Cuantificación experimental de las interacciones entre los sistemas de administración de fármacos y las células in vitro: una guía para la evaluación preclínica de nanomedicina

Summary

Se demuestra un flujo de trabajo para la cuantificación absoluta de las interacciones fármaco-célula portadora utilizando citometría de flujo para permitir una mejor evaluación racional de nuevos sistemas de administración de fármacos. Este flujo de trabajo es aplicable a portadores de medicamentos de cualquier tipo.

Abstract

Un componente importante del diseño de sistemas de administración de fármacos se refiere a cómo amplificar o atenuar las interacciones con tipos específicos de células. Por ejemplo, un quimioterapéutico podría funcionalizarse con un anticuerpo para mejorar la unión a las células cancerosas ("dirigido") o funcionalizarse con polietilenglicol para ayudar a evadir el reconocimiento de células inmunes ("sigilo"). Incluso a nivel celular, optimizar la unión y la absorción de un portador de fármacos es un problema complejo de diseño biológico. Por lo tanto, es valioso separar la fuerza con la que un nuevo portador interactúa con una célula de la eficacia funcional de la carga de un transportista una vez entregada a esa célula.

Para continuar con el ejemplo quimioterapéutico, "qué tan bien se une a una célula cancerosa" es un problema separado de "qué tan bien mata una célula cancerosa". Los ensayos cuantitativos in vitro para estos últimos están bien establecidos y generalmente se basan en la medición de la viabilidad. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones publicadas sobre las interacciones célula-portador son cualitativas o semicuantitativas. En general, estas mediciones se basan en el etiquetado fluorescente del portador y, en consecuencia, informan interacciones con las células en unidades relativas o arbitrarias. Sin embargo, este trabajo puede estandarizarse y hacerse absolutamente cuantitativo con un pequeño número de experimentos de caracterización. Tal cuantificación absoluta es valiosa, ya que facilita las comparaciones racionales, inter e intraclase de varios sistemas de administración de fármacos: nanopartículas, micropartículas, virus, conjugados anticuerpo-fármaco, células terapéuticas diseñadas o vesículas extracelulares.

Además, la cuantificación es un requisito previo para los metanálisis posteriores o los enfoques de modelado in silico . En este artículo, se presentan videoguías, así como un árbol de decisión sobre cómo lograr la cuantificación in vitro para los sistemas de administración de medicamentos portadores, que tienen en cuenta las diferencias en el tamaño del portador y la modalidad de etiquetado. Además, se discuten otras consideraciones para la evaluación cuantitativa de los sistemas avanzados de administración de fármacos. Esto pretende servir como un recurso valioso para mejorar la evaluación racional y el diseño para la próxima generación de medicamentos.

Introduction

El diseño de construcciones de administración de fármacos que exhiben un comportamiento específico y diseñado dependiendo del tipo de célula que encuentren ha atraído un interés sustancial de la investigación. Las posibles construcciones o "portadores" de administración de fármacos incluyen formulaciones lipídicas, inorgánicos nanocultivados, ensamblajes poliméricos, vesículas extracelulares, células bacterianas funcionalizadas o virus modificados. Todos estos pueden exhibir especificidad de órganos, tejidos o células debido a propiedades físicas, propiedades de superficie o funcionalizaciones químicas diseñadas como la unión de anticuerpos ^1,2.

Un paso casi omnipresente en la evaluación in vitro de portadores es incubar células con una suspensión que contenga dicho portador cargado de fármaco. Después de la incubación, el rendimiento del transportista se mide a través de una lectura funcional del rendimiento de la carga de drogas, por ejemplo, la eficiencia de la transfección o la toxicidad. Las lecturas funcionales son útiles, ya que son una medida posterior de la efectividad del operador. Sin embargo, para construcciones de administración de fármacos más complejas, es cada vez más importante ir más allá de las lecturas funcionales y cuantificar por separado el grado de interacción del portador con la célula de interés. Hay algunas razones para esto.

En primer lugar, existe un creciente interés en descubrir (y mejorar iterativamente) tecnologías de transporte de "plataforma", que pueden transportar una variedad de carga. Por ejemplo, las nanopartículas lipídicas (LNP) diseñadas para encapsular ARN pueden intercambiar una secuencia de ARN por otra con pocas advertencias³. Por lo tanto, para mejorar iterativamente la tecnología del transportista, es fundamental cuantificar su rendimiento independientemente de la funcionalidad de la carga. En segundo lugar, las lecturas funcionales pueden no ser sencillas para la carga de interés, comprometiendo la capacidad de iterar y evaluar rápidamente las formulaciones de los portadores. Si bien se podría realizar una optimización in vitro utilizando una carga modelo con una lectura funcional directa (por ejemplo, fluorescencia), cambiar la carga puede cambiar la respuesta biológica a un transportista⁴ y, por lo tanto, puede no producir resultados representativos. En tercer lugar, muchos portadores están diseñados para interactuar y ser absorbidos por un tipo de célula específico. Esa capacidad de fijación de objetivos de un transportista puede y debe diferenciarse del rendimiento de su carga terapéutica posterior a la focalización. Para continuar con el ejemplo de LNP, una carga de ARN podría ser extremadamente potente, pero si la LNP no puede unirse a la célula, ser internalizada y liberar el ARN, no se observará ningún efecto funcional aguas abajo. Esto puede ser un problema particularmente para los portadores destinados a atacar tipos de células difíciles de transfectar, como las células T⁵. Por el contrario, un LNP podría apuntar de manera extremadamente efectiva, pero la carga de ARN podría no funcionar. Un ensayo posterior que solo mide la funcionalidad de la carga no podrá diferenciar entre estas dos situaciones, lo que complicará el desarrollo y la optimización de los sistemas de administración de medicamentos portadores.

En este trabajo, se discute cómo cuantificar absolutamente la asociación de portadores. Asociación es un término que se refiere al grado de interacción medido experimentalmente entre un portador y una célula. La asociación no diferencia entre la unión a la membrana y la internalización: un portador puede estar asociado porque está unido a la superficie celular o porque la célula lo ha internalizado. La asociación se mide comúnmente como parte de los experimentos de incubación de portadores celulares. Históricamente, la asociación ha sido reportada ya sea en unidades fluorescentes arbitrarias (típicamente "intensidad de fluorescencia mediana" o MFI) o como "asociación porcentual", métricas cuyas limitaciones han sido discutidas previamente⁶. En resumen, estas mediciones no son comparables entre experimentos, laboratorios y portadores de fármacos debido a las diferencias en los protocolos experimentales, la configuración del citómetro de flujo y las intensidades de etiquetado de diferentes portadores. Se han hecho esfuerzos para superar el primero calibrando el citómetro, convirtiendo así la medida relativa de MFI en una medida absolutamente cuantitativa de fluorescencia⁷. Sin embargo, este método no tiene en cuenta la variabilidad en la intensidad del etiquetado de varios portadores y, por lo tanto, no permite la comparación racional de varios rendimientos de portadores en una celda objetivo de elección⁸.

Aquí, cómo convertir prácticamente de unidades fluorescentes relativas y arbitrarias a la métrica cuantitativa absoluta del "número de portadores por célula" se demuestra realizando un pequeño número de experimentos de caracterización adicionales. Si se desea otra métrica de concentración de portador (por ejemplo, masa portadora por celda o volumen portador por celda), es fácil convertir de portadores por celda, siempre que se haya realizado la caracterización del portador. Para abreviar y evitar la jerga, la palabra "portador" se usa dentro de este trabajo para referirse a la amplia variedad de construcciones de administración de medicamentos. Estas técnicas de cuantificación son igualmente aplicables, ya sea que se apliquen a una partícula de oro de nanoingeniería o a una bacteria de bioingeniería.

Algunos hechos permiten la conversión de unidades fluorescentes arbitrarias a portadores por célula. Primero, la intensidad de fluorescencia medida es proporcional a la concentración de un fluoróforo⁹ (o un portador marcado con fluorescencia), suponiendo que la fluorescencia está dentro de los límites de detección del instrumento y los ajustes de instrumentación son los mismos. Por lo tanto, si se conocen la fluorescencia de un portador y la fluorescencia de una muestra, se puede determinar cuántos portadores están presentes en esa muestra si todas las mediciones se realizaron bajo los mismos ajustes y condiciones. Sin embargo, especialmente para portadores más pequeños, puede que no sea posible medir la fluorescencia del portador, la autofluorescencia celular y la fluorescencia asociada a la célula con portadores en el mismo instrumento con la misma configuración. En este caso, existe un segundo requisito para que sea posible convertir entre la fluorescencia medida en un instrumento y la fluorescencia medida en otro. Para ello, se puede establecer una curva estándar de concentración de fluoróforos para medir la intensidad de fluorescencia en ambos instrumentos, aprovechando^{el estándar 9} de Moléculas de fluorocromo soluble equivalente (MESF). Esto permite la medición de la fluorescencia del portador a granel en un no citómetro, una medición que se puede hacer en portadores de cualquier tamaño o característica. Cuando dicha cuantificación a granel se realiza en una suspensión portadora de concentración conocida, se puede calcular una vez más el número de portadores por celda de una muestra.

Si bien este trabajo demuestra el proceso para medir la asociación de portadores (según lo determinado por la intensidad de fluorescencia medida), se podría realizar un protocolo análogo para otras medidas de interacción célula-portador (por ejemplo, un protocolo experimental que diferencie los portadores internalizados y unidos a la membrana). Además, este protocolo sería en gran medida el mismo si la asociación se midiera a través de un ensayo no fluorescente (por ejemplo, a través de citometría de masas).

Protocol

1. Elegir la transmisión adecuada

1. Siga el árbol de decisión descrito en la Figura 1 para determinar el mejor flujo de trabajo (flujo) (Figura 2) para la configuración experimental utilizada. Consulte la discusión para obtener más comentarios sobre esta elección de corriente.
2. Si sigue el flujo del citómetro, continúe con los pasos 2.1.1-2.2.7. Si sigue la transmisión masiva, continúe con los pasos 3.1.1.1-3.1.5.7.

Figura 1: Árbol de decisión del flujo de trabajo. La decisión sobre qué Stream utilizar depende principalmente del tipo de interés del operador. Los portadores más grandes y los portadores con altas propiedades de dispersión se pueden detectar más fácilmente individualmente en los citómetros, lo que los hace adecuados para la cuantificación utilizando el flujo de citómetro. El Bulk Stream es adecuado para todos los demás tipos de transportistas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Información general sobre los flujos de trabajo. Este protocolo se divide en dos Streams diferentes. El Cytometer Stream utiliza un citómetro sensible para contar los portadores en suspensión, medir su fluorescencia individual y luego determinar la fluorescencia de las células incubadas con portadores. El Bulk Stream utiliza técnicas no basadas en citometría, como el análisis de seguimiento de nanopartículas, para contar los portadores en suspensión. La fluorescencia portadora individual se cuantifica utilizando un lector de microplacas o espectrofluorómetro. El uso del citómetro de flujo está, por lo tanto, restringido a medir la fluorescencia final de las células incubadas con portadores, una medición que se puede hacer en una gama más amplia de citómetros y que es independiente del tipo de portador utilizado. Abreviaturas: MESF = moléculas de fluorocromo soluble equivalente; MFI = intensidad media de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. La corriente del citómetro

1. Conteo de transportistas
   NOTA: Para esta medición se puede utilizar cualquier citómetro de flujo, siempre que se conozca el caudal (μL/s). Si el caudal es desconocido y no se puede determinar, no continúe con este paso. En su lugar, continúe con el paso 3.1. El recuento de los portadores en suspensión permite una determinación precisa y reproducible del número de portadores incubados en cada experimento celular.
   1. Configure el citómetro para detectar portadores, tanto por un canal de dispersión óptica (típicamente dispersión lateral [SSC]) como por fluorescencia. Asegúrese de ajustar el umbral para permitir la detección de los transportistas.
      NOTA: La iteración a través de diferentes canales de dispersión óptica puede ser necesaria si SSC no proporciona una señal clara (por ejemplo, dispersión directa [FSC]).
   2. Ejecute una muestra de solo diluyente para cuantificar el recuento de eventos de fondo tanto en el SSC como en los canales fluorescentes.
      NOTA: Los recuentos ideales de eventos en segundo plano son <100 eventos/s.
   3. Preparar a los portadores para la citometría de flujo.
      1. Asegúrese de que los portadores estén bien suspendidos por vórtice o sonicación, dependiendo del sistema de portador involucrado.
      2. Si es posible, asegúrese de que la concentración de portadores esté entre 1,000 portadores/μL y 10,000 portadores/μL. Un recuento de eventos de uno a dos órdenes de magnitud más alto que el fondo es un buen comienzo. Si se desconoce el orden de magnitud de la concentración de portadores, un buen comienzo es preparar una dilución de 1:1.000 de stock. Utilice los resultados iniciales como retroalimentación para informar futuras diluciones de muestras.
         NOTA: Una suspensión turbia generalmente está demasiado concentrada.
   4. Cargue la primera muestra portadora en el citómetro y comience a grabar.
   5. Comparar los recuentos de eventos resultantes tanto de los canales SSC como de fluorescencia; Estos deben ser aproximadamente iguales (<10% de diferencia). Si no es así, verifique la configuración del citómetro, por ejemplo, la configuración del tubo fotomultiplicador (PMT) y la intensidad del láser para el canal fluorescente. Alternativamente, use otros métodos como la microscopía confocal para validar que el etiquetado fluorescente de los portadores esté presente y sea uniforme.
   6. Repita los pasos 2.1.3 a 2.1.5 dos o más veces adicionales con diluciones diferentes de la cepa. Asegúrese de que el recuento de eventos en cada muestra sea al menos un orden de magnitud mayor que el recuento de eventos en segundo plano.
   7. Verifique que tres o más muestras muestren una tendencia lineal, es decir, una dilución de muestra de dos veces debe dar lugar a una reducción correspondiente del doble en la concentración de portadores medida.
   8. Utilice las muestras dentro del rango lineal, los factores de dilución correspondientes y el caudal conocido del citómetro para calcular la concentración del portador de material de acuerdo con la ecuación (1):
      (1)
      donde C es la concentración de portadores de existencias en portadores/ml. Se recomienda utilizar el recuento de eventos derivado de la detección de dispersión óptica en lugar de fluorescencia.
2. Lectura de citometría de flujo del experimento de células portadoras, incluida la determinación de la intensidad de fluorescencia por portador
   NOTA: Idealmente, la intensidad fluorescente por portador se determinará lo más cerca posible del experimento de la célula portadora. Esto es para garantizar que las IMF obtenidas para portadores individuales puedan compararse directamente con las IMF de células asociadas con los portadores. En la práctica, un citómetro generalmente generará resultados similares cuando se usa en días consecutivos usando los mismos voltajes PMT, pero esto no se puede garantizar.
   1. Diseñar el experimento de la célula portadora. Utilice la concentración de portadores determinada en el paso 2.1 para administrar la dosis deseada de portadores.
   2. Configure el citómetro de flujo para el experimento final de celda portadora determinando los ajustes óptimos de voltaje PMT en los canales relevantes. Establezca los umbrales para permitir la detección del operador.
   3. Ejecute los portadores en suspensión para determinar la intensidad de fluorescencia por portador bajo la configuración actual de PMT.
   4. Si es necesario, cambie los umbrales del citómetro para detectar las células y no los portadores.
   5. Ejecutar una muestra de control negativo -células no incubadas con portadores- para determinar la fluorescencia de fondo (autofluorescencia) de las células.
   6. Ejecute las muestras de células portadoras para determinar la intensidad de fluorescencia por celda. Esta fluorescencia es una combinación lineal de autofluorescencia celular y la presencia de portadores fluorescentes.
   7. Calcula el número de portadores por celda usando la siguiente ecuación (2):
      (2)
      donde P_assoc es el número de portadores asociados por célula, la _célula FI es la IMF de las células incubadas con portadores, el _fondo FI es la MFI de las células no incubadas con portadores, y el _portador FI es la MFI de los portadores en suspensión.

3. El flujo masivo

1. Conteo de portadores: análisis de seguimiento de nanopartículas
   NOTA: En el flujo a granel, el recuento de portadores es un paso necesario para cuantificar la intensidad absoluta de fluorescencia por portador (ver paso 3.1.4). Además, contar los portadores en suspensión permite la determinación precisa y reproducible del número de portadores incubados en cada experimento celular.
   1. Preparación
      1. Monte la celda de flujo en el módulo láser y bloquee todo el módulo láser en su lugar dentro del instrumento.
      2. Lentamente (no más rápido que 0.1 ml / s) enjuague la celda de flujo con ~ 1 ml de agua destilada. Si se forman burbujas dentro de la celda de flujo, retraiga la suspensión parcialmente para fusionar la burbuja con la interfaz aire-líquido antes de continuar.
      3. Inicie la cámara aproximadamente a la mitad del enrojecimiento; Asegúrese de confirmar que los residuos del portador se hayan lavado. Seleccione Capturar para abrir la pestaña Configuración de captura y haga clic en Iniciar cámara.
      4. Seque el sistema con 1 ml de aire. Si hay portadores estáticos visibles en la pantalla, limpie la celda de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      5. Prepare los portadores para el análisis de seguimiento de nanopartículas asegurándose de que los portadores estén bien suspendidos mediante vórtice o sonicación, dependiendo del sistema portador involucrado. Si se desconoce el orden de magnitud de la concentración de la madre, prepare una dilución 1:100 de la cepa y use los resultados iniciales como retroalimentación para informar futuras diluciones de muestras. Diluir los portadores en agua y no solución salina tamponada con fosfato (PBS) para preparar al menos ~0.6-1 ml de cada muestra con una concentración de portadores entre 1 × 10⁷ portadores/ml y 1 × 10⁹ portadores/ml.
         NOTA: Una suspensión turbia generalmente está demasiado concentrada. Los tampones y las sales pueden generar un alto ruido de fondo.
   2. Medición
      1. Saque el módulo láser y colóquelo en posición vertical.
      2. Extraiga la primera muestra portadora en una jeringa de 1 ml. Conecte la jeringa a la entrada del tubo y cargue cuidadosamente la muestra en la celda de flujo. Si se forman burbujas dentro de la celda de flujo, retraiga la suspensión parcialmente para fusionar la burbuja con la interfaz aire-líquido antes de continuar. Asegúrese de que toda la celda de flujo esté llena de líquido, luego haga una pausa.
      3. Ajuste el enfoque de la cámara si es necesario para visualizar portadores individuales. Realice ajustes de enfoque grueso con la perilla giratoria en el lado derecho del instrumento. Realice ajustes más precisos seleccionando la pestaña Hardware | Bombas/Etapa. Cambie el enfoque ajustando el control deslizante Enfoque .
      4. Ajuste el nivel de la cámara para asegurarse de que no haya sobresaturación. En la pestaña Captura , seleccione el nivel de cámara óptimo ajustando el control deslizante.
      5. Si el instrumento está equipado con este accesorio, cargue la jeringa que contiene la muestra portadora en la bomba de jeringa para garantizar un flujo continuo de muestras durante las mediciones.
      6. En la pestaña SOP , seleccione Medición estándar para tomar cinco capturas de 30 s cada una. Ingrese el nombre de archivo Base y, si lo desea, agregue información de muestra adicional haciendo clic en el botón Avanzado (que abre un diálogo modal con una variedad de opciones).
         NOTA: Si se introduce un factor de dilución, el software ajustará automáticamente la medición final de la concentración del portador. Se desaconseja la introducción de este factor. En su lugar, realice el ajuste manualmente, lo que facilita el análisis y permite evaluar si cada dilución se encuentra dentro del rango dinámico del instrumento (paso 3.1.3.4).
      7. Presione Crear y ejecutar script y espere a que aparezca una ventana emergente que le pide que avance la muestra.
      8. Si utiliza la bomba de jeringa, seleccione la pestaña Hardware | Pestaña Bomba de jeringa | ajuste la velocidad de infusión a 30-80 y pulse Infundir. Si no está utilizando la bomba de jeringa, avance manualmente la muestra.
      9. En la ventana emergente, seleccione Aceptar para comenzar a capturar. Después de cada una de las cinco capturas, cuando vuelva a aparecer la ventana emergente Avance de la muestra, compruebe que la muestra sigue moviéndose a través de la celda de flujo, ya sea manualmente o a través de la bomba de jeringa. A continuación, seleccione Aceptar para continuar con la siguiente captura.
         NOTA: Después de cinco capturas, el software abre automáticamente la pestaña Proceso y abre una ventana emergente que solicita ajustar la configuración del proceso.
   3. Análisis
      1. En la pestaña Proceso , ajuste el control deslizante Umbral de detección (entre 4 y 8) para identificar correctamente los distintos portadores visibles en la pantalla. Ajuste la ganancia de pantalla también para ayudar a la visualización; no afectará al análisis posterior. Utilice el control deslizante situado debajo de la pantalla de captura para desplazarse por varios fotogramas del vídeo para ayudar a establecer el umbral de detección.
         NOTA: El umbral de detección debe establecerse una vez y, posteriormente, no debe modificarse entre mediciones o muestras.
      2. En la ventana emergente (nota después del paso 3.1.2.9), pulse OK para iniciar el análisis de seguimiento. Supervise el progreso del análisis haciendo clic en la pestaña Análisis | Ficha Análisis único .
      3. Una vez finalizado el análisis, busque que aparezca un mensaje de configuración de exportación , en el que Incluir PDF e Incluir resumen del experimento deben estar seleccionados de forma predeterminada. Seleccione cualquier otro formato de exportación que desee.
      4. En la sección Resultados de la exportación de datos PDF, para asegurarse de que la concentración medida es fiable, verifique que la concentración portadora medida esté entre 1 × 10⁷ portadoras/ml y 1 × 10⁹ portadoras/ml (el rango dinámico del instrumento) y compruebe si hay mensajes de error o mensajes de precaución debajo del resultado de la medición de la concentración.
      5. Repita los pasos 3.1.2.1-3.1.3.4 dos o más veces con diluciones diferentes de la cepa. Asegúrese de que la concentración de cada muestra esté dentro del rango lineal del instrumento.
      6. Seleccione tres o más muestras que muestren una tendencia lineal, es decir, una dilución de muestra de dos veces debe dar lugar a una reducción correspondiente de dos veces en la concentración de portadores medida. Utilice las muestras seleccionadas y los factores de dilución correspondientes para calcular la concentración del portador de stock.
   4. Determinación de la intensidad absoluta de fluorescencia por portadora
      NOTA: Dado que la fluorescencia de portadores individuales en esta corriente no se puede caracterizar directamente, la intensidad de fluorescencia se cuantifica a granel. Este método se basa en el hecho de que la intensidad de fluorescencia está linealmente relacionada con la concentración de fluorocromo de acuerdo con la ley de Lambert-Beer. Cuando dicha cuantificación global de portadores en suspensión se realiza en una suspensión de concentración conocida de portador (ver paso 3.1), puede derivarse la fluorescencia por portador. Este paso se puede realizar en un lector de placas de fluorescencia o en un espectrofluorómetro. La intensidad de fluorescencia se compara con una curva estándar de muestras con fluorescencia absoluta conocida, dada en número de MESF.
      1. Use una solución del fluorocromo libre para etiquetar el portador: resuspenda el tinte en el tampón apropiado (por ejemplo, DMSO) y realice diluciones adicionales en el mismo tampón que el diluyente portador. Alternativamente, use una solución de un anticuerpo conjugado con el fluorocromo. Calcule la concentración de la solución madre (MESF/ml) a partir de la concentración en mg/ml, el peso molecular en mg/mol y el número de Avogadro utilizando la ecuación (3). Realice una dilución en serie en el diluyente portador para generar muestras de curva estándar.
         (3)
         NOTA: Utilice un anticuerpo conjugado con fluorocromo sólo si se conoce el grado de marcado, es decir, la relación molar entre el fluorocromo y el anticuerpo en la solución. Inicialmente, genere una curva estándar con un amplio rango, ya que la intensidad de fluorescencia de la muestra portadora aún se desconoce. A partir de aquí, limítelo para incluir el rango requerido.
      2. Prepare las muestras portadoras.
         NOTA: La mejor práctica es probar dos o más diluciones portadoras para validar que las mediciones son lineales y caen dentro del rango de la curva estándar.
      3. Mida la fluorescencia de volúmenes iguales de cada muestra, es decir, curvas portadoras y estándar.
      4. Generar una curva estándar y deducir la intensidad de fluorescencia absoluta a granel en MESF/mL para las muestras portadoras medidas.
      5. Calcule la intensidad absoluta de fluorescencia por portador (MESF/portador) dividiendo la fluorescencia a granel (MESF/mL) por la concentración de portador (portadores/mL) como en la ecuación (4):
         (4)
   5. Experimento celular (incluida la determinación de la intensidad de fluorescencia equivalente por portador)
      NOTA: En este paso, las perlas de cuantificación de citometría de flujo se utilizan para generar una curva estándar de la relación entre MESF y MFI. Estas perlas de cuantificación consisten en múltiples poblaciones de perlas con un número conocido de MESF por cuenta, y estas perlas individuales pueden ser detectadas por cualquier citómetro. Idealmente, la curva estándar MESF se determina al mismo tiempo que la lectura de los experimentos de células portadoras. Esto es para garantizar que los valores de MFI calculados para portadores individuales puedan compararse directamente con el MFI de las células asociadas con portadores. En la práctica, un citómetro generalmente generará resultados similares cuando se usa en días consecutivos usando los mismos voltajes PMT, pero esto no se puede garantizar.
      1. Diseñar el experimento de la célula portadora. Utilizar la concentración de portadores determinada en la sección 3.1.3 para administrar la dosis deseada de portadores.
      2. Configure el citómetro de flujo para el experimento final de celda portadora determinando los ajustes óptimos de voltaje PMT en los canales relevantes.
      3. Ejecute una muestra de control negativo, es decir, células no incubadas con portadores, para determinar la fluorescencia de fondo.
      4. Preparar y resuspender las perlas de cuantificación de citometría de flujo. Utilice el mismo tampón que se utiliza para las muestras de células (por ejemplo, PBS). Si las poblaciones de cuentas se proporcionan por separado, agruparlas.
      5. Ejecute la muestra de perlas de cuantificación por citometría de flujo.
      6. Ejecute las muestras de células portadoras para determinar la intensidad de fluorescencia por celda.
      7. Utilice la muestra de perlas de cuantificación para generar una curva estándar que convierta la intensidad de fluorescencia absoluta (MESF) en MFI. Utilice esta curva estándar y los resultados del paso 3.1.4 para calcular la IMF teórica de los portadores. Calcula el número de portadores por celda usando la ecuación (5):
         (5)
         Donde P_assoc es el número de portadores asociados por célula, la _célula FI es la IMF de las células incubadas con portadores, el _fondo FI es la MFI de las células no incubadas con portadores y el _portador FI es el MFI calculado de los portadores en suspensión (paso 3.1.4).

Representative Results

Como se discutió anteriormente, los diferentes tipos de portadores de fármacos requieren el uso de diferentes técnicas para la cuantificación absoluta de la asociación célula-portador. Por ejemplo, las partículas de núcleo de poli(ácido metacrílico) estabilizado con disulfuro (PMA_SH) de 633 nm son lo suficientemente grandes y densas para su detección con un citómetro de flujo sensible. Como tal, estas partículas se marcaron fluorescentemente, luego se cerraron y se contaron utilizando la dispersión de luz de ángulo lateral (SALS, análoga a SSC), así como el canal fluorescente apropiado (Figura 3). La diferencia en el recuento de eventos en ambos canales fue de 1.98%, dentro del rango aceptable.

En contraste, las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro de 100 nm son demasiado pequeñas para detectarlas individualmente y, por lo tanto, se analizaron utilizando el Bulk Stream. Estas nanopartículas se contaron y caracterizaron mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas (Figura 4). El tamaño medio de nanopartículas de 136 nm refleja el diámetro hidrodinámico de la nanopartícula en el agua. La concentración de nanopartículas medida, aún no corregida para la dilución realizada, cae dentro del rango dinámico del instrumento, lo que sugiere una determinación exitosa y precisa de la concentración de nanopartículas.

Continuando en el Bulk Stream, la intensidad de fluorescencia absoluta de una suspensión portadora se convertirá en un valor MFI en el citómetro de flujo utilizado para la incubación final del portador celular. En este experimento, las perlas de cuantificación marcadas con el mismo colorante fluorescente que el portador se utilizaron durante varios días para generar curvas estándar en un citómetro de flujo (Figura 5). La correlación entre la IMF medida y el valor MESF de las perlas de cuantificación es lineal y muy similar entre las fechas medidas. Sin embargo, se pueden observar ligeras diferencias entre las fechas y, como tal, se recomienda regenerar una curva estándar como parte de la lectura de los experimentos de células portadoras.

Una vez que se ha determinado la IMF de los portadores individuales, los datos de la asociación célula-portador pueden cuantificarse absolutamente e interpretarse con mayor precisión. Se recomienda realizar experimentos de curso temporal, por ejemplo, incubar células HeLa marcadas fluorescentemente con cápsulas_{PMA SH} de 235 nm, para varios puntos de tiempo entre 0 h y 24 h (Figura 6). Como era de esperar, la fluorescencia celular mediana aumenta con el tiempo, lo que indica que las cápsulas se asocian con las células HeLa. Si bien tales experimentos se pueden usar para comparar el rendimiento relativo del portador en varios puntos temporales, estos resultados no son absolutamente cuantitativos.

La importancia de la cuantificación absoluta, ya sea que se realice a través de la corriente del citómetro o la corriente a granel, se hace evidente cuando se compara la asociación de dos tipos de portadores. La Figura 7 muestra los mismos dos experimentos, analizados por cuantificación relativa (Figura 7A) o cuantificación absoluta. La diferencia en la respuesta celular aparente a los portadores es marcada, dependiendo del análisis realizado; Los portadores no deben compararse directamente cuando se utiliza la cuantificación relativa (Figura 7A), mientras que la cuantificación absoluta es independiente de la intensidad del etiquetado y, por lo tanto, más comparable (Figura 7B).

Figura 3: Recuento de partículas usando un citómetro de flujo (Cytometer Stream). Se utilizó un citómetro de flujo Apogee. (A) Conteo de partículas utilizando un canal óptico (SALS), lo que resulta en un recuento de eventos de 200,659. (B) Conteo de portadores utilizando el canal fluorescente del portador, lo que resulta en un recuento de eventos de 204,636. En ambos casos, se aplicó una transformada arcsinh seguida de compuerta (en 6 y 4, respectivamente). Cifras creadas a partir de datos brutos de partículas núcleo-capa de 633 nm publicadas por primera vez en Faria et ^al.10. Abreviatura: SALS = dispersión de luz de ángulo pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Conteo de portadores utilizando el análisis de seguimiento de nanopartículas (flujo masivo). Las nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro de 100 nm de tamaño se caracterizaron y contaron mediante el análisis de seguimiento de nanopartículas. Izquierda, histograma de concentración/tamaño de los resultados individuales de cinco mediciones replicadas. Correcto, la distribución promedio de concentración / tamaño ± SEM de cinco réplicas. En esta muestra en particular, se realizó una dilución 1:2.000 de stock para obtener una concentración dentro del rango dinámico del instrumento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Conversión de MESF a MFI utilizando perlas de cuantificación en un citómetro de flujo (Bulk Stream). Se analizaron perlas fluorescentes con cuatro valores MESF diferentes en un citómetro de flujo en varios días, y se dibujaron curvas estándar. Abreviaturas: MESF = moléculas de fluorocromo soluble equivalente; MFI = intensidad media de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Experimento celular final en series de curso de citómetro de flujo y tiempo (Cytometer Stream y Bulk Stream). Imágenes representativas de datos de citometría de flujo de un experimento de curso temporal. Las células THP-1 se incubaron con una cápsula polimérica de 235 nm durante 0 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 16 h y 24 h (de izquierda a derecha). La fluorescencia portadora se muestra en el eje x, mientras que un canal óptico se muestra en el eje y. En todos los casos, se realizó una transformación arcsinh. No se realizó ninguna compuerta (aparte de elegir los límites del gráfico). Creado a partir de datos brutos en Faria et ^al.10. Abreviatura: SALS = dispersión de luz de ángulo pequeño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Cuantificación relativa versus absoluta de la asociación de células portadoras (Cytometer Stream y Bulk Stream). Ambas figuras visualizan datos de los mismos dos experimentos, una incubación de 24 h entre macrófagos RAW264.7 y portadores de núcleo-cáscara de 150 nm (azul) o 633 nm (naranja), creados a partir de datos brutos en Faria et ^al.10. Se trazan las medianas de ambas réplicas técnicas. (A) Cuantificación relativa, reportada como IMF en a.u. (B) Cuantificación absoluta, reportada como el número de portadores por célula. Abreviaturas: MFI = intensidad media de fluorescencia; a.u. = unidades arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

La caracterización de las interacciones entre los portadores de fármacos y las células es cada vez más importante en el desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Específicamente, para permitir la evaluación racional y la comparación de varias construcciones de portadores, la cuantificación absoluta del rendimiento de dicho portador para interactuar con las células objetivo y fuera del objetivo es crítica. Este protocolo describe una metodología de dos flujos que permite a cualquier investigador que trabaje con un portador de fármaco convertir datos de citometría de flujo semicuantitativos relativos sobre la asociación célula-portador en resultados cuantitativos absolutos. El proceso descrito es aplicable a cualquier tipo de portador (pequeño, grande, orgánico, inorgánico) siempre que estén marcados con fluorescencia. Sin embargo, diferentes portadores requieren diferentes enfoques para calcular los portadores por celda. Esto se debe a los límites de varios instrumentos utilizados para las mediciones de caracterización requeridas.

Como tal, este protocolo se divide en dos corrientes: la corriente del citómetro y la corriente a granel. El primero, el Cytometer Stream, es el enfoque más sencillo y requiere solo un citómetro de flujo, pero este citómetro debe ser lo suficientemente sensible como para detectar los portadores individuales utilizados, o, en otras palabras, el portador del fármaco de interés debe ser lo suficientemente grande y denso como para ser detectado. El Bulk Stream es compatible con cualquier tipo de portador, ya que la necesidad de detectar portadores individuales se evita mediante el uso de instrumentación alternativa. Sin embargo, el Bulk Stream requiere que se realicen más experimentos de caracterización.

Para ayudar a elegir el Stream apropiado (y como tal, las tecnologías apropiadas), las consideraciones anteriores se han resumido en un árbol de decisión (Figura 1). Para reiterar, el Bulk Stream es adecuado para todos los investigadores, independientemente del tipo de portador utilizado y, por lo tanto, siempre se puede revertir como respaldo. Los flujos de trabajo de las dos secuencias se describen en la figura 2. En particular, con los avances continuos en la sensibilidad de los citómetros de flujo, es posible que el Cytometer Stream se pueda utilizar para portadores de más de <300 nm.

Se deben tomar algunas notas sobre este procedimiento. En primer lugar, la estrategia descrita para convertir la fluorescencia celular en un número absoluto de portadores por célula se basa en la medición de la fluorescencia portadora individual en suspensión. Sin embargo, la fluorescencia está influenciada por el entorno químico inmediato del fluorocromo (por ejemplo, el diluyente portador, la superficie celular o varios compartimentos intracelulares). En particular, se sabe que el ambiente ácido del compartimento endosomal afecta la intensidad de fluorescencia de ciertos colorantes principalmente basados en proteínas¹¹. Como tal, independientemente del tipo de portador estudiado, se recomienda utilizar rangos de colorantes altamente fotoestables e insensibles al pH para el etiquetado de los portadores de medicamentos (consulte la Tabla de materiales para obtener una recomendación). El beneficio adicional de esta gama de tintes es su brillo general, que mejora la sensibilidad de la detección de portadores de fármacos.

En segundo lugar, los métodos discutidos anteriormente están destinados a proporcionar orientación, pero de ninguna manera forman una lista exclusiva de técnicas que se pueden utilizar para realizar los diversos pasos en el flujo de trabajo de cuantificación. En particular, existe una variedad de técnicas para contar portadores más pequeños o de baja dispersión (como los del Bulk Stream). Estos incluyen otros instrumentos capaces de realizar el mismo Análisis de seguimiento de nanopartículas 12, así como otros métodos en conjunto, como la dispersión dinámica de luz multiángulo, la espectroscopia de masas, la microscopía electrónica¹³, la gravimetría o las mediciones de densidad óptica (revisadas más a fondo por Shang y Gao¹⁴). Además, esta cuantificación experimental -pasar de unidades de fluorescencia arbitrarias a un número absoluto de portadores por célula- es solo una parte de lo que podría denominarse un "flujo de trabajo de biología cuantitativa". La cuantificación experimental absoluta es necesaria pero no suficiente. La mera cuantificación e informe de la asociación de portadores no tiene en cuenta las diferencias en la asociación de partículas debido a la configuración experimental, como el tiempo de incubación, la dosis y la concentración del portador del fármaco agregado, o el número de células utilizadas por contenedor experimental.

Además, los portadores con diferentes propiedades fisicoquímicas pueden tener dosis muy diferentes entregadas a las células, incluso cuando la configuración experimental es idéntica¹⁵. El rendimiento del transportista, incluso in vitro, no se puede determinar sin tener en cuenta todos estos factores. En otras palabras, la mera cuantificación de la asociación madre-célula portadora no permite, en general, una comparación imparcial de portadores entre investigadores y laboratorios. En este sentido, ha habido una discusión previa sobre la importancia de realizar experimentos de curso temporal de asociación de células portadoras y posteriores modelos matemáticos in silico para derivar parámetros cinéticos (es decir, constantes de tasa) como una medida imparcial y cuantitativa de la afinidad entre un par particular de células portadoras¹⁰. La cuantificación experimental es también un requisito previo para la aplicación de otras técnicas in silico , como la identificación de fuentes potenciales de heterogeneidad biológica¹⁶ o la determinación de la cinética de penetración en un modelo biológico complejo¹⁷. En combinación con las directrices de Minimum Information Reporting in Bio-Nano Experimental Literature para la notificación estandarizada¹⁸, la evaluación cuantitativa del rendimiento de los portadores puede acelerar el desarrollo de una nueva nanomedicina.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	pH-stable dye used to label 150 nm, 235 nm, or 633 nm PMASH carriers; example of good dye to use in cell-carrier association studies
Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		Sensitive flow cytometer capable of detecting small carriers for counting and read out for final cell-barrier experiments
FCS Express	De Novo Software		Software used to analyze flow cytometry data, i.e., perform gating and derive median fluorescence intensity values of populations of choice. Alternatives include FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Standard microplate reader instrument used for bulk fluorescence measurements of carriers in solution
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		Less sensitive flow cytometer, but one more generally available to researchers. Can be used to read out final cell-carrier experiment
NanoSight NS300	Malvern Panalytical		Instrument used for Nanoparticle Tracking Analysis
Prism 8	GraphPad		Software used to graph and calculate standard curves. Alternatives include Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python amongst many others
Quantum MESF kits Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Absolute quantitation beads for flow cytometery. Used to convert fluorescence intensities measured in bulk on a microplate reader to fluorescence intensities measured on a flow cytometer using the MESF standard