Summary
Dit protocol beschrijft hoe actinekometen op de oppervlakken van kralen kunnen worden geproduceerd met behulp van in de handel verkrijgbare eiwitingrediënten. Dergelijke systemen bootsen de uitstekende structuren in cellen na en kunnen worden gebruikt om fysiologische mechanismen van krachtproductie op een vereenvoudigde manier te onderzoeken.
Abstract
Veel celbewegingen en vormveranderingen en bepaalde soorten intracellulaire bacteriële en organelmotiliteit worden aangedreven door het biopolymeer actine dat een dynamisch netwerk vormt aan het oppervlak van de cel, organel of bacterie. De biochemische en mechanische basis van krachtproductie tijdens dit proces kan worden bestudeerd door op actine gebaseerde beweging op een acellulaire manier te reproduceren op inerte oppervlakken zoals kralen die zijn gefunctionaliseerd en geïncubeerd met een gecontroleerde set componenten. Onder de juiste omstandigheden verzamelt zich een elastisch actinenetwerk aan het kraaloppervlak en breekt open als gevolg van de stress die wordt gegenereerd door netwerkgroei, waardoor een "actine-komeet" wordt gevormd die de kraal voortbeweegt. Dergelijke experimenten vereisen echter de zuivering van een groot aantal verschillende actinebindende eiwitten, waardoor ze vaak buiten het bereik van niet-specialisten komen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van actinekometen en beweeglijkheid van kralen met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia. Kraalcoating, kraalgrootte en motiliteitsmengsel kunnen worden gewijzigd om het effect op de kraalsnelheid, trajecten en andere parameters te observeren. Deze test kan worden gebruikt voor het testen van de biochemische activiteiten van verschillende actinebindende eiwitten en voor het uitvoeren van kwantitatieve fysieke metingen die licht werpen op de eigenschappen van actieve materie van actinenetwerken. Dit zal een nuttig hulpmiddel zijn voor de gemeenschap, waardoor de studie van in vitro actine-gebaseerde motiliteit mogelijk wordt zonder deskundige kennis in actinebindende eiwitzuivering.
Introduction
Actinepolymerisatie in cellen wordt ruimtelijk en temporeel gecontroleerd door een strakke regulatie van actinefilamentnucleatie stroomafwaarts van celsignalering1. Nucleatie vindt plaats via de vorming van een actinetrimmer, en dan polymeriseren beide uiteinden van het ontluikende filament spontaan, hoewel het ene uiteinde dynamischer is (het prikkeldraadeinde) dan het andere (het puntige uiteinde)2. Wanneer nucleatie en prikkeldraad-end polymerisatie naar een oppervlak worden gericht, produceren ze voldoende kracht (in het pico-naar-nano Newton-bereik) om het celmembraan uit te duwen voor beweging en om microngrote objecten in de cel te verplaatsen met ATP-hydrolyse als energiebron3. Enkele voorbeelden zijn Listeria monocytogenes-bacteriën die actinekometen gebruiken om zich van cel naar cel te verspreiden, en mitochondriën, waarbij op actine-komeet gebaseerde beweging belangrijk is voor gerandomiseerde overerving tijdens mitose 4,5. Actinekometen op endosomen en andere intracellulaire blaasjes zijn betrokken bij onthechting van donormembranen 6,7,8.
Met de hier gepresenteerde methode worden de signaleringsaspecten van cellulaire actinepolymerisatie omzeild en wordt actinepolymerisatie geproduceerd op micrometrische polystyreenparels door ze te coaten met activatoren van vertakte actine-nucleatie, met name het actieve domein van het menselijke WASP-eiwit, VCA (ook wel WA of WCA genoemd)1. De gecoate kralen worden vervolgens geïncubeerd in een mengsel met de ingrediënten die nodig zijn voor actinepolymerisatie, waaronder de belangrijkste actinepolymerisatienucleator in cellen, het Arp2/3-complex, dat door VCA aan het kraaloppervlak wordt geactiveerd om nieuwe filamenten te vormen als takken van de zijkanten van dochterfilamenten1. Actine polymeriseert aanvankelijk uniform rond de kraal, maar breekt dan spontaan de symmetrie om een actinekomeet te creëren die de kraal naar voren duwt, waardoor celachtige uitstekende netwerken en kometen op een gecontroleerde manier worden gerecreëerd. Vergelijkbare benaderingen met kralen en andere gecoate oppervlakken zijn in het verleden door ons en anderen gebruikt om de biochemie en biofysica van actinepolymerisatiete bestuderen 9,10,11,12, maar uitgebreide expertise in actinebindende eiwitten was vereist voor deze experimenten. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft hoe actinekometen en beweeglijkheid volledig kunnen worden gemaakt met commercieel beschikbare (of binnenkort beschikbare) reagentia, waardoor deze aanpak voor iedereen toegankelijk wordt, ook in een educatieve omgeving voor het onderwijzen van biofysische concepten. Belangrijke kenmerken zijn het belang van zacht en betrouwbaar pipetteren, het gebruik van profiline-gecomplexeerd monomeer als actinebron en de essentie van het gebruik van een zeer actieve Apr2/3 complexe activator als een kraalcoatingreagens.
Protocol
1. Bereiding van buffers
OPMERKING: Gebruik ultrapuur H2O voor alle buffers. Het hoeft niet steriel te zijn. Filtreer alle in stap 1.1-1.4 beschreven oplossingen met een spuitfilter van 0,2 μm, aliquot in porties van 500 μL-2 ml per buis, afhankelijk van het gebruik, en bewaar bij -20 °C.
- Bereid 10% BSA door 2 g BSA in een conische buis van 50 ml te wegen en te vullen tot de 20 ml met H2O. Meng totdat de BSA is opgelost (ongeveer 30 minuten) en vul vervolgens het volume aan tot 20 ml.
OPMERKING: Gebruik BSA van hoge kwaliteit (zie Materiaaltabel). De 10% BSA-oplossing wordt gebruikt in zowel de kraalbereiding als de motiliteitsmix. - Bereid voor de bereiding van kralen Xb-buffer (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl2 en 0,1 mM CaCl2, pH 7,5) als een 10x-oplossing en verdun voor gebruik (100 μL 10x Xb-stamoplossing + 900 μL H2O). Bereid Xb/1% BSA door 100 μL 10x Xb stamoplossing + 100 μL 10% BSA + 800 μL H2O te mengen.
- Bereid G-buffer (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM DTT, 2 mM ATP), de buffer die wordt gebruikt om monomeer actine (G-actine) te verdunnen. Aanpassen aan pH 7, niet pH 8 zoals traditioneel gebruikt (zie discussie).
- Bereid de motiliteitsbuffer MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). Voor sommige toepassingen is 10x MB13 handig. Bereid echter 10x MB13 voor zonder BSA, omdat dit leidt tot problemen tijdens de pH-aanpassing. Voeg BSA toe uit 10% stockoplossing (bereid in stap 1.1) bij het reconstitueren van 1x MB13 van 10x MB13.
2. Bereiding van eiwitoplossingen
OPMERKING: Gebruik ultrapuur H2O voor alle resuspensaties. Het hoeft niet steriel te zijn. Behandel alle eiwitten op ijs en aliquot in voorgekoelde buizen. Manipuleer voorzichtig om geen bubbels te produceren en nooit vortex-eiwitoplossingen. Voor voorraden die bij -80°C worden bewaard, is flash freezing in vloeibare stikstof niet nodig. Pas de grootte van aliquot aan om meer dan ongeveer vijf vries-dooicycli te voorkomen, omdat dit de activiteit van geen van de eiwitten lijkt te beïnvloeden. Werkende aliquots kunnen enkele weken bij -20 °C worden bewaard.
- Bereid G-actine (konijnenskeletspieren) oplossing zoals hieronder beschreven.
- Pulscentrifuge actinepoeder (zie Materiaaltabel) bij 4 °C om de vaste stof aan de onderkant van de buis te verzamelen.
- Voeg H2O toe volgens de instructies van de fabrikant (1 mg eiwit in 100 μL koud H2O voor ongelabeld actine, 100 μg eiwit in 100 μL koude H2O voor ATTO-gelabelde actine).
- Laat het minstens 15 minuten op ijs staan. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren, laat het nog minstens 15 minuten op ijs zitten en meng opnieuw. Pulscentrifuge bij 4 °C om de oplossing op de bodem van de buis te verzamelen en remix.
- Bereid 10-50 μL aliquots ongelabeld actine, afhankelijk van het gebruik, en 20 μL aliquots ATTO-gelabeld actine. Bewaar de aliquots bij -80 °C.
- Om actine-oligomeren te depolymeriseren die zich vormen tijdens lyofilisatie en bevriezing, verdunt u een aliquot geresuspendeerd actine ~ 8-voudig in G-buffer met extra ATP en DTT (bijvoorbeeld tot 20 μL geresuspendeerde actineoplossing uit stap 2.1.4, voeg 134 μL G-buffer, 0,32 μL van 0,2 mM ATP en 0,16 μL van 1 M DTT toe). Voeg voor fluorescerende etikettering ongeveer 10% gelabelde actine toe; voeg bijvoorbeeld 5 μL ATTO-gelabeld actine toe aan 40 μL verdund ongelabeld actine. Laat het op ijs depolymeriseren met af en toe mengen (pipetteren) ten minste een paar dagen tot een week voordat de eiwitconcentratie wordt gemeten door Bradford-assay zoals beschreven in stap 3.
OPMERKING: Houd verdunde ongelabelde en fluorescerende actine op ijs in een koude kamer of koelkast; nooit invriezen of laten opwarmen. Het preparaat zal in de loop van de tijd blijven depolymeriseren en kan, wanneer het op de juiste manier wordt behandeld, gedurende ten minste 6 maanden worden gebruikt.
- Resuspend Arp2/3 complex (varkenshersenen) (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant (20 μg eiwit in 20 μL koud H2O), met de volgorde van pulscentrifuging, mengen, enz. op ijs zoals beschreven voor actine in stap 2.1. Combineer de eiwitoplossingen van het resuspenderen van twee tubes poeder om een grotere voorraad te hebben voor reproduceerbare experimenten. Bereid 2 μL aliquots en bewaar bij -80 °C.
- Resuspendeer profiline (humaan recombinant) (zie materiaaltabel) in een 4x hogere concentratie dan voorgeschreven in de instructies van de fabrikant (100 μg eiwit in 25 μL koud H2O), met de volgorde van pulscentrifugeren, mengen, enz. op ijs zoals voor actine in stap 2.1. Combineer de eiwitoplossingen van het resuspenderen van twee tubes poeder voordat u de eiwitconcentratie bepaalt om een grotere voorraad te hebben voor reproduceerbare experimenten.
OPMERKING: Bewaar op ijs in een koude kamer of koelkast; nooit invriezen of laten opwarmen. Wanneer goed behandeld, is geresuspendeerde profilin goed voor ten minste 6 maanden tot 1 jaar. - Resuspend capping protein (α1β2, human recombinant) (zie materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant (50 μg eiwit in 50 μL koud H2O), met de volgorde van pulscentrifuging, mengen enz. op ijs zoals beschreven voor actine in stap 2.1. Koel 50 μL glycerol op ijs en voeg er de 50 μL resuspendeerd capping protein aan toe; meng voorzichtig. Bewaren bij -20 °C.
OPMERKING: De oplossing bevriest niet en de activiteit is robuust, dus de oplossing kan maanden of zelfs jaren als een enkele aliquot worden bewaard als deze zorgvuldig wordt behandeld. Muis recombinant capping eiwit, het eiwit dat in het verleden het meest werd gebruikt in in vitro experimenten13, zal binnenkort commercieel beschikbaar zijn. - Resuspend gelsolin (humaan recombinant, His-tagged) (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant (20 μg eiwit in 20 μL koud H2O), met de volgorde van pulscentrifuging, mengen, enz. op ijs zoals beschreven voor actine in stap 2.1. Ongeveer 2 μL gelsolin wordt gebruikt per dag van experimenten; bereid daarom grote aliquots (5-10 μL) en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: Het protocol met gelsolin wordt als alternatief verstrekt. Het gebruik van capping-eiwit in de plaats van gelsolin wordt aanbevolen, gekocht of gezuiverd zoals in13. - Resuspendeer VCA (human wasp-VCA, GST-tagged) (zie materiaaltabel) in 2x hogere concentratie dan voorgeschreven in de instructies van de fabrikant (500 μg eiwit in 250 μL koud H2O), met de volgorde van pulscentrifugeren, mengen, enz. op ijs zoals voor actine in stap 2.1. Maak 10 μL aliquots en bewaar bij -80 °C.
OPMERKING: Zodra SpVCA (humane pVCA, streptavidin en His-tagged) op de markt is gebracht of als eiwitzuivering14 mogelijk is, wordt het gebruik van SpVCA in plaats van VCA aanbevolen. VCA geeft niet reproduceerbaar kometen onder de hier beschreven omstandigheden.
3. Meting van eiwitconcentraties
- Construeer een Bradford-standaardcurve gemaakt van twee overlappende seriële verdunningen van BSA.
OPMERKING: De standaardcurve hoeft slechts om de paar maanden (of zelfs minder vaak) te worden geconstrueerd zolang de spectrofotometer niet verandert.- Plaats in rij 1 van een microbuisrek buizen voor BSA-verdunningsreeks #1: vier buizen van 2 ml gevolgd door vier buizen van 1,5 ml. Plaats in rij 3 van het rek buizen voor BSA-verdunningsreeks # 2 zoals voor serie # 1. Plaats in rij 5 van het rek een buis van 2 ml voor elk te meten monster, samen met twee buizen van 1,5 ml. Voeg een enkele buis van 1,5 ml toe in rij 5 voor de lege buis.
- Meet bradfordreagens (zie materiaaltabel) in de buizen van 1,5 ml.
- Vul een conische buis van 15 ml naar boven met Bradford Reagentia voor gemakkelijker pipetteren (overtollige hoeveelheid wordt teruggegeven aan de voorraadfles in de koelkast) op ijs. Neem 200 μL Bradford Reagens en werp het terug in de conische buis om de pipetpunt nat te maken. Omdat de oplossing stroperig is, pipetteer dan langzaam om de oplossing in en uit de punt te laten komen en volledig te verlaten zonder bubbels te maken.
- Pipetteer met de "voorvochtige" tip langzaam 200 μL Bradford-reagens in elk van de 1,5 ml buizen in het rek (vier voor elke BSA-verdunning, één voor de blanco en twee voor elk te meten monster). Doe dit eerst om het Bradford-reagens grondig te laten opwarmen tot kamertemperatuur voordat u het mengt met eiwitoplossingen. Breng de resterende inhoud van de conische buis van 15 ml terug naar de fles.
- Meet H2O uit in de buizen van 2 ml. Voeg in rij 1 van het rek 1.990 μL H2O toe aan de eerste buis en 900 μL aan de drie andere buizen. Voeg voor rij 3 1.992,5 μL toe aan de eerste buis en 900 μL aan de drie andere buisjes. Voeg 2.000 μL H2O toe aan elk van de monsterbuizen in rij 5.
OPMERKING: Gebruik voor alle volumes groter dan 1.000 μL een pipet van 1.000 μL, maar dien de volledige hoeveelheid toe door tweemaal te pipetteren. Het is belangrijk om alles klaar te maken voordat u met de volgende stappen begint, om te voorkomen dat eiwitten gedurende lange tijd sterk verdund in H2O achterblijven. - Om BSA-verdunningsreeks #1 te bereiden, mengt u 10 μL gekalibreerde 2 mg/ml BSA (zie Materiaaltabel) in de buis met 1.990 μL H2O om een 10 μg/ml oplossing te maken. Maak hieruit drie seriële verdunningen (5 μg/ml, 2,5 μg/ml en 1,25 μg/ml BSA) door 900 μl van elke oplossing over te brengen naar de volgende buis (die 900 μL H2O bevat).
- Om BSA-verdunningsreeks #2 te bereiden, mengt u 7,5 μL gekalibreerde 2 mg/ml BSA in de buis met 1.992,5 μL H2O om een 7,5 μg/ml oplossing te maken. Maak hieruit drie seriële verdunningen (3,75 μg/ml, 1,875 μg/ml en 0,9375 μg/ml BSA) door 900 μl van elke oplossing over te brengen naar de volgende buis (die 900 μL H2O bevat).
- Meng en lees absorptie om de standaardcurve te genereren. Voeg 800 μL H2O toe aan de Bradford-reagensbuis voor de blanco en start de timer. Meng zo efficiënt mogelijk zonder bubbels te maken 800 μL van elke BSA-standaard met 200 μL Bradford-reagens in de voorbereide buizen. Zodra alle normen zijn gemengd met Bradford-reagens (< 5 min), giet u elke standaard in een wegwerpcuvette en leest u de absorptie bij 600 nm in de spectrofotometer na het leegmaken van de machine.
OPMERKING: Dezelfde cuvette kan worden gebruikt om de hele serie te lezen als de minst geconcentreerde standaard eerst wordt gelezen en de cuvette goed wordt geleegd tussen de lezingen. Voer de standaardcurve opnieuw uit totdat de lineaire fit een R-waarde van ten minste 0,99 heeft. Pas nadat pipetteren en voorzichtig mengen onder de knie is, gaat u verder met het lezen van monsters.
- Meet concentraties van actine- en actinebindende eiwitten
- Meng in de 2 ml-buisjes met 2.000 μL H2O (bereid in stap 3.1.3) voorzichtig het volgende: 2 μL elk van Arp2/3-complex en profiline, 4 μL gelabeld G-actine, 5 μL elk van gelsolin en VCA en 8 μL capping protein (humane recombinant). Neem onmiddellijk 800 μL van de oplossing en meng met het reeds bereide Bradford-reagens en herhaal dit om voor elk monster twee metingen binnen 5%-10% van elkaar te hebben. Een groter verschil duidt op een probleem met resuspensie of hantering. Lees binnen een paar minuten na het mengen met Bradford-reagens.
OPMERKING: Als u een standaardcurve van een andere dag gebruikt, hoeft naast de monsters alleen de blanco uit stap 3.1.6 te worden voorbereid.
- Meng in de 2 ml-buisjes met 2.000 μL H2O (bereid in stap 3.1.3) voorzichtig het volgende: 2 μL elk van Arp2/3-complex en profiline, 4 μL gelabeld G-actine, 5 μL elk van gelsolin en VCA en 8 μL capping protein (humane recombinant). Neem onmiddellijk 800 μL van de oplossing en meng met het reeds bereide Bradford-reagens en herhaal dit om voor elk monster twee metingen binnen 5%-10% van elkaar te hebben. Een groter verschil duidt op een probleem met resuspensie of hantering. Lees binnen een paar minuten na het mengen met Bradford-reagens.
- Bereken de concentraties van actine- en actinebindende eiwitten met behulp van de standaardcurve en de verdunningsfactor. Voer de meting voor elke nieuwe resuspensie opnieuw uit. Molecuulgewichten om mg/ml-metingen verkregen via Bradford-assay om te zetten in μM zijn: actine 43 kD, Arp2/3 complex 224 kD, profiline 15 kD, gelsolin 95 kD, capping protein 68 kD (humane recombinant) of 63,5 kD (muisrecombinant), VCA 43 kD en SpVCA 54 kD (monomeermoleculaire gewicht).
4. Coating van kralen
- Koel de centrifuge voor op 4 °C en zet het roermiddel droogblok (zie materiaaltabel) op 18 °C.
- Was de kralen: pipet 50 μL Xb-buffer in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg 9 μL kralensuspensie met een diameter van 4,5 μm of 2 μL kralensuspensie met een diameter van 1 μm (2,5 % suspensie van 4,5 μm) toe (zie materiaaltabel). Meng grondig en centrifugeer de monsters bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Het totale oppervlak van beide kraalmaten is 3 cm2:
afgeleid door het aantal kralen en vervolgens hun totale oppervlak te berekenen met behulp van klassieke vergelijkingen voor het volume en de oppervlakte van bollen. Andere maten kralen kunnen worden gebruikt als de hoeveelheden worden aangepast om het totale oppervlak constant te houden op 3 cm2. - Bestrijk de kralen: verwijder het supernatant voorzichtig zonder de kralen te storen en resuspenseer de kraalkorrel in 40 μL van 2 μM SpVCA (of 7 μM VCA) in Xb-buffer door voorzichtig pipetteren. Roeren bij 18 °C, 1.000 tpm gedurende 20 min.
- Gewassen gecoate kralen: centrifugeer het mengsel (20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C) en verwijder het supernatant voorzichtig. Resuspendeer de kralen in 50 μL koude Xb/1% BSA en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en herhaal de wasstap 1x.
- Resuspendeer de gecoate kraalkorrel uit stap 4.4 in 120 μL koude Xb/1% BSA voor beide maten kralen, zodat de hoeveelheid kraaloppervlak/μL kraaloplossing hetzelfde is. Bewaren op ijs in een koelkast of koelcel. Gecoate kralen blijven minstens enkele weken normaal functioneren.
5. Het voorbereiden van de motiliteitsmix en dia's voor observatie
OPMERKING: Het totale volume van de motiliteitsmix is 8,4 μL om rekening te houden met ongeveer 25 μm speling tussen de dia en de 18 mm x 18 mm afdeklip, zodat kralen van alle groottes (tot 10 μm diameter) niet worden geperst. De basismotiliteitsmix is ongeveer 5 μM G-actine (10% gelabeld fluorescerend actine) met 5 μM profiline, 50 nM Arp2/3 complex en 25 nM capping protein (of 240 nM gelsolin).
- Bereid het motiliteitsreactiemengsel voor. Exacte hoeveelheden actine (en dus profiline) zijn afhankelijk van de in stap 3.3 berekende concentratie, maar een representatieve reactie is als volgt. Meng op ijs, in deze volgorde: 3,2 μL MB13, 1,5 μL profiline bij 30 μM verdund in MB13, 1 μL capping protein bij 0,21 μM verdund in MB13 of gelsolin verdund tot 2 μM in MB13, 1 μL Arp2/3 complex bij 0,47 μM verdund in MB13, 0,2 μL kragelsuspensie (vortex vlak voor gebruik), en 1,5 μL actine bij 30 μM in G-buffer. Meng goed maar snel en start de timer.
- Spot het hele motiliteitsreactiemengsel op een dia. Dek af met een afdeklip van 18 mm x 18 mm en sluit de afdeklip af met gesmolten VALAP met een kleine kwast. VALAP is een mengsel van lanoline, paraffine en vaseline (zie Tabel van Materialen) 1:1:1 in gewicht, gesmolten en samen geroerd.
6. Microscopie observatie
- Observeer motiliteitsreacties onmiddellijk met behulp van een 100x objectief op een rechtopstaande of een omgekeerde microscoop (zie Materiaaltabel), uitgerust met fasecontrast en/of epifluorescentiemicroscopie (GFP-kubus, zie Materiaaltabel). Waarnemingen gebeuren bij kamertemperatuur (23-25 °C).
- Om gemiddelde verplaatsingssnelheden voor een hele populatie kralen te verkrijgen, registreert u fasecontrast of fluorescerende stilstaande beelden in de loop van de tijd door de hele dia te scannen. Meet de komeetlengte met de hand en plot versus tijd. De helling van de lineaire fit is de gemiddelde groeisnelheid.
- Om de snelheid van individuele kralen te evalueren, verzamelt u time-lapse-films in fasecontrastmicroscopie. Afhankelijk van de kraalsnelheid en de vereiste resolutie, neem frames om de 1-10 s. Gebruik de trackingtool van elk beeldverwerkingsprogramma om kraalsnelheden en trajecten te verkrijgen.
Representative Results
Een van de belangrijkste aspecten van het reproduceerbaar creëren van actinekometen op kralen is zacht en nauwkeurig pipetteren van delicate actinebindende eiwitten. Het genereren van een Bradford-standaardcurve is een goede manier om pipetteervaardigheden te evalueren. Figuur 1A,B toont de buizen voor de standaardcurve en een voorbeeld van hoe de twee seriële verdunningen van BSA eruit zien als ze eenmaal gemengd zijn met Bradford-reagens. Let op de gegradeerde blauwe tint (hogere eiwitconcentratie geeft een blauwere oplossing). Wanneer deze oplossingen worden afgelezen in de spectrofotometer en uitgezet, geven ze een standaardcurve zoals weergegeven in figuur 1C. Om zorgvuldig pipetteren te oefenen, moet de test worden herhaald totdat de lineaire correlatiefactor 0,999 is, zoals getoond.
Zodra de concentraties van commerciële geresuspendeerde eiwitten zorgvuldig zijn geëvalueerd via de Bradford-test, worden gecoate kralen en motiliteitsmix bereid en gemengd. Figuur 2A toont representatieve beelden van de verschillende stadia van komeetvorming: actinewolken vormen zich binnen enkele minuten na het mengen van SpVCA-gecoate kralen en motiliteitsmedium; wolkenpolarisatie vindt plaats na ~ 5 minuten en komeetproductie op 15-20 minuten. De actinekometen, zichtbaar met zowel epifluorescentie- als fasecontrastmicroscopie (figuur 2A), blijven vele uren langer worden, maar een consistente snelheid wordt niet gehandhaafd, zodat de parelmotiliteit normaal gesproken binnen 1 uur wordt geëvalueerd. Aan de andere kant duurt het 30 minuten met VCA-gecoate kralen om heldere actinewolken te verkrijgen (figuur 2B) en vormen zich geen kometen, hoewel symmetrie begint te breken bij 1-2 uur (pijl in figuur 2B) en wolken polarisatie vertonen na nachtelijke incubatie.
Figuur 3 toont een voorbeeld van parelsnelheidsevaluatie in aanwezigheid van capping-eiwit. Omdat alle kralen de symmetrie op ongeveer hetzelfde moment verbreken, worden "pseudo-time-lapse" -opnames uitgevoerd waarbij de dia wordt gescand en foto's van de hele populatie kometen in de loop van de tijd worden gemaakt (figuur 3A). Kometen depolymeriseren niet; daarom kan de toename van komeetlengtes gemeten in de loop van de tijd worden gebruikt om de verplaatsingssnelheid te berekenen (figuur 3B). Gelsolin kan worden gebruikt op de plaats van het afdekken van eiwit voor komeetvorming als 10x meer gelsolin wordt toegevoegd om de verminderde afdekactiviteit te compenseren. Kometen gevormd in aanwezigheid van gelsolin zijn kwalitatief hetzelfde en bewegen met ongeveer dezelfde snelheden als kralen met capping protein (figuur 3C). Capping-activiteit is de sleutel tot het concentreren van polymerisatie aan het oppervlak van de kraal, en wanneer noch capping-eiwit noch gelsolin zijn opgenomen in de motiliteitsmix, polariseren actinewolken nooit om kometen te vormen, hoewel heldere actinewolken zich rond de kralen vormen (figuur 3D). Kometen op kralen kunnen worden gebruikt om op actine gebaseerde krachtproductie in verschillende biochemische contexten te meten door de motiliteitsmix te wijzigen en het resultaat op motiliteit te observeren met behulp van verschillende micromanipulatietechnieken, bijvoorbeeld15.
Figuur 1: Bradford-standaardcurve. (A) Afbeelding van hoe de buizen moeten worden ingesteld voor het maken van de Bradford-standaardcurve. Voorbeeldbuizen worden niet getoond. (B) Afbeelding van de twee overlappende BSA seriële verdunningen eenmaal gemengd met Bradford-reagens. (C) De absorpties bij 600 nm van de onder B) vermelde oplossingen worden gemeten in de spectrofotometer en worden uitgezet als functie van de eiwitconcentraties van de BSA-oplossingen. De lineaire pasvorm wordt gebruikt om de monsterconcentratie te berekenen. De correlatiefactor, R, van de lineaire fit is 0,999. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Komeetvorming op SpVCA-gecoate kralen in tegenstelling tot VCA-gecoate kralen. (A) Representatieve SpVCA-gecoate kralen (verschillende kraal in elke afbeelding) die in de loop van de tijd worden getoond. Tijd vanaf het moment van mengen wordt aangegeven. Actinewolken vormen zich onmiddellijk en wolkenpolarisatie geeft kometen, die urenlang blijven uitrekken. (B) Representatieve VCA-gecoate kralen (verschillende kraal in elke afbeelding) die in de loop van de tijd worden getoond. Meer dan 1 uur is nodig om het begin van actinewolkpolarisatie (pijl) te zien en zelfs lange incubaties produceren geen kometen. Alle beelden zijn van kralen met een diameter van 4,5 μm, epifluorescentiebeeldvorming van fluorescerende actine in combinatie met fasecontrastvisualisatie voor de tijdspunten van 15 en 20 minuten in (A), schaalbalken = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van de kometen en de kraalsnelheid. (A) en (C) In aanwezigheid van capping protein (CP) of gelsolin polariseren actinewolken om kometen te vormen in de eerste 20 minuten van de reactie, en kometen verlengen in de loop van de tijd. Tijd vanaf het mengen aangegeven voor elke afbeelding; elke afbeelding is een andere kraal. Er is enige variabiliteit tussen kralen en bereiding, maar gemiddeld bewegen kralen met micron / sub-micron per minuut snelheden (0,2-1 μm / min) onder de hier beschreven standaardomstandigheden. (B) Representatieve grafiek met de evaluatie van de lengte van de komeet (hele populatie van kralen) in de loop van de tijd. De helling van de lineaire correlatie komt overeen met de gemiddelde verplaatsingssnelheid, in dit geval 0,24 μm /min. (D) Bij afwezigheid van aftoppingsactiviteit (geen capping-eiwit of gelsolin), vormen zich actinewolken rond kralen, maar vormen zich geen kometen. Alle beelden zijn van kralen met een diameter van 4,5 μm, epifluorescentiebeeldvorming van fluorescerende actine, schaalstaven = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft hoe actinenetwerkgroei op kraaloppervlakken, komeetvorming en kraalmotiliteit kan worden verkregen met behulp van commercieel beschikbare eiwitten. Soms worden kometen echter niet reproduceerbaar waargenomen of zijn ze inhomogeen tussen de dia en de coverslip. De volgende discussie benadrukt enkele belangrijke punten in het protocol en suggereert enkele parameters die kunnen worden aangepast. Een factor om in gedachten te houden is dat komeetvorming en kraalsnelheid worden beïnvloed door temperatuur, met temperaturen ver boven 25 ° C of veel minder dan 23 ° C die de komeetvorming negatief beïnvloeden en onherleidbare gegevens opleveren. Het gebruik van een temperatuurgestuurde microscoop of een microscoop in een klimaatgestuurde ruimte wordt sterk aanbevolen. Hoewel fluorescerend gelabeld actine vaak wordt opgenomen in de motiliteitsmix om kometen te observeren door fluorescentiemicroscopie, zodra kometen meer dan een kraaldiameter in lengte hebben, zijn ze ook zichtbaar door fasecontrastmicroscopie als een donker uitstrijkje naast de kraal. Fasecontrastvisualisatie is meer geschikt voor time-lapse-beeldvorming, omdat enige fototoxiciteit wordt geassocieerd met fluorescentiebeeldvorming, zelfs via een draaiende schijf. Omdat kralen na verloop van tijd bezinken, produceert een omgekeerde microscoop minder horizontale kraaldrift dan een rechtopstaande en is het meer geschikt voor films. Het gebruik van gesmolten VALAP om dia's af te dichten is belangrijk omdat stoffen zoals nagellak de vorming van komeet verstoren. Grote hoeveelheden VALAP kunnen in een bekerglas worden gemaakt en vervolgens worden geschept om kleinere bekers bij te vullen die vatbaarder zijn voor snel smelten. VALAP is jarenlang goed bij kamertemperatuur.
Een ander belangrijk technisch aspect is een zorgvuldige buffer- en motiliteitsmixvoorbereiding. Voorzichtigheid is geboden bij het bereiden van MB13, met name bij de pH-aanpassingsstap. De pH van MB13 moet snel worden aangepast naar neutraal met NaOH om ATP-hydrolyse te voorkomen, maar niet te snel als de EGTA solubilizeert naarmate de pH neutraal nadert. EGTA is een belangrijk ingrediënt omdat het het calcium complexeert dat gebonden is aan actine, waardoor in de motiliteitsmix de actievere magnesiumvorm16 ontstaat. MB13 te snel of te langzaam voorbereid geeft suboptimale komeetvorming of zelfs helemaal geen. Een bijkomend belangrijk punt is om de KCl-concentratie in de motiliteitsmix zorgvuldig bij te houden bij het spelen met omstandigheden. Bijvoorbeeld, bij gebruik van 1x MB13 in de reactiemix en verdunning van profiline, capping eiwit en het Arp2/3-complex in MB13, is de uiteindelijke KCl-concentratie in de motiliteitsreactie ongeveer 40-50 mM als gevolg van verdunning door G-buffer. Deze concentratie geeft de beste resultaten in de komeettest, en meer dan 60 mM KCl vermindert de Arp2/3 complexe nucleating activiteit.
Aan de eiwitkant van de dingen is een cruciaal technisch aspect van het verkrijgen van actinekometen een goede behandeling van commerciële actinebindende eiwitten, in het bijzonder nauwkeurige pipettering van microliterhoeveelheden. De lineariteit van de Bradford-standaardcurve is een goede test van pipetteren en de curve kan vervolgens worden gebruikt voor routinematige metingen van eiwitconcentraties. Bij het gebruik van geresuspendeerde commerciële eiwitten voor de komeetprocedure is het inderdaad belangrijk om altijd de eiwitconcentraties te verifiëren, omdat batchvariabiliteit en gebruikersfouten tijdens resuspensie kunnen leiden tot verschillen tussen reële en verwachte concentraties. Soms kunnen kleine verschillen in eiwitconcentraties leiden tot de volledige afwezigheid van kometen.
Een ander belangrijk aspect van de hier gepresenteerde methode is het gebruik van profiline-gecomplexeerde G-actine als brandstof voor polymerisatie. Historisch gezien gebruikten in vitro systemen pre-gepolymeriseerde filamenteuze actine (F-actine) als actinebron: depolymerisatie in de bulk gevoede polymerisatie op het oppervlak10,17. Dit had het voordeel dat het G-actineniveaus controleerde, maar voegde een laag complexiteit toe die extra componenten nodig had om depolymerisatie te katalyseren. Aangezien de omzet van het actinenetwerk niet noodzakelijk is voor de productie van kracht en motiliteit, die worden gevoed door nucleatie en polymerisatie aan het oppervlak van de kraal, terwijl actine-depolymerisatiefactoren zoals ADF / cofilin werken op de verouderde netwerken ver van het oppervlak18, wordt de meeste in vitro reconstitutie van actine-gebaseerde motiliteit nu gedaan zonder omzet voor eenvoud. Er zijn echter enkele nadelen aan het gebruik van G-actine. Ten eerste, bij het gebruik van commerciële actine, dat is gelyofiliseerd, zijn oligomeren aanwezig. De hier beschreven depolymerisatiestappen zijn erg belangrijk voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. In het bijzonder, hoewel G-buffer traditioneel wordt aangepast aan pH 8, lijkt een lagere pH (bijvoorbeeld pH 7) beter te werken in de in dit artikel beschreven testen, mogelijk omdat een lage pH depolymerisatie verbetert19. Een ander nadeel van het gebruik van G-actine is dat eenmaal geplaatst in zoutomstandigheden die tolerant zijn voor polymerisatie, spontane nucleatie optreedt en F-actine zich vormt in de bulk en op het kraaloppervlak. Het complexeren van G-actine met profiline onderdrukt spontane nucleatie in de bulk en puntige eindpolymerisatie, waardoor zowel nucleatie als prikkeldraad-endpolymerisatie aan het oppervlak wordt gericht20. Profilin-G-actine is fysiologisch relevant, omdat veel van het actine in de cel in deze vorm aanwezig is21. Hier wordt een 1:1 verhouding van profilin:actine gebruikt; hogere verhoudingen (bijvoorbeeld 3:1) remmen echter de polymerisatie in de bulk grondiger, hoewel hogere verhoudingen ook het Arp2/3-complex en de prikkeldraadeindverlenging tot op zekere hoogte remmen22,23.
Aftoppingsactiviteit is ook de sleutel voor komeetvorming, omdat het zorgt voor het inbrengen van nieuwe actine aan het oppervlak via cycli van nucleatie door oppervlakte-geactiveerd Arp2/3-complex24,25. Zonder afdekken breken actinewolken de symmetrie om kometen te vormen niet, omdat polymerisatie aan het oppervlak niet genoeg spanning opbouwt om de wolk open te breken26. In het verleden hebben we zelfgezuiverd recombinant muisafdekeiwit13 gebruikt, maar tests die voor dit artikel zijn uitgevoerd, geven aan dat commercieel verkrijgbaar recombinant humaan capping-eiwit even effectief is, net als commercieel verkrijgbaar gelsolin, hoewel 10x meer gelsolin moet worden gebruikt, en voor bepaalde toepassingen is het misschien niet geschikt omdat het actine-scheidende activiteit heeft en27.
Ten slotte ligt de robuustheid van deze methode in het gebruik van een zeer actieve Arp2/3 complexe activator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA omvat het profiline-G-actine bindingsdomein van WASP (het p-domein) naast het Arp2/3 complexe bindingsdomein, omdat dit het meest efficiënt blijkt te zijn in profiline-G-actine condities29. Wat nog belangrijker is, het gebruik van de streptavidin-tag, oorspronkelijk geïntroduceerd om oppervlaktefunctionalisatie via de biotine-streptavidin-link mogelijk te maken, heeft het extra effect van het verhogen van de Arp2/3-complexactivering, vermoedelijk vanwege het feit dat streptavidin een tetrameer is en dus de activator clustert, waarvan bekend is dat deze de Arp2/3-complexe activiteit verhoogt30 . Commercieel geproduceerde SpVCA is momenteel in ontwikkeling en zal binnenkort beschikbaar zijn voor aankoop. Verder moet worden opgemerkt dat, hoewel 40 μL van 2 μM SpVCA routinematig wordt gebruikt om 3 cm2 van het kraaloppervlak te coaten, andere coatingconcentraties (hoger en lager) ook werken, en spelen met deze omstandigheden geeft verschillende komeetgroeisnelheden en morfologieën. Inderdaad, wanneer kometen zich niet vormen of de komeetgrootte niet homogeen is op de dia, moeten verschillende coatingomstandigheden worden getest, evenals verschillende KCl- en profilineconcentraties in de motiliteitsmix. De concentraties van actine, Arp2/3-complex en capping-eiwit in de motiliteitsmix kunnen ook worden gewijzigd om de vorming van komeet te optimaliseren, maar in onze handen geeft het veranderen van deze verhoudingen vaak verwarrende resultaten.
Tot slot produceren de hier beschreven methoden actineassemblage op kraaloppervlakken en beweeglijkheid, maar elk oppervlak dat met SpVCA kan worden gefunctionaliseerd, kan worden gebruikt. In gevallen waarin adsorptie zoals hier beschreven niet werkt, kan het streptavidin-deel worden gebruikt om SpVCA na biotinylering aan het interesseoppervlak te bevestigen. De aldus gevormde actinestructuren, kometen of anderszins, kunnen worden gebruikt voor het testen van verschillende biochemische en biofysische aspecten van actinenetwerken en zijn vooral geschikt voor fysieke manipulaties met micropipettes, optische pincetten en laserablaties 15,26,31,32. Naast het gebruik ervan voor de onderzoeksgemeenschap, is de hier beschreven aanpak geschikt als een leermiddel voor niet-gegradueerde biofysicastudenten om actieve materieconcepten zoals symmetriebreuk en zelforganisatie te bestuderen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben met de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
We danken de leden van ons nieuwe huis bij LPENS oprecht voor hun warme welkom, en in het bijzonder het ABCDJ-team voor al hun hulp en steun. J.P. erkent financiële steun van de Stichting ARC (Grant PJA 20191209604) en C.S. erkent financiële steun van de Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | A12373 (recently discontinued) | This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol. |
| Actin, rabbit muscle, ATTO-488 | Hypermol | 8153 | |
| Actin, rabbit skeletal muscle | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Arp2/3 complex | Cytoskeleton | RP01P | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BioSpectrometer, basic | Eppendorf | 035739 | |
| Bradford Reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| BSA, high quality | Sigma | A3059 | |
| BSA standard 2 mg/mL (Pierce) | Thermo Scientific | 23209 | |
| Capping protein (a1b2, mouse recombinant) | Home-purified (Reference 13) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
| Capping protein (a1b2, human recombinant) | Hypermol | 8322 | |
| Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 | Olympus | discontinued | Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used. |
| Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) | Eppendorf | 035963 | |
| ** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL | Eppendorf | 035969 | |
| Gelsolin (human recombinant, His-tagged) | Cytoskeleton | HPG6 | |
| Lanolin | Sigma | 49909 | |
| Microcentrifuge 5427R + rotor | Eppendorf | 934126 | |
| Microscope, upright: BX51 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
| Microscope, inverted: IX70 | Olympus | discontinued | Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used. |
| Paraffin | Sigma | 76244 | |
| Petroleum jelly: Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Pipettes Research Plus | Eppendorf | Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example). | |
| **10 µL | 933954 | ||
| **2.5 µL | 933953 | These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended. | |
| Polystyrene carboxylate beads | Polysciences | ||
| **approx. 1 µm diameter | 08226 | ||
| **approx. 4.5 µm diameter | 17140-5 | ||
| Profilin 1 (human recombinant, untagged) | Cytoskeleton | PR02 | |
| SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) | Home-purified (Reference 14) | This product will soon be commercially available from Cytoskeleton. | |
| VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) | Cytoskeleton | VCG03 |
References
- Campellone, K. G., Welch, M. D. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).
- Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
- Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility. Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
- Tilney, L. G., Tilney, M. S. The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria. Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).
- Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).
- Taunton, J., et al. Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP. Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).
- Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis. BMC Developmental Biology. 7, 142 (2007).
- Merrifield, C. J., et al. Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells. Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).
- Samarin, S., et al. How VASP enhances actin-based motility. Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).
- Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
- Boujemaa-Paterski, R., et al. Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility. Nature Communications. 8 (1), 655 (2017).
- Akin, O., Mullins, R. D. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 133 (5), 841-851 (2008).
- Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).
- Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005 (2013).
- Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -F., Sykes, C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).
- Carlier, M. -F. Actin: protein structure and filament dynamics. Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).
- Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).
- Reymann, A. -C., et al. Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin. Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).
- Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin's multiple actions on actin filaments. Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).
- Plastino, J., Blanchoin, L. Dynamic stability of the actin ecosystem. Journal of Cell Science. 132 (4), 219832 (2019).
- Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
- Suarez, C., et al. Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex. Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).
- Courtemanche, N., Pollard, T. D. Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments. Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).
- Achard, V., et al. A "primer"-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).
- Sykes, C., Plastino, J. Actin filaments up against a wall. Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).
- vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).
- McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -K., Simonetti, K. D. The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions. FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).
- Abou-Ghali, M., et al. Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility. Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).
- Yarar, D., D'Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. Motility determinants in WASP family proteins. Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).
- Padrick, S. B., et al. Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins. Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).
- Bussonier, M., et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).
- Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -F., Sykes, C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).
