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Immunology and Infection

Analyse automatisée des phénotypes intracellulaires de Salmonella à l’aide d’ImageJ

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64263
Automatic Translation
1, 1, 1
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Summary

Salmonella envahit et se réplique à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales à la fois dans les vacuoles spécifiques de Salmonella et libres dans le cytosol (hyper-réplication). Un protocole basé sur la microscopie à fluorescence à haut débit est décrit ici pour quantifier les phénotypes intracellulaires de Salmonella par deux analyses d’images complémentaires via ImageJ, atteignant une résolution et un score unicellulaires.

Abstract

Salmonella est un entéropathogène capable d’envahir l’épithélium intestinal et de se répliquer dans les entérocytes, à la fois à l’intérieur des vacuoles spécifiques de Salmonella et libres dans le cytosol (hyper-réplication cytosolique). Ces différents phénotypes de réplication intracellulaire conduisent à différentes voies de pathogenèse, c’est-à-dire que l’hyper-réplication cytosolique induit la mort cellulaire inflammatoire et l’extrusion dans la lumière intestinale, tandis que la réplication vacuolaire conduit à la pénétration trans-épithéliale et à la propagation systémique. Des efforts importants ont été déployés pour créer des outils de microscopie permettant d’étudier le comportement de Salmonella à l’intérieur des cellules envahies, tels que le plasmide rapporteur de fluorescence pCHAR-Duo qui permet la discrimination entre les bactéries vacuolaires et cytosoliques par expression différentielle de mCherry et GFP. Cependant, les phénotypes intracellulaires sont souvent notés manuellement, une procédure longue qui limite l’analyse à un petit nombre d’échantillons et de cellules. Pour surmonter ces limitations, deux analyses d’images complémentaires et automatisées ont été développées à l’aide d’ImageJ, un logiciel d’analyse d’images disponible gratuitement. Dans le protocole à haut débit, les cellules épithéliales ont été infectées par Salmonella portant pCHAR-Duo en utilisant des plaques à 96 puits. L’imagerie a été réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé. Ensuite, deux méthodes d’analyse d’images ont été appliquées pour mesurer le comportement intracellulaire de Salmonella à différents niveaux de détail. La première méthode mesure la charge bactérienne intracellulaire globale et l’étendue de l’hyper-réplication cytosolique. Il est rapide et permet la notation d’un grand nombre de cellules et d’échantillons, ce qui le rend approprié pour les tests à haut débit tels que les expériences de criblage. La deuxième méthode effectue une analyse unicellulaire pour déterminer le pourcentage de cellules infectées, la charge vacuolaire moyenne de Salmonella et le taux d’hyper-réplication cytosolique, ce qui donne plus de détails sur le comportement de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales. Les protocoles peuvent être exécutés par des scripts ImageJ spécialement conçus pour exécuter automatiquement des analyses par lots des principales étapes de l’interaction Salmonella-entérocyte.

Introduction

Salmonella est l’agent bactérien le plus fréquemment signalé à l’origine de foyers de maladies d’origine alimentaire dans l’Union européenne1. La principale manifestation pathologique de l’infection à Salmonella est l’entérite, qui est le résultat du comportement pathogène dans l’intestin après l’ingestion et de la réponse inflammatoire locale qui en résulte2. Cependant, Salmonella peut également se propager aux sites extra-intestinaux et provoquer une infection systémique, en particulier chez les personnes immunodéprimées. Le type d’interaction entre Salmonella et l’épithélium intestinal conditionne l’issue de l’infection. Une fois dans la lumière intestinale, Salmonella envahit et se réplique à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales. Au niveau intracellulaire, Salmonella peut présenter deux phénotypes de réplication différents, l’hyper-réplication cytosolique et la réplication lente intravacuolaire dans les vacuoles contenant Salmonella (SCV). L’hyper-réplication cytosolique induit la mort des cellules hôtes inflammatoires et l’extrusion de Salmonella dans la lumière intestinale3 ; La réplication vacuolaire conduit à une pénétration trans-épithéliale et à une propagation systémique4. Par conséquent, l’étendue de l’invasion et de la réplication vacuolaire par rapport à cytosolique influence l’évolution de l’infection.

Le genre Salmonella est très diversifié, y compris des milliers de sérotypes avec différentes gammes d’hôtes et capacités à causer des maladies. Par exemple, S. Typhimurium est défini comme un sérotype généraliste, car il infecte plusieurs hôtes non apparentés et représente l’une des principales causes de salmonellose humaine. Différemment, S. Le derby est considéré comme un sérotype adapté aux porcs, car il est principalement isolé du porc, mais il est également signalé dans le top cinq des sérovars responsables de l’infection humaine1. Cependant, la connaissance du comportement bactérien à l’intérieur des cellules épithéliales se limite essentiellement à l’étude de quelques souches de référence, comme S. Typhimurium SL1344, qui ne représentent pas la grande diversité naturelle de la pathogénicité de Salmonella . La caractérisation de l’interaction de différentes souches de Salmonella avec les cellules épithéliales contribuerait à comprendre leurs différentes pathogénicités. Pour cette raison, un protocole basé sur la microscopie à fluorescence à haut débit a été développé pour analyser le comportement intracellulaire d’un grand nombre de souches de manière rapide et largement automatisée. Dans ce protocole, l’infection des cellules épithéliales a été réalisée dans des plaques d’imagerie à 96 puits et l’acquisition d’images a été effectuée à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé. Le plasmide pCHAR-Duo a été utilisé pour observer les phénotypes d’invasion et de réplication de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales par microscopie fluorescente5. Ce plasmide porte le gène codant pour le rapporteur fluorescent rouge mCherry, exprimé de manière constitutive par toutes les cellules bactériennes transformées, et le gène codant pour le rapporteur fluorescent vert GFP, dont l’expression est activée par le glucose-6-phosphate présent exclusivement dans le cytosol des cellules eucaryotes et absent dans les SCV. Par conséquent, le plasmide permet la discrimination entre les bactéries vacuolaires et cytosoliques par l’expression différentielle des rapporteurs mCherry et GFP.

Les bactéries vacuolaires et cytosoliques sur les images de microscopie sont généralement quantifiées par notation manuelle6, mais il s’agit d’une méthode longue qui limite l’analyse à un petit nombre d’échantillons. Par conséquent, deux analyses d’images complémentaires et automatisées ont été développées - l’analyse de zone et l’analyse de cellules uniques - à l’aide d’ImageJ7, un logiciel d’analyse d’images disponible gratuitement. L’analyse de la zone mesure la charge bactérienne intracellulaire globale et l’étendue de l’hyper-réplication cytosolique en utilisant les données des zones occupées par les cellules épithéliales, les salmonelles rouges et vertes dans chaque image de microscopie acquise. Cette méthode peut être appliquée aux images acquises à faible grossissement; Par conséquent, il permet de marquer un nombre élevé de cellules épithéliales avec peu d’images, raccourcissant le temps d’acquisition. L’analyse unicellulaire utilise la segmentation cellulaire pour déterminer le pourcentage de cellules infectées, la charge vacuolaire moyenne et le pourcentage de cellules infectées subissant une hyper-réplication cytosolique avec une résolution unicellulaire.

Dans ce protocole, toutes les étapes de l’analyse d’image sont décrites en détail pour être effectuées manuellement, mais la même analyse peut être automatisée par nos scripts ImageJ spécialement conçus. Ces scripts permettent également d’exécuter des analyses par lots pour analyser automatiquement plusieurs images et ainsi accélérer l’exécution de la méthode.

Protocol

1. Infection des cellules épithéliales par Salmonella porteur du plasmide rapporteur pCHAR-Duo

REMARQUE: Une pipette multicanal est recommandée.

  1. Enduisez les plaques d’imagerie à 96 puits de parois noires et de fond plat en verre avec du collagène juste avant utilisation.
    1. Diluer l’acide acétique glacial (17,4 M) dans de l’eau déminéralisée stérile sous une hotte chimique pour obtenir une solution d’acide acétique de 20 mM. Dans des conditions stériles, filtrer la solution à travers un filtre à seringue d’une taille de pores de 0,2 μm. Laisser la solution dans une grille à 0-4 °C pendant 5 min.
    2. Diluer 3 mg/mL de collagène à 50 μg/mL dans une solution d’acide acétique prérefroidie de 20 mM. Mélanger en retournant 10 fois, puis distribuer 30 μL de solution de collagène par puits (5 μg de collagène/cm2), en gardant la solution dans une grille à 0-4 °C pour éviter la gélification du collagène.
    3. Assurez-vous que le fond du puits est complètement recouvert de collagène, puis laissez la plaque sous flux laminaire pendant 1 h à température ambiante (RT).
    4. Retirez délicatement la solution et effectuez trois lavages avec 30 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Utilisez une pipette multicanal de 100 μL ou 50 μL pour éviter le décollement du collagène.
  2. Culture de cellules épithéliales INT407 dans des plaques d’imagerie recouvertes de collagène 20-24 h avant l’infection.
    1. Culture systématique de cellules INT407 dans25 cm 2 flacons dans un milieu essentiel minimum avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), ci-après défini milieu de culture (CM), complété par 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep).
    2. Laver deux fois les fioles INT407 avec 5 mL de PBS, puis détacher les cellules avec 1 mL de solution trypsine-EDTA pendant 3-5 min à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de CO2 à 5% 20-24 h avant l’infection. Compter les cellules et préparer une suspension de 3 x 105 cellules/mL dans le CM.
    3. Distribuer 100 μL de suspension/puits cellulaire dans des plaques d’imagerie recouvertes de collagène pour obtenir une confluence à 100 %. Incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 pendant 1 h pour faciliter l’adhésion cellulaire. Ensuite, ajouter 100 μL de CM et incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 pendant 20-24 h jusqu’à l’infection (étape 1.4).
      NOTE: Afin d’imager les bactéries intracellulaires, les souches de Salmonella sont transformées avec le plasmide rapporteur pCHAR-Duo qui a été aimablement fourni par la Dre Olivia Steele-Mortimer. Les souches testées ici ont été sélectionnées pour représenter la diversité phénotypique couverte par le protocole et valider les analyses d’images de la section 4. Voir les résultats représentatifs pour plus de détails sur les souches utilisées dans cette étude.
  3. Préparer des cultures en phase stationnaire de souches de Salmonella porteuses du plasmide rapporteur pCHAR-Duo.
    1. Prélever le stock de glycérol Salmonella avec l’extrémité d’une pipette de 10 μL et l’inoculer dans 1 mL de bouillon Luria Bertani (10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium par litre) complété par 100 μg/ml d’ampicilline.
    2. Incuber l’inoculum statiquement à 37 °C pendant 20 h avant l’infection pour atteindre la phase stationnaire de croissance, correspondant à ~1 x 109 unités formant colonies (UFC)/mL8.
  4. Infecter les cellules épithéliales INT407 avec Salmonella.
    REMARQUE: Les infections sont effectuées en trois exemplaires.
    1. Lavez délicatement les cellules INT407 avec 200 μL de PBS/puits.
    2. Préparer l’inoculum de Salmonella en diluant la culture de bactéries pendant la nuit dans la MC pour obtenir le nombre souhaité d’UFC par cellule épithéliale, défini comme la multiplicité de l’infection (MOI). Ici, MOI 100 a été utilisé.
    3. Inoculer 200 μL/puits, puis recouvrir la plaque d’une membrane d’étanchéité respirante et incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 pendant 1 h. L’inoculation est considérée comme le temps zéro de l’infection.
    4. Retirer l’inoculum et laver doucement avec 200 μL de PBS/puits, puis ajouter 200 μL de CM avec de la gentamicine 100 μg/mL par puits. Couvrir la plaque d’une membrane d’étanchéité respirante, puis incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 pendant 1 h.
    5. Retirer le CM avec de la gentamicine 100 μg/mL et laver doucement avec 200 μL de PBS/puits. Ajouter 200 μL de CM avec de la gentamicine 10 μg/mL par puits, recouvrir la plaque d’une membrane d’étanchéité respirante, puis incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 pendant 8 h.

2. Fixation de l’échantillon et coloration des cellules épithéliales

REMARQUE : Protéger les échantillons de l’exposition directe à la lumière. Les volumes sont indiqués pour les puits d’une plaque de 96 puits. L’optimisation du volume est nécessaire pour différentes plaques ou supports de culture cellulaire.

  1. À 8 heures après l’infection, retirer la CM et laver doucement trois fois avec 200 μL/puits de PBS. Retirer le PBS en retournant la plaque sur du papier absorbant; Évitez d’aspirer.
  2. Fixer les monocouches infectées avec 100 μL/puits de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS pendant 20 min à TA. Éliminer le PFA à 4 % et laver trois fois avec 200 μL/puits de PBS. La plaque peut être conservée pendant un maximum de 16-24 h à 4 °C. Passez à l’étape suivante.
  3. Coloration des cellules épithéliales.
    REMARQUE : La coloration à l’ADN DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) (étape 2.3.1) est utilisée pour l’analyse de la zone pour colorer uniquement les noyaux, et la coloration à haute teneur (HCS) (étape 2.3.2) est utilisée pour l’analyse unicellulaire afin de colorer toute la cellule épithéliale. D’autres colorants cellulaires peuvent être utilisés, mais l’optimisation de l’acquisition et de l’analyse d’images est nécessaire.
    1. Analyse de surface : distribuer 100 μL/puits de DAPI (solution de 300 nM dans PBS) et incuber 5 min à RT à l’abri de la lumière.
    2. Analyse unicellulaire : perméabiliser avec 100 μL/puits de triton 0,1x dans PBS pendant 15 min à TA. Laver trois fois avec du PBS et distribuer 100 μL/puits de colorant HCS dilué 1:2000 dans PBS. Incuber pendant 30 min à RT à l’abri de la lumière.
  4. Retirer la solution de coloration et laver trois fois avec 200 μL/puits de PBS. Ajouter 50 μL/puits de PBS pour l’acquisition automatisée d’images.

3. Acquisition d’images avec un microscope à fluorescence automatisé

REMARQUE : Ici, un faible grossissement (objectif 10x/0,3 NA, objectif 1 μm/pixel) à l’étape 3.1.1 pour l’analyse de surface et un grossissement élevé (objectif 40x/0,75 NA, objectif 0,255 μm/pixel) à l’étape 3.1.2 pour l’analyse unicellulaire sont utilisés dans le protocole d’acquisition. D’autres grossissements peuvent être utilisés, mais l’optimisation de l’acquisition et de l’analyse des images est nécessaire. Si le microscope disponible le permet, acquérir des images sous forme de régions de tuiles (TR), une « mosaïque » de champs contigus appelés tuiles, pour enregistrer de grandes zones d’échantillonnage. Réglez l’autofocus au centre d’un TR au lieu d’en définir un pour chaque vignette, afin de réduire l’exposition de l’échantillon pendant la procédure de mise au point automatique.

  1. Utilisez l’autofocus logiciel dans le canal de coloration cellulaire (canal bleu pour la coloration HCS et la coloration nucléaire DAPI) comme position z de référence. Acquérir des images dans le canal de coloration cellulaire (465 nm, cellules ou noyaux) et dans les canaux rapporteurs pCHAR-Duo mCherry (610 nm, salmonelles intracellulaires) et GFP (509 nm, salmonelles hyper-réplicatives cytosoliques).
    1. Analyse de surface : Image ≥104 cellules/réplication technique (c.-à-d. au moins trois TR de quatre tuiles/puits correspondant à une réplication technique sont recommandées) à un grossissement de 10x.
      REMARQUE: Un seul plan z est suffisant pour imager à la fois les cellules contenant des cellules vacuolaires et les cellules contenant des salmonelles hyper-réplicatives cytosoliques à un grossissement de 10x.
    2. Analyse d’une seule cellule : Image ≥1 000 cellules/réplication technique (c.-à-d. au moins deux TR de 16 tuiles/puits correspondant à une réplication technique sont recommandées) à un grossissement de 40x. Plusieurs plans z sont nécessaires pour imager à la fois les cellules contenant des cellules vacuolaires et les cellules contenant des salmonelles hyper-réplicatives cytosoliques. Définir la pile z optimale (une pile z de 3,85 μm avec un intervalle de 0,55 μm pour obtenir huit plans z est indiquée pour imager les cellules INT407 infectées par des salmonelles cytosoliques hyper-réplicatives à 40x). Chaque plan z est ci-après identifié comme n/8, avec n compris entre 1 (correspondant au plan z inférieur) et 8 (correspondant au plan z supérieur).
  2. La sortie de chaque acquisition est un fichier nommé Acquisition.czi qui inclut des images de tous les champs, canaux et plans z. Si des TR ont été acquis, fusionnez les tuiles pour obtenir une image globale de chaque TR en utilisant un seul fichier Acquisition.czi comme entrée pour la méthode d’assemblage.

4. Analyse d’images à l’aide d’ImageJ

REMARQUE : Les étapes 4.1 et 4.2 sont spécialement conçues pour l’expérience et l’acquisition décrites ci-dessus. D’autres contextes expérimentaux pourraient nécessiter une optimisation de l’analyse. L’analyse d’un seul fichier Acquisition.czi est décrite. Pour l’analyse par lots, recherchez le script d’analyse unicellulaire et le script d’analyse de zone en tant que fichiers supplémentaires (Fichier supplémentaire 1 et Fichier supplémentaire 2). Les étiquettes utilisées dans les scripts et les commandes ImageJ sont en gras dans les sections ci-dessous.

  1. Analyse de zone
    1. Ouvrez le fichier Acquisition.czi dans ImageJ, nommé AcquisitionTitle dans le script : File > Open > AcquisitionTitle.czi. Une fenêtre montrant toutes les chaînes s’ouvrira. Les canaux sont indiqués comme c:1-3/3 en fonction de l’ordre d’acquisition. Ici, c:1/3 correspond au bleu (DAPI), c:2/3 à mCherry (Salmonellae intracellulaire) et c:3/3 à la GFP (Salmonellae hyper-réplicative cytosolique).
    2. Réduisez le bruit aléatoire pour préparer les images pour la mesure de surface aux étapes 4.1.6 et 4.1.7.
      1. Dupliquez la fenêtre AcquisitionTitle à l’aide de Image > Dupliquer > OK pour obtenir la fenêtre AcquisitionTitle1 .
      2. Appliquez le flou gaussien à AcquisitionTitle1 via le filtre de > de processus > flou gaussien. Laissez la valeur Sigma par défaut sur 2 et cliquez sur OK. Une fenêtre Process Stack? s’ouvrira, cliquez sur Oui pour traiter tous les canaux.
      3. Soustrayez l’AcquisitionTitle1 filtré par gaussien du fichier d’origine AcquisitionTitle par Process > Calculatrice d’images : sélectionnez AcquisitionTitle comme Image1, choisissez l’opération Subtract dans la liste déroulante, puis sélectionnez AcquisitionTitle1 comme Image2. Cliquez sur OK. Une fenêtre Process Stack? s’ouvre. Cliquez sur Oui pour traiter les trois images (canaux) afin d’obtenir la fenêtre ResultsOfAcquisitionTitle.
    3. Fractionnez les couches via Image > Couleur > Fractionner les couches. Chaque image de canal est maintenant affichée dans une fenêtre distincte, automatiquement nommée par ImageJ C-ResultsOfAcquisitionTitle. Ici, C1-ResultsOfAcquisitionTitle correspond à DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle à mCherry ( salmonelles intracellulaires) et C3-ResultsOfAcquisitionTitle à GFP (cytosolic hyper-replicating Salmonellae).
    4. Traitez l’image C1-ResultsOfAcquisitionTitle pour mesurer la zone occupée par les noyaux des cellules épithéliales.
      1. Accédez à Traiter > Lisse pour homogénéiser le nucléole qui apparaît sous forme de trous à l’intérieur de la zone des noyaux.
      2. Définissez un seuil sur l’image C1-ResultsOfAcquisitionTitle pour exclure l’arrière-plan à l’aide de l '> Image Ajuster > seuil : cochez Arrière-plan sombre et sélectionnez Rouge dans la liste déroulante. Définissez le seuil automatique du triangle , puis utilisez le curseur supérieur pour définir la valeur de seuil minimale lorsque les noyaux apparaissent en rouge et que l’arrière-plan apparaît en noir (Seuil = 100, appliqué dans ce protocole).
        REMARQUE : Les seuils automatiques décrits aux étapes 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 et 4.2.4.3 sont suggérés à titre de guide pour permettre à l’utilisateur de définir manuellement le seuil le mieux ajusté pour les cellules nuclei/épithéliales et les bactéries, respectivement. La valeur du seuil automatique sera remplacée dans le script par le seuil manuel défini. Le seuil manuel défini sera appliqué à l’ensemble de l’analyse des lots.
    5. Choisissez les mesuresqui vous intéressent en utilisant Analyser > Définir la mesure : Vérifier la limite au seuil pour limiter la mesure aux pixels seuillés. Zone de contrôle, correspondant à la surface totale occupée par les pixels seuillés (c.-à-d. noyaux dans C1-ResultsOfAcquisitionTitle, Salmonellae intracellulaires dans C2-ResultsOfAcquisitionTitle, Salmonellae hyper-réplicatives cytosoliques dans C3- ResultsOfAcquisitionTitle). Cochez Étiquette d’affichage pour enregistrer le titre d’acquisition et le canal de chaque image de la table de résultats.
    6. Mesurez la zone occupée par les noyaux à l’aide de l’option Analyser > mesurer. Les mesures sont enregistrées dans la table de résultats qui s’ouvre automatiquement.
    7. Traiter C2-ResultsOfAcquisitionTitle et C3-ResultsOfAcquisitionTitle pour mesurer la surface occupée par l’ensemble des salmonelles intracellulaires et les salmonelles hyperréplicatives cytosoliques, respectivement. Suivez les étapes 4.1.4-4.1.6 avec quelques modifications : sautez l’étape de lissage à l’étape 4.1.4.1 et utilisez le seuil automatique Otsu au lieu du triangle à l’étape 4.1.4.2 comme guide pour définir la valeur seuil minimale (curseur supérieur) lorsque les salmonelles apparaissent rouges et que l’arrière-plan apparaît noir (seuil = 200 suggéré).
    8. Enregistrez la table de résultats à l’aide de Fichier > Enregistrer sous > Tous les fichiers.
    9. Ouvrez le tableau Résultat dans une feuille de calcul afin de calculer les ratios de surface pour chaque fichier AcquisitionTitle analysé :
      1. Calculer le taux d’infection : diviser la surface occupée par les Salmonelles intracellulaires totales (ici canal rouge, C2-) par la surface occupée par les noyaux des cellules épithéliales (ici DAPI, C1-).
      2. Calculer le taux d’hyper-réplication : diviser la surface occupée par les Salmonelles hyper-réplicatives cytosoliques (canal vert, C3-) par la surface occupée par les Salmonelles intracellulaires totales (canal rouge, C2-).
  2. Analyse unicellulaire
    1. Ouvrez le fichier Acquisition.czi dans ImageJ, nommé AcquisitionTitle dans le script : Menu Fichier > Ouvrez > Acquisition.czi. Une fenêtre montrant les images de toutes les chaînes et de tous les z-planes s’ouvrira.
    2. Divisez les canaux par Image > Couleur > Split Channels. Les canaux sont maintenant affichés dans des fenêtres séparées, automatiquement nommées par ImageJ comme C-AcquisitionTitle. Ici, la fenêtre C1-AcquisitionTitle correspond aux cellules épithéliales (bleu), la fenêtre C2-AcquisitionTitle aux salmonelles intracellulaires (mCherry) et la fenêtre C3-AcquisitionTitle au canal cytosolique hyper-réplicatif des salmonelles (GFP). Chaque fenêtre C-AcquisitionTitle inclut tous les z-planes acquis.
    3. Traiter le C1-Titre d’acquisition fenêtre, correspondant aux cellules épithéliales, pour segmenter les cellules.
      1. Choisissez l’image z-plane à utiliser pour la segmentation des cellules. Sélectionnez la fenêtre C1-AcquisitionTitle et utilisez Image > Dupliquer : écrivez le numéro du plan z choisi (c’est-à-dire 1 pour sélectionner z 1/8), écrivez C1Zplane dans la zone Titre, décochez la case Pile dupliquée, puis cliquez sur OK pour dupliquer uniquement l’image z-plane sélectionnée. Une fenêtre appelée C1Zplane affichant l’image z-plane sélectionnée s’ouvrira.
      2. Traitez l’image C1Zplane obtenue pour améliorer le contraste de l’image. Processus ouvert > améliorer le contraste: ajustez les pixels saturés (c’est-à-dire qu’ici 1% est utilisé) et cochez Normaliser. Ensuite, cliquez sur OK pour appliquer la technique d’amélioration du contraste afin d’obtenir une image C1Zplane normalisée par contraste.
      3. Traiter l’image C1Zplane normalisée par contraste pour segmenter les cellules épithéliales. Utilisez Process > Find Maxima pour ouvrir le menu FindMaxima : tout d’abord, marquez la sélection du point d’aperçu pour définir la tolérance au bruit afin d’attribuer un seul point maxima à chaque cellule épithéliale. Indicateur Exclure les maxima de bord. Sélectionnez le type de sortie Particules segmentées et cliquez sur OK pour obtenir C1ZplaneSegmented, une nouvelle image binaire de type masque montrant chaque particule segmentée par point maximal marqué.
        Remarque : L’algorithme Find Maxima ImageJ est utilisé pour segmenter les cellules. Des points maxima (pics d’intensité en pixels) sont détectés sur l’ensemble de l’image, correspondant potentiellement aux cellules. Un seuil de bruit (tolérance au bruit) est défini, et la zone contiguë autour des points maxima est analysée pour créer une image binaire en forme de masque définissant chaque particule segmentée par point maxima, donc chaque cellule.
      4. Traitez l’image C1ZplaneSegmented pour créer un masque de cellules segmentées. Utiliser Analyser > Analyser les particules : sélectionnez l’option Afficher les masques et Exclure sur les bords. Ajustez la plage de surface des particules segmentées à inclure dans le masque, correspondant au paramètre Size, afin d’exclure les objets mal segmentés tels que les amas de cellules et les fractions de cellules. Pour noter la zone des objets segmentés par erreur, utilisez l’outil de traçage de baguette dans la barre d’outils : sélectionnez particule avec la baguette, puis ouvrez Analyser > mesurer pour mesurer la surface des objets erronés. Définissez l’intervalle de taille (plage suggérée 250-1700 pixels2) et cliquez sur OK pour obtenir le masque binaire MaskofC1ZplaneSegmented.
      5. Par défaut, le masque binaire MaskOfC1ZplaneSegmented possède une LUT inversée. Utilisez LUT > Inverser LUT dans la barre d’outils.
      6. Traitez le masque binaire MaskOfC1ZplaneSegmented pour corriger la segmentation des cellules :
        1. Image C1Zplane normalisée par contraste de seuil obtenue à l’étape 4.2.3.2. Utiliser l’image > ajuster > seuil : cochez Arrière-plan sombre. Définissez le paramètre de seuil automatique par défaut . Choisissez l’option Rouge et ajustez la valeur seuil minimale (barre supérieure) jusqu’à ce que les cellules apparaissent complètement rouges, laissant un arrière-plan sombre (Seuil = 8 000 appliqué dans ce protocole). Ensuite, cliquez sur Appliquer pour convertir l’image C1Zplane normalisée en contraste en une image binaire avec des cellules en blanc et l’arrière-plan en noir.
        2. Segmentation correcte des cellules dans le masque binaire MaskOfC1ZplaneSegmented . Utiliser Process > Image Calculator : sélectionnez MaskOfC1ZplaneSegmented as Image1, choisissez l’opération AND dans la liste déroulante, puis sélectionnez le C1Zplane normalisé par contraste seuillé comme Image2. Cliquez sur OK. L’image de sortie est automatiquement nommée par ImageJ comme Résultats du masque de C1Zplane segmenté.
      7. Résultats du processus du masque de C1Zplane segmenté pour étiqueter chaque cellule segmentée en tant que région d’intérêt (ROI). Utilisez Analyser > analyser les particules. Ajustez la taille comme à l’étape 4.2.3.4, puis sélectionnez l’option Ne rien afficher. Cochez Ajouter au gestionnaire pour ajouter toutes les particules (cellules segmentées) à l’outil ROI Manager. Cochez également Exclure sur les bords. Cliquez sur OK. Le menu ROI Manager affiche une liste de toutes les particules (cellules segmentées), définies comme ROI, étiquetées de manière unique avec leurs coordonnées y et x respectives.
      8. Enregistrez les données de ROI sous forme de ROI-cells-AcquisitionTitle.zip via le menu ROI Manager en cliquant sur Plus > Enregistrer. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip sera ouvert à l’étape 4.2.4.6 pour l’analyse de cellule unique.
    4. Traiter le C2-Titre d’acquisition fenêtre (ici canal rouge), correspondant à intracellulaire Salmonellae, pour mesurer le nombre de cellules infectées et la charge vacuolaire intracellulaire.
      1. Soustrayez le canal vert (C3-) du canal rouge (C2-) pour éliminer les pixels flous des Salmonelles hyperréplicantes cytosoliques.
        1. Utilisez Process > Calculatrice d’image. Sélectionnez C2-Acquisitiontitle comme Image1, choisissez l’opération Soustraire dans la liste déroulante, puis sélectionnez C3-Acquisitiontitle comme Image2. Cochez Créer une nouvelle fenêtre et cliquez sur OK.
        2. Appliquez une soustraction à l’ensemble de la pile z en cliquant sur Oui dans la pile de processus? fenêtre. La fenêtre de sortie est nommée ResultsOfC2AcquisitionTitle dans le script.
      2. Traitez ResultsOfC2AcquisitionTitle pour réduire le bruit aléatoire.
        1. Dupliquez la fenêtre ResultsOfC2AcquisitionTitle en cliquant sur le menu Image > Dupliquer. Cochez Pile en double et appuyez sur OK pour obtenir la fenêtre ResultsOfC2AcquisitionTitle1 .
        2. Appliquez le flou gaussien à la fenêtre ResultsOfC2AcquisitionTitle1 via le filtre de > de processus > le flou gaussien. Laissez la valeur Sigma comme 2 ou personnalisez-la (c’est-à-dire ici Sigma: 4 a été utilisé). Cliquez sur OK et appliquez Gaussian Blur à l’ensemble de la z-stack en cliquant sur Oui dans la fenêtre Process Stack? .
        3. Soustrayez le filtre gaussien ResultsOfC2AcquisitionTitle1 à ResultsOfC2AcquisitionTitle en cliquant sur Process > Image Calculator. Sélectionnez ResultsOfC2AcquisitionTitle comme Image1, choisissez l’opération Soustraire dans la liste déroulante, puis sélectionnez ResultsOfC2AcquisitionTitle1 comme Image2. Cliquez sur OK. Appliquez une soustraction à l’ensemble de la pile z en cliquant sur Oui dans la fenêtre Pile de processus? pour obtenir une fenêtre automatiquement nommée par ImageJ comme Résultats des résultats de C2-AcquisitionTitle.
      3. Traiter les résultats des résultats de C2-AcquisitionTitle pour séparer les salmonelles de l’arrière-plan. Utiliser l’image > Ajuster > seuil : cochez Arrière-plan sombre et définissez le seuil automatique Otsu . Ajustez la valeur seuil minimale (barre supérieure) jusqu’à ce que les salmonelles apparaissent complètement rouges, laissant un arrière-plan sombre (seuil = 100 appliqué dans ce protocole). Cliquez sur Appliquer et la fenêtre Convertir en binaire s’ouvrira: cochez Fond noir, puis cliquez sur OK. La pile z complète est maintenant convertie en images binaires.
      4. Sélectionnez le plan Z du milieu, correspondant au plan de focalisation vacuolaire de Salmonellae, dans les résultats de la fenêtre binaire Résultats de l’acquisition C2-Title de l’étape 4.2.4.3 : Piles > d’images > Définir la tranche et écrivez le numéro du plan z de votre choix (par exemple, ici z: 4/8 est utilisé). Cliquez sur OK.
      5. Réglez les mesures à enregistrer pour chaque ROI (cellule). Utiliser Analyser > Définir la mesure : vérifiez la zone, correspondant à la surface totale de chaque retour sur investissement. Vérifiez Fraction de surface et Limite au seuil pour enregistrer uniquement la fraction de surface occupée par des pixels seuillés (salmonelles intracellulaires) pour chaque retour sur investissement. Cochez la case Afficher l’étiquette pour étiqueter chaque retour sur investissement avec le titre de l’image, le canal, le plan z et les coordonnées x-y dans le tableau de résultats.
      6. Traiter le plan z choisi des salmonelles intracellulaires pour enregistrer les étiquettes, la superficie et la %zone occupée par les salmonelles pour chaque cellule (ROI): ouvrez le fichier ROI-cells-AcquisitionTitle.zip, enregistré à l’étape 4.2.3.8, par File > Ouvrez et cliquez sur Mesure dans le menu ROI Manager. Le résultat est un tableau rapportant les mesures sélectionnées.
      7. Enregistrez la table de résultats à l’aide de Fichier > Enregistrer sous dans la fenêtre de résultats.
      8. Ouvrez ResultTable dans une feuille de calcul : l’étiquette La zone et le % de surface occupée par les salmonelles intracellulaires sont indiqués pour chaque ROI, correspondant à une cellule profilée identifiée de manière unique avec les coordonnées x et y.
      9. Mesurer le nombre de cellules infectées correspondant aux ROI montrant une %Surface > 0 occupée par des pixels seuillés, correspondant aux Salmonellae (c’est-à-dire qu’ici une %Aire > 0,2% est considérée pour identifier les cellules infectées). Ensuite, calculez le pourcentage de cellules infectées sur le total des cellules.
      10. Mesurer la charge vacuolaire de Salmonella/cellule en calculant le pourcentage moyen de surface occupée par les Salmonellae vacuolaires pour toutes les cellules infectées.
    5. Traiter le canal vert (C3-AcquisitionTitle) pour mesurer le nombre de cellules présentant des salmonelles hyper-réplicatives cytosoliques. Suivez les étapes 4.2.4.2 à 4.2.4.9, mais avec quelques modifications.
      1. Travailler sur les plans z supérieurs (ici z:7/8), puisque les cellules montrant des salmonelles cytosoliques hyper-réplicatives dépassent de la monocouche; par conséquent, ils se concentrent sur un plan différent par rapport aux cellules sans Salmonellae hyper-réplicative.
      2. Mesurer le nombre de cellules contenant des salmonelles hyperréplicatives cytosoliques (en vert) en notant les cellules (ROI) montrant une %Surface occupée par les Salmonelles élevée (p. ex., une %Aire > 20 % est considérée pour identifier les cellules contenant des Salmonelles hyperréplicatives cytosoliques). Ensuite, calculez le pourcentage de cellules contenant des Salmonellae hyper réplicatives cytosoliques sur le total de cellules infectées notées à l’étape 4.2.4.9.

Representative Results

Infection des cellules épithéliales par des souches de Salmonella
Ce protocole a été développé pour analyser l’invasion cellulaire et la réplication cytosolique (Figure 1A) vs charge vacuolaire (Figure 1B) de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales. Le protocole a été validé en utilisant les trois souches de Salmonella suivantes, S. Souche de référence de Typhimurium SL1344 (S. Tm), S. Derby ER1175 wildtype (S. Derby wt) et le mutant isogénique de S. Derby ER1175 sans gène sipA (S. Derby ΔsipA). La souche S. Derby ER1175 a été isolée chez des porcs et fait partie de la collection de surveillance IZSLER d’isolats de Salmonella. Les souches ont été sélectionnées afin de représenter la diversité phénotypique couverte par le protocole. En particulier, ces souches ont été choisies parce que leur comportement à l’intérieur des cellules épithéliales était déjà connu pour différer en termes d’invasion ou de réplication9 ; par conséquent, ils constituaient des contrôles précieux pour tester si le protocole permettait de distinguer quantitativement les différences dans les phénotypes intracellulaires de Salmonella. En particulier, S. Tm et S. Derby wt ont été inclus parce que nous avions précédemment démontré que S. Tm a une efficacité d’invasion et de réplication intracellulaire supérieure à celle du S. Derby wt9 tandis que S. Derby ΔsipA a été ajouté en tant que souche altérée par hyper-réplication puisque l’effecteur de virulence SipA joue un rôle crucial dans l’apparition de l’hyper-réplication10,11. Il a déjà été signalé pour S. Tm que la réplication cytosolique commence 4 h après l’invasion, puis la population cytosolique hyper-réplique rapidement pour remplir la cellule épithéliale à 8 h11,12. De manière constante, une infection de 8 heures de long était appropriée pour observer et quantifier le phénotype d’hyper-réplication cytosolique également dans S. Derby wt et S. Derby ΔsipA.

Analyse de zone
L’analyse de surface à l’étape 4.1 fournit une mesure de la colonisation globale des cellules épithéliales par Salmonella (taux d’infection), ainsi qu’une mesure de l’hyper-réplication (taux d’hyper-réplication). Dans le workflow d’analyse de zone décrit à la figure 2, le bruit aléatoire est réduit, puis les canaux sont divisés et traités indépendamment. Un seuil est fixé pour chaque canal afin d’exclure le bruit de fond de la mesure de surface. Ensuite, la surface occupée par les pixels seuillés est mesurée pour chaque canal. Le résultat de l’analyse des aires est un tableau rapportant, pour chaque fichier d’acquisition, l’extension des zones occupées par les noyaux de cellules épithéliales (canal bleu), les salmonelles intracellulaires exprimant la cerise (canal rouge) et les salmonelles cytosoliques hyper-réplicatives qui expriment la GFP (canal vert) avec mCherry. Le taux d’infection est calculé en divisant la zone occupée par les salmonelles exprimant mCherry par la surface occupée par les noyaux des cellules hôtes. Les résultats des souches testées ont montré que S. Tm affiche un taux d’infection significativement plus élevé par rapport aux deux S. Souches de Derby, comme prévu (figure 3A). Par conséquent, ces résultats démontrent l’efficacité de l’analyse de surface pour détecter les différences dans la capacité des souches de Salmonella à coloniser les cellules épithéliales. Le rapport d’hyper-réplication de Salmonella est mesuré en divisant la surface occupée par les Salmonellae exprimant la GFP par la surface occupée par les Salmonellae intracellulaires exprimant mCherry. Conformément au rôle de SipA dans la détermination de l’hyper-réplication, un rapport d’hyper-réplication significativement réduit pour S. La souche Derby ΔsipA a été mesurée par rapport à S. Derby wt, (figure 3B). Aucune différence d’hyper-réplication n’a été observée entre S. Tm et S. Derby wt. Dans l’ensemble, l’analyse de la zone a effectivement révélé différents niveaux d’hyper-réplication parmi les souches testées.

Analyse unicellulaire
L’analyse unicellulaire permet de quantifier l’invasion de Salmonella et la charge vacuolaire par rapport à la réplication cytosolique à l’intérieur des cellules épithéliales avec une résolution unicellulaire. Tel que décrit à l’étape 4.2, pour chaque dossier d’acquisition, les canaux bleu, rouge et vert ont été traités indépendamment (figure 4). Plus précisément, le canal bleu, correspondant aux cellules épithéliales, a été traité à l’étape 4.2.3 pour obtenir la segmentation cellulaire. Ensuite, des cellules segmentées ont été ajoutées au gestionnaire de région d’intérêt (ROI) pour obtenir une liste de ROI, correspondant à toutes les cellules segmentées étiquetées de manière unique avec des coordonnées y-x. Afin de supprimer les pixels flous des Salmonelles hyper-réplicantes exprimant la GFP, les pixels du canal vert ont été soustraits de ceux du canal rouge. Le tableau de sortie de l’analyse de cellule unique rapporte, pour chaque retour sur investissement, la superficie et le pourcentage de la zone du retour sur investissement occupée par Salmonellae exprimant le rapporteur constitutif mCherry uniquement ou le rapporteur sensible au cytosol GFP. Le pourcentage de la surface de la cellule occupée par des salmonelles exprimant uniquement mCherry a été traité à l’étape 4.2.4 pour calculer le pourcentage de cellules infectées et la charge vacuolaire moyenne (Figure 5A). L’analyse de la charge vacuolaire a montré que le S. Les souches de derby génèrent une charge vacuolaire moyenne nettement inférieure à S. Tm (figure 5B). Inversement, seule une réduction légère et non significative du pourcentage de cellules infectées a été observée dans S. Souches de derby comparées à S. Tm (figure 5A). Le pourcentage de la surface de la cellule occupée par des salmonelles exprimant la GFP a été traité à l’étape 4.2.5 pour obtenir le taux d’hyper-réplication. Aucune différence n’a été observée entre S. Tm et S. Derby wt, tandis que S. Derby ΔsipA a montré une diminution significative de l’hyper-réplication, ce qui correspond au résultat de l’analyse de surface (Figure 5C) et au rôle de SipA dans l’induction de l’hyper-réplication.

Figure 1
Figure 1 : Hyper-réplication cytosolique de Salmonella et charge vacuolaire. Des images représentatives de (A) l’hyper-réplication de Salmonella et (B) de la charge vacuolaire acquise à fort grossissement (40x) sont montrées. Le panneau B montre les différents plans de focalisation des cellules contenant des salmonelles hyper-réplicatives (z:7/8), par rapport aux salmonelles non hyper-réplicatives (z:4/8). Les barres d’échelle blanches sont de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Déroulement de l’analyse de zone. Le flux de travail de l’analyse de surface est montré pour une acquisition représentative à faible grossissement (10x) de cellules INT407 infectées pendant 8 h avec Salmonella portant le plasmide pCHAR-Duo (MOI 100). Tout d’abord, le bruit aléatoire est réduit, puis les canaux sont divisés en C1, C2 et C3 et traités indépendamment. Un seuil est fixé pour chaque canal afin d’exclure le bruit de fond de la zone de mesure. Ensuite, la surface occupée par les pixels seuillés uniquement - correspondant aux noyaux cellulaires en C1, à toutes les salmonelles intracellulaires en C2 et aux salmonelles cytosoliques en C3 - est mesurée pour chaque canal. Les images analysées ici sont les résultats de quatre carreaux acquis à un grossissement de 10x fusionnés par couture. Les barres d’échelle blanches sont de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Résultats de l’analyse de la zone. Les résultats de l’analyse de la zone sont présentés. (A) Le rapport d’infection est calculé en divisant la surface occupée par les salmonelles exprimant mCherry (canal C2), représentant toutes les bactéries intracellulaires, par la surface occupée par les noyaux des cellules hôtes (canal C1). (B) Le rapport d’hyper-réplication a été mesuré en divisant la zone occupée par les salmonelles exprimant la GFP (canal C3), représentant uniquement les bactéries hyperréplicatives cytosoliques, par la surface occupée par toutes les salmonelles intracellulaires exprimant mCherry. Chaque point représente une réplique. L’analyse a été menée sur trois répétitions biologiques, chacune testée en trois exemplaires. Les lignes noires indiquent les valeurs moyennes. La signification a été calculée à l’aide d’un test t bilatéral, et les valeurs p sont rapportées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Déroulement de l’analyse unicellulaire. Le flux de travail de l’analyse unicellulaire est montré pour une acquisition représentative à fort grossissement (40x) de cellules INT407 infectées pendant 8 h par Salmonella portant le plasmide pCHAR-Duo (MOI 100). Tout d’abord, les canaux sont divisés en C1, C2 et C3 et traités indépendamment. Le canal bleu (C1), correspondant aux cellules épithéliales, est traité pour obtenir la segmentation cellulaire, puis chaque cellule segmentée est définie comme une région d’intérêt (ROI) étiquetée de manière unique avec les coordonnées y-x. Le canal rouge (C2) est traité en soustrayant le canal vert (C3) pour éliminer les salmonelles cytosoliques hyper-réplicatives floues, laissant toutes les salmonelles vacuolaires exprimant mCherry seulement, puis le bruit aléatoire a été réduit et le seuil est réglé pour exclure le bruit de fond des mesures. Enfin, la surface occupée par les Salmonellae vacuolaires pour chaque ROI est mesurée. Le canal vert (C3), correspondant aux salmonelles exprimant la GFP cytosolique totale, est traité de manière similaire. Les images analysées ici sont les résultats de 16 carreaux fusionnés par couture. Les barres d’échelle blanches sont de 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Résultats de l’analyse sur une seule cellule. Les résultats de l’analyse unicellulaire sont présentés. (A) Le pourcentage de cellules infectées est obtenu en divisant le nombre de cellules dont un pourcentage de surface occupée par des Salmonellae exprimant uniquement mCherry> 0,2 par le nombre total de cellules. (B) La charge vacuolaire moyenne a été obtenue en calculant le pourcentage moyen de surface occupée par les salmonelles exprimant uniquement mCherry dans les cellules infectées. (C) Le taux d’hyper-réplication a été calculé en divisant le nombre de cellules dont un pourcentage de la surface occupée par des Salmonellae exprimant la GFP≥20% par le nombre total de cellules infectées. Les données de trois à quatre réplicats biologiques testés en triple exemplaire sont rapportées. Les barres indiquent l’erreur type de mesure. La signification a été calculée à l’aide d’un test t bilatéral, et les valeurs p sont rapportées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Script d’analyse de zone. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Script d’analyse unicellulaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La façon dont Salmonella colonise les cellules épithéliales intestinales influence le résultat de l’infection. Lors de l’invasion, l’hyper-réplication cytosolique induit une inflammation de l’intestin3, tandis que la réplication vacuolaire peut entraîner une propagation systémique4. La capacité des souches de Salmonella à envahir et à se répliquer à l’intérieur des cellules épithéliales intestinales9 peut varier. En effet, Salmonella est un genre extrêmement diversifié comprenant plus de 2 500 sérovars, qui ont différentes capacités à causer des maladies. En outre, Salmonella est la cause la plus fréquemment signalée de foyers épidémiques d’origine alimentaire dans l’Union européenne, ce qui indique une forte propagation dans la population humaine1. Par conséquent, la disponibilité de méthodes fiables à haut débit pour la quantification des phénotypes intracellulaires de Salmonella est d’une grande importance pour évaluer les différences de virulence entre un grand nombre de souches de Salmonella et, en fin de compte, permettre une évaluation précise et spécifique des risques de cet agent pathogène.

Le protocole décrit ici mesure le comportement de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales de manière rapide et automatisée. L’infection des cellules épithéliales est réalisée dans des microplaques d’imagerie à 96 puits et un microscope à fluorescence automatisé est utilisé pour l’acquisition d’images, ce qui rend le protocole adapté aux applications à haut débit. Ce protocole tire parti du plasmide pCHAR-Duo, qui permet de distinguer les Salmonelles vacuolaires des Salmonelles cytosoliques grâce à l’expression différentielle de deux rapporteurs fluorescents5. Les phénotypes intracellulaires de Salmonella sont souvent analysés par notation manuelle, une procédure longue qui ne convient pas à l’analyse d’un grand nombre de souches et de cultures cellulaires par souche et sujette aux erreurs de l’opérateur et aux variations inter-opérateurs. Pour surmonter ces limitations, deux analyses d’images complémentaires et automatisées ont été développées, l’analyse de zone et l’analyse de cellule unique. ImageJ, un logiciel disponible gratuitement, a été utilisé pour développer les deux analyses. Afin d’accélérer l’exécution du protocole, les scripts ImageJ pour l’analyse par lots de plusieurs fichiers d’acquisition sans intervention de l’opérateur sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires.

L’analyse de surface a été conçue pour quantifier, en quelques étapes, la colonisation globale des cellules épithéliales (taux d’infection) et le niveau d’hyper-réplication (taux d’hyper-réplication) par la mesure des zones spécifiquement occupées par les noyaux des cellules épithéliales et par les salmonelles exprimant mCherry ou mCherry avec la GFP. L’analyse de surface est appliquée aux images acquises à faible grossissement, où les salmonelles vacuolaires et hyper-réplicatives sont focalisées dans le même plan z, et un grand nombre de cellules épithéliales est affiché par champ microscopique, ce qui réduit la taille et le nombre de fichiers d’acquisition. L’analyse de zone permet une analyse automatisée, rapide et légère sur le plan informatique d’un grand nombre d’échantillons, ce qui la rend adaptée aux tests à haut débit tels que les expériences de criblage.

L’analyse unicellulaire a été conçue pour quantifier les phénotypes de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales avec une résolution unicellulaire, obtenue par segmentation cellulaire et mesure de la zone cellulaire et du pourcentage de surface occupée par les Salmonellae hyper-réplicatives vacuolaires et cytosoliques. La colonisation globale des cellules épithéliales caractérisées par l’analyse de l’aire est ici décomposée en trois paramètres quantitatifs, le pourcentage de cellules infectées, la charge vacuolaire moyenne et le taux d’hyper-réplication, permettant d’évaluer et de quantifier la contribution de chaque phénotype à la colonisation globale, complétant ainsi les résultats de l’analyse de surface. Les plus grands détails offerts par l’analyse à cellule unique se font au prix d’une acquisition et d’une analyse d’image plus lentes. En fait, afin d’obtenir une résolution unicellulaire, l’acquisition d’image est effectuée à fort grossissement. Cela implique que plusieurs plans z sont nécessaires pour observer les salmonelles vacuolaires et cytosoliques au point et que l’acquisition d’un grand nombre de champs par échantillon est nécessaire pour marquer un nombre élevé de cellules épithéliales, prolongeant ainsi le temps d’acquisition par rapport à l’analyse de surface. De plus, l’analyse de plusieurs fichiers d’acquisition volumineux est exigeante en termes de calcul, ce qui nécessite un poste de travail approprié (un poste de travail 6 cœurs et 32 Go de RAM a été utilisé). Par conséquent, l’analyse unicellulaire peut être utilisée de manière autonome dans des conditions de débit limité ou comme méthode de deuxième niveau couplée à l’analyse de zone pour mieux comprendre les phénotypes de Salmonella à l’intérieur des cellules épithéliales.

Les deux analyses complémentaires ont été validées à l’aide de S. Tm, S. Derby wt, et S. Derby ΔsipA, choisi parce que leur comportement à l’intérieur des cellules épithéliales était déjà connu pour différer en termes d’invasion ou de réplication 9,10. Les résultats des analyses de surface et de cellule unique montrent que le protocole a permis de distinguer quantitativement les différences dans les phénotypes intracellulaires de Salmonella en fonction des caractéristiques des souches testées. De plus, ces résultats démontrent que l’analyse unicellulaire permet de quantifier la contribution de chaque phénotype intracellulaire (invasion, charge vacuolaire et réplication cytosolique) à la colonisation globale notée à l’aide de l’analyse de surface.

Ce protocole a été appliqué ici pour étudier la pathogénicité in vitro de différentes souches de Salmonella, mais il peut avoir d’autres applications telles que l’étude de mutants aléatoires pour identifier les gènes impliqués dans l’invasion et / ou la réplication à l’intérieur des cellules épithéliales. De plus, le protocole peut être adapté pour analyser le comportement de Salmonella à l’intérieur d’autres lignées cellulaires que les cellules INT407. Il peut également être utilisé comme point de départ pour développer des méthodes similaires pour étudier l’interaction cellule-pathogène d’autres micro-organismes intracellulaires.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient remercier la Dre Olivia Steele-Mortimer d’avoir partagé le plasmide pCHAR-Duo. Ce travail a été financé par le ministère italien de la Santé, subventions PRC2019014 et PRC2021004.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well imaging microplate Eppendorf 30741030 Cell culture and infection
Ampicillin Sigma-Aldrich 59349 Bacteria culture
Axio observer inverted microscope ZEISS Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono ZEISS Microscope Camera
Breathable sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059 Infection assay
Colibrì 5/7 ZEISS Led light source
Collagen I rat tail Life Technologies A1048301 Collagen coating
DAPI Invitrogen D3571 Cell staining
Fetal bovine serum Gibco 10099-141 Cell culture and infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G12664 Infection assay
Glacial acetic acid Carlo Erba 401391 Collagen coating
HCS CellMask Blue Invitrogen H32720 Cell staining
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium Sigma-Aldrich M5650-500ML Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4% Invitrogen FB002 Cell fixation
Potassium chloride PanReac AppliChem 131494.1211 PBS preparation
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60220 PBS preparation
Sodium Chloride PanReac AppliChem 131659.1214 Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 71640 PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap Euroclone ET7025 Cell culture
Triton X-100 Biorad 1610407 Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Cell culture and infection
Tryptone Oxoid LP0042B Bacteria culture
Yeast extract Biolife 4122202 Bacteria culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Berni, M., Pongolini, S., Tambassi,… More

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi, M. Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ. J. Vis. Exp. (186), e64263, doi:10.3791/64263 (2022).

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