Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rekonstituering av aktinbasert motilitet med kommersielt tilgjengelige proteiner

Published: October 28, 2022 doi: 10.3791/64261
Automatic Translation
1, 1
1Laboratoire de physique de l’Ecole Normale Supérieure, ENS, Université PSL, CNRS, Sorbonne Université, Université Paris Cité

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man produserer aktinkometer på overflaten av perler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige proteiningredienser. Slike systemer etterligner de fremspringende strukturer som finnes i celler, og kan brukes til å undersøke fysiologiske mekanismer for kraftproduksjon på en forenklet måte.

Abstract

Mange cellebevegelser og formendringer og visse typer intracellulær bakteriell og organell motilitet drives av biopolymeraktin som danner et dynamisk nettverk på overflaten av cellen, organellen eller bakterien. Det biokjemiske og mekaniske grunnlaget for kraftproduksjon under denne prosessen kan studeres ved å reprodusere aktinbasert bevegelse på en acellulær måte på inerte overflater som perler som funksjonaliseres og inkuberes med et kontrollert sett med komponenter. Under passende forhold samles et elastisk aktinnettverk på perleoverflaten og bryter opp på grunn av spenningen som genereres av nettverksvekst, og danner en "aktinkomet" som driver perlen fremover. Imidlertid krever slike eksperimenter rensing av en rekke forskjellige aktinbindende proteiner, og setter dem ofte utenfor rekkevidden til ikke-spesialister. Denne artikkelen beskriver en protokoll for reproduserbar innhenting av aktinkometer og motilitet av perler ved bruk av kommersielt tilgjengelige reagenser. Perlebelegg, perlestørrelse og motilitetsblanding kan endres for å observere effekten på perlehastighet, baner og andre parametere. Denne analysen kan brukes til å teste de biokjemiske aktivitetene til forskjellige aktinbindende proteiner, og for å utføre kvantitative fysiske målinger som kaster lys over aktive materieegenskaper til aktinnettverk. Dette vil være et nyttig verktøy for samfunnet, som muliggjør studier av in vitro aktinbasert motilitet uten ekspertkunnskap i aktinbindende proteinrensing.

Introduction

Aktinpolymerisasjon i celler styres romlig og tidsmessig ved tett regulering av aktinfilamentkjernering nedstrøms for cellesignalering1. Nukleering skjer via dannelsen av en aktintrimer, og deretter polymeriseres begge ender av det begynnende filamentet spontant, selv om den ene enden er mer dynamisk (piggenden) enn den andre (den spisse enden)2. Når nukleering og piggendepolymerisasjon er rettet mot en overflate, produserer de nok kraft (i pico-til-nano Newton-serien) til å skyve ut cellemembranen for bevegelse og å flytte mikronstørrelsesobjekter inne i cellen med ATP-hydrolyse som energikilde3. Noen eksempler inkluderer Listeria monocytogenes bakterier som bruker aktinkometer til å spre seg fra celle til celle, og mitokondrier, hvor aktin kometbasert bevegelse er viktig for randomisert arv under mitose 4,5. Aktinkometer på endosomer og andre intracellulære vesikler er involvert i løsrivelse fra donormembraner 6,7,8.

Med metoden som presenteres her, blir signalaspektene ved cellulær aktinpolymerisering omgått, og aktinpolymerisasjon produseres på mikrometriske polystyrenperler ved å belegge dem med aktivatorer av forgrenet aktinkjernering, spesielt det aktive domenet til det humane WASP-proteinet, VCA (også kalt WA eller WCA)1. De belagte perlene inkuberes deretter i en blanding som inneholder ingrediensene som er nødvendige for aktinpolymerisering, inkludert hovedaktinpolymerisasjonskjernen i celler, Arp2/3-komplekset, som aktiveres av VCA på perleoverflaten for å danne nye filamenter som grener av sidene av datterfilamenter1. Aktin polymeriserer først jevnt rundt perlen, men bryter deretter spontant symmetrien for å skape en aktinkomet som skyver perlen fremover, og derved gjenskaper cellelignende fremspringende nettverk og kometer på en kontrollert måte. Lignende tilnærminger med perler og andre belagte overflater har tidligere blitt brukt av oss og andre for å studere biokjemi og biofysikk av aktinpolymerisasjon 9,10,11,12, men omfattende kompetanse innen aktinbindende proteiner var nødvendig for disse forsøkene. Protokollen som presenteres her beskriver hvordan man robust kan lage aktinkometer og motilitet helt med kommersielt tilgjengelige (eller snart tilgjengelige) reagenser, noe som gjør denne tilnærmingen tilgjengelig for alle, inkludert i en pedagogisk setting for undervisning i biofysiske konsepter. Nøkkelfunksjoner inkluderer viktigheten av skånsom og pålitelig pipettering, bruk av profilinkompleksmonomer som aktinkilde, og nødvendigheten av å bruke en svært aktiv Apr2/3 kompleks aktivator som et perlebeleggreagens.

Protocol

1. Klargjøring av buffere

MERK: Bruk ultraren H2O for alle buffere. Det trenger ikke å være sterilt. Filtrer alle oppløsningene beskrevet i trinn 1.1-1.4 med et 0,2 μm sprøytefilter, aliquot i porsjoner på 500 μL-2 ml per rør avhengig av bruk, og oppbevares ved -20 °C.

  1. Forbered 10% BSA ved å veie 2 g BSA i et 50 ml konisk rør og fyll til 20 ml merket med H2O. Bland til BSA er oppløst (ca. 30 min), og gjør deretter volumet til 20 ml.
    MERK: Bruk BSA av høy kvalitet (se tabell over materialer). 10% BSA-løsningen brukes i både dråpepreparasjon og motilitetsblandingen.
  2. For tilberedning av perler, tilbered Xb-buffer (10 mM HEPES, 0,1 M KCl, 1 mM MgCl 2 og 0,1 mM CaCl 2, pH 7,5) som en 10x løsning, og fortynn før bruk (100 μL av 10x Xb stamløsning + 900 μL av H2 O). Forbered Xb / 1% BSA ved å blande 100 μL 10x Xb stamløsning + 100 μL av 10% BSA + 800 μL H2O.
  3. Forbered G-buffer (2 mM Tris, 0,2 mM CaCl 2, 0,2 mM DTT,2 mM ATP), som er bufferen som brukes til å fortynne monomert aktin (G-aktin). Juster til pH 7, ikke pH 8 som tradisjonelt brukt (se diskusjon).
  4. Forbered motilitetsbufferen MB13 (10 mM HEPES, 1,5 mM ATP, 3 mM DTT, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM KCl, 1% BSA, pH 7,5). For noen applikasjoner er 10x MB13 nyttig. Forbered imidlertid 10x MB13 uten BSA, da det fører til problemer under pH-justering. Tilsett BSA fra 10 % mikstur, oppløsning (fremstilt i trinn 1.1) ved rekonstituering av 1x MB13 fra 10x MB13.

2. Tilberedning av proteinløsninger

MERK: Bruk ultraren H2O for alle resuspensions. Det trenger ikke å være sterilt. Håndter alle proteiner på is og aliquot i forkjølte rør. Manipuler forsiktig for ikke å produsere bobler, og aldri vortex proteinløsninger. For at lagrene skal lagres ved -80 °C, er det ikke nødvendig å fryse i flytende nitrogen. Tilpass aliquotstørrelsen for å unngå mer enn omtrent fem fryse-tine-sykluser, da dette ikke ser ut til å påvirke aktiviteten til noen av proteinene. Arbeidsaliquots kan lagres ved -20 °C i noen uker.

  1. Klargjør G-actin (kanin skjelettmuskulatur) løsning som beskrevet nedenfor.
    1. Pulssentrifuge aktinpulver (se tabell over materialer) ved 4 °C for å samle det faste stoffet i bunnen av røret.
    2. Tilsett H2 O i henhold til produsentens instruksjoner (1 mg protein i 100 μL kald H 2 O for umerket aktin, 100 μg protein i 100 μL kald H2O for ATTO-merket aktin).
    3. La den ligge på isen i minst 15 min. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned, la den ligge på is i minst 15 minutter til, og bland igjen. Pulssentrifuge ved 4 °C for å samle opp oppløsningen i bunnen av slangen, og remiks.
    4. Forbered 10-50 μL aliquots av umerket aktin avhengig av bruk, og 20 μL aliquots av ATTO-merket aktin. Oppbevar aliquotene ved -80 °C.
    5. For å depolymerisere aktinoligomerer som dannes under lyofilisering og frysing, fortynn en aliquot av resuspendert aktin ~ 8 ganger i G-buffer pigget med ytterligere ATP og DTT (for eksempel til 20μL resuspended aktinoppløsning fra trinn 2.1.4, tilsett 134 μL G-buffer, 0,32 μL av 0,2 mM ATP og 0,16 μL av 1 M DTT). For fluorescerende merking, legg til ca 10% merket aktin; Tilsett for eksempel 5 μL ATTO-merket aktin til 40 μL fortynnet umerket aktin. La det depolymerisere på is med sporadisk blanding (pipettering) minst noen dager til en uke før du måler proteinkonsentrasjon ved Bradford-analyse som beskrevet i trinn 3.
      MERK: Hold fortynnet umerket og fluorescerende aktin på is i et kaldt rom eller kjøleskap; Frys aldri eller la det varme. Preparatet vil fortsette å depolymerisere over tid, og når det håndteres riktig, kan det brukes i minst 6 måneder.
  2. Resuspend Arp2/3 kompleks (svin hjerne) (se tabell over materialer) etter produsentens instruksjoner (20 μg protein i 20 μL kaldt H 2 O), med sekvensen av puls sentrifugering, blanding, etc. på is som beskrevet for aktin i trinn2.1. Kombiner proteinløsningene fra å resuspendere to rør med pulver for å få et større lager for reproduserbare eksperimenter. Tilbered 2 μL aliquots og oppbevar ved -80 °C.
  3. Resuspend profilin (human rekombinant) (se materialtabell) med en 4x høyere konsentrasjon enn angitt i produsentens instruksjoner (100 μg protein i 25 μL kald H 2 O), med sekvensen av pulssentrifugering, blanding, etc. på is som for aktin i trinn2.1. Kombiner proteinløsningene fra å resuspendere to rør med pulver før du bestemmer proteinkonsentrasjonen for å få et større lager for reproduserbare eksperimenter.
    MERK: Oppbevares på is i et kjølerom eller kjøleskap; Frys aldri eller la det varme. Når det håndteres riktig, er resuspended profilin bra i minst 6 måneder til 1 år.
  4. Resuspendere kapslingsprotein (α1β2, human rekombinant) (se materialtabell) i henhold til produsentens instruksjoner (50 μg protein i 50 μL kald H 2 O), med sekvensen av pulssentrifugering, blanding etc. på is som beskrevet for aktin i trinn2.1. Chill 50 μL glyserol på is og tilsett 50 μL resuspended capping protein til det; bland forsiktig. Oppbevares ved -20 °C.
    MERK: Løsningen fryser ikke og aktiviteten er robust, slik at løsningen kan oppbevares som en enkelt aliquot i måneder, eller til og med år, hvis den håndteres forsiktig. Mus rekombinant capping protein, den mest brukte i det siste i in vitro eksperimenter13, vil snart være kommersielt tilgjengelig.
  5. Resuspend gelsolin (human rekombinant, His-tagged) (se materialtabell) etter produsentens instruksjoner (20 μg protein i 20 μL kald H 2 O), med sekvensen av pulssentrifugering, blanding, etc. på is som beskrevet for aktin i trinn2.1. Omtrent 2 μL gelsolin brukes per dag med eksperimenter; Tilbered derfor store aliquots (5-10 μL) og oppbevar ved -80 ° C.
    MERK: Protokollen med gelsolin er gitt som et alternativ. Bruk av capping protein i stedet for gelsolin anbefales, enten kjøpt eller renset som i13.
  6. Resuspend VCA (human WASP-VCA, GST-tagged) (se materialtabell) ved 2x høyere konsentrasjon enn angitt i produsentens instruksjoner (500 μg protein i 250 μL kald H 2 O), med sekvensen av pulssentrifugering, blanding, etc. på is som for aktin i trinn2.1. Lag 10 μL aliquots og oppbevar ved -80 °C.
    MERK: Når SpVCA (human pVCA, streptavidin og His-tagget) er kommersialisert eller hvis proteinrensing14 er mulig, anbefales bruk av SpVCA i stedet for VCA. VCA gir ikke reproduserbart kometer under de forhold som er beskrevet her.

3. Måling av proteinkonsentrasjoner

  1. Konstruer en Bradford-standardkurve laget av to overlappende serielle fortynninger av BSA.
    MERK: Standardkurven trenger bare å konstrueres hvert par måneder (eller enda sjeldnere) så lenge spektrofotometeret ikke endres.
    1. I rad 1 av et mikrorørstativ, plasser rør for BSA-fortynningsserie #1: fire 2 ml rør etterfulgt av fire 1,5 ml rør. I rad 3 i stativet, plasser rør for BSA fortynningsserie #2 som for serie #1. I rad 5 i stativet plasserer du ett 2 ml rør for hver prøve som skal måles sammen med to 1,5 ml rør. Legg til en enkelt 1,5 ml rør i rad 5 for blankt.
    2. Mål ut Bradford Reagens (se tabell over materialer) i 1,5 ml rørene.
      1. Fyll et 15 ml konisk rør til toppen med Bradford Reagent for enklere pipettering (overskudd vil bli returnert til lagerflasken i kjøleskapet) på is. Ta opp 200 μL Bradford Reagens og kast det tilbake i det koniske røret for å fukte pipettespissen. Siden oppløsningen er tyktflytende, pipette sakte for å la løsningen komme inn og forlate spissen helt uten å lage bobler.
      2. Med den "pre-våte" spissen, pipetter sakte 200 μL Bradford Reagens inn i hvert av de 1,5 ml rørene i stativet (fire for hver BSA-fortynning, en for blank og to for hver prøve som skal måles). Gjør dette først for å la Bradford-reagenset varmes grundig til romtemperatur før det blandes med proteinløsninger. Returner det gjenværende innholdet i det 15 ml koniske røret til flasken.
    3. Mål ut H 2 O i2ml rørene. I rad 1 av stativet legger du til 1,990 μL H2O til det første røret, og 900 μL til de tre andre rørene. For rad 3 tilsettes 1 992,5 μL til det første røret og 900 μL til de tre andre rørene. Tilsett 2,000 μL H2O til hvert av prøverørene i rad 5.
      MERK: For alle volumer større enn 1000 μL, bruk en 1000 μL pipette, men administrer hele mengden ved pipettering to ganger. Det er viktig å gjøre alt klart før du starter de påfølgende trinnene, for å unngå å forlate proteiner som er sterkt fortynnet i H2O i lange perioder.
    4. For å forberede BSA-fortynningsserie #1, bland 10 μL kalibrert 2 mg / ml BSA (se materialtabell) i røret med 1,990 μL H2O for å lage en 10 μg / ml løsning. Fra dette gjør du tre serielle fortynninger (5 μg / ml, 2,5 μg / ml og 1,25 μg / ml BSA) ved å overføre 900 μL av hver løsning til neste rør (inneholdende 900 μL H2O).
    5. For å forberede BSA-fortynningsserie #2, bland 7,5 μL kalibrert 2 mg / ml BSA inn i røret med 1,992,5 μL H2O for å lage en 7,5 μg / ml løsning. Fra dette gjør du tre serielle fortynninger (3,75 μg / ml, 1,875 μg / ml og 0,9375 μg / ml BSA) ved å overføre 900 μL av hver løsning til neste rør (inneholdende 900 μL H2O).
    6. Bland og les absorbans for å generere standardkurven. Tilsett 800 μL H2O i Bradford-reagensrøret for blankt, og start timeren. Så effektivt som mulig uten å lage bobler, bland 800 μL av hver BSA-standard med 200 μL Bradford-reagens i de fremstilte rørene. Når alle standardene er blandet med Bradford-reagens (< 5 min), hell hver standard i en engangskyvette og les absorbansen ved 600 nm i spektrofotometeret etter at maskinen er blank.
      MERK: Den samme kyvetten kan brukes til å lese hele serien hvis den minst konsentrerte standarden leses først og kyvetten tømmes godt mellom avlesningene. Gjør om standardkurven til den lineære tilpasningen har en R-verdi på minst 0,99. Først etter at pipettering og skånsom blanding er mestret, fortsett å lese prøver.
  2. Måle konsentrasjoner av aktin og aktinbindende proteiner
    1. I 2 ml rørene som inneholder 2000 μL H 2 O (fremstilt i trinn 3.1.3), bland forsiktig inn følgende:2μL hver av Arp2/3 kompleks og profilin, 4 μL merket G-aktin, 5 μL hver av gelsolin og VCA og 8 μL kappende protein (human rekombinant). Ta umiddelbart 800 μL av løsningen og bland med det allerede tilberedte Bradford-reagenset, og gjenta deretter for å ha to avlesninger innen 5% -10% av hverandre for hver prøve. En større forskjell indikerer et problem med resuspendering eller håndtering. Les innen få minutter etter blanding med Bradford reagens.
      MERK: Hvis du bruker en standardkurve fra en annen dag, må bare blankt fra trinn 3.1.6 klargjøres, i tillegg til prøvene.
  3. Beregn konsentrasjonene av aktin og aktinbindende proteiner ved hjelp av standardkurven og fortynningsfaktoren. Gjør om målingen for hver nye resuspendering. Molekylvekter for å konvertere mg / ml avlesninger oppnådd via Bradford-analyse til μM er: aktin 43 kD, Arp2/3-kompleks 224 kD, profilin 15 kD, gelsolin 95 kD, kappeprotein 68 kD (human rekombinant) eller 63,5 kD (musrekombinant), VCA 43 kD og SpVCA 54 kD (monomer molekylvekt).

4. Belegg av perler

  1. Forkjøl sentrifugen til 4 °C og sett den omrørende tørrblokken (se Materialtabell) til 18 °C.
  2. Vask perlene: pipette 50 μL Xb-buffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør, tilsett 9 μL med 4,5 μm diameter perlesuspensjon eller 2 μL med 1 μm diameter perlesuspensjon (2,5 % w/v suspensjon) (se materialtabell). Bland grundig og sentrifuger prøvene ved 20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
    MERK: Total dråpeoverflate av begge perlestørrelser er 3 cm2:
    Equation 1
    avledet ved å beregne antall perler og deretter deres totale overflate ved hjelp av klassiske ligninger for volum og overflateareal av sfærer. Andre størrelser av perler kan brukes hvis mengder justeres for å holde det totale overflatearealet konstant på 3 cm2.
  3. Belegg perlene: Fjern supernatanten forsiktig uten å forstyrre perlene, og resuspend perlepelleten i 40 μL av 2 μM SpVCA (eller 7 μM VCA) i Xb-bufferen ved forsiktig pipettering. Agiter ved 18 °C, 1000 o / min i 20 minutter.
  4. Vask belagte perler: sentrifuger blandingen (20 000 x g i 10 minutter ved 4 °C) og fjern supernatanten forsiktig. Resuspend perlene i 50 μL kald Xb / 1% BSA, og sentrifuge ved 20.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og gjenta vasketrinn 1x.
  5. Resuspend den belagte dråpepelleten fra trinn 4.4 i 120 μL kald Xb / 1% BSA for begge størrelser av perler, slik at mengden perleoverflate / μL perleoppløsning er den samme. Oppbevares på is i kjøleskap eller kjølerom. Belagte perler vil fortsette å fungere normalt i minst flere uker.

5. Forbereder motilitetsblandingen og lysbildene for observasjon

MERK: Det totale volumet av motilitetsblandingen er 8,4 μL for å tillate ca. 25 μm klaring mellom lysbildet og 18 mm x 18 mm dekselslipp, slik at perler i alle størrelser (opptil 10 μm diameter) ikke klemmes. Den grunnleggende motilitetsblandingen er ca. 5 μM G-aktin (10% merket fluorescerende aktin) med 5 μM profilin, 50 nM Arp2/3 kompleks og 25 nM capping protein (eller 240 nM gelsolin).

  1. Forbered motilitetsreaksjonsblandingen. Eksakte mengder aktin (og derfor profilin) avhenger av konsentrasjonen beregnet i trinn 3.3, men en representativ reaksjon er som følger. Bland på is, i denne rekkefølgen: 3,2 μL MB13, 1,5 μL profilin ved 30 μM fortynnet i MB13, 1 μL kappeprotein ved 0,21 μM fortynnet i MB13 eller gelsolin fortynnet til 2 μM i MB13, 1 μL Arp2/3-kompleks ved 0,47 μM fortynnet i MB13, 0,2 μL perlesuspensjon (vortex like før bruk), og 1,5 μL aktin ved 30 μM i G-buffer. Bland godt, men raskt og start timeren.
  2. Se hele motilitetsreaksjonsblandingen på et lysbilde. Dekk til med et deksel på 18 mm x 18 mm, og forsegl dekselet med smeltet VALAP med en liten pensel. VALAP er en blanding av lanolin, parafin og vaselin (se materialtabell) 1:1:1 etter vekt, smeltet og omrørt sammen.

6. Mikroskopi observasjon

  1. Observer motilitetsreaksjoner umiddelbart ved bruk av et 100x-mål på enten et oppreist eller et omvendt mikroskop (se materialtabell), utstyrt med fasekontrast og / eller epifluorescensmikroskopi (GFP-kube, se materialtabell). Observasjoner gjøres ved romtemperatur (23-25 °C).
    1. Hvis du vil oppnå gjennomsnittlige forskyvningshastigheter for en hel populasjon av perler, registrerer du fasekontrast eller fluorescerende stillbilder over tid ved å skanne hele lysbildet. Mål kometlengde for hånd og plott mot tid. Hellingen til den lineære passformen er den gjennomsnittlige veksthastigheten.
    2. For å evaluere hastigheten på individuelle perler, samle time-lapse-filmer i fasekontrastmikroskopi. Avhengig av perlehastigheten og oppløsningen som kreves, ta bilder hver 1-10 s. Bruk sporingsverktøyet til et hvilket som helst bildebehandlingsprogram for å oppnå perlehastigheter og baner.

Representative Results

Et av de viktigste aspektene ved reproduserbar fremstilling av aktinkometer på perler er skånsom og presis pipettering av delikate aktinbindende proteiner. Å generere en Bradford-standardkurve er en god måte å evaluere pipetteringsferdigheter på. Figur 1A, B viser rørene for standardkurven og et eksempel på hvordan de to serielle fortynningene av BSA ser ut når de er blandet med Bradford-reagens. Legg merke til den graderte blå nyansen (høyere proteinkonsentrasjon gir en blåere løsning). Når de leses i spektrofotometeret og plottes, gir disse løsningene en standardkurve som vist i figur 1C. For å øve forsiktig pipettering, bør analysen gjentas til den lineære korrelasjonsfaktoren er 0,999, som vist.

Når konsentrasjonene av kommersielle resuspenderte proteiner har blitt nøye evaluert via Bradford-analysen, fremstilles belagte perler og motilitetsblanding og blandes sammen. Figur 2A viser representative bilder av de forskjellige stadiene av kometdannelse: aktinskyer dannes i løpet av minutter etter blanding av SpVCA-belagte perler og motilitetsmedium; Skypolarisering skjer ved ~ 5 min og kometproduksjon ved 15-20 min. Aktinkometene, synlige med både epifluorescens og fasekontrastmikroskopi (figur 2A), fortsetter å forlenge i mange timer, men en konsistent hastighet opprettholdes ikke, slik at dråpemotilitet normalt evalueres innen 1 time. På den annen side tar det 30 minutter med VCA-belagte perler for å oppnå lyse aktinskyer (figur 2B), og ingen kometer dannes, selv om symmetrien begynner å bryte ved 1-2 timer (pil i figur 2B) og skyer viser polarisering etter inkubasjon over natten.

Figur 3 viser et eksempel på evaluering av dråpehastighet i nærvær av capping protein. Siden alle perler bryter symmetrien på omtrent samme tid, utføres "pseudo-time-lapse"-opptak der lysbildet skannes og bilder av hele populasjonen av kometer tas over tid (figur 3A). Kometer depolymeriserer ikke; Økningen i kometlengder målt over tid kan derfor brukes til å beregne forskyvningshastighet (figur 3B). Gelsolin kan brukes i stedet for kappeprotein for kometdannelse hvis 10 ganger mer gelsolin tilsettes for å kompensere for redusert kappeaktivitet. Kometer dannet i nærvær av gelsolin er kvalitativt de samme og beveger seg med omtrent samme hastigheter som perler med kappeprotein (figur 3C). Cappingaktivitet er nøkkelen til å konsentrere polymerisasjonen på overflaten av perlen, og når verken kappeprotein eller gelsolin er inkludert i motilitetsblandingen, polariserer aktinskyer aldri for å danne kometer, selv om lyse aktinskyer dannes rundt perlene (figur 3D). Kometer på perler kan brukes til å måle aktinbasert kraftproduksjon i forskjellige biokjemiske sammenhenger ved å endre motilitetsblandingen og observere resultatet på motilitet ved hjelp av forskjellige mikromanipuleringsteknikker, for eksempel15.

Figure 1
Figur 1: Bradford standardkurve. (A) Bilde av hvordan du setter opp rørene for å lage Bradford-standardkurven. Prøverør vises ikke. (B) Bilde av de to overlappende BSA-serielle fortynningene som en gang ble blandet med Bradford-reagens. (C) Absorbansene ved 600 nm av løsningene vist i (B) måles i spektrofotometeret og plottes som en funksjon av proteinkonsentrasjonene i BSA-løsningene. Den lineære passformen brukes til å beregne prøvekonsentrasjonen. Korrelasjonsfaktoren, R, for den lineære passformen er 0,999. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kometdannelse på SpVCA-belagte perler i motsetning til VCA-belagte perler. (A) Representative SpVCA-belagte perler (forskjellig perle i hvert bilde) vist over tid. Tid fra blandetidspunktet er angitt. Actinskyer dannes umiddelbart, og skypolarisering gir kometer, som fortsetter å forlenge i flere timer. (B) Representative VCA-belagte perler (forskjellig perle i hvert bilde) vist over tid. Mer enn 1 time er nødvendig for å se begynnelsen av aktinskypolarisasjon (pil) og til og med lange inkubasjoner produserer ikke kometer. Alle bildene er av 4,5 μm diameter perler, epifluorescens avbildning av fluorescerende aktin parret med fasekontrastvisualisering for 15 og 20 min tidspunkter i (A), skala barer = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Kometer og perlehastighetsanalyse . (A) og (C) I nærvær av enten capping protein (CP) eller gelsolin, polariserer aktinskyer for å danne kometer i løpet av de første 20 minuttene av reaksjonen, og kometer forlenges over tid. Tid fra blanding angitt for hvert bilde; Hvert bilde er en annen perle. Det er noe variasjon mellom perler og tilberedning, men i gjennomsnitt beveger perler seg ved mikron/sub-mikron per min hastigheter (0,2-1 μm/min) under standardbetingelsene beskrevet her. (B) Representativ graf som viser evaluering av kometlengde (hele populasjonen av perler) over tid. Hellingen til den lineære korrelasjonen tilsvarer den gjennomsnittlige forskyvningshastigheten, i dette tilfellet 0,24 μm/min. (D) I fravær av kappeaktivitet (ingen kapslingsprotein eller gelsolin) dannes aktinskyer rundt perler, men kometer dannes ikke. Alle bildene er av 4,5 μm diameter perler, epifluorescens avbildning av fluorescerende aktin, skala barer = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, beskriver hvordan man oppnår aktinnettverksvekst på perleoverflater, kometdannelse og perlemotilitet ved bruk av kommersielt tilgjengelige proteiner. Noen ganger observeres imidlertid ikke kometer reproduserbart eller er inhomogene mellom lysbildet og dekselet. Den følgende diskusjonen legger vekt på noen viktige punkter i protokollen og foreslår noen parametere som kan justeres. En faktor å huske på er at kometdannelse og dråpehastighet påvirkes av temperatur, med temperaturer mye over 25 ° C eller mye under 23 ° C som negativt påvirker kometdannelsen og gir ikke-reproduserbare data. Bruk av temperaturregulert mikroskop eller mikroskop i klimakontrollert rom anbefales på det sterkeste. Selv om fluorescerende merket aktin ofte er inkludert i motilitetsblandingen for å observere kometer ved fluorescensmikroskopi, når kometer er mer enn en perlediameter i lengde, er de også synlige ved fasekontrastmikroskopi som et mørkt smør ved siden av perlen. Fasekontrastvisualisering er mer hensiktsmessig for time-lapse-avbildning, da noe fototoksisitet er forbundet med fluorescensavbildning selv via spinnskive. Fordi perler legger seg over tid, produserer et omvendt mikroskop mindre horisontal perledrift enn en oppreist og er mer passende for filmer. Bruken av smeltet VALAP for å forsegle lysbilder er viktig da stoffer som neglelakk forstyrrer kometdannelsen. Store mengder VALAP kan lages i et beger, og deretter øses ut for å fylle opp mindre beger som er mer egnet til rask smelting. VALAP er bra i årevis ved romtemperatur.

Et annet viktig teknisk aspekt er omhyggelig klargjøring av buffer- og motilitetsblanding. Det må utvises forsiktighet ved tilberedning av MB13, spesielt ved justeringstrinnet for pH. PH på MB13 bør justeres raskt til nøytral med NaOH for å unngå ATP-hydrolyse, men ikke for raskt når EGTA oppløses når pH nærmer seg nøytral. EGTA er en viktig ingrediens fordi den komplekser kalsium bundet til aktin, noe som gir i motilitetsblandingen den mer aktive magnesiumformen16. MB13 fremstilt for raskt eller for sakte gir suboptimal kometdannelse eller til og med ingen i det hele tatt. Et annet viktig poeng er å holde nøye oversikt over KCl-konsentrasjonen i motilitetsblandingen når du spiller med forholdene. For eksempel, når du bruker 1x MB13 i reaksjonsblandingen og fortynner profilin, kappeprotein og Arp2/3-komplekset i MB13, er den endelige KCl-konsentrasjonen i motilitetsreaksjonen ca. 40-50 mM på grunn av fortynning med G-buffer. Denne konsentrasjonen gir de beste resultatene i kometanalysen, og mer enn 60 mM KCl reduserer Arp2/3 kompleks nukleeringsaktivitet.

På proteinsiden av ting er et kritisk teknisk aspekt ved å skaffe aktinkometer riktig håndtering av kommersielle aktinbindende proteiner, spesielt presis pipettering av mikrolitermengder. Lineariteten til Bradford-standardkurven er en god test av pipettering, og kurven kan deretter brukes til rutinemessige målinger av proteinkonsentrasjoner. Når man bruker resuspenderte kommersielle proteiner til kometprosedyren, er det derfor viktig å alltid verifisere proteinkonsentrasjoner, da batchvariabilitet og brukerfeil under resuspendering kan føre til forskjeller mellom reelle og forventede konsentrasjoner. Noen ganger kan små forskjeller i proteinkonsentrasjoner føre til fullstendig fravær av kometer.

Et annet viktig aspekt ved metoden som presenteres her er bruken av profilinkompleksert G-aktin som drivstoff for polymerisering. Historisk sett brukte in vitro-systemer prepolymerisert filamentøst aktin (F-aktin) som aktinkilde: depolymerisering i bulkfôret polymerisering på overflaten10,17. Dette hadde fordelen av å kontrollere G-aktinnivåer, men la til et lag av kompleksitet som krever ytterligere komponenter for å katalysere depolymerisering. Siden omsetning av aktinnettverket ikke er nødvendig for kraftproduksjon og motilitet, som drives av nukleering og polymerisering på overflaten av perlen, mens aktin-depolymeriseringsfaktorer som ADF / cofilin virker på de eldre nettverkene langt fra overflaten18, gjøres de fleste in vitro-rekonstituering av aktinbasert motilitet nå uten omsetning for enkelhets skyld. Det er imidlertid noen ulemper ved bruk av G-aktin. For det første, når du bruker kommersielt aktin, som har blitt lyofilisert, er oligomerer tilstede. Depolymerisasjonstrinnene beskrevet her er svært viktige for å oppnå reproduserbare resultater. Spesielt, selv om G-buffer tradisjonelt er justert til pH 8, ser lavere pH (pH 7, for eksempel) ut til å fungere bedre i analysene beskrevet i denne artikkelen, muligens fordi lav pH forbedrer depolymerisering19. En annen ulempe ved bruk av G-aktin er at når det er plassert i saltforhold som er tillatt for polymerisering, oppstår spontan nukleering og F-aktin dannes i bulk så vel som på perleoverflaten. Kompleksering av G-aktin med profilin undertrykker spontan nukleering i bulk og spiss endepolymerisasjon, og fokuserer dermed både nukleering og piggetapppolymerisasjon på overflaten20. Profilin-G-aktin er fysiologisk relevant, da mye av aktinet i cellen er tilstede i dette skjemaet21. Her brukes et 1: 1-forhold mellom profilin: actin; Imidlertid hemmer høyere forhold (for eksempel 3: 1) mer grundig polymerisasjon i bulk, selv om høyere forhold også hemmer Arp2/3-komplekset og piggenden forlengelse til en viss grad22,23.

Cappingaktivitet er også nøkkelen for kometdannelse siden det sikrer innsetting av nytt aktin på overflaten via sykluser av nukleering av overflateaktivert Arp2/3-kompleks24,25. Uten capping bryter ikke aktinskyer symmetrien for å danne kometer fordi polymerisasjon på overflaten ikke bygger opp nok spenning til å bryte opp skyen26. Tidligere har vi brukt hjemmerenset rekombinant musekappeprotein 13, men tester utført for denne artikkelen indikerer at kommersielt tilgjengelig rekombinant humant kappeprotein er like effektivt, som kommersielt tilgjengelig gelsolin, selv om10 ganger mer gelsolin må brukes, og for visse applikasjoner kan det ikke være hensiktsmessig da det har aktinavskjærende aktivitet samt capping27.

Endelig ligger robustheten til denne metoden i bruken av en veldig aktiv Arp2/3 kompleks aktivator, streptavidin-pVCA (SpVCA)28. SpVCA inkluderer profilin-G-actin-bindingsdomenet til WASP (p-domenet) i tillegg til Arp2/3-kompleksbindingsdomenet, da dette er funnet å være mest effektivt i profilin-G-actin-forhold29. Enda viktigere, bruken av streptavidin-taggen, opprinnelig introdusert for å tillate overflatefunksjonalisering via biotin-streptavidin-lenken, har den ekstra effekten av å øke Arp2/3-kompleksaktiveringen, antagelig på grunn av at streptavidin er en tetramer og dermed klynger aktivatoren, kjent for å øke Arp2/3 kompleks aktivitet30 . Kommersielt produserte SpVCA er for tiden under utvikling og vil snart være tilgjengelig for kjøp. Det skal videre bemerkes at selv om 40 μL av 2 μM SpVCA rutinemessig brukes til å belegge 3 cm2 perleoverflate, fungerer andre beleggkonsentrasjoner (høyere og lavere) også, og å leke med disse forholdene gir forskjellige kometveksthastigheter og morfologier. Faktisk, når kometer ikke dannes eller kometstørrelsen ikke er homogen på lysbildet, bør forskjellige beleggforhold testes, samt forskjellige KCl- og profilinkonsentrasjoner i motilitetsblandingen. Konsentrasjonene av aktin, Arp2/3-kompleks og kappeprotein i motilitetsblandingen kan også endres for å optimalisere kometdannelsen, men i våre hender gir endring av disse proporsjonene ofte forvirrende resultater.

For å konkludere, produserer metodene beskrevet her aktinmontering på perleoverflater og motilitet, men enhver overflate som kan funksjonaliseres med SpVCA kan brukes. I tilfeller der adsorpsjon som beskrevet her ikke virker, kan streptavidin-delen brukes til å feste SpVCA til overflaten av interesse etter biotinylering. Aktinstrukturene som dannes på denne måten, kometer eller på annen måte, kan brukes til å teste forskjellige biokjemiske og biofysiske aspekter ved aktinnettverk, og er spesielt egnet for fysiske manipulasjoner med mikropipetter, optisk pinsett og laserablasjoner 15,26,31,32. I tillegg til bruken til forskningsmiljøet, er tilnærmingen beskrevet her hensiktsmessig som et undervisningsverktøy for studenter i biofysikk for å studere aktive materiebegreper som symmetribrudd og selvorganisasjon.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Vi anerkjenner medlemmene av vårt nye hjem på LPENS for deres varme velkomst, og spesielt ABCDJ-teamet for all deres hjelp og støtte. JP anerkjenner økonomisk støtte fra stiftelsen ARC (Grant PJA 20191209604), og CS anerkjenner økonomisk støtte fra Human Frontiers Science Program Organization (Grant RGP0026/2020).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Actin, rabbit muscle, Alexa Fluor 488 conjugate  Invitrogen (ThermoFisher Scientific) A12373 (recently discontinued) This product can be replaced with ATTO-488 actin from Hypermol.
Actin, rabbit muscle, ATTO-488 Hypermol 8153
Actin, rabbit skeletal muscle Cytoskeleton AKL99
Arp2/3 complex Cytoskeleton RP01P
ATP Sigma A7699
BioSpectrometer, basic Eppendorf 035739
Bradford Reagent Bio-Rad 500-0006
BSA, high quality Sigma A3059
BSA standard 2 mg/mL (Pierce) Thermo Scientific 23209
Capping protein (a1b2, mouse recombinant) Home-purified (Reference 13) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
Capping protein (a1b2, human recombinant) Hypermol 8322
Cube, GFP: U-MNIBA3 or U-MWB2 Olympus discontinued Any GFP cube, adapted to the microscope being used, can be used.
Dry block, agitating: ThermoMixer C (refrigerated) Eppendorf 035963
** with SmartBlock, 24 microtubes 2 mL Eppendorf 035969
Gelsolin (human recombinant, His-tagged) Cytoskeleton HPG6
Lanolin Sigma 49909
Microcentrifuge 5427R + rotor Eppendorf 934126
Microscope, upright: BX51 Olympus discontinued Any epifluorescence upright microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Microscope, inverted: IX70 Olympus discontinued Any epifluorescence inverted microscope equipped with phase contrast optics can be used.
Paraffin Sigma 76244
Petroleum jelly: Vaseline Sigma 16415
Pipettes Research Plus Eppendorf Gilson pipettes don't work as well for delivery of very small volumes (0.5 µL for example).
**10 µL 933954
**2.5 µL 933953 These two sizes are essential, but the use of high-quality pipettes (a full Research Plus set for example) is recommended.
Polystyrene carboxylate beads Polysciences
**approx. 1 µm diameter 08226
**approx. 4.5 µm diameter 17140-5
Profilin 1 (human recombinant, untagged) Cytoskeleton PR02
SpVCA (human WASP pVCA domain, N-ter His-tag, C-ter Streptavidin tag) Home-purified (Reference 14) This product will soon be commercially available from Cytoskeleton.
VCA (human WASP VCA domain, GST-tagged) Cytoskeleton VCG03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Campellone, K. G., Welch, M. D. A nucleator arms race: cellular control of actin assembly. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 237-251 (2010).
  2. Pollard, T. D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. Journal of Cell Biology. 103, 2747-2754 (1986).
  3. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., Plastino, J. Actin dynamics, architecture and mechanics in cell motility. Physiological Reviews. 94 (1), 235-263 (2014).
  4. Tilney, L. G., Tilney, M. S. The wily ways of a parasite: induction of actin assembly by Listeria. Trends in Microbiology. 1 (1), 25-31 (1993).
  5. Moore, A. S., et al. Actin cables and comet tails organize mitochondrial networks in mitosis. Nature. 591 (7851), 659-664 (2021).
  6. Taunton, J., et al. Actin-dependent propulsion of endosomes and lysosomes by recruitment of N-WASP. Journal of Cell Biology. 148 (3), 519-530 (2000).
  7. Velarde, N., Gunsalus, K. C., Piano, F. Diverse roles of actin in C. elegans early embryogenesis. BMC Developmental Biology. 7, 142 (2007).
  8. Merrifield, C. J., et al. Endocytic vesicles move at the tips of actin tails in cultured mast cells. Nature Cell Biology. 1 (1), 72-74 (1999).
  9. Samarin, S., et al. How VASP enhances actin-based motility. Journal of Cell Biology. 163 (1), 131-142 (2003).
  10. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  11. Boujemaa-Paterski, R., et al. Network heterogeneity regulates steering in actin-based motility. Nature Communications. 8 (1), 655 (2017).
  12. Akin, O., Mullins, R. D. Capping protein increases the rate of actin-based motility by promoting filament nucleation by the Arp2/3 complex. Cell. 133 (5), 841-851 (2008).
  13. Palmgren, S., Ojala, P. J., Wear, M. A., Cooper, J. A., Lappalainen, P. Interactions with PIP2, ADP-actin monomers, and capping protein regulate the activity and localization of yeast twinfilin. Journal of Cell Biology. 155 (2), 251-260 (2001).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Marcy, Y., Prost, J., Carlier, M. -F., Sykes, C. Forces generated during actin-based propulsion: a direct measurement by micromanipulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 5992-5997 (2004).
  16. Carlier, M. -F. Actin: protein structure and filament dynamics. Journal of Biological Chemistry. 266 (1), 1-4 (1991).
  17. Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D., Carlier, M. F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. Nature. 401 (6753), 613-616 (1999).
  18. Reymann, A. -C., et al. Turnover of branched actin filament networks by stochastic fragmentation with ADF/cofilin. Molecular Biology of the Cell. 22 (14), 2541-2550 (2011).
  19. Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. Quantitative variations with pH of Actin Depolymerizing Factor/Cofilin's multiple actions on actin filaments. Biochemistry. 58 (1), 40-47 (2019).
  20. Plastino, J., Blanchoin, L. Dynamic stability of the actin ecosystem. Journal of Cell Science. 132 (4), 219832 (2019).
  21. Pollard, T. D., Blanchoin, L., Mullins, R. D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 545-576 (2000).
  22. Suarez, C., et al. Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex. Developmental Cell. 32 (1), 43-53 (2015).
  23. Courtemanche, N., Pollard, T. D. Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments. Biochemistry. 52 (37), 6456-6466 (2013).
  24. Achard, V., et al. A "primer"-based mechanism underlies branched actin filament network formation and motility. Current Biology. 20 (5), 423-428 (2010).
  25. Sykes, C., Plastino, J. Actin filaments up against a wall. Nature. 464 (7287), 365-366 (2010).
  26. vander Gucht, J., Paluch, E., Plastino, J., Sykes, C. Stress release drives symmetry breaking for actin-based movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7847-7852 (2005).
  27. McGough, A. M., Staiger, C. J., Min, J. -K., Simonetti, K. D. The gelsolin family of actin regulatory proteins: modular structures, versatile functions. FEBS Letters. 552 (2-3), 75-81 (2003).
  28. Abou-Ghali, M., et al. Capping protein is not necessary for polarized actin network growth and actin based motility. Journal of Biological Chemistry. 295, 15366-15375 (2020).
  29. Yarar, D., D'Alessio, J. A., Jeng, R. L., Welch, M. D. Motility determinants in WASP family proteins. Molecular Biology of the Cell. 13 (11), 4045-4059 (2002).
  30. Padrick, S. B., et al. Hierarchical regulation of WASP/WAVE proteins. Molecular Cell. 32 (3), 426-438 (2008).
  31. Bussonier, M., et al. Mechanical detection of a long-range actin network emanating from a biomimetic cortex. Biophysical Journal. 107 (4), 854-862 (2014).
  32. Paluch, E., vander Gucht, J., Joanny, J. -F., Sykes, C. Deformations in actin comets from rocketing beads. Biophysical Journal. 91 (8), 3113-3122 (2006).

Tags

Bioteknologi utgave 188
Rekonstituering av aktinbasert motilitet med kommersielt tilgjengelige proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sykes, C., Plastino, J.… More

Sykes, C., Plastino, J. Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins. J. Vis. Exp. (188), e64261, doi:10.3791/64261 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter