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Bioengineering

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन के साथ एक्टिन-आधारित गतिशीलता का पुनर्गठन

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64261
Automatic Translation
1, 1
1Laboratoire de physique de l’Ecole Normale Supérieure, ENS, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université Paris Cité

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन सामग्री का उपयोग करके मोतियों की सतहों पर एक्टिन धूमकेतु का उत्पादन कैसे किया जाए। ऐसी प्रणालियां कोशिकाओं में पाई जाने वाली प्रोट्रूसिव संरचनाओं की नकल करती हैं, और इसका उपयोग सरलीकृत तरीके से बल उत्पादन के शारीरिक तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

कई सेल आंदोलनों और आकार में परिवर्तन और कुछ प्रकार के इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल और ऑर्गेनेल गतिशीलता बायोपॉलीमर एक्टिन द्वारा संचालित होते हैं जो सेल, ऑर्गेनेल या जीवाणु की सतह पर एक गतिशील नेटवर्क बनाते हैं। इस प्रक्रिया के दौरान बल उत्पादन के जैव रासायनिक और यांत्रिक आधार का अध्ययन अक्रिय सतहों जैसे मोती पर एक कोशिकीय तरीके से एक्टिन-आधारित आंदोलन को पुन: उत्पन्न करके किया जा सकता है जो घटकों के नियंत्रित सेट के साथ कार्यात्मक और इनक्यूबेट होते हैं। उपयुक्त परिस्थितियों में, एक लोचदार एक्टिन नेटवर्क मोती की सतह पर इकट्ठा होता है और नेटवर्क विकास से उत्पन्न तनाव के कारण खुल जाता है, जिससे एक "एक्टिन धूमकेतु" बनता है जो मोती को आगे बढ़ाता है। हालांकि, इस तरह के प्रयोगों के लिए विभिन्न एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन के एक मेजबान के शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है, जो अक्सर उन्हें गैर-विशेषज्ञों की पहुंच से परे रखते हैं। यह लेख व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों का उपयोग करके एक्टिन धूमकेतु और मोतियों की गतिशीलता को पुन: प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है। मोती की गति, प्रक्षेपपथ और अन्य मापदंडों पर प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए मोती कोटिंग, मोती का आकार और गतिशीलता मिश्रण को बदला जा सकता है। इस परख का उपयोग विभिन्न एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन की जैव रासायनिक गतिविधियों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, और मात्रात्मक भौतिक माप करने के लिए जो एक्टिन नेटवर्क के सक्रिय पदार्थ गुणों पर प्रकाश डालते हैं। यह समुदाय के लिए एक उपयोगी उपकरण होगा, जो एक्टिन-बाध्यकारी प्रोटीन शुद्धिकरण में विशेषज्ञ ज्ञान के बिना इन विट्रो एक्टिन-आधारित गतिशीलता के अध्ययन को सक्षम करेगा।

Introduction

कोशिकाओं में एक्टिन पोलीमराइजेशन को सेल सिग्नलिंग1 के डाउनस्ट्रीम एक्टिन फिलामेंट न्यूक्लियेशन के तंग विनियमन द्वारा स्थानिक और अस्थायी रूप से नियंत्रित किया जाता है। न्यूक्लियेशन एक एक्टिन ट्रिमर के गठन के माध्यम से होता है, और फिर नवजात फिलामेंट के दोनों छोर अनायास बहुलक होते हैं, हालांकि एक छोर दूसरे (नुकीले छोर) की तुलना में अधिक गतिशील (कांटेदार अंत) होता है। जब न्यूक्लियेशन और कांटेदार अंत पोलीमराइजेशन को एक सतह की ओर निर्देशित किया जाता है, तो वे गति के लिए कोशिका झिल्ली को बाहर धकेलने और ऊर्जा स्रोतके रूप में एटीपी हाइड्रोलिसिस के साथ सेल के अंदर माइक्रोन-आकार की वस्तुओं को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त बल (पिको-टू-नैनो न्यूटन रेंज में) उत्पन्न करते हैं। कुछ उदाहरणों में लिस्टेरिया मोनोसाइटोजेन्स बैक्टीरिया शामिल हैं जो कोशिका से कोशिका में फैलने के लिए एक्टिन धूमकेतु का उपयोग करते हैं, और माइटोकॉन्ड्रिया, जहां माइटोसिस 4,5 के दौरान यादृच्छिक विरासत के लिए एक्टिन धूमकेतु-आधारित आंदोलन महत्वपूर्ण है। एंडोसोम और अन्य इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं पर एक्टिन धूमकेतु को दाता झिल्ली 6,7,8 से अलगाव में फंसाया जाता है।

यहां प्रस्तुत विधि के साथ, सेलुलर एक्टिन पोलीमराइजेशन के सिग्नलिंग पहलुओं को दरकिनार कर दिया जाता है, और एक्टिन पोलीमराइजेशन को माइक्रोमेट्रिक पॉलीस्टाइनिन मोतियों पर ब्रांकेड एक्टिन न्यूक्लियेशन के सक्रियकर्ताओं के साथ कोटिंग करके उत्पादित किया जाता है, विशेष रूप से मानव डब्ल्यूएएसपी प्रोटीन के सक्रिय डोमेन, वीसीए (जिसे डब्ल्यूए या डब्ल्यूसीए भी कहा जाता है)1। लेपित मोतियों को तब एक मिश्रण में इनक्यूबेट किया जाता है जिसमें एक्टिन पोलीमराइजेशन के लिए आवश्यक तत्व होते हैं, जिसमें कोशिकाओं में मुख्य एक्टिन पोलीमराइजेशन न्यूक्लेटर, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स शामिल है, जिसे वीसीए द्वारा बीड़ी की सतह पर सक्रिय किया जाता है ताकि बेटी फिलामेंट्स1 के किनारों से शाखाओं के रूप में नए फिलामेंट्स बनाए जा सकें। एक्टिन शुरू में मोती के चारों ओर समान रूप से बहुलक होता है, लेकिन फिर अनायास एक एक्टिन धूमकेतु बनाने के लिए समरूपता को तोड़ता है जो मोती को आगे बढ़ाता है, जिससे सेल जैसे प्रोट्रूसिव नेटवर्क और धूमकेतु को नियंत्रित तरीके से फिर से बनाया जाता है। मोतियों और अन्य लेपित सतहों के साथ इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग अतीत में हमारे और अन्य लोगों द्वारा एक्टिन पोलीमराइजेशन 9,10,11,12 के जैव रसायन और बायोफिज़िक्स का अध्ययन करने के लिए किया गया है, लेकिन इन प्रयोगों के लिए एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन में व्यापक विशेषज्ञता की आवश्यकता थी। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (या जल्द ही उपलब्ध होने वाले) अभिकर्मकों के साथ पूरी तरह से एक्टिन धूमकेतु और गतिशीलता कैसे बनाई जाए, जिससे यह दृष्टिकोण किसी के लिए भी सुलभ हो जाता है, जिसमें बायोफिज़िकल अवधारणाओं को पढ़ाने के लिए शैक्षिक सेटिंग भी शामिल है। मुख्य विशेषताओं में कोमल और विश्वसनीय पिपेटिंग का महत्व, एक्टिन स्रोत के रूप में प्रोफाइलिन-जटिल मोनोमर का उपयोग, और एक मोती कोटिंग अभिकर्मक के रूप में अत्यधिक सक्रिय अप्रैल 2/3 कॉम्प्लेक्स एक्टिवेटर का उपयोग करने की अनिवार्यता शामिल है।

Protocol

1. बफर की तैयारी

नोट: सभी बफर के लिए अल्ट्राप्योर एच2ओ का उपयोग करें। यह बाँझ नहीं होना चाहिए। चरण 1.1-1.4 में वर्णित सभी समाधानों को 0.2 μm सिरिंज फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें, उपयोग के आधार पर 500 μL-2 mL प्रति ट्यूब के भागों में एलिकोट करें, और -20 °C पर स्टोर करें।

  1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2 ग्राम बीएसए का वजन करके 10% बीएसए तैयार करें और एच 2 ओ के साथ20एमएल निशान तक भरें।
    नोट: उच्च गुणवत्ता बीएसए का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 10% बीएसए समाधान का उपयोग मोती तैयार करने और गतिशीलता मिश्रण दोनों में किया जाता है।
  2. मोती तैयार करने के लिए, एक्सबी बफर (10 एमएम एचईपीईएस, 0.1 एमकेसीएल, 1 एमएम एमजीसीएल2, और 0.1 एमएम सीएसीएल2, पीएच 7.5) को 10x घोल के रूप में तैयार करें, और उपयोग से पहले पतला करें (10x Xb स्टॉक समाधान का 100 μL + H2O का 900 μL)। Xb/1% BSA तैयार करें, जिसमें 10x Xb स्टॉक समाधान का 100 μL + 10% BSA का 100° L +H2O का 800 μL मिलाकर तैयार करें।
  3. जी-बफर (2 एमएम ट्राइस, 0.2 एमएम सीएसीएल2, 0.2 एमएम डीटीटी, 2 एमएम एटीपी) तैयार करें, जो मोनोमेरिक एक्टिन (जी-एक्टिन) को पतला करने के लिए उपयोग किया जाने वाला बफर है। पीएच 7 को समायोजित करें, न कि पीएच 8 जैसा कि पारंपरिक रूप से उपयोग किया जाता है (चर्चा देखें)।
  4. गतिशीलता बफर MB13 (10 mM HEPES, 1.5 mM ATP, 3 mM DTT, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% बीएसए, pH 7.5) तैयार करें। कुछ अनुप्रयोगों के लिए, 10x MB13 उपयोगी है। हालांकि, बीएसए के बिना 10x MB13 तैयार करें, क्योंकि यह पीएच समायोजन के दौरान समस्याओं की ओर जाता है। 10x MB13 से 1x MB13 का पुनर्गठन करते समय 10% स्टॉक समाधान (चरण 1.1 में तैयार) से बीएसए जोड़ें।

2. प्रोटीन समाधान की तैयारी

नोट: सभी पुन: निलंबन के लिए अल्ट्राप्योर एच2ओ का उपयोग करें। यह बाँझ नहीं होना चाहिए। बर्फ पर सभी प्रोटीनों को संभालें और पूर्व-ठंडा ट्यूबों में एलिकोट करें। बुलबुले का उत्पादन न करने के लिए धीरे से हेरफेर करें, और कभी भी भंवर प्रोटीन समाधान न करें। स्टॉक को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीजिंग आवश्यक नहीं है। लगभग पांच फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचने के लिए एलिकोट आकार को अनुकूलित करें, क्योंकि यह किसी भी प्रोटीन की गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है। काम करने वाले एलिकोट को कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

  1. जी-एक्टिन (खरगोश कंकाल की मांसपेशी) समाधान तैयार करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. ट्यूब के तल पर ठोस इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पल्स सेंट्रीफ्यूज एक्टिन पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एच2ओ जोड़ें (बिना लेबल वाले एक्टिन के लिए ठंडे एच2ओ के 100 μL में 1 मिलीग्राम प्रोटीन, एटीटीओ-लेबल एक्टिन के लिए कोल्ड एच2ओ के 100 μL में 100 μg प्रोटीन)।
    3. इसे कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर बैठने दें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं, इसे कम से कम 15 मिनट बर्फ पर बैठने दें, और फिर से मिलाएं। ट्यूब के तल पर समाधान एकत्र करने और रीमिक्स करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पल्स सेंट्रीफ्यूज।
    4. उपयोग के आधार पर बिना लेबल वाले एक्टिन के 10-50 μL एलिकोट तैयार करें, और एटीटीओ-लेबल एक्टिन के 20 μL एलिकोट। -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
    5. लियोफिलाइजेशन और फ्रीजिंग के दौरान बनने वाले एक्टिन ऑलिगोमर्स को डीपोलीमराइज करने के लिए, अतिरिक्त एटीपी और डीटीटी के साथ स्पाइक किए गए जी-बफर में पुन: निलंबित एक्टिन ~ 8-गुना के एक एलिकोट को पतला करें (उदाहरण के लिए, चरण 2.1.4 से पुन: निलंबित एक्टिन समाधान के 20 डिग्रीलीटर तक, जी-बफर के 134 μL जोड़ें, 0.2 mM ATP का 0.32 μL और 1 M DTT का 0.16 μL जोड़ें)। फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए, लगभग 10% लेबल एक्टिन जोड़ें; उदाहरण के लिए, एटीटीओ-लेबल एक्टिन के 5 μL को पतला अनलेबल एक्टिन के 40 μL में जोड़ें। चरण 3 में वर्णित ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता को मापने से पहले कम से कम कुछ दिनों से एक सप्ताह तक इसे कभी-कभी मिश्रण (पिपेटिंग) के साथ बर्फ पर डीपोलीमराइज करें।
      नोट: ठंडे कमरे या रेफ्रिजरेटर में बर्फ पर पतला बिना लेबल और फ्लोरोसेंट एक्टिन रखें; कभी भी फ्रीज या गर्म होने की अनुमति न दें। तैयारी समय के साथ डीपोलिमराइजिंग जारी रहेगी, और जब ठीक से संभाला जाता है तो कम से कम 6 महीने तक उपयोग किया जा सकता है।
  2. चरण 2.1 में एक्टिन के लिए वर्णित बर्फ पर पल्स सेंट्रीफ्यूजिंग, मिक्सिंग आदि के अनुक्रम के साथ निर्माता के निर्देशों (20 μL ठंडेH2 O में 20μg प्रोटीन) का पालन करते हुए Arp2/3 कॉम्प्लेक्स (सामग्री की तालिका देखें) को पुन: निलंबित करें। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों के लिए एक बड़ा स्टॉक रखने के लिए पाउडर के दो ट्यूबों को फिर से निलंबित करने से प्रोटीन समाधानों को मिलाएं। 2 μL एलिकोट तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. चरण2.1में एक्टिन के लिए बर्फ पर पल्स सेंट्रीफ्यूजिंग, मिक्सिंग आदि के अनुक्रम के साथ निर्माता के निर्देशों (25 μL कोल्ड एच 2 ओ में 100 μg प्रोटीन) में निर्धारित सांद्रता की तुलना में 4 गुना अधिक सांद्रता पर पुन: निलंबित प्रोफाइलिन (मानव पुनः संयोजक) (सामग्री की तालिका देखें)। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रयोगों के लिए एक बड़ा स्टॉक रखने के लिए प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने से पहले पाउडर के दो ट्यूबों को पुन: निलंबित करने से प्रोटीन समाधानों को मिलाएं।
    नोट: ठंडे कमरे या रेफ्रिजरेटर में बर्फ पर रखें; कभी भी फ्रीज या गर्म होने की अनुमति न दें। जब ठीक से संभाला जाता है, तो पुन: निलंबित प्रोफाइलिन कम से कम 6 महीने से 1 वर्ष के लिए अच्छा होता है।
  4. चरण 2.1 में एक्टिन के लिए वर्णित बर्फ पर पल्स सेंट्रीफ्यूजिंग, मिक्सिंग आदि के अनुक्रम के साथ निर्माता के निर्देशों (50 μL ठंडेH2O में 50 μg प्रोटीन) का पालन करते हुए पुन: निलंबन कैपिंग प्रोटीन (a1:2, मानव पुनः संयोजक) (सामग्री की तालिका देखें)। बर्फ पर ग्लिसरॉल के 50 μL को ठंडा करें और इसमें 50 μL पुन: निलंबित कैपिंग प्रोटीन जोड़ें; धीरे से मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: समाधान फ्रीज नहीं होता है और गतिविधि मजबूत होती है, इसलिए समाधान को महीनों, या यहां तक कि वर्षों तक एकल एलिकोट के रूप में रखा जा सकता है, अगर सावधानी से संभाला जाए। माउस रिकॉम्बिनेंट कैपिंग प्रोटीन, जो इन विट्रो प्रयोगों13 में अतीत में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है, जल्द ही व्यावसायिक रूप से उपलब्ध होगा।
  5. चरण 2.1 में एक्टिन के लिए वर्णित बर्फ पर पल्स सेंट्रीफ्यूजिंग, मिक्सिंग आदि के अनुक्रम के साथ निर्माता के निर्देशों (20 μL कोल्डH2 O में 20μg प्रोटीन) का पालन करते हुए पुन: निलंबन जेलसोलिन (मानव पुनः संयोजक, हिस-टैग्ड) (सामग्री की तालिका देखें)। प्रयोगों के प्रति दिन लगभग 2 μL Gelsolin का उपयोग किया जाता है; इसलिए, बड़े एलिकोट (5-10 μL) तैयार करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: गेलसोलिन के साथ प्रोटोकॉल एक विकल्प के रूप में प्रदान किया जाता है। गेलसोलिन के स्थान पर कैपिंग प्रोटीन के उपयोग की सिफारिश की जाती है, या तो13 में खरीदा या शुद्ध किया जाता है।
  6. VCA (मानव WASP-VCA, GST-tagged) ( सामग्री की तालिका देखें) को निर्माता के निर्देशों में निर्धारित की तुलना में 2 गुना अधिक सांद्रता पर पुन: निलंबित करें (250 μL ठंडेH2O में 500 μg प्रोटीन), चरण 2.1 में एक्टिन के लिए बर्फ पर पल्स सेंट्रीफ्यूजिंग, मिश्रण आदि के अनुक्रम के साथ। 10 μL एलिकोट बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: एक बार एसपीवीसीए (मानव पीवीसीए, स्ट्रेप्टाविडिन और हिस-टैग) का व्यावसायीकरण हो जाता है या यदि प्रोटीन शुद्धि14 संभव है, तो वीसीए के बजाय एसपीवीसीए के उपयोग की सिफारिश की जाती है। वीसीए यहां वर्णित शर्तों के तहत धूमकेतु को स्पष्ट रूप से नहीं देता है।

3. प्रोटीन सांद्रता का माप

  1. बीएसए के दो अतिव्यापी सीरियल कमजोर पड़ने से बने ब्रैडफोर्ड मानक वक्र का निर्माण करें।
    नोट: मानक वक्र को केवल हर कुछ महीनों (या यहां तक कि कम बार) का निर्माण करने की आवश्यकता होती है जब तक कि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नहीं बदलता है।
    1. माइक्रोट्यूब रैक की पंक्ति 1 में, बीएसए तनुकरण श्रृंखला # 1 के लिए ट्यूब रखें: चार 2 एमएल ट्यूबों के बाद चार 1.5 एमएल ट्यूब। रैक की पंक्ति 3 में, श्रृंखला # 1 के रूप में बीएसए तनुकरण श्रृंखला # 2 के लिए ट्यूब रखें। रैक की पंक्ति 5 में, प्रत्येक नमूने के लिए दो 1.5 एमएल ट्यूबों के साथ मापा जाने के लिए एक 2 एमएल ट्यूब रखें। रिक्त स्थान के लिए पंक्ति 5 में एक एकल 1.5 एमएल ट्यूब जोड़ें।
    2. ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक को मापें ( सामग्री की तालिका देखें) 1.5 एमएल ट्यूबों में।
      1. बर्फ पर आसान पाइपिंग के लिए ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ शीर्ष पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब भरें (रेफ्रिजरेटर में स्टॉक बोतल को अतिरिक्त वापस कर दिया जाएगा)। 200 μL ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक लें और पिपेट टिप को गीला करने के लिए इसे शंक्वाकार ट्यूब में वापस निकाल दें। चूंकि समाधान चिपचिपा है, इसलिए समाधान को बुलबुले बनाए बिना पूरी तरह से टिप में प्रवेश करने और छोड़ने की अनुमति देने के लिए धीरे-धीरे पिपेट करें।
      2. "प्री-वेट" टिप के साथ, धीरे-धीरे ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 200 μL को रैक में 1.5 एमएल ट्यूबों में से प्रत्येक में डाल दिया जाता है (प्रत्येक बीएसए कमजोर पड़ने के लिए चार, रिक्त स्थान के लिए एक और मापा जाने वाले प्रत्येक नमूने के लिए दो)। प्रोटीन समाधान के साथ मिश्रण करने से पहले ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक को कमरे के तापमान पर अच्छी तरह से गर्म करने की अनुमति देने के लिए इसे पहले करें। बोतल में 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब की शेष सामग्री वापस करें।
    3. 2एमएल ट्यूबों में एच 2 ओ मापें। रैक की पंक्ति 1 में, पहली ट्यूब में 1,990 μL H2O जोड़ें, और तीन अन्य ट्यूबों में 900 μL जोड़ें। पंक्ति 3 के लिए, पहली ट्यूब में 1,992.5 μL और तीन अन्य ट्यूबों में 900 μL जोड़ें। पंक्ति 5 में प्रत्येक नमूना ट्यूब में 2,000 μL H2O जोड़ें।
      नोट: 1,000 μL से बड़े सभी संस्करणों के लिए, 1,000 μL पिपेट का उपयोग करें, लेकिन दो बार पाइपिंग द्वारा पूरी राशि का प्रशासन करें। बाद के चरणों को शुरू करने से पहले सब कुछ तैयार करना महत्वपूर्ण है, ताकि प्रोटीन को लंबे समय तक एच2ओ में अत्यधिक पतला छोड़ने से बचा जा सके।
    4. बीएसए तनुकरण श्रृंखला # 1 तैयार करने के लिए, 10 μL कैलिब्रेटेड 2 mg / mL बीएसए ( सामग्री की तालिका देखें) को ट्यूब में 10 μl H2O के साथ मिलाकर 10 μg / mL घोल बनाएं। इससे, प्रत्येक घोल के 900 μL को अगली ट्यूब (जिसमें 900 μL H 2 O युक्त) में स्थानांतरित करके तीन सीरियल कमजोर पड़ने (5 μg/mL, 2.5 μg/mL, और1.25μg/mL BSA) बनाएं।
    5. बीएसए तनुकरण श्रृंखला # 2 तैयार करने के लिए, 7.5 μL कैलिब्रेटेड 2 mg / mL BSA को ट्यूब में 1,992.5 μL H2O के साथ मिलाकर 7.5 μg / mL घोल बनाएं। इसमें से, प्रत्येक घोल के 900 μL को अगली ट्यूब (जिसमें 900 μL H2O युक्त) में स्थानांतरित करके तीन सीरियल डाइल्यूशन (3.75 μg/mL, 1.875 μg/mL और 0.9375 μg/mL BSA) बनाएं।
    6. मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए अवशोषण को मिलाएं और पढ़ें। रिक्त स्थान के लिए ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक ट्यूब में 800 μL H2O जोड़ें, और टाइमर प्रारंभ करें। बुलबुले बनाए बिना यथासंभव कुशलता से, तैयार ट्यूबों में 200 μL ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ प्रत्येक बीएसए मानक के 800 μL मिलाएं। एक बार जब सभी मानकों को ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक (< 5 मिनट) के साथ मिला दिया जाता है, तो प्रत्येक मानक को डिस्पोजेबल क्यूवेट में डालें और मशीन को खाली करने के बाद स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 600 एनएम पर अवशोषण पढ़ें।
      नोट: पूरी श्रृंखला को पढ़ने के लिए एक ही क्यूवेट का उपयोग किया जा सकता है यदि कम से कम केंद्रित मानक पहले पढ़ा जाता है और क्यूवेट को पढ़ने के बीच अच्छी तरह से खाली किया जाता है। मानक वक्र को तब तक फिर से करें जब तक कि रैखिक फिट का आर मान कम से कम 0.99 न हो। पाइपिंग और कोमल मिश्रण में महारत हासिल करने के बाद ही, नमूने पढ़ने के लिए आगे बढ़ें।
  2. एक्टिन और एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन की सांद्रता को मापें
    1. H2O के 2,000 μL (चरण 3.1.3 में तैयार) वाले2mL ट्यूबों में, धीरे से निम्नलिखित में मिलाएं: Arp2/3 कॉम्प्लेक्स और प्रोफाइलिन में से प्रत्येक में 2 μL, लेबल G-actin का 4 μL, गेलसोलिन और VCA का 5 μL और कैपिंग प्रोटीन (मानव पुनः संयोजक) का 8 μL। तुरंत समाधान का 800 μL लें और पहले से तैयार ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ मिलाएं, और फिर प्रत्येक नमूने के लिए एक दूसरे के 5% -10% के भीतर दो रीडिंग करने के लिए दोहराएं। एक बड़ा अंतर पुन: निलंबन या हैंडलिंग के साथ एक समस्या को इंगित करता है। ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ मिश्रण के कुछ मिनटों के भीतर पढ़ें।
      नोट: यदि किसी अन्य दिन से मानक वक्र का उपयोग करते हैं, तो नमूने के अलावा, चरण 3.1.6 से केवल रिक्त स्थान तैयार किया जाना चाहिए।
  3. मानक वक्र और कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग करके एक्टिन और एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन की सांद्रता की गणना करें। प्रत्येक नए पुन: निलंबन के लिए माप को फिर से करें। ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से प्राप्त मिलीग्राम / एमएल रीडिंग को μM में परिवर्तित करने के लिए आणविक भार हैं: एक्टिन 43 kD, Arp2/3 कॉम्प्लेक्स 224 kD, प्रोफाइलिन 15 kD, गेलसोलिन 95 kD, कैपिंग प्रोटीन 68 kD (मानव पुनः संयोजक) या 63.5 kD (माउस रिकॉम्बिनेंट), VCA 43 kD, और SPVCA 54 kD (मोनोमर आणविक भार)।

4. मोतियों की कोटिंग

  1. सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और आंदोलनकारी सूखे ब्लॉक ( सामग्री की तालिका देखें) को 18 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. मोतियों को धोएं: 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक्सबी बफर के 50 μL पिपेट जोड़ें, 4.5 μm व्यास के मोती निलंबन का 9 μL जोड़ें या 1 μm व्यास मोती निलंबन (2.5% w / v निलंबन) का 2 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। अच्छी तरह से मिलाएं और नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: दोनों मोती आकारों का कुल मोती सतह क्षेत्र 3 सेमी2 है:
    Equation 1
    मोतियों की संख्या और फिर गोले के आयतन और सतह क्षेत्र के लिए क्लासिक समीकरणों का उपयोग करके उनकी कुल सतह की गणना करके प्राप्त किया गया। मोतियों के अन्य आकारों का उपयोग किया जा सकता है यदि कुल सतह क्षेत्र को 3 सेमी 2 पर स्थिर रखने के लिए मात्रा को समायोजित किया जाताहै।
  3. मोतियों को कोट करें: मोतियों को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें, और कोमल पिपेटिंग द्वारा एक्सबी बफर में 2 μM SpVCA (या 7 μM VCA) के 40 μL में मोती की गोली को फिर से निलंबित करें। 20 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस, 1,000 आरपीएम पर आंदोलन करें।
  4. लेपित मोतियों को धोएं: मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x g ) और सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक हटा दें। 1% बीएसए के 50 μL में मोतियों को फिर से निलंबित करें, और सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x g पर पुन: निलंबित करें। सतह पर तैरने वाला निकालें और वॉशिंग स्टेप 1एक्स को दोहराएं।
  5. लेपित मोती गोली को चरण 4.4 से 120 μL ठंडे Xb/1% BSA में दोनों आकारों के मोतियों के लिए पुन: निलंबित करें ताकि मोती की सतह क्षेत्र/μL की मात्रा समान हो। रेफ्रिजरेटर या ठंडे कमरे में बर्फ पर स्टोर करें। लेपित मोती कम से कम कई हफ्तों तक सामान्य रूप से काम करना जारी रखेंगे।

5. अवलोकन के लिए गतिशीलता मिश्रण और स्लाइड तैयार करना

नोट: गतिशीलता मिश्रण की कुल मात्रा 8.4 μL है जो स्लाइड और 18 मिमी x 18 मिमी कवरस्लिप के बीच लगभग 25 μm निकासी की अनुमति देती है ताकि सभी आकारों (10 μm व्यास तक) के मोतियों को निचोड़ा न जा सके। मूल गतिशीलता मिश्रण लगभग 5 μM G-actin (10% लेबल फ्लोरोसेंट एक्टिन) है जिसमें 5 μM प्रोफाइलिन, 50 nM Arp2/3 कॉम्प्लेक्स, और 25 nM कैपिंग प्रोटीन (या 240 nM gelsolin) हैं।

  1. गतिशीलता प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें। एक्टिन की सटीक मात्रा (और इसलिए प्रोफाइलिन) चरण 3.3 में गणना की गई एकाग्रता पर निर्भर करती है, लेकिन एक प्रतिनिधि प्रतिक्रिया निम्नानुसार है। बर्फ पर इस क्रम में मिलाएं: MB13 का 3.2 μL, MB13 में पतला 30 μM पर 1.5 μL प्रोफिलिन, MB13 में पतला 0.21 μM पर प्रोटीन का 1 μL या MB13 में 2 μM तक पतला किया गया, Arp2/3 कॉम्प्लेक्स का 1 μL 0.47 μM पर MB13 में पतला, 0.2 μL b13 में पतला, 0.2 μL bad Suspension (vortex) में पतला 0.2 μM पर, 1 μL arp2/3 कॉम्प्लेक्स एमबी 13 में पतला, 0.2 μL bad Suspension (vortex) में पतला 0.21 μM पर प्रोटीन का 1 μL, MB13 में पतला 1.2 μM, 0.2 μL bed suspension (उपयोग से ठीक पहले) में पतला 0.21 μM पर प्रोटीन का 1 μL और जी-बफर में 30 μM पर 1.5 μL एक्टिन। अच्छी तरह से मिलाएं लेकिन जल्दी से और टाइमर शुरू करें।
  2. एक स्लाइड पर संपूर्ण गतिशीलता प्रतिक्रिया मिश्रण को देखें। 18 मिमी x 18 मिमी कवरस्लिप के साथ कवर करें और एक छोटे पेंटब्रश का उपयोग करके पिघले हुए VALAP के साथ कवरस्लिप को सील करें। VALAP लैनोलिन, पैराफिन और पेट्रोलियम जेली का मिश्रण है ( सामग्री की तालिका देखें) 1: 1: 1 वजन से, पिघला हुआ और एक साथ हिलाया जाता है।

6. माइक्रोस्कोपी अवलोकन

  1. एक सीधे या उल्टे माइक्रोस्कोप पर 100x उद्देश्य का उपयोग करके गतिशीलता प्रतिक्रियाओं का तुरंत निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें), जो चरण कंट्रास्ट और / या एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (जीएफपी क्यूब, सामग्री की तालिका देखें) से लैस है। अवलोकन कमरे के तापमान (23-25 डिग्री सेल्सियस) पर किए जाते हैं।
    1. मोतियों की पूरी आबादी के लिए औसत विस्थापन गति प्राप्त करने के लिए, पूरी स्लाइड को स्कैन करके समय के साथ चरण कंट्रास्ट या फ्लोरोसेंट स्टिल छवियों को रिकॉर्ड करें। धूमकेतु की लंबाई को हाथ और प्लॉट बनाम समय से मापें। रैखिक फिट का ढलान औसत विकास गति है।
    2. अलग-अलग मोतियों की गति का मूल्यांकन करने के लिए, चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी में टाइम-लैप्स फिल्में एकत्र करें। मोती की गति और आवश्यक रिज़ॉल्यूशन के आधार पर, हर 1-10 सेकंड में फ्रेम लें। मोती की गति और प्रक्षेपपथ प्राप्त करने के लिए किसी भी छवि प्रसंस्करण प्रोग्राम के ट्रैकिंग टूल का उपयोग करें।

Representative Results

मोतियों पर एक्टिन धूमकेतु बनाने के प्रमुख पहलुओं में से एक नाजुक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन का कोमल और सटीक पाइपिंग है। ब्रैडफोर्ड मानक वक्र उत्पन्न करना पिपेटिंग कौशल का मूल्यांकन करने का एक अच्छा तरीका है। चित्रा 1 ए, बी मानक वक्र के लिए ट्यूबों को दिखाता है और ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ मिश्रित होने पर बीएसए के दो सीरियल कमजोर पड़ने का एक उदाहरण दिखाता है। वर्गीकृत नीले रंग पर ध्यान दें (उच्च प्रोटीन एकाग्रता एक नीला घोल देती है)। जब स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में पढ़ा जाता है और प्लॉट किया जाता है, तो ये समाधान एक मानक वक्र देते हैं जैसा कि चित्र 1 सी में दिखाया गया है। सावधानीपूर्वक पाइपिंग का अभ्यास करने के लिए, परख को तब तक दोहराया जाना चाहिए जब तक कि रैखिक सहसंबंध कारक 0.999 न हो, जैसा कि दिखाया गया है।

एक बार ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से वाणिज्यिक पुन: निलंबित प्रोटीन की सांद्रता का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया गया है, लेपित मोती और गतिशीलता मिश्रण तैयार किए जाते हैं और एक साथ मिश्रित होते हैं। चित्रा 2 ए धूमकेतु गठन के विभिन्न चरणों की प्रतिनिधि छवियों को दिखाता है: एसपीवीसीए-लेपित मोतियों और गतिशीलता माध्यम को मिलाने के मिनटों के भीतर एक्टिन बादल बनते हैं; बादल ध्रुवीकरण ~ 5 मिनट पर होता है और धूमकेतु उत्पादन 15-20 मिनट पर होता है। एपिफ्लोरेसेंस और फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 ए) दोनों के साथ दिखाई देने वाले एक्टिन धूमकेतु, कई घंटों तक लम्बी होते रहते हैं, लेकिन एक सुसंगत गति बनाए नहीं रखी जाती है इसलिए मोती गतिशीलता का मूल्यांकन सामान्य रूप से 1 घंटे के भीतर किया जाता है। दूसरी ओर, चमकीले एक्टिन बादलों (चित्रा 2 बी) को प्राप्त करने के लिए वीसीए-लेपित मोतियों के साथ 30 मिनट लगते हैं, और कोई धूमकेतु नहीं बनता है, हालांकि समरूपता 1-2 घंटे ( चित्रा 2 बी में तीर) पर टूटने लगती है और बादल रात भर इनक्यूबेशन के बाद ध्रुवीकरण दिखाते हैं।

चित्रा 3 कैपिंग प्रोटीन की उपस्थिति में मोती वेग मूल्यांकन का एक उदाहरण दिखाता है। चूंकि सभी मोती लगभग एक ही समय में समरूपता को तोड़ते हैं, इसलिए "छद्म-समय-चूक" रिकॉर्डिंग की जाती है जहां स्लाइड को स्कैन किया जाता है और धूमकेतु की पूरी आबादी की तस्वीरें समय के साथ ली जाती हैं (चित्रा 3 ए)। धूमकेतु डिपोलीमराइज्ड नहीं होते हैं; इसलिए, समय के साथ मापा धूमकेतु की लंबाई में वृद्धि का उपयोग विस्थापन गति (चित्रा 3 बी) की गणना करने के लिए किया जा सकता है। गेलसोलिन का उपयोग धूमकेतु के गठन के लिए कैपिंग प्रोटीन के स्थान पर किया जा सकता है यदि इसकी कम कैपिंग गतिविधि की भरपाई के लिए 10 गुना अधिक गेलसोलिन जोड़ा जाता है। गेलसोलिन की उपस्थिति में बनने वाले धूमकेतु गुणात्मक रूप से समान होते हैं और कैपिंग प्रोटीन (चित्रा 3 सी) के साथ मोतियों के समान गति से चलते हैं। कैपिंग गतिविधि मोती की सतह पर पोलीमराइजेशन को केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, और जब न तो कैपिंग प्रोटीन और न ही गेलसोलिन को गतिशीलता मिश्रण में शामिल किया जाता है, तो एक्टिन बादल धूमकेतु बनाने के लिए ध्रुवीकृत नहीं होते हैं, हालांकि मोतियों के चारों ओर उज्ज्वल एक्टिन बादल बनते हैं (चित्रा 3 डी)। मोतियों पर धूमकेतु का उपयोग गतिशीलता मिश्रण को बदलकर और विभिन्न माइक्रोमैनिपुलेशन तकनीकों का उपयोग करके गतिशीलता पर परिणाम का अवलोकन करके विभिन्न जैव रासायनिक संदर्भों में एक्टिन-आधारित बल उत्पादन को मापने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए15।

Figure 1
चित्र 1: ब्रैडफोर्ड मानक वक्र( ए) ब्रैडफोर्ड मानक वक्र बनाने के लिए ट्यूबों को कैसे सेट किया जाए, इसका चित्र। नमूना ट्यूब नहीं दिखाए जाते हैं। (बी) ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के साथ मिश्रित होने के बाद दो अतिव्यापी बीएसए सीरियल कमजोर पड़ने की तस्वीर। (सी) (बी) में दिखाए गए समाधानों के 600 एनएम पर अवशोषण को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में मापा जाता है और बीएसए समाधानों की प्रोटीन सांद्रता के कार्य के रूप में प्लॉट किया जाता है। नमूना एकाग्रता की गणना करने के लिए रैखिक फिट का उपयोग किया जाता है। रैखिक फिट का सहसंबंध कारक, आर, 0.999 है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: वीसीए-लेपित मोतियों के विपरीत एसपीवीसीए-लेपित मोतियों पर धूमकेतु का गठन। (ए) प्रतिनिधि एसपीवीसीए-लेपित मोती (प्रत्येक छवि में अलग-अलग मोती) समय के साथ दिखाए गए। मिश्रण के क्षण से समय इंगित किया गया है। एक्टिन बादल तुरंत बनते हैं, और बादल ध्रुवीकरण धूमकेतु देता है, जो घंटों तक लम्बा होता रहता है। (बी) प्रतिनिधि वीसीए-लेपित मोती (प्रत्येक छवि में अलग-अलग मोती) समय के साथ दिखाए गए। एक्टिन क्लाउड ध्रुवीकरण (तीर) की शुरुआत को देखने के लिए 1 घंटे से अधिक आवश्यक है और यहां तक कि लंबे ऊष्मायन धूमकेतु का उत्पादन नहीं करते हैं। सभी छवियां 4.5 μm व्यास के मोती, फ्लोरोसेंट एक्टिन की एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग (A) में 15 और 20 मिनट के समय-बिंदुओं के लिए चरण कंट्रास्ट विज़ुअलाइज़ेशन के साथ युग्मित हैं, स्केल सलाखों = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: धूमकेतु और मोती वेग विश्लेषण। (A) और (C) कैपिंग प्रोटीन (CP) या गेल्सोलिन की उपस्थिति में, एक्टिन बादल प्रतिक्रिया के पहले 20 मिनट में धूमकेतु बनाने के लिए ध्रुवीकृत होते हैं, और धूमकेतु समय के साथ बढ़ते हैं। प्रत्येक छवि के लिए इंगित मिश्रण से समय; प्रत्येक छवि एक अलग मोती है। मोतियों और तैयारी के बीच कुछ परिवर्तनशीलता है, लेकिन औसतन मोती यहां वर्णित मानक स्थितियों के तहत माइक्रोन / उप-माइक्रोन प्रति मिनट गति (0.2-1 μm / min) पर चलते हैं। (बी) समय के साथ धूमकेतु की लंबाई (मोतियों की पूरी आबादी) का मूल्यांकन दिखाने वाला प्रतिनिधि ग्राफ। रैखिक सहसंबंध का ढलान औसत विस्थापन गति से मेल खाता है, इस मामले में 0.24 μm / min. (D) कैपिंग गतिविधि (कोई कैपिंग प्रोटीन या गेलसोलिन नहीं) की अनुपस्थिति में, मोतियों के चारों ओर एक्टिन बादल बनते हैं, लेकिन धूमकेतु नहीं बनते हैं। सभी छवियां 4.5 μm व्यास के मोती, फ्लोरोसेंट एक्टिन की एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग, स्केल बार = 5 μm की हैं। कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां विस्तृत प्रोटोकॉल बताता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन का उपयोग करके मोती सतहों, धूमकेतु गठन और मोती गतिशीलता पर एक्टिन नेटवर्क वृद्धि कैसे प्राप्त की जाए। हालांकि, कभी-कभी धूमकेतु ओं को पुन: नहीं देखा जाता है या स्लाइड और कवरस्लिप के बीच असंगत होते हैं। निम्नलिखित चर्चा प्रोटोकॉल में कुछ प्रमुख बिंदुओं पर जोर देती है और कुछ मापदंडों का सुझाव देती है जिन्हें समायोजित किया जा सकता है। ध्यान रखने योग्य एक कारक यह है कि धूमकेतु गठन और मोती की गति तापमान से प्रभावित होती है, जिसमें तापमान 25 डिग्री सेल्सियस से बहुत अधिक या 23 डिग्री सेल्सियस से बहुत नीचे होता है जो धूमकेतु के गठन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है और अपरिवर्तनीय डेटा देता है। जलवायु-नियंत्रित कमरे में तापमान-नियंत्रित माइक्रोस्कोप या माइक्रोस्कोप का उपयोग दृढ़ता से अनुशंसित है। यद्यपि फ्लोरोसेंटली लेबल वाले एक्टिन को अक्सर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा धूमकेतु का निरीक्षण करने के लिए गतिशीलता मिश्रण में शामिल किया जाता है, एक बार धूमकेतु लंबाई में एक मोती व्यास से अधिक होते हैं, तो वे चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा मोती के बगल में एक अंधेरे स्मीयर के रूप में भी दिखाई देते हैं। फेज कंट्रास्ट विज़ुअलाइज़ेशन टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए अधिक उपयुक्त है क्योंकि कुछ फोटोटॉक्सिसिटी स्पिनिंग डिस्क के माध्यम से भी फ्लोरेसेंस इमेजिंग से जुड़ी होती है। क्योंकि मोती समय के साथ बस जाते हैं, एक उल्टा माइक्रोस्कोप एक सीधे की तुलना में कम क्षैतिज मोती बहाव पैदा करता है और फिल्मों के लिए अधिक उपयुक्त है। स्लाइड को सील करने के लिए पिघला हुआ वलप का उपयोग महत्वपूर्ण है क्योंकि नेल पॉलिश जैसे पदार्थ धूमकेतु के गठन में हस्तक्षेप करते हैं। बड़ी मात्रा में VALAP को एक बीकर में बनाया जा सकता है, और फिर छोटे बीकर को तेजी से पिघलने के लिए अधिक अनुकूल बनाने के लिए निकाला जा सकता है। कमरे के तापमान पर VALAP वर्षों के लिए अच्छा है।

एक अन्य प्रमुख तकनीकी पहलू सावधानीपूर्वक बफर और गतिशीलता मिश्रण तैयारी है। एमबी 13 तैयार करते समय सावधानी बरतनी चाहिए, विशेष रूप से पीएच समायोजन चरण पर। एटीपी हाइड्रोलिसिस से बचने के लिए एमबी 13 के पीएच को एनएओएच के साथ तटस्थ करने के लिए तेजी से समायोजित किया जाना चाहिए, लेकिन बहुत जल्दी नहीं क्योंकि ईजीटीए घुलनशील होता है क्योंकि पीएच तटस्थ तक पहुंचता है। ईजीटीए एक प्रमुख घटक है क्योंकि यह एक्टिन से बंधे कैल्शियम को जटिल करता है, गतिशीलता मिश्रण में अधिक सक्रिय मैग्नीशियम फॉर्म16 देता है। बहुत जल्दी या बहुत धीरे-धीरे तैयार किया गया एमबी 13 उप-धूमकेतु गठन देता है या यहां तक कि कोई भी नहीं। एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण बिंदु परिस्थितियों के साथ खेलते समय गतिशीलता मिश्रण में केसीएल एकाग्रता का सावधानीपूर्वक ट्रैक रखना है। उदाहरण के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण में 1x MB13 का उपयोग करते समय और प्रोफाइलिन को पतला करते समय, प्रोटीन को कैप करना, और MB13 में Arp2/3 कॉम्प्लेक्स, गतिशीलता प्रतिक्रिया में अंतिम KCl एकाग्रता लगभग 40-50 mM होती है। यह एकाग्रता धूमकेतु परख में सबसे अच्छा परिणाम देती है, और 60 एमएम केसीएल से अधिक एआरपी 2/3 जटिल न्यूक्लियेटिंग गतिविधि को कम करता है।

चीजों के प्रोटीन पक्ष पर, एक्टिन धूमकेतु प्राप्त करने का एक महत्वपूर्ण तकनीकी पहलू वाणिज्यिक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन का उचित संचालन है, विशेष रूप से माइक्रोलीटर मात्रा का सटीक पाइपिंग। ब्रैडफोर्ड मानक वक्र की रैखिकता पिपेटिंग का एक अच्छा परीक्षण है और वक्र का उपयोग प्रोटीन सांद्रता के नियमित माप के लिए किया जा सकता है। दरअसल, धूमकेतु प्रक्रिया के लिए पुन: निलंबित वाणिज्यिक प्रोटीन का उपयोग करते समय, हमेशा प्रोटीन सांद्रता को सत्यापित करना महत्वपूर्ण होता है, क्योंकि पुनर्निलंबन के दौरान बैच परिवर्तनशीलता और उपयोगकर्ता त्रुटि वास्तविक और अपेक्षित सांद्रता के बीच अंतर पैदा कर सकती है। कभी-कभी प्रोटीन सांद्रता में छोटे अंतर धूमकेतु की पूर्ण अनुपस्थिति का कारण बन सकते हैं।

यहां प्रस्तुत विधि का एक और महत्वपूर्ण पहलू पोलीमराइजेशन के लिए ईंधन के रूप में प्रोफाइलिन-कॉम्प्लेक्स जी-एक्टिन का उपयोग है। ऐतिहासिक रूप से, इन विट्रो सिस्टम ने एक्टिन स्रोत के रूप में प्री-पोलीमराइज्ड फिलामेंटस एक्टिन (एफ-एक्टिन) का उपयोग किया: सतह पर थोक फेड पोलीमराइजेशन में डिपोलीमराइजेशन10,17। इसमें जी-एक्टिन के स्तर को नियंत्रित करने का लाभ था, लेकिन जटिलता की एक परत को जोड़ा गया, जिसमें डिपोलीमराइजेशन को उत्प्रेरित करने के लिए अतिरिक्त घटकों की आवश्यकता होती है। चूंकि बल उत्पादन और गतिशीलता के लिए एक्टिन नेटवर्क का कारोबार आवश्यक नहीं है, जो मोती की सतह पर न्यूक्लियेशन और पोलीमराइजेशन द्वारा संचालित होते हैं, जबकि एडीएफ / कोफिलिन जैसे एक्टिन डिपोलीमराइजेशन कारक सतह18 से दूर वृद्ध नेटवर्क पर कार्य करते हैं, एक्टिन-आधारित गतिशीलता का अधिकांश इन विट्रो पुनर्गठन अब सादगी के लिए कारोबार के बिना किया जाता है। हालांकि, जी-एक्टिन का उपयोग करने के लिए कुछ कमियां हैं। सबसे पहले, वाणिज्यिक एक्टिन का उपयोग करते समय, जिसे लियोफिलाइज्ड किया गया है, ऑलिगोमर्स मौजूद हैं। यहां वर्णित डीपोलीमराइजेशन चरण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने में बहुत महत्वपूर्ण हैं। विशेष रूप से, हालांकि जी-बफर को पारंपरिक रूप से पीएच 8 में समायोजित किया जाता है, कम पीएच (पीएच 7, उदाहरण के लिए) इस लेख में वर्णित परख में बेहतर काम करता प्रतीत होता है, संभवतः क्योंकि कम पीएच डीपोलीमराइजेशन19 को बढ़ाता है। जी-एक्टिन का उपयोग करने का एक और नुकसान यह है कि एक बार नमक की स्थिति में पोलीमराइजेशन के लिए अनुमेय होने के बाद, सहज न्यूक्लियेशन होता है और एफ-एक्टिन थोक के साथ-साथ मोती की सतह पर भी बनता है। प्रोफाइलिन के साथ जी-एक्टिन को जटिल बनाना थोक और नुकीले अंत पोलीमराइजेशन में सहज न्यूक्लियेशन को दबा देता है, जिससे सतह20 पर न्यूक्लियेशन और कांटेदार एंड पोलीमराइजेशन दोनों पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। प्रोफाइलिन-जी-एक्टिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, क्योंकि सेल में अधिकांश एक्टिन इस रूप21 में मौजूद है। यहां, प्रोफाइलिन: एक्टिन के 1: 1 अनुपात का उपयोग किया जाता है; हालांकि, उच्च अनुपात (उदाहरण के लिए 3: 1) थोक में पोलीमराइजेशन को अधिक अच्छी तरह से रोकते हैं, हालांकि उच्च अनुपातकुछ हद तक एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स और कांटेदार अंत बढ़ाव को भी रोकते हैं।

धूमकेतु निर्माण के लिए कैपिंग गतिविधि भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सतह-सक्रिय एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स24,25 द्वारा न्यूक्लियेशन के चक्रों के माध्यम से सतह पर नए एक्टिन के सम्मिलन को सुनिश्चित करता है। कैपिंग के बिना, एक्टिन बादल धूमकेतु बनाने के लिए समरूपता को नहीं तोड़ते हैं क्योंकि सतह पर पोलीमराइजेशन क्लाउड26 को तोड़ने के लिए पर्याप्त तनाव का निर्माण नहीं करता है। अतीत में, हमने घर-शुद्ध पुनः संयोजक माउस कैपिंग प्रोटीन 13 का उपयोग किया है, लेकिन इस लेख के लिए किए गएपरीक्षणों से संकेत मिलता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक मानव कैपिंग प्रोटीन समान रूप से प्रभावी है, जैसा कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध गेलसोलिन है, हालांकि 10 गुना अधिक गेलसोलिन का उपयोग किया जाना है, और कुछ अनुप्रयोगों के लिए, यह उचित नहीं हो सकता है क्योंकि इसमें एक्टिन विच्छेदन गतिविधि के साथ-साथ कैपिंग27 भी है।

अंत में इस विधि की मजबूती एक बहुत ही सक्रिय एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स एक्टिवेटर, स्ट्रेप्टाविडिन-पीवीसीए (एसपीवीसीए) 28 के उपयोग में रहती है। एसपीवीसीए में एआरपी 2/3 जटिल बाइंडिंग डोमेन के अलावा डब्ल्यूएएसपी (पी डोमेन) के प्रोफाइलिन-जी-एक्टिन बाइंडिंग डोमेन शामिल हैं क्योंकि यह प्रोफाइलिन-जी-एक्टिन स्थितियों29 में सबसे कुशल पाया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि स्ट्रेप्टाविडिन टैग का उपयोग, जिसे मूल रूप से बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन लिंक के माध्यम से सतह कार्यात्मककरण की अनुमति देने के लिए पेश किया गया था, में एआरपी 2/3 जटिल सक्रियण को बढ़ाने का अतिरिक्त प्रभाव पड़ता है, संभवतः इस तथ्य के कारण कि स्ट्रेप्टाविडिन एक टेट्रामर है और इस प्रकार सक्रियकर्ता को क्लस्टर करता है, जिसे एआरपी 2/3 जटिल गतिविधि30 को बढ़ाने के लिए जाना जाता है। . व्यावसायिक रूप से उत्पादित एसपीवीसीए वर्तमान में विकास में है और जल्द ही खरीद के लिए उपलब्ध होगा। यह आगे ध्यान दिया जाना चाहिए कि, हालांकि 2 μM SpVCA का 40 μL नियमित रूप से 3 सेमी2 मोती की सतह को कोट करने के लिए उपयोग किया जाता है, अन्य कोटिंग सांद्रता (उच्च और निम्न) भी काम करती है, और इन स्थितियों के साथ खेलने से अलग-अलग धूमकेतु विकास गति और आकृति विज्ञान मिलता है। दरअसल, जब धूमकेतु नहीं बनते हैं या धूमकेतु का आकार स्लाइड पर समरूप नहीं होता है, तो विभिन्न कोटिंग स्थितियों का परीक्षण किया जाना चाहिए, साथ ही गतिशीलता मिश्रण में विभिन्न केसीएल और प्रोफाइलिन सांद्रता भी होनी चाहिए। गतिशीलता मिश्रण में एक्टिन, एआरपी 2/3 कॉम्प्लेक्स और कैपिंग प्रोटीन की सांद्रता को धूमकेतु गठन को अनुकूलित करने के लिए भी बदला जा सकता है, लेकिन हमारे हाथों में, इन अनुपातों को बदलना अक्सर भ्रामक परिणाम देता है।

निष्कर्ष निकालने के लिए, यहां वर्णित विधियां मोती की सतहों और गतिशीलता पर एक्टिन असेंबली का उत्पादन करती हैं, लेकिन किसी भी सतह जिसे एसपीवीसीए के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है, का उपयोग किया जा सकता है। ऐसे मामलों में जहां यहां वर्णित सोखना काम नहीं करता है, स्ट्रेप्टाविडिन मोइटी का उपयोग बायोटिनाइलेशन के बाद एसपीवीसीए को ब्याज की सतह पर संलग्न करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार गठित एक्टिन संरचनाओं, धूमकेतु या अन्यथा, का उपयोग एक्टिन नेटवर्क के विभिन्न जैव रासायनिक और बायोफिज़िकल पहलुओं के परीक्षण के लिए किया जा सकता है, और विशेष रूप से माइक्रोपिपेट्स, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और लेजर एब्लेशन 15,26,31,32 के साथ भौतिक जोड़तोड़ के लिए उपयुक्त हैं। अनुसंधान समुदाय के लिए इसके उपयोग के अलावा, यहां वर्णित दृष्टिकोण स्नातक बायोफिज़िक्स छात्रों के लिए सक्रिय पदार्थ अवधारणाओं जैसे समरूपता तोड़ने और आत्म-संगठन का अध्ययन करने के लिए एक शिक्षण उपकरण के रूप में उपयुक्त है।

Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि इस लेख की सामग्री के साथ उनके हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से LPENS में हमारे नए घर के सदस्यों को उनके गर्मजोशी से स्वागत के लिए स्वीकार करते हैं, और विशेष रूप से, ABCDJ टीम को उनकी सभी मदद और समर्थन के लिए। जेपी फाउंडेशन एआरसी (ग्रांट पीजेए 20191209604) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है, और सीएस मानव सीमांत विज्ञान कार्यक्रम संगठन (ग्रांट आरजीपी 0026/2020) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate  Invitrogen (ThermoFisher Scientific) A12373 (recently discontinued) This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol.
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 Hypermol 8153
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Arp2/3 complex Cytoskeleton RP01P
ATP Sigma A7699
BioSpectrometer, basic Eppendorf 035739
Bradford Reagent Bio-Rad 500-0006
BSA, high quality Sigma A3059
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) Thermo Scientific 23209
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) Home-purified (Reference 13) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
Capping protein (a1b2, human recombinant) Hypermol 8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 Olympus discontinued Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used.
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) Eppendorf 035963
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL Eppendorf 035969
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) Cytoskeleton HPG6
Lanolin Sigma 49909
Microcentrifuge 5427R + rotor Eppendorf 934126
Microscope, upright: BX51 Olympus discontinued Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Microscope, inverted: IX70 Olympus discontinued Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Paraffin Sigma 76244
Petroleum jelly: Vaseline Sigma 16415
Pipettes Research Plus Eppendorf Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example).
**10 µL 933954
**2.5 µL 933953 These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended.
Polystyrene carboxylate beads Polysciences
**approx. 1 µm diameter 08226
**approx. 4.5 µm diameter 17140-5
Profilin 1 (human recombinant, untagged) Cytoskeleton PR02
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) Home-purified (Reference 14) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) Cytoskeleton VCG03

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 188
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन के साथ एक्टिन-आधारित गतिशीलता का पुनर्गठन
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Sykes, C., Plastino, J.… More

Sykes, C., Plastino, J. Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64261, doi:10.3791/64261 (2022).

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