 따라서 새로운 담체가 세포와 얼마나 강하게 상호 작용하는지와 일단 해당 세포로 전달되면 담체의화물의 기능적 효능을 분리하는 것이 중요합니다.
화학 요법의 예를 계속하기 위해 "암세포에 얼마나 잘 결합하는지"는 "암세포를 얼마나 잘 죽이는지"와는 별개의 문제입니다. 후자에 대한 정량적 체외 분석은 잘 확립되어 있으며 일반적으로 생존력 측정에 의존합니다. 그러나 세포-운반체 상호 작용에 대한 대부분의 발표 된 연구는 정 성적 또는 반 정량적입니다. 일반적으로 이러한 측정은 캐리어의 형광 표지에 의존하며 결과적으로 상대적 또는 임의의 단위로 세포와의 상호 작용을 보고합니다. 그러나이 작업은 표준화 될 수 있으며 소수의 특성화 실험으로 절대적으로 정량적으로 만들 수 있습니다. 이러한 절대 정량화는 나노입자, 마이크로입자, 바이러스, 항체-약물 접합체, 조작된 치료 세포 또는 세포외 소포와 같은 다양한 약물 전달 시스템의 합리적, 클래스 간 및 클래스 내 비교를 용이하게 하기 때문에 가치가 있습니다.
또한 정량화는 후속 메타 분석 또는 인실리코 모델링 접근 방식의 전제 조건입니다. 이 기사에서는 캐리어 크기 및 라벨링 양식의 차이를 고려한 캐리어 약물 전달 시스템에 대한 체외 정량화를 달성하는 방법에 대한 의사 결정 트리와 비디오 가이드를 제공합니다. 또한 고급 약물 전달 시스템의 정량적 평가에 대한 추가 고려 사항이 논의됩니다. 이것은 차세대 의학을위한 합리적인 평가와 설계를 향상시키는 귀중한 자원으로 사용하기위한 것입니다.
Introduction
만나는 세포 유형에 따라 특이적이고 설계된 행동을 나타내는 약물 전달 구조체의 설계는 상당한 연구 관심을 끌었습니다. 잠재적인 약물 전달 구축물 또는 "담체"는 지질 제형, 나노성장 무기물, 중합체 어셈블리, 세포외 소포, 기능화된 박테리아 세포, 또는 변형된 바이러스를 포함한다. 이들 모두는 물리적 특성, 표면 특성 또는 항체 부착 1,2와 같은 공학적 화학적 기능화로 인해 장기, 조직 또는 세포 특이성을 나타낼 수 있습니다.
시험관내 담체 평가에서 거의 유비쿼터스 단계는 상기 약물 로딩 담체를 함유하는 현탁액으로 세포를 배양하는 것이다. 인큐베이션 후, 담체 성능은 약물 화물의 성능, 예를 들어 형질주입 효율 또는 독성의 기능적 판독을 통해 측정된다. 기능 판독값은 캐리어 효율성의 다운스트림 척도이므로 유용합니다. 그러나 더 복잡한 약물 전달 구조체의 경우 기능적 판독을 넘어 관심 세포와의 캐리어 상호 작용 정도를 개별적으로 정량화하는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 여기에는 몇 가지 이유가 있습니다.
첫째, 다양한화물을 운반 할 수있는 "플랫폼"운송 기술을 발견 (및 반복적으로 개선)하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 예를 들어, RNA를 캡슐화하도록 설계된 지질 나노 입자 (LNP)는 몇 가지주의 사항없이 하나의 RNA 서열을 다른 RNA 서열로 교환 할 수 있습니다3. 따라서 캐리어 기술을 반복적으로 개선하려면 화물 기능과 관계없이 성능을 정량화하는 것이 중요합니다. 둘째, 기능적 판독은 관심 화물에 대해 간단하지 않을 수 있으며, 캐리어 제형을 신속하게 반복하고 평가하는 능력을 손상시킬 수 있습니다. 간단한 기능 판독(예: 형광)이 있는 모델 화물을 사용하여 시험관 내 최적화를 수행할 수 있는 반면, 화물을 변경하면 캐리어(4 )에 대한 생물학적 반응이 변경될 수 있으므로 대표 결과를 산출하지 못할 수 있습니다. 셋째, 많은 운반체는 특정 세포 유형과 상호 작용하고 흡수되도록 설계되었습니다. 담체의 이러한 타겟팅 능력은 그의 치료적 화물 포스트 타겟팅의 성능과 구별될 수 있고 구별되어야 한다. LNP 예를 계속하기 위해 RNA 화물은 매우 강력할 수 있지만 LNP가 세포에 결합하여 내재화되고 RNA를 방출할 수 없는 경우 다운스트림 기능 효과가 관찰되지 않습니다. 이는 특히 T 세포5와 같이 형질감염하기 어려운 세포 유형을 표적으로 하는 담체에게 문제가 될 수 있습니다. 반대로 LNP는 매우 효과적으로 표적화할 수 있지만 RNA 화물은 작동하지 않을 수 있습니다. 화물 기능만 측정하는 다운스트림 분석으로는 이 두 가지 상황을 구별할 수 없으므로 운반체 약물 전달 시스템의 개발 및 최적화가 복잡해집니다.
이 작업에서는 캐리어 연관성 을 절대적으로 정량화하는 방법에 대해 논의합니다. 연관성은 실험적으로 측정된 운반체와 세포 간의 상호 작용 정도를 나타내는 용어입니다. 결합은 막 결합과 내재화를 구별하지 않는다 - 담체는 세포 표면에 결합되어 있거나 세포가 그것을 내재화했기 때문에 연관될 수 있다. 연관성은 일반적으로 세포-담체 배양 실험의 일부로 측정됩니다. 역사적으로 연관성은 임의의 형광 단위 (일반적으로 "중간 형광 강도"또는 MFI) 또는 "퍼센트 연관성"으로보고되었으며, 그 한계는 이전에 논의되었습니다6. 요컨대, 이러한 측정은 실험 프로토콜, 유세포분석기 설정 및 다른 운반체의 라벨링 강도의 차이로 인해 실험, 실험실 및 약물 운반체 간에 비교할 수 없습니다. 세포 분석기를 보정하여 MFI의 상대적 측정을 형광7의 절대 정량적 측정으로 변환함으로써 전자를 극복하기위한 노력이 이루어졌습니다. 그러나, 이 방법은 다양한 캐리어의 라벨링 강도에서의 가변성을 설명하지 않으며, 따라서, 선택(8)의 타겟 셀에서 다양한 캐리어 성능의 합리적인 비교를 허용하지 않는다.
여기서, 상대적이고 임의의 형광 단위로부터 "세포당 운반체의 수"의 절대 정량적 메트릭으로 실질적으로 변환하는 방법은 소수의 추가 특성화 실험을 수행하여 입증된다. 캐리어 농도의 다른 메트릭이 필요한 경우(예: 셀당 캐리어 질량 또는 셀당 캐리어 부피), 캐리어 특성화가 수행된 경우 셀당 캐리어에서 변환하는 것이 간단합니다. 간결함과 전문 용어를 피하기 위해 이 작업에서 "운반체"라는 단어는 방대한 약물 전달 구조를 지칭하는 데 사용됩니다. 이러한 정량화 기술은 나노 공학 금 입자 또는 생체 공학 박테리아에 적용되는지 여부에 관계없이 동일하게 적용됩니다.
몇 가지 사실은 임의의 형광 단위에서 세포당 운반체로의 변환을 가능하게 합니다. 첫째, 측정된 형광 강도는 형광단9(또는 형광 표지된 담체)의 농도에 비례하며, 형광이 기기의 검출 한계 내에 있고 기기 설정이 동일하다고 가정합니다. 따라서 캐리어의 형광과 샘플의 형광을 알고 있으면 모든 측정이 동일한 설정 및 조건에서 수행되면 해당 샘플에 얼마나 많은 캐리어가 존재하는지 확인할 수 있습니다. 그러나 특히 더 작은 캐리어의 경우 동일한 설정으로 동일한 기기에서 캐리어 형광, 세포 자가형광 및 캐리어와 연결된 세포 형광을 측정하는 것이 불가능할 수 있습니다. 이 경우 한 기기에서 측정된 형광과 다른 기기에서 측정된 형광 간에 변환할 수 있도록 하는 두 번째 요구 사항이 있습니다. 이를 위해 형광단 농도의 표준 곡선을 설정하여 등가 가용성 형광체 분자(MESF) 표준9를 활용하여 두 기기의 형광 강도를 측정할 수 있습니다. 그런 다음 비세포분석기에서 대량으로 운반체 형광을 측정할 수 있으며, 이는 모든 크기 또는 특성의 운반체에서 수행할 수 있는 측정입니다. 이러한 벌크 정량화가 알려진 농도의 담체 현탁액에 대해 수행될 때, 샘플의 세포당 담체의 수가 다시 한번 계산될 수 있다.
이 작업은 캐리어 연관성을 측정하는 프로세스 (측정 된 형광 강도에 의해 결정됨)를 보여 주지만, 유사한 프로토콜이 세포-캐리어 상호 작용의 다른 측정 (예 : 내재화 된 캐리어와 막 결합 캐리어를 구별하는 실험 프로토콜)에 대해 수행 될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 연관성이 비형광 분석(예: 질량 세포분석을 통해)을 통해 측정된 경우 대체로 동일합니다.
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Protocol
1. 적절한 스트림 선택
- 그림 1 에 설명된 의사 결정 트리에 따라 사용된 실험 설정에 가장 적합한 워크플로(스트림)(그림 2)를 결정합니다. 이 스트림 선택에 대한 추가 의견은 토론을 참조하십시오.
- 세포분석기 스트림을 따르는 경우 2.1.1-2.2.7단계를 계속합니다. 대량 스트림을 따르는 경우 3.1.1.1-3.1.5.7단계를 계속 진행합니다.
그림 1: 작업 스트림 의사 결정 트리. 사용할 스트림에 대한 결정은 주로 관심 있는 이동통신사 유형에 따라 다릅니다. 더 큰 운반체와 높은 산란 특성을 가진 담체는 세포분석기에서 개별적으로 더 쉽게 검출할 수 있으므로 세포분석기 스트림을 사용한 정량화에 적합합니다. 벌크 스트림은 다른 모든 캐리어 유형에 적합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 작업 흐름 개요. 이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 스트림으로 분할됩니다. Cytometer Stream은 민감한 세포분석기를 사용하여 현탁액에 있는 운반체를 계수하고 개별 형광을 측정한 다음 운반체와 함께 배양된 세포의 형광을 결정합니다. 벌크 스트림은 나노입자 추적 분석과 같은 비세포분석 기반 기술을 사용하여 현탁액에 있는 운반체를 계산합니다. 이어서, 개별 담체 형광은 마이크로플레이트 판독기 또는 분광형광계를 사용하여 정량화된다. 따라서 유세포분석기의 사용은 담체와 함께 배양된 세포의 최종 형광을 측정하는 것으로 제한되며, 이는 더 넓은 범위의 세포분석기에서 수행할 수 있고 사용된 운반체 유형과 무관한 측정입니다. 약어 : MESF = 동등한 가용성 형광 색소 분자; MFI = 중간 형광 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 세포분석기 스트림
- 캐리어 카운팅
알림: 유속(μL/s)을 알고 있는 경우 이 측정에 모든 유세포분석기를 사용할 수 있습니다. 유량을 알 수 없고 결정할 수 없는 경우 이 단계를 진행하지 마십시오. 대신 3.1단계로 진행하십시오. 현탁액에서 캐리어를 계수하면 각 세포 실험에서 배양된 캐리어의 수를 정확하고 재현 가능하게 결정할 수 있습니다.- 광학 산란 채널(일반적으로 측면 산란[SSC])과 형광에 의해 운반체를 검출하도록 세포분석기를 설정합니다. 캐리어를 탐지할 수 있도록 임계값을 조정해야 합니다.
알림: SSC가 명확한 신호를 제공하지 않는 경우 다른 광학 산란 채널을 통한 반복이 필요할 수 있습니다(예: 순방향 산란[FSC]). - 희석제만 있는 샘플을 실행하여 SSC 및 형광 채널 모두에서 백그라운드 이벤트 수를 정량화합니다.
참고: 이상적인 백그라운드 이벤트 수는 <100개 이벤트/초입니다. - 유세포 분석을 위해 담체를 준비하십시오.
- 캐리어가 관련된 캐리어 시스템에 따라 와류 또는 초음파 처리에 의해 잘 매달려 있는지 확인하십시오.
- 가능하면 캐리어 농도가 1,000 캐리어/μL에서 10,000 캐리어/μL 사이인지 확인하십시오. 배경보다 1-2배 더 큰 이벤트 수는 좋은 시작입니다. 담체 농도의 크기를 알 수 없는 경우 재고에서 1:1,000 희석을 준비하는 것이 좋습니다. 초기 결과를 피드백으로 사용하여 향후 샘플 희석을 알립니다.
알림: 흐린 서스펜션은 일반적으로 너무 집중되어 있습니다.
- 첫 번째 캐리어 샘플을 세포 분석기에로드하고 기록을 시작하십시오.
- SSC와 형광 채널 모두에서 발생하는 이벤트 수를 비교합니다. 이들은 거의 같아야합니다 (<10 % 차이). 그렇지 않은 경우 형광 채널의 광전자 증배관(PMT) 설정 및 레이저 강도와 같은 세포계 설정을 확인하십시오. 대안적으로, 공초점 현미경과 같은 다른 방법을 사용하여 담체의 형광 표지가 존재하고 균일한지 검증한다.
- 2.1.3-2.1.5단계를 두 번 이상 더 반복하여 재고에서 다른 희석액을 사용합니다. 각 샘플의 이벤트 수가 백그라운드 이벤트 수보다 한 자릿수 이상 높은지 확인합니다.
- 3개 이상의 샘플이 선형 추세를 보이는지, 즉 2배 샘플 희석이 측정된 담체 농도에서 상응하는 2배 감소를 가져와야 하는지 확인합니다.
- 선형 범위 내의 샘플, 해당 희석 계수 및 알려진 세포계 유속을 사용하여 방정식 (1)에 따라 스톡 캐리어 농도를 계산합니다.
(1)
여기서 C 는 담체/mL 단위의 스톡 담체 농도입니다. 형광보다는 광학 산란 검출에서 파생된 이벤트 수를 사용하는 것이 좋습니다.
- 광학 산란 채널(일반적으로 측면 산란[SSC])과 형광에 의해 운반체를 검출하도록 세포분석기를 설정합니다. 캐리어를 탐지할 수 있도록 임계값을 조정해야 합니다.
- 담체당 형광 강도 측정을 포함한 담체-세포 실험의 유세포분석 판독
참고: 이상적으로, 캐리어당 형광 강도는 캐리어-셀 실험에 가능한 한 가깝게 결정될 것이다. 이는 개별 캐리어에 대해 수득된 MFI가 캐리어와 연관된 셀의 MFI와 직접 비교될 수 있도록 하기 위한 것이다. 실제로 세포 분석기는 일반적으로 동일한 PMT 전압을 사용하여 연속적으로 사용할 때 유사한 결과를 생성하지만 보장 할 수는 없습니다.- 캐리어-셀 실험을 설계합니다. 단계 2.1에서 결정된 담체 농도를 사용하여 원하는 용량의 담체를 투여한다.
- 관련 채널에서 최적의 PMT 전압 설정을 결정하여 최종 캐리어 셀 실험을 위한 유세포분석기를 설정합니다. 캐리어 탐지를 허용하도록 임계값을 설정합니다.
- 캐리어를 현탁액으로 실행하여 현재 PMT 설정에서 캐리어당 형광 강도를 결정합니다.
- 필요한 경우 세포분석기 임계값을 변경하여 운반체가 아닌 세포를 검출합니다.
- 음성 대조군 샘플을 실행하여 담체와 함께 인큐베이션되지 않은 세포-세포의 배경 형광(autofluorescence)을 결정하였다.
- 캐리어-세포 샘플을 실행하여 세포당 형광 강도를 결정합니다. 이 형광은 세포자가 형광과 형광 운반체의 존재의 선형 조합입니다.
- 다음 식 (2)를 사용하여 셀당 캐리어 수를 계산합니다.
(2)
여기서, Passoc은 세포 당 연관된 운반체의 수이고, FI 세포는 운반체와 함께 배양된 세포의 MFI이고, FI 배경은 운반체와 함께 배양되지 않은 세포의 MFI이고, FI 운반체는 현탁액 중의 운반체의 MFI이다.
(1)
(2)3. 대량 스트림
- 캐리어 카운팅: 나노입자 추적 분석
참고: 벌크 스트림에서 캐리어 카운팅은 캐리어당 절대 형광 강도를 정량화하는 데 필요한 단계입니다(3.1.4단계 참조). 또한, 현탁액에서 담체를 계수하면 각 세포 실험에서 배양된 담체의 수를 정확하고 재현 가능하게 결정할 수 있습니다.- 준비
- 플로우 셀을 레이저 모듈에 장착하고 전체 레이저 모듈을 기기 내부의 제자리에 고정합니다.
- 천천히(0.1mL/s 이하) ~1mL의 증류수로 플로우 셀을 세척합니다. 플로우 셀 내에 기포가 형성되면 계속하기 전에 현탁액을 부분적으로 수축시켜 기포를 공기-액체 인터페이스와 병합합니다.
- 플러싱의 중간쯤에 카메라를 시작합니다. 캐리어 파편이 씻겨 나갔는지 확인하십시오. 캡처를 선택하여 캡처 설정 탭을 열고 카메라 시작을 클릭합니다.
- 1mL의 공기로 시스템을 건조시킵니다. 화면에 정전기 캐리어가 보이면 제조업체의 지침에 따라 플로우 셀을 청소하십시오.
- 관련된 캐리어 시스템에 따라 캐리어가 와류 또는 초음파 처리를 통해 잘 매달려 있는지 확인하여 나노 입자 추적 분석을 위해 캐리어를 준비하십시오. 스톡 농도의 크기를 알 수 없는 경우 스톡에서 1:100 희석을 준비하고 초기 결과를 피드백으로 사용하여 향후 샘플 희석을 알립니다. 담체를 인산염 완충 식염수(PBS)가 아닌 물에 희석하여 담체 농도가 1 × 107 담체/mL와 1 × 109 담체/mL 사이인 각 시료의 최소 ~0.6-1mL를 준비합니다.
알림: 흐린 서스펜션은 일반적으로 너무 집중되어 있습니다. 버퍼와 염분은 높은 배경 소음을 생성할 수 있습니다.
- 측량
- 레이저 모듈을 꺼내 똑바로 세우십시오.
- 첫 번째 캐리어 샘플을 1mL 주사기에 넣습니다. 주사기를 튜브 입구에 부착하고 샘플을 플로우 셀에 조심스럽게 로드합니다. 플로우 셀 내에 기포가 형성되면 계속하기 전에 현탁액을 부분적으로 수축시켜 기포를 공기-액체 인터페이스와 병합합니다. 전체 플로우 셀이 액체로 채워져 있는지 확인한 다음 일시 중지하십시오.
- 개별 캐리어를 시각화하기 위해 필요한 경우 카메라 초점을 조정합니다. 악기의 오른쪽에 있는 회전 노브로 초점을 거칠게 조정합니다. 하드웨어 탭을 선택하여 더 세밀하게 조정 | 펌프/스테이지. 초점 슬라이더를 조정하여 초점을 변경합니다.
- 과포화가 없도록 카메라 레벨을 조정합니다. Capture 탭에서 슬라이더를 조정하여 최적의 카메라 레벨을 선택합니다.
- 기기에 이 액세서리가 장착된 경우 캐리어 샘플이 포함된 주사기를 주사기 펌프 에 로드하여 측정 중에 지속적인 샘플 흐름을 보장합니다.
- SOP 탭에서 표준 측정을 선택하여 각각 30초씩 5회 캡처합니다. Base 파일 이름을 입력하고 원하는 경우 [고급] 버튼을 클릭하여 샘플 정보를 추가합니다(다양한 선택 항목이 있는 모달 대화상자가 열림).
알림: 희석 계수를 입력하면 최종 캐리어 농도 측정이 소프트웨어에 의해 자동으로 조정됩니다. 이 요소를 입력하는 것이 좋습니다. 대신 수동으로 조정을 수행하여 분석을 용이하게 하고 각 희석이 기기의 동적 범위 내에 있는지 여부를 평가할 수 있습니다(3.1.3.4단계). - 스크립트 만들기 및 실행을 누르고 샘플을 진행하라는 팝업이 나타날 때까지 기다립니다.
- 실린지 펌프를 사용하는 경우 하드웨어 탭 | 주사기 펌프 탭 | 주입 속도를 30-80으로 설정하고 주입을 누릅니다. 주사기 펌프를 사용하지 않는 경우 샘플을 수동으로 진행하십시오.
- 팝업 창에서 확인을 선택하여 캡처를 시작합니다. 5개의 캡처 후 샘플을 미리 진행하십시오 팝업이 다시 나타나면 샘플이 수동으로 또는 주사기 펌프를 통해 플로우 셀을 통해 여전히 움직이고 있는지 확인합니다. 그런 다음 확인을 선택하여 다음 캡처를 진행합니다.
알림: 5번의 캡처 후 소프트웨어가 자동으로 프로세스 탭을 열고 프로세스 설정을 조정하라는 팝업을 엽니다.
- 분석
- 프로세스 탭에서 감지 임계값 슬라이더(4에서 8 사이)를 조정하여 화면에 표시되는 개별 캐리어를 올바르게 식별합니다. 시각화를 돕기 위해 화면 게인도 조정하십시오. 다운스트림 분석에는 영향을 미치지 않습니다. 캡처 화면 아래의 슬라이더를 사용하여 비디오의 여러 프레임을 스크롤하여 감지 임계값 설정을 지원합니다.
알림: 검출 임계값은 한 번 설정해야 하며, 이후에는 측정값 또는 샘플 간에 변경해서는 안 됩니다. - 팝업(3.1.2.9단계 이후의 참고)에서 확인을 눌러 추적 분석을 시작합니다. 분석 탭을 클릭하여 분석 진행률을 모니터링합니다. 단일 분석 탭.
- 분석이 완료되면 내보내기 설정 프롬프트가 나타나는지 확인하고, 여기서 PDF 포함 및 실험 요약 포함이 기본적으로 선택되어 있어야 합니다. 원하는 대로 다른 내보내기 형식을 선택합니다.
- PDF 데이터 내보내기의 결과 섹션에서 측정된 농도를 신뢰할 수 있는지 확인하기 위해 측정된 담체 농도가 기기의 동적 범위인 1 × 107 캐리어/mL와 1 ×10 9 캐리어/mL 사이인지 확인하고 농도 측정 결과 아래에 오류 메시지 또는 주의 메시지가 있는지 확인합니다.
- 3.1.2.1-3.1.3.4단계를 두 번 이상 반복하여 재고에서 다른 희석액을 사용합니다. 각 샘플의 농도가 기기의 선형 범위 내에 있는지 확인하십시오.
- 선형 추세를 나타내는 3개 이상의 샘플을 선택, 즉 2배 샘플 희석은 측정된 담체 농도에서 상응하는 2배 감소를 초래해야 합니다. 선택한 샘플과 해당 희석 계수를 사용하여 재고 운반체 농도를 계산합니다.
- 프로세스 탭에서 감지 임계값 슬라이더(4에서 8 사이)를 조정하여 화면에 표시되는 개별 캐리어를 올바르게 식별합니다. 시각화를 돕기 위해 화면 게인도 조정하십시오. 다운스트림 분석에는 영향을 미치지 않습니다. 캡처 화면 아래의 슬라이더를 사용하여 비디오의 여러 프레임을 스크롤하여 감지 임계값 설정을 지원합니다.
- 캐리어당 절대 형광 강도의 결정
참고: 이 스트림에서 개별 캐리어의 형광을 직접 특성화할 수 없기 때문에 형광 강도는 대량으로 정량화됩니다. 이 방법은 형광 강도가 Lambert-Beer 법칙에 따라 형광 농도와 선형적으로 관련되어 있다는 사실에 의존합니다. 현탁액 중의 담체의 이러한 벌크 정량화가 공지된 담체 농도의 현탁액 상에서 수행될 때(단계 3.1 참조), 담체 당 형광이 유도될 수 있다. 이 단계는 형광 플레이트 판독기 또는 분광 형광계에서 수행 할 수 있습니다. 형광 강도는 MESF의 수로 주어진 알려진 절대 형광을 가진 샘플의 표준 곡선과 비교됩니다.- 담체에 라벨을 붙이기 위해 유리 플루오로크롬 용액을 사용하십시오: 염료를 적절한 완충액(예를 들어, DMSO)에 재현탁시키고 담체 희석제와 동일한 완충액에서 추가 희석을 수행합니다. 대안적으로, 형광 색소에 접합된 항체의 용액을 사용한다. 방정식 (3)을 사용하여 농도 (mg / mL), 분자량 (mg / mole) 및 아보가드로 수에서 원액 (MESF / mL)을 계산하십시오. 캐리어 희석제에서 연속 희석을 수행하여 표준 곡선 샘플을 생성합니다.
(3)
참고: 형광 색소 접합 항체는 표지 정도, 즉 용액 내 형광 색소와 항체 사이의 몰비가 알려진 경우에만 사용하십시오. 초기에는 담체 샘플의 형광 강도가 아직 알려지지 않았기 때문에 넓은 범위의 표준 곡선을 생성합니다. 여기에서 필요한 범위를 포함하도록 범위를 좁힙니다. - 캐리어 샘플을 준비합니다.
참고: 가장 좋은 방법은 두 개 이상의 캐리어 희석을 테스트하여 측정값이 선형이고 표준 곡선 범위 내에 있는지 확인하는 것입니다. - 각 샘플의 동일한 부피, 즉 캐리어 및 표준 곡선 모두의 형광을 측정합니다.
- 표준 곡선을 생성하고 측정된 캐리어 샘플에 대해 MESF/mL 단위의 벌크 절대 형광 강도를 공제합니다.
- 벌크 형광(MESF/mL)을 방정식 4와 같이 운반체 농도(담체/mL)로 나누어 담체당 절대 형광 강도(MESF/운반체)를 계산합니다.
(4)
- 담체에 라벨을 붙이기 위해 유리 플루오로크롬 용액을 사용하십시오: 염료를 적절한 완충액(예를 들어, DMSO)에 재현탁시키고 담체 희석제와 동일한 완충액에서 추가 희석을 수행합니다. 대안적으로, 형광 색소에 접합된 항체의 용액을 사용한다. 방정식 (3)을 사용하여 농도 (mg / mL), 분자량 (mg / mole) 및 아보가드로 수에서 원액 (MESF / mL)을 계산하십시오. 캐리어 희석제에서 연속 희석을 수행하여 표준 곡선 샘플을 생성합니다.
- 세포 실험(운반체당 등가 형광 강도의 결정 포함)
참고: 이 단계에서는 유세포분석 정량 비드를 사용하여 MESF와 MFI 간의 관계에 대한 표준 곡선을 생성합니다. 이러한 정량 비드는 비드당 MESF의 수가 알려진 여러 비드 집단으로 구성되며, 이러한 개별 비드는 모든 세포분석기로 검출할 수 있습니다. 이상적으로, MESF 표준 곡선은 담체-세포 실험의 판독과 동시에 결정된다. 이는 개별 캐리어에 대해 계산된 MFI 값이 캐리어와 관련된 셀의 MFI와 직접 비교될 수 있도록 하기 위한 것이다. 실제로 세포 분석기는 일반적으로 동일한 PMT 전압을 사용하여 연속적으로 사용할 때 유사한 결과를 생성하지만 보장 할 수는 없습니다.- 캐리어-셀 실험을 설계합니다. 섹션 3.1.3에서 결정된 담체 농도를 사용하여 원하는 용량의 담체를 투여하십시오.
- 관련 채널에서 최적의 PMT 전압 설정을 결정하여 최종 캐리어 셀 실험을 위한 유세포분석기를 설정합니다.
- 음성 대조군 샘플, 즉 담체와 함께 배양되지 않은 세포를 실행하여 배경 형광을 결정합니다.
- 유동 세포분석 정량 비드를 준비하고 재현탁시킨다. 세포 샘플에 사용된 것과 동일한 완충액(예를 들어, PBS)을 사용한다. 비드 개체군이 별도로 제공되는 경우 함께 풀링합니다.
- 유동 세포분석 비드 샘플을 실행한다.
- 캐리어-세포 샘플을 실행하여 세포당 형광 강도를 결정합니다.
- 정량 비드 샘플을 사용하여 절대 형광 강도(MESF)를 MFI로 변환하는 표준 곡선을 생성합니다. 이 표준 곡선과 3.1.4단계의 결과를 사용하여 캐리어의 이론적 MFI를 계산합니다. 방정식 (5)를 사용하여 셀당 캐리어 수를 계산하십시오.
(5)
여기서, Passoc은 세포 당 연관된 운반체의 수이고, FI 세포는 운반체와 함께 배양된 세포의 MFI이고, FI 배경은 운반체와 함께 배양되지 않은 세포의 MFI이고, FI 운반체는 현탁액 중의 운반체의 계산된 MFI이다(단계 3.1.4).
- 준비
(3)
(4)
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Representative Results
이전에 논의된 바와 같이, 상이한 약물 담체 유형은 세포-담체 결합의 절대 정량화를 위해 상이한 기술의 사용을 필요로 한다. 예를 들어, 633nm 디설파이드 안정화 폴리(메타크릴산)(PMASH) 코어쉘 입자는 민감한 유세포분석기를 사용하여 검출하기에 충분히 크고 밀도가 높습니다. 따라서 이러한 입자는 형광으로 표지 된 다음 측면 각도 광산란 (SALS, SSC와 유사)과 적절한 형광 채널을 사용하여 게이팅되고 계수되었습니다 (그림 3). 두 채널의 이벤트 수 차이는 1.98%로 허용 범위 내에 있었습니다.
대조적으로, 100nm 초상자성 산화철 나노입자는 너무 작아서 개별적으로 검출할 수 없으므로 Bulk Stream을 사용하여 분석했습니다. 이러한 나노 입자는 나노 입자 추적 분석을 사용하여 계수되고 특성화되었습니다 (그림 4). 136 nm의 평균 나노입자 크기는 물에서 나노입자의 유체역학적 직경을 반영한다. 측정된 나노입자 농도(수행된 희석에 대해 아직 보정되지 않음)는 기기의 동적 범위 내에 속하며, 이는 나노입자 농도의 성공적이고 정확한 결정을 시사합니다.
벌크 스트림에서 계속해서, 담체 현탁액의 절대 형광 강도는 최종 세포-담체 배양에 사용되는 유동 세포분석기 상에서 MFI 값으로 변환되어야 한다. 이 실험에서는 담체와 동일한 형광 염료로 표지된 정량 비드를 여러 날에 걸쳐 사용하여 유세포분석기에서 표준 곡선을 생성했습니다(그림 5). 측정된 MFI와 정량 비드의 MESF 값 사이의 상관관계는 선형이며 측정된 날짜 간에 대체로 유사합니다. 그러나 날짜 간의 약간의 차이가 관찰 될 수 있으므로 캐리어 세포 실험의 판독 값의 일부로 표준 곡선을 재생성하는 것이 좋습니다.
개별 캐리어의 MFI가 결정되면, 셀-캐리어 연관 데이터는 절대적으로 정량화되고 보다 정확하게 해석될 수 있다. 0h에서 24h 사이의 다양한 시점 동안 235nm PMASH 캡슐로 형광 표지된 HeLa 세포를 배양하는 것과 같은 시간 과정 실험을 수행하는 것이 좋습니다(그림 6). 예상대로 중앙 세포 형광은 시간이 지남에 따라 증가하여 캡슐이 HeLa 세포와 결합하고 있음을 나타냅니다. 이러한 실험은 다양한 시점에서 상대적인 반송파 성능을 비교하는 데 사용할 수 있지만 이러한 결과는 절대적으로 정량적이지는 않습니다.
Cytometer Stream 또는 Bulk Stream을 통해 수행되는 절대 정량의 중요성은 두 캐리어 유형의 연관성을 비교할 때 명확 해집니다. 그림 7은 상대 정량 (그림 7A) 또는 절대 정량으로 분석 된 동일한 두 실험을 보여줍니다. 운반체에 대한 명백한 세포 반응의 차이는 수행 된 분석에 따라 뚜렷합니다. 상대 정량화를 사용할 때 캐리어를 직접 비교해서는 안 되며(그림 7A), 절대 정량화는 라벨링 강도와 무관하므로 더 비교할 수 있습니다(그림 7B).
그림 3: 유세포분석기(Cytometer Stream)를 사용한 입자 계수. 아포지 유세포분석기가 사용되었습니다. (A) 광학 채널(SALS)을 사용한 입자 계수로 이벤트 수가 200,659개입니다. (B) 캐리어의 형광 채널을 사용한 캐리어 카운팅으로 인해 이벤트 카운트가 204,636입니다. 두 경우 모두 arcsinh 변환과 게이팅이 적용되었습니다 (각각 6 및 4). 633nm 코어-쉘 입자의 원시 데이터에서 생성된 수치는 Faria et al.10에 처음 발표되었습니다. 약어 : SALS = 소각 광 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 나노입자 추적 분석(벌크 스트림)을 사용한 캐리어 계수. 100 nm 크기의 초상자성 산화철 나노입자를 특성화하고 나노입자 추적 분석을 사용하여 계수하였다. 왼쪽, 5번의 반복 측정의 개별 결과에 대한 농도/크기 히스토그램. 오른쪽, 평균 농도/크기 분포 ± 5번의 반복실험의 SEM. 이 특정 샘플에서, 장비의 동적 범위 내의 농도를 얻기 위해 재고로부터 1:2,000 희석을 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 유세포분석기(벌크 스트림)에서 정량 비드를 사용하여 MESF를 MFI로 변환. 4개의 상이한 MESF 값을 갖는 형광 비드를 다양한 날에 유세포분석기 상에서 분석하고, 표준 곡선을 그렸다. 약어 : MESF = 동등한 가용성 형광 색소 분자; MFI = 중간 형광 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 유세포분석기-시간 과정 시리즈(세포분석기 스트림 및 벌크 스트림)에 대한 최종 세포 실험. 시간 경과 실험에서 얻은 유세포 분석 데이터의 대표 이미지. THP-1 세포를 0시간, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간 및 24시간(왼쪽에서 오른쪽으로) 동안 235nm 폴리머 캡슐과 함께 배양하였다. 캐리어 형광은 x축에 표시되고 광학 채널은 y축에 표시됩니다. 모든 경우에 아크신 변환이 수행되었습니다. 게이팅이 수행되지 않았습니다(그래프의 한계를 선택하는 것 제외). Faria et al.10의 원시 데이터에서 생성되었습니다. 약어 : SALS = 소각 광 산란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 캐리어-세포 결합의 상대적 대 절대 정량화(세포분석기 스트림 및 벌크 스트림). 두 그림 모두 Faria et al.10의 원시 데이터에서 생성된 RAW264.7 대식세포와 150nm(파란색) 또는 633nm 코어쉘 캐리어(주황색) 사이의 24시간 배양이라는 동일한 두 실험의 데이터를 시각화합니다. 두 기술 반복실험의 중위수가 플롯됩니다. (A) 상대적 정량화, a.u.에서 MFI로 보고됨 (B) 절대 정량화, 세포당 운반체의 수로 보고됨. 약어: MFI = 중간 형광 강도; a.u. = 임의의 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
약물 운반체와 세포 간의 상호 작용을 특성화하는 것은 새로운 약물 전달 시스템의 개발에서 점점 더 중요해지고 있습니다. 구체적으로, 다양한 캐리어 구축물의 합리적인 평가 및 비교를 허용하기 위해, 표적 및 비표적 세포와 상호작용하는 상기 캐리어의 성능의 절대적인 정량화가 중요하다. 이 프로토콜은 약물 운반체와 함께 작업하는 모든 연구자가 세포-운반체 결합에 대한 상대적 반정량적 유세포분석 데이터를 절대 정량적 결과로 변환할 수 있도록 하는 2-스트림 방법론을 설명합니다. 윤곽이 잡힌 공정은 모든 유형의 담체(소형, 대형, 유기물, 무기물)에 적용할 수 있으며 형광 라벨이 부착된 경우 적용할 수 있습니다. 그러나 다른 캐리어는 셀당 캐리어를 계산하기 위해 다른 접근 방식을 필요로합니다. 이는 필요한 특성화 측정에 사용되는 다양한 기기의 한계 때문입니다.
따라서 이 프로토콜은 세포분석기 스트림과 벌크 스트림의 두 스트림으로 나뉩니다. 첫 번째인 Cytometer Stream은 보다 간단한 접근 방식이며 유세포분석기만 필요하지만 이 세포분석기는 사용된 개별 운반체를 검출할 수 있을 만큼 충분히 민감해야 합니다. 벌크 스트림은 대체 계측기를 사용하여 개별 캐리어를 감지해야 할 필요성을 피할 수 있으므로 모든 캐리어 유형과 호환됩니다. 그러나 벌크 스트림은 더 많은 특성화 실험을 수행해야 합니다.
적절한 Stream(및 적절한 기술)을 선택하는 데 도움이 되도록 위의 고려 사항이 의사 결정 트리로 요약되었습니다(그림 1). 다시 말하지만, 벌크 스트림은 사용되는 캐리어 유형에 관계없이 모든 연구자에게 적합하므로 항상 백업으로 되돌릴 수 있습니다. 두 스트림의 워크플로는 그림 2에 요약되어 있습니다. 특히, 유세포분석기의 감도가 지속적으로 발전함에 따라 세포분석기 스트림을 더 많은 <300nm 캐리어에 사용할 수 있습니다.
이 절차에 대해 몇 가지 참고 사항을 작성해야합니다. 먼저, 세포 형광을 세포 당 절대 수의 담체로 전환시키기 위한 기술된 전략은 현탁액 중의 개별 담체 형광의 측정에 의존한다. 그러나, 형광은 플루오로크롬의 즉각적인 화학적 환경(예를 들어, 담체 희석제, 세포 표면, 또는 다양한 세포내 구획)에 의해 영향을 받는다. 특히, 엔도솜 구획의 산성 환경은 특정 주로 단백질계 염료(11)의 형광 강도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 따라서 연구된 담체 유형에 관계없이 약물 운반체의 라벨링에 pH에 민감하지 않고 광도가 높은 염료 범위를 사용하는 것이 좋습니다(권장 사항은 재료 표 참조). 이 염료 범위의 추가 이점은 일반적인 밝기로 약물 운반체 검출의 감도를 향상시킵니다.
둘째, 위에서 논의된 방법은 지침을 제공하기 위한 것이지만 정량 분석 워크플로우에서 다양한 단계를 수행하는 데 사용할 수 있는 독점적인 기술 목록을 형성하지는 않습니다. 특히, 더 작거나 낮은 산란 캐리어를 계산하기위한 다양한 기술이 존재합니다 (벌크 스트림의 캐리어처럼). 여기에는 동일한 나노입자 추적 분석(12)을 수행할 수 있는 다른 기기뿐만 아니라 다각도 동적 광산란, 질량 분광법, 전자 현미경(13), 중량 측정법 또는 광학 밀도 측정(Shang 및 Gao14에 의해 추가로 검토됨)과 같은 다른 방법이 모두 포함됩니다. 또한, 임의의 형광 단위에서 세포당 절대 운반체 수로 이동하는 이 실험적 정량화는 "정량적 생물학 워크플로우"라고 할 수 있는 것의 일부일 뿐입니다. 절대적인 실험적 정량화가 필요하지만 충분하지는 않습니다. 단순히 캐리어 연관성을 정량화하고 보고하는 것만으로는 배양 시간, 추가된 약물 캐리어의 용량 및 농도 또는 실험 용기당 사용된 세포 수와 같은 실험 설정으로 인한 입자 연관성의 차이를 설명하지 않습니다.
또한, 상이한 물리화학적 성질을 갖는 담체는 실험 셋업이 동일한 경우에도 세포에 전달되는 매우 상이한 투여량을 가질 수 있다(15). 캐리어 성능은 시험관 내에서도 이러한 모든 요소를 고려하지 않고는 결정할 수 없습니다. 즉, 단순히 운반체-세포 연관성을 정량화하는 것만으로는 일반적으로 연구자와 실험실 간의 운반체의 편견 없는 비교가 허용되지 않습니다. 이러한 관점에서, 특정 캐리어-셀 쌍10 사이의 친화도의 편향되지 않은 정량적 척도로서 운동 파라미터 (즉, 속도 상수)를 도출하기 위해 캐리어-셀 연관의 시간 과정 실험 및 후속 인실리코 수학적 모델링을 수행하는 것의 중요성에 대한 사전 논의가 있었다. 실험적 정량화는 또한 생물학적 이질성의 잠재적 공급원을 식별하거나(16) 복잡한 생물학적 모델(17)에서 침투 동역학을 결정하는 것과 같은 다른 인실리코 기술이 적용되기 위한 전제 조건이다. 표준화 된보고18에 대한 Bio-Nano 실험 문헌 지침의 최소 정보보고와 결합하여 캐리어 성능의 정량적 평가는 새로운 나노 의학의 개발을 가속화 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 호주 국립 보건 및 의학 연구위원회 (NHMRC; 프로그램 보조금 번호 GNT1149990), 호주 HIV 및 간염 바이러스 연구 센터 (ACH2) 및 Réjane Louise Langlois의 재산에서 선물. FC는 NHMRC(National Health and Medical Research Council) 수석 수석 연구 펠로우십(GNT1135806)의 상을 수상했습니다. 그림 1 과 그림 2 는 BioRender.com 사용하여 만들었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 647 C2 Maleimide | Invitrogen | A20347 | pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies |
| Apogee A50 Microflow | Apogee | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting | |
| CytoFLEX S Flow Cytometer | Beckman Coulter | Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments | |
| FCS Express | De Novo Software | Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python | |
| Infinite 200 PRO | Tecan Lifesciences | Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment | |
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis | |
| Prism 8 | GraphPad | Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others | |
| Quantum MESF kits Alexa Fluor 647 | Bangs Laboratories | 647 | Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard |
References
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