Quantificação Experimental de Interações entre Sistemas de Liberação de Medicamentos e Células In Vitro: Um Guia para Avaliação Pré-Clínica de Nanomedicina

Summary

Um fluxo de trabalho é demonstrado para a quantificação absoluta das interações fármaco-célula transportadora usando citometria de fluxo para permitir uma melhor avaliação racional de novos sistemas de liberação de medicamentos. Este fluxo de trabalho é aplicável a portadores de medicamentos de qualquer tipo.

Abstract

Um componente importante do projeto de sistemas de liberação de medicamentos diz respeito a como amplificar ou atenuar as interações com tipos específicos de células. Por exemplo, um quimioterápico pode ser funcionalizado com um anticorpo para melhorar a ligação às células cancerosas ("direcionamento") ou funcionalizado com polietilenoglicol para ajudar a evitar o reconhecimento de células imunes ("stealth"). Mesmo em um nível celular, otimizar a ligação e a absorção de um portador de medicamentos é um problema complexo de design biológico. Assim, é valioso separar o quão fortemente um novo transportador interage com uma célula da eficácia funcional da carga de uma transportadora uma vez entregue a essa célula.

Para continuar o exemplo quimioterápico, "quão bem ele se liga a uma célula cancerosa" é um problema separado de "quão bem ele mata uma célula cancerosa". Os ensaios quantitativos in vitro para estes últimos estão bem estabelecidos e geralmente dependem da medição da viabilidade. No entanto, a maioria das pesquisas publicadas sobre interações célula-portador é qualitativa ou semiquantitativa. Geralmente, essas medições dependem da marcação fluorescente do portador e, consequentemente, relatam interações com células em unidades relativas ou arbitrárias. No entanto, este trabalho pode ser padronizado e ser feito absolutamente quantitativo com um pequeno número de experimentos de caracterização. Essa quantificação absoluta é valiosa, pois facilita comparações racionais, inter e intraclasse de vários sistemas de liberação de drogas - nanopartículas, micropartículas, vírus, conjugados anticorpo-droga, células terapêuticas modificadas ou vesículas extracelulares.

Além disso, a quantificação é um pré-requisito para meta-análises subsequentes ou abordagens de modelagem in silico . Neste artigo, são apresentados guias em vídeo, bem como uma árvore de decisão sobre como alcançar a quantificação in vitro para sistemas de liberação de medicamentos transportadores, que levam em conta diferenças no tamanho do transportador e na modalidade de rotulagem. Além disso, outras considerações para a avaliação quantitativa de sistemas avançados de liberação de medicamentos são discutidas. Pretende-se que isso sirva como um recurso valioso para melhorar a avaliação racional e o design para a próxima geração de medicamentos.

Introduction

O design de construções de entrega de medicamentos que exibem um comportamento específico e projetado, dependendo do tipo de célula que encontram, atraiu um interesse substancial da pesquisa. Potenciais construções de liberação de medicamentos ou "transportadores" incluem formulações lipídicas, inorgânicos nano-cultivados, conjuntos poliméricos, vesículas extracelulares, células bacterianas funcionalizadas ou vírus modificados. Todos estes podem apresentar especificidade de órgãos, tecidos ou células devido a propriedades físicas, propriedades de superfície ou funcionalizações químicas modificadas, como a fixação de anticorpos ^1,2.

Um passo quase onipresente na avaliação do transportador in vitro é incubar células com uma suspensão contendo o referido transportador carregado de drogas. Após a incubação, o desempenho do transportador é medido por meio de uma leitura funcional do desempenho da carga do medicamento, por exemplo, eficiência ou toxicidade da transfecção. As leituras funcionais são úteis, pois são uma medida a jusante da eficácia da transportadora. No entanto, para construções de liberação de medicamentos mais complexas, é cada vez mais importante ir além das leituras funcionais e quantificar separadamente o grau de interação do transportador com a célula de interesse. Existem algumas razões para isso.

Primeiro, há um interesse crescente em descobrir (e melhorar iterativamente) tecnologias de transportadoras de "plataforma", que podem transportar uma variedade de cargas. Por exemplo, nanopartículas lipídicas (LNPs) projetadas para encapsular RNA podem trocar uma sequência de RNA por outra com poucas ressalvas³. Assim, para melhorar iterativamente a tecnologia da transportadora, é fundamental quantificar seu desempenho independentemente da funcionalidade da carga. Em segundo lugar, as leituras funcionais podem não ser simples para a carga de interesse, comprometendo a capacidade de iterar e avaliar rapidamente as formulações da transportadora. Embora se possa realizar a otimização in vitro usando uma carga modelo com uma leitura funcional direta (por exemplo, fluorescência), a alteração da carga pode alterar a resposta biológica a um transportador⁴ e, portanto, não produzir resultados representativos. Em terceiro lugar, muitos portadores são projetados para interagir e ser absorvidos por um tipo específico de célula. Essa capacidade de segmentação de um transportador pode e deve ser diferenciada do desempenho da sua segmentação terapêutica de postos de carga. Para continuar o exemplo do LNP, uma carga de RNA pode ser extremamente potente, mas se o LNP for incapaz de se ligar à célula, ser internalizado e liberar o RNA, nenhum efeito funcional a jusante será observado. Isso pode ser um problema particularmente para portadores destinados a atingir tipos de células difíceis de transfectar, como as células T⁵. Por outro lado, um LNP poderia atingir de forma extremamente eficaz, mas a carga de RNA pode não funcionar. Um ensaio a jusante que mede apenas a funcionalidade da carga não será capaz de diferenciar entre essas duas situações, complicando assim o desenvolvimento e a otimização dos sistemas de entrega de medicamentos transportadores.

Neste trabalho, discute-se como quantificar absolutamente a associação de operadores. Associação é um termo que se refere ao grau de interação medido experimentalmente entre um portador e uma célula. A associação não diferencia entre ligação à membrana e internalização – um transportador pode estar associado porque está ligado à superfície celular ou porque a célula o internalizou. A associação é comumente medida como parte de experimentos de incubação de portadores de células. Historicamente, a associação tem sido relatada em unidades fluorescentes arbitrárias (tipicamente "intensidade de fluorescência mediana" ou MFI) ou como "associação percentual", métricas cujas limitações foram discutidas anteriormente⁶. Em suma, essas medições não são comparáveis entre experimentos, laboratórios e portadores de medicamentos devido a diferenças nos protocolos experimentais, configurações de citômetros de fluxo e intensidades de marcação de diferentes portadores. Esforços têm sido feitos para superar o primeiro calibrando o citômetro, convertendo assim a medida relativa da IFM em uma medida absolutamente quantitativa de fluorescência⁷. No entanto, esse método não leva em conta a variabilidade na intensidade de marcação de vários portadores e, portanto, não permite a comparação racional de vários desempenhos de portadores em uma célula-alvo de escolha⁸.

Aqui, como converter praticamente de unidades fluorescentes arbitrárias relativas para a métrica quantitativa absoluta do "número de portadores por célula" é demonstrado pela realização de um pequeno número de experimentos de caracterização adicionais. Se outra métrica de concentração de transportador for desejada (por exemplo, massa de transportador por célula ou volume de transportador por célula), é simples converter de portadores por célula, desde que a caracterização do transportador tenha sido feita. Para brevidade e para evitar jargões, a palavra "portador" é usada neste trabalho para se referir à vasta variedade de construções de entrega de drogas. Essas técnicas de quantificação são igualmente aplicáveis, sejam aplicadas a uma partícula de ouro nano-modificada ou a uma bactéria de bioengenharia.

Alguns fatos permitem a conversão de unidades fluorescentes arbitrárias em portadores por célula. Primeiro, a intensidade de fluorescência medida é proporcional à concentração de um fluoróforo⁹ (ou um transportador marcado fluorescentemente), assumindo que a fluorescência está dentro dos limites de detecção do instrumento e as configurações de instrumentação são as mesmas. Assim, se a fluorescência de um transportador e a fluorescência de uma amostra são conhecidas, pode-se determinar quantos portadores estão presentes nessa amostra se todas as medições foram realizadas sob as mesmas configurações e condições. No entanto, especialmente para portadores menores, pode não ser possível medir a fluorescência do portador, a autofluorescência celular e a fluorescência associada à célula com portadores no mesmo instrumento com as mesmas configurações. Neste caso, há um segundo requisito para tornar possível a conversão entre a fluorescência medida em um instrumento e a fluorescência medida em outro. Para tanto, uma curva padrão de concentração de fluoróforo pode ser estabelecida para medir a intensidade de fluorescência em ambos os instrumentos, aproveitando^{o padrão 9} de Moléculas de Fluorocromo Solúvel Equivalente (MESF). Isso permite a medição da fluorescência do transportador em massa em um não-citômetro, uma medição que pode ser feita em portadores de qualquer tamanho ou característica. Quando essa quantificação a granel é feita numa suspensão transportadora de concentração conhecida, o número de transportadores por célula de uma amostra pode, uma vez mais, ser calculado.

Embora este trabalho demonstre o processo de medição da associação do transportador (determinado pela intensidade de fluorescência medida), um protocolo análogo poderia ser realizado para outras medidas de interação célula-portador (por exemplo, um protocolo experimental que diferencia portadores internalizados e ligados à membrana). Além disso, este protocolo seria em grande parte o mesmo se a associação fosse medida através de um ensaio não fluorescente (por exemplo, através de citometria de massa).

Protocol

1. Escolhendo o fluxo apropriado

1. Siga a árvore de decisão descrita na Figura 1 para determinar o melhor fluxo de trabalho (fluxo) (Figura 2) para a configuração experimental usada. Consulte a discussão para mais comentários sobre essa escolha de fluxo.
2. Se seguir o fluxo do citômetro, continue com as etapas 2.1.1-2.2.7. Se estiver seguindo o Bulk Stream, continue com as etapas 3.1.1.1-3.1.5.7.

Figura 1: Árvore de decisão do fluxo de trabalho. A decisão sobre qual Stream usar depende principalmente do tipo de interesse da operadora. Portadores maiores e portadores com altas propriedades de dispersão podem ser mais facilmente detectados individualmente em citômetros, tornando-os adequados para quantificação usando o Cytometer Stream. O Bulk Stream é adequado para todos os outros tipos de transportadoras. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visão geral dos fluxos de trabalho. Este protocolo é dividido em dois fluxos diferentes. O Cytometer Stream usa um citômetro sensível para contar os portadores em suspensão, medir sua fluorescência individual e, em seguida, determinar a fluorescência das células incubadas com portadores. O Bulk Stream usa técnicas não baseadas em citometria, como a Análise de Rastreamento de Nanopartículas, para contar os portadores em suspensão. A fluorescência do transportador individual é então quantificada usando um leitor de microplacas ou espectrofluorômetro. O uso do citômetro de fluxo restringe-se, portanto, à mensuração da fluorescência final de células incubadas com portadores, medida que pode ser feita em uma faixa mais ampla de citômetros e que independe do tipo de transportador utilizado. Abreviaturas: MESF = Moléculas de Fluorocromo Solúvel Equivalente; IFM = intensidade mediana da fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. O fluxo do citômetro

1. Contagem de transportadoras
   NOTA: Qualquer citômetro de fluxo pode ser usado para esta medição, desde que a taxa de fluxo (μL/s) seja conhecida. Se a vazão for desconhecida e não puder ser determinada, não prossiga com esta etapa. Em vez disso, prossiga com a etapa 3.1. A contagem dos portadores em suspensão permite a determinação precisa e reprodutível do número de portadores incubados em cada experimento celular.
   1. Configure o citômetro para detectar portadores, tanto por um canal de espalhamento óptico (normalmente dispersão lateral [SSC]) quanto por fluorescência. Certifique-se de ajustar o limite para permitir a detecção das portadoras.
      NOTA: A iteração através de diferentes canais de dispersão óptica pode ser necessária se o SSC não fornecer um sinal claro (por exemplo, dispersão direta [FSC]).
   2. Execute uma amostra somente de diluente para quantificar a contagem de eventos em segundo plano no SSC e nos canais fluorescentes.
      NOTA: As contagens de eventos em segundo plano ideais são <100 eventos/s.
   3. Prepare os transportadores para a citometria de fluxo.
      1. Certifique-se de que os portadores estejam bem suspensos por vórtice ou sonicação, dependendo do sistema de transporte envolvido.
      2. Se possível, certifique-se de que a concentração do transportador esteja entre 1.000 portadores/μL e 10.000 portadores/μL. Uma contagem de eventos de uma a duas ordens de magnitude maior do que o plano de fundo é um bom começo. Se a ordem de grandeza da concentração do transportador for desconhecida, um bom começo é preparar uma diluição de 1:1.000 do estoque. Use os resultados iniciais como feedback para informar futuras diluições de amostras.
         NOTA: Uma suspensão turva é geralmente muito concentrada.
   4. Carregue a primeira amostra transportadora no citômetro e inicie o registro.
   5. Comparar contagens de eventos resultantes do SSC e dos canais de fluorescência; estes devem ser aproximadamente iguais (diferença de <10%). Caso contrário, verifique as configurações do citômetro, por exemplo, as configurações do tubo fotomultiplicador (PMT) e a intensidade do laser para o canal fluorescente. Alternativamente, use outros métodos, como a microscopia confocal, para validar que a marcação fluorescente dos portadores está presente e uniforme.
   6. Repita os passos 2.1.3-2.1.5 duas ou mais vezes adicionais com diluições diferentes do reserva. Certifique-se de que a contagem de eventos em cada amostra seja pelo menos uma ordem de magnitude maior do que a contagem de eventos em segundo plano.
   7. Verifique se três ou mais amostras apresentam uma tendência linear, ou seja, uma diluição de amostra de duas vezes deve resultar numa redução correspondente de duas vezes na concentração do transportador medida.
   8. Utilizar as amostras dentro da gama linear, os factores de diluição correspondentes e o caudal do citómetro conhecido para calcular a concentração do transportador de reserva de acordo com a equação (1):
      (1)
      onde C é a concentração do transportador de estoque nos transportadores/mL. Recomenda-se usar a contagem de eventos derivada da detecção de espalhamento óptico em vez de fluorescência.
2. Leitura da citometria de fluxo do experimento de células portadoras, incluindo a determinação da intensidade de fluorescência por transportadora
   NOTA: Idealmente, a intensidade fluorescente por portadora será determinada o mais próximo possível do experimento de célula portadora. Isto destina-se a garantir que as IFM obtidas para portadores individuais possam ser directamente comparadas com as IFM de células associadas aos portadores. Na prática, um citômetro geralmente gera resultados semelhantes quando usado em dias consecutivos usando as mesmas tensões PMT, mas isso não pode ser garantido.
   1. Projete o experimento de célula portadora. Utilizar a concentração do transportador determinada no passo 2.1 para administrar a dose desejada dos transportadores.
   2. Configure o citômetro de fluxo para o experimento final da célula portadora determinando as configurações ideais de tensão PMT nos canais relevantes. Defina os limites para permitir a detecção da operadora.
   3. Execute os portadores em suspensão para determinar a intensidade de fluorescência por transportadora sob as configurações atuais de PMT.
   4. Se necessário, altere os limiares do citômetro para detectar as células e não os portadores.
   5. Execute uma amostra de controle negativo - células não incubadas com portadores - para determinar a fluorescência de fundo (autofluorescência) das células.
   6. Execute as amostras de células portadoras para determinar a intensidade de fluorescência por célula. Esta fluorescência é uma combinação linear de autofluorescência celular e a presença de portadores fluorescentes.
   7. Calcule o número de portadores por célula usando a seguinte equação (2):
      (2)
      onde P_assoc é o número de portadores associados por célula, _célula FI é o MFI de células incubadas com portadores, fundo FI é o MFI de células não incubadas com portadores e FI_carrier é o MFI de portadores em suspensão.

3. O fluxo em massa

1. Contagem de portadores: análise de rastreamento de nanopartículas
   NOTA: No Bulk Stream, a contagem da transportadora é uma etapa necessária para quantificar a intensidade absoluta de fluorescência por transportadora (ver etapa 3.1.4). Além disso, a contagem dos portadores em suspensão permite a determinação precisa e reprodutível do número de portadores incubados em cada experimento celular.
   1. Preparação
      1. Monte a célula de fluxo no módulo laser e trave todo o módulo laser no lugar dentro do instrumento.
      2. Lentamente (não mais rápido que 0,1 mL/s) lave a célula de fluxo com ~1 mL de água destilada. Se as bolhas se formarem dentro da célula de fluxo, retraia a suspensão parcialmente para fundir a bolha com a interface ar-líquido antes de prosseguir.
      3. Inicie a câmera mais ou menos na metade do caminho através da lavagem; Certifique-se de confirmar que os detritos da transportadora estão lavados. Selecione Capturar para abrir a guia Configurações de captura e clique em Iniciar câmera.
      4. Seque o sistema com 1 mL de ar. Se algum portador estático estiver visível na tela, limpe a célula de fluxo de acordo com as instruções do fabricante.
      5. Prepare os portadores para a Análise de Rastreamento de Nanopartículas, garantindo que os portadores estejam bem suspensos via vórtice ou sonicação, dependendo do sistema de suporte envolvido. Se a ordem de grandeza da concentração da unidade populacional for desconhecida, preparar uma diluição de 1:100 a partir da unidade populacional e utilizar os resultados iniciais como feedback para informar futuras diluições de amostras. Diluir os transportadores em água e não em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para preparar pelo menos ~0,6-1 mL de cada amostra com uma concentração de transportador entre 1 × 10⁷ carreadores/mL e 1 × 10⁹ carreadores/mL.
         NOTA: Uma suspensão turva é geralmente muito concentrada. Buffers e sais podem gerar alto ruído de fundo.
   2. Medição
      1. Retire o módulo laser e coloque-o na posição vertical.
      2. Elaborar a primeira amostra transportadora numa seringa de 1 ml. Ligue a seringa à entrada do tubo e carregue cuidadosamente a amostra na célula de fluxo. Se as bolhas se formarem dentro da célula de fluxo, retraia a suspensão parcialmente para fundir a bolha com a interface ar-líquido antes de prosseguir. Certifique-se de que toda a célula de fluxo esteja cheia de líquido e, em seguida, pause.
      3. Ajuste o foco da câmera, se necessário, para visualizar suportes individuais. Faça ajustes grosseiros de foco com o botão giratório no lado direito do instrumento. Faça ajustes mais precisos selecionando a guia Hardware | Bombas/Palco. Altere o foco ajustando o controle deslizante Foco .
      4. Ajuste o nível da câmera para garantir que não haja saturação excessiva. Na guia Capturar , selecione o Nível da câmera ideal ajustando o controle deslizante.
      5. Se o instrumento estiver equipado com este acessório, carregue a seringa que contém a amostra transportadora na bomba de seringa para garantir o fluxo contínuo da amostra durante as medições.
      6. Na guia POP , selecione Medição padrão para fazer cinco capturas de 30 s cada. Insira o nome do arquivo base e, se desejar, adicione informações de exemplo adicionais clicando no botão Avançado (que abre uma caixa de diálogo modal com uma variedade de opções).
         NOTA: Se um fator de diluição for inserido, a medição final da concentração do transportador será ajustada automaticamente pelo software. Inserir este fator é desaconselhado. Em vez disso, execute o ajuste manualmente, o que facilita a análise e permite avaliar se cada diluição se enquadra na faixa dinâmica do instrumento (etapa 3.1.3.4).
      7. Pressione Create and Run Script (Criar e Executar Script ) e aguarde a exibição de um pop-up solicitando o adiantamento da amostra.
      8. Se estiver a utilizar a Bomba de Seringa, selecione o separador Hardware | Guia Bomba de seringa | defina a Taxa de Infusão em 30-80 e pressione Infundir. Se não estiver a utilizar a bomba de seringa, avance manualmente a amostra.
      9. Na janela pop-up, selecione OK para iniciar a captura. Após cada uma das cinco capturas, quando o pop-up Avançar amostra reaparecer, verifique se a amostra ainda está se movendo através da célula de fluxo, manualmente ou através da bomba de seringa. Em seguida, selecione OK para prosseguir com a próxima captura.
         NOTA: Após cinco capturas, o software abre automaticamente a guia Processo e abre um pop-up pedindo para ajustar as configurações do processo.
   3. Análise
      1. Na guia Processo , ajuste o controle deslizante Limiar de Detecção (entre 4 e 8) para identificar corretamente portadores distintos visíveis na tela. Ajuste o Ganho de Tela também para ajudar na visualização; não afectará a análise a jusante. Use o controle deslizante sob a tela de captura para percorrer vários quadros do vídeo para ajudar na configuração de limite de detecção.
         NOTA: O limiar de detecção deve ser definido uma vez e, posteriormente, não deve ser alterado entre medições ou amostras.
      2. No pop-up (observação após a etapa 3.1.2.9), pressione OK para iniciar a análise de rastreamento. Monitore o progresso da análise clicando na guia Análise | Guia Análise única .
      3. Quando a análise estiver concluída, procure um prompt de Configurações de exportação para aparecer, no qual Incluir PDF e Incluir resumo do experimento devem ser selecionados por padrão. Selecione quaisquer outros formatos de exportação conforme desejado.
      4. Na seção Resultados da exportação de dados em PDF, para garantir que a concentração medida seja confiável, verifique se a concentração do transportador medida está entre 1 × 10⁷ portadores/mL e 1 × 10⁹ portadores/mL - a faixa dinâmica do instrumento - e verifique se há mensagens de erro ou mensagens de cautela abaixo do resultado da medição de concentração.
      5. Repetir os passos 3.1.2.1-3.1.3.4 duas ou mais vezes com diluições diferentes da existência. Certifique-se de que a concentração de cada amostra se enquadra na faixa linear do instrumento.
      6. Selecione três ou mais amostras que mostrem uma tendência linear, ou seja, uma diluição de amostra de duas vezes deve resultar em uma redução de duas vezes correspondente na concentração de transportador medida. Utilizar as amostras seleccionadas e os factores de diluição correspondentes para calcular a concentração do transportador de existências.
   4. Determinação da intensidade absoluta de fluorescência por transportadora
      NOTA: Uma vez que a fluorescência de portadores individuais neste fluxo não pode ser caracterizada diretamente, a intensidade de fluorescência é quantificada a granel. Este método baseia-se no fato de que a intensidade da fluorescência está linearmente relacionada à concentração de fluorocromo de acordo com a lei de Lambert-Beer. Quando essa quantificação a granel dos transportadores em suspensão é feita numa suspensão de concentração conhecida do transportador (ver etapa 3.1), a fluorescência por transportador pode ser obtida. Esta etapa pode ser feita em um leitor de placa de fluorescência ou em um espectrofluorômetro. A intensidade de fluorescência é comparada a uma curva padrão de amostras com fluorescência absoluta conhecida, dada em número de MESFs.
      1. Use uma solução do fluorocromo livre para rotular o transportador: ressuscite o corante no tampão apropriado (por exemplo, DMSO) e execute diluições adicionais no mesmo tampão que o diluente transportador. Alternativamente, use uma solução de um anticorpo conjugado ao fluorocromo. Calcular a concentração da solução-mãe (MESF/ml) a partir da concentração em mg/ml, do peso molecular em mg/mol e do número de Avogadro utilizando a equação (3). Efectuar uma diluição em série no diluente transportador para gerar amostras de curva padrão.
         (3)
         NOTA: Use um anticorpo conjugado com fluorocromo somente se o grau de marcação, ou seja, a relação molar entre o fluorocromo e o anticorpo na solução, for conhecido. Inicialmente, gere uma curva padrão com uma ampla gama, pois a intensidade de fluorescência da amostra portadora ainda é desconhecida. A partir daqui, restrinja-o para incluir o intervalo necessário.
      2. Prepare as amostras do portador.
         NOTA: A melhor prática é testar duas ou mais diluições de transportadores para validar que as medições são lineares e estão dentro do intervalo da curva padrão.
      3. Meça a fluorescência de volumes iguais de cada amostra, ou seja, curvas portadoras e padrão.
      4. Gerar uma curva padrão e deduzir a intensidade de fluorescência absoluta em massa em MESF/mL para as amostras transportadoras medidas.
      5. Calcular a intensidade absoluta de fluorescência por transportador (MESF/transportador) dividindo a fluorescência a granel (MESF/mL) pela concentração do transportador (transportadores/mL) como na equação (4):
         (4)
   5. Experimento celular (incluindo a determinação da intensidade de fluorescência equivalente por portador)
      NOTA: Nesta etapa, os grânulos de quantificação de citometria de fluxo são usados para gerar uma curva padrão da relação entre MESF e MFI. Essas contas de quantificação consistem em várias populações de contas com um número conhecido de MESF por conta, e essas contas individuais podem ser detectadas por qualquer citômetro. Idealmente, a curva padrão MESF é determinada ao mesmo tempo que a leitura dos experimentos de células portadoras. Isto destina-se a garantir que os valores de IFM calculados para portadores individuais possam ser diretamente comparados com os IFM de células associadas a portadores. Na prática, um citômetro geralmente gera resultados semelhantes quando usado em dias consecutivos usando as mesmas tensões PMT, mas isso não pode ser garantido.
      1. Projete o experimento de célula portadora. Utilizar a concentração do transportador determinada na secção 3.1.3 para administrar a dose desejada dos transportadores.
      2. Configure o citômetro de fluxo para o experimento final da célula portadora determinando as configurações ideais de tensão PMT nos canais relevantes.
      3. Execute uma amostra de controle negativo, ou seja, células não incubadas com portadores, para determinar a fluorescência de fundo.
      4. Prepare e ressuspenda as contas de quantificação da citometria de fluxo. Use o mesmo buffer usado para as amostras de células (por exemplo, PBS). Se as populações de contas forem fornecidas separadamente, agrupe-as.
      5. Execute a amostra de contas de quantificação por citometria de fluxo.
      6. Execute as amostras de células portadoras para determinar a intensidade de fluorescência por célula.
      7. Use a amostra de contas de quantificação para gerar uma curva padrão convertendo a intensidade absoluta de fluorescência (MESF) em MFI. Utilizar esta curva padrão e os resultados da etapa 3.1.4 para calcular a IFM teórica dos portadores. Calcule o número de portadores por célula usando a equação (5):
         (5)
         Em que P_assoc é o número de portadores associados por célula, _célula FI é o IFM de células incubadas com portadores, FI _fundo é o IFM de células não incubadas com portadores e _{FI portador} é o IFM calculado de portadores em suspensão (etapa 3.1.4).

Representative Results

Como discutido anteriormente, diferentes tipos de portadores de drogas requerem o uso de diferentes técnicas para a quantificação absoluta da associação célula-portador. Por exemplo, as partículas de núcleo-casca de poli(ácido metacrílico) estabilizadas com dissulfeto de 633 nm (PMA_SH) são grandes e densas o suficiente para detecção usando um citômetro de fluxo sensível. Dessa forma, essas partículas foram marcadas fluorescentemente, depois fechadas e contadas por meio de espalhamento de luz de ângulo lateral (SALS, análogo ao SSC), bem como o canal fluorescente apropriado (Figura 3). A diferença na contagem de eventos em ambos os canais foi de 1,98%, bem dentro da faixa aceitável.

Em contraste, as nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro de 100 nm são muito pequenas para serem detectadas individualmente e, portanto, foram analisadas usando o Bulk Stream. Essas nanopartículas foram contadas e caracterizadas por meio da Análise de Rastreamento de Nanopartículas (Figura 4). O tamanho médio das nanopartículas de 136 nm reflete o diâmetro hidrodinâmico da nanopartícula na água. A concentração de nanopartículas medida - ainda não corrigida para a diluição realizada - cai dentro da faixa dinâmica do instrumento, sugerindo uma determinação bem-sucedida e precisa da concentração de nanopartículas.

Continuando no Bulk Stream, a intensidade absoluta de fluorescência de uma suspensão transportadora deve ser convertida em um valor de IFM no citômetro de fluxo usado para a incubação final do portador de células. Neste experimento, esferas de quantificação marcadas com o mesmo corante fluorescente que o transportador foram utilizadas em vários dias para gerar curvas padrão em um citômetro de fluxo (Figura 5). A correlação entre a IFM medida e o valor MESF das contas de quantificação é linear e amplamente semelhante entre as datas medidas. No entanto, pequenas diferenças entre as datas podem ser observadas e, como tal, recomenda-se regenerar uma curva padrão como parte da leitura dos experimentos de células portadoras.

Uma vez determinada a IFM de portadores individuais, os dados de associação célula-portador podem ser absolutamente quantificados e interpretados com mais precisão. Recomenda-se a realização de experimentos de curso de tempo, por exemplo, incubação de células HeLa marcadas fluorescentemente com cápsulas de PMA_SH de 235 nm, para vários pontos de tempo entre 0 h e 24 h (Figura 6). Como esperado, a fluorescência celular mediana aumenta ao longo do tempo, indicando que as cápsulas estão se associando às células HeLa. Embora tais experimentos possam ser usados para comparar o desempenho relativo da transportadora em vários pontos de tempo, esses resultados não são absolutamente quantitativos.

A importância da quantificação absoluta, seja feita via Cytometer Stream ou Bulk Stream, fica clara quando se compara a associação de dois tipos de portadores. A Figura 7 mostra os mesmos dois experimentos, analisados por quantificação relativa (Figura 7A) ou quantificação absoluta. A diferença na resposta celular aparente aos portadores é gritante, dependendo da análise realizada; os portadores não devem ser comparados diretamente quando se utiliza a quantificação relativa (Figura 7A), enquanto a quantificação absoluta é independente da intensidade de marcação e, portanto, mais comparável (Figura 7B).

Figura 3: Contagem de partículas utilizando um citômetro de fluxo (Cytometer Stream). Utilizou-se citômetro de fluxo Apogee. (A) Contagem de partículas usando um canal óptico (SALS), resultando em uma contagem de eventos de 200.659. (B) Contagem da portadora usando o canal fluorescente da portadora, resultando em uma contagem de eventos de 204.636. Em ambos os casos, uma transformada de arcsinh seguida de gating foi aplicada (em 6 e 4, respectivamente). Figuras criadas a partir de dados brutos de partículas núcleo-casca de 633 nm publicadas pela primeira vez em Faria et ^al.10. Abreviação: SALS = dispersão de luz de pequeno ângulo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Contagem de portadores usando a Análise de Rastreamento de Nanopartículas (Bulk Stream). Nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro de 100 nm de tamanho foram caracterizadas e contadas usando a Análise de Rastreamento de Nanopartículas. Histograma de concentração/tamanho à esquerda dos resultados individuais de cinco medições replicadas. A distribuição média correta/de concentração/tamanho ± MEV de cinco repetições. Nesta amostra em particular, uma diluição de 1:2.000 do estoque foi realizada para obter uma concentração dentro da faixa dinâmica do instrumento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Convertendo MESF em MFI usando contas de quantificação em um citômetro de fluxo (Bulk Stream). Contas fluorescentes com quatro valores diferentes de MESF foram analisadas em um citômetro de fluxo em vários dias, e curvas padrão foram desenhadas. Abreviaturas: MESF = Moléculas de Fluorocromo Solúvel Equivalente; IFM = intensidade mediana da fluorescência. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Experimento celular final em séries de curso temporal do citômetro de fluxo (Cytometer Stream e Bulk Stream). Imagens representativas de dados de citometria de fluxo de um experimento de curso de tempo. As células THP-1 foram incubadas com cápsula polimérica de 235 nm por 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h e 24 h (da esquerda para a direita). A fluorescência da portadora é mostrada no eixo x, enquanto um canal óptico é mostrado no eixo y. Em todos os casos, uma transformada de arco foi realizada. Nenhum gating foi realizado (além da escolha dos limites do gráfico). Criado a partir de dados brutos em Faria et ^al.10. Abreviação: SALS = dispersão de luz de pequeno ângulo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Quantificação relativa versus absoluta da associação célula-portadora (Cytometer Stream e Bulk Stream). Ambas as figuras visualizam dados dos mesmos dois experimentos, uma incubação de 24 h entre macrófagos RAW264.7 e portadores de núcleo-concha de 150 nm (azul) ou 633 nm (laranja), criados a partir de dados brutos em Faria et ^al.10. As medianas de ambas as replicações técnicas são plotadas. (A) Quantificação relativa, relatada como IFM em u.a. (B) Quantificação absoluta, relatada como o número de portadores por célula. Abreviaturas: IFM = intensidade mediana da fluorescência; a.u. = unidades arbitrárias. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Caracterizar as interações entre portadores de drogas e células está se tornando cada vez mais importante no desenvolvimento de novos sistemas de liberação de medicamentos. Especificamente, para permitir a avaliação racional e a comparação de vários construtos de portadores, a quantificação absoluta do desempenho do referido portador para interagir com células-alvo e fora do alvo é fundamental. Este protocolo descreve uma metodologia de dois fluxos que permite a qualquer pesquisador que trabalhe com um portador de drogas converter dados de citometria de fluxo semiquantitativos relativos na associação célula-portador em resultados quantitativos absolutos. O processo descrito é aplicável a qualquer tipo de transportador – pequeno, grande, orgânico, inorgânico – desde que sejam rotulados fluorescentemente. No entanto, diferentes transportadoras requerem abordagens diferentes para calcular as transportadoras por célula. Isto é devido aos limites de várias instrumentações utilizadas para as medições de caracterização necessárias.

Como tal, este protocolo é dividido em dois fluxos: o fluxo de citômetro e o fluxo em massa. O primeiro, o Cytometer Stream, é a abordagem mais direta e requer apenas um citômetro de fluxo, mas esse citômetro precisa ser sensível o suficiente para detectar os portadores individuais usados, ou, em outras palavras, o portador do medicamento de interesse precisa ser grande e denso o suficiente para ser detectado. O Bulk Stream é compatível com qualquer tipo de transportador, pois a necessidade de detectar transportadores individuais é contornada através do uso de instrumentação alternativa. No entanto, o Bulk Stream requer que mais experimentos de caracterização sejam feitos.

Para ajudar na escolha do Stream apropriado (e, como tal, das tecnologias apropriadas), as considerações acima foram resumidas em uma árvore de decisão (Figura 1). Para reiterar, o Bulk Stream é adequado para todos os pesquisadores, independentemente do tipo de transportadora utilizada e, portanto, pode sempre ser revertido como um backup. Os fluxos de trabalho dos dois Streams são descritos na Figura 2. Notavelmente, com os avanços contínuos na sensibilidade dos citômetros de fluxo, é possível que o Cytometer Stream possa ser usado para portadores de mais de <300 nm.

Algumas observações devem ser feitas sobre este procedimento. Primeiro, a estratégia descrita para converter a fluorescência celular em um número absoluto de portadores por célula baseia-se na medição da fluorescência do portador individual em suspensão. No entanto, a fluorescência é influenciada pelo ambiente químico imediato do fluorocromo (por exemplo, o diluente transportador, a superfície celular ou vários compartimentos intracelulares). Em particular, sabe-se que o ambiente ácido do compartimento endossômico afeta a intensidade de fluorescência de certos corantes principalmente à base de proteínas¹¹. Como tal, independentemente do tipo de transportador estudado, recomenda-se o uso de faixas de corantes insensíveis ao pH e altamente fotoestáveis para a rotulagem de portadores de medicamentos (consulte a Tabela de Materiais para uma recomendação). O benefício adicional desta gama de corantes é o seu brilho geral, que aumenta a sensibilidade da detecção de portadores de drogas.

Em segundo lugar, os métodos discutidos acima destinam-se a fornecer orientação, mas de forma alguma formam uma lista exclusiva de técnicas que podem ser usadas para executar as várias etapas no fluxo de trabalho de quantificação. Em particular, existe uma variedade de técnicas para contar transportadores menores ou de baixa dispersão (como os do Bulk Stream). Estes incluem outros instrumentos capazes de realizar a mesma Análise de Rastreamento de Nanopartículas¹², bem como outros métodos, como espalhamento dinâmico de luz multi-ângulo, espectroscopia de massa, microscopia eletrônica¹³, gravimetria ou medições de densidade óptica (revisadas por Shang e Gao¹⁴). Além disso, essa quantificação experimental – passando de unidades de fluorescência arbitrárias para um número absoluto de portadores por célula – é apenas parte do que pode ser chamado de "fluxo de trabalho de biologia quantitativa". A quantificação experimental absoluta é necessária, mas não suficiente. A mera quantificação e o relato da associação de portadores não levam em conta as diferenças na associação de partículas devido à configuração experimental, como o tempo de incubação, a dose e a concentração do portador do medicamento adicionado ou o número de células usadas por recipiente experimental.

Além disso, portadores com diferentes propriedades físico-químicas podem ter dosagens muito diferentes entregues às células, mesmo quando a configuração experimental é idêntica¹⁵. O desempenho da transportadora – mesmo in vitro – não pode ser determinado sem levar em conta todos esses fatores. Em outras palavras, a mera quantificação da associação célula-portadora não permite, em geral, uma comparação imparcial de portadores entre pesquisadores e laboratórios. Sob essa luz, houve uma discussão prévia sobre a importância de realizar experimentos de curso temporal de associação célula-transportadora e subsequente modelagem matemática in silico para derivar parâmetros cinéticos (ou seja, constantes de taxa) como uma medida imparcial e quantitativa da afinidade entre um determinado par de células portadoras¹⁰. A quantificação experimental também é um pré-requisito para que outras técnicas in silico sejam aplicadas, como a identificação de fontes potenciais de heterogeneidade biológica¹⁶ ou a determinação da cinética de penetração em um modelo biológico complexo¹⁷. Combinada com as diretrizes do Minimum Information Reporting in Bio-Nano Experimental Literature para relatórios padronizados¹⁸, a avaliação quantitativa do desempenho do portador pode acelerar o desenvolvimento de novos nanomedicamentos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard