Summary
살모넬라 균 은 살모넬라 특이 적 액포와 세포질에서 자유 (과다 복제) 모두에서 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제합니다. 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜은 ImageJ를 통한 두 가지 보완 이미지 분석을 통해 살모넬라균 의 세포 내 표현형을 정량화하여 단일 세포 분해능 및 스코어링에 도달하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.
Abstract
살모넬 라 균은 장 상피를 침범하고 살모넬라 균 특이 적 액포 내부와 세포질에서 자유 (세포질 과잉 복제) 모두에서 장 세포에서 복제 할 수있는 장 병원체입니다. 이러한 세포 내 복제의 이러한 다양한 표현형은 병인의 다른 경로, 즉 세포질 과복제는 염증성 세포 사멸 및 장 내강으로의 압출을 유도하는 반면, 액포 복제는 상피 횡단 침투 및 전신 확산을 유도합니다. mCherry와 GFP의 차별적 발현에 의해 액포와 세포질 박테리아를 구별할 수 있는 pCHAR-Duo 형광 리포터 플라스미드와 같은 침범된 세포 내에서 살모넬라 균의 거동을 연구하기 위한 현미경 도구를 만들기 위해 상당한 노력을 기울였습니다. 그러나 세포 내 표현형은 종종 수동으로 점수를 매기므로 분석을 소수의 샘플과 세포로 제한하는 시간 소모적 인 절차입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 고처리량 프로토콜에서, 상피 세포는 96-웰 플레이트를 사용하여 pCHAR-Duo를 운반하는 살모넬라균 에 감염되었다. 이미징은 자동화된 형광 현미경을 사용하여 수행하였다. 그런 다음 두 가지 이미지 분석 방법을 적용하여 서로 다른 세부 수준에서 살모넬라균 의 세포 내 거동을 측정했습니다. 첫 번째 방법은 전체 세포 내 박테리아 부하와 세포질 과복제의 정도를 측정합니다. 빠르고 많은 수의 세포와 샘플의 스코어링이 가능하여 스크리닝 실험과 같은 고처리량 분석에 적합합니다. 두 번째 방법은 단일 세포 분석을 수행하여 감염된 세포의 비율, 살모 넬라균 의 평균 액포 부하 및 상피 세포 내부의 살모넬라균 행동에 대한 자세한 정보를 제공하는 세포질 과복제율을 결정합니다. 프로토콜은 살모넬라-장 세포 상호 작용의 주요 단계에 대한 배치 분석을 자동으로 실행하기 위해 특별히 설계된 ImageJ 스크립트로 수행 할 수 있습니다.
Introduction
살모넬라 균은 유럽 연합1에서 식 인성 질환의 발병을 일으키는 가장 빈번하게보고되는 박테리아 인자입니다. 살모넬라 감염의 주요 병리학 적 증상은 장염이며, 이는 섭취 후 장내 병원체 행동과 그에 따른 국소 염증 반응의 결과입니다2. 그러나 살모넬라 균은 또한 장 외 부위로 전파되어 특히 면역 저하 된 개인에게 전신 감염을 일으킬 수 있습니다. 살모넬라와 장 상피 사이의 상호 작용 유형은 감염의 결과를 결정합니다. 일단 장 내강에 들어가면 살모넬라 균은 장 상피 세포 내부로 침입하여 복제합니다. 세포 내 수준에서 살모넬라 균은 살모넬라 함유 액포 (SCV) 내에서 세포질 과복제와 액포 내 느린 복제의 두 가지 다른 복제 표현형을 나타낼 수 있습니다. 세포질 과복제는 염증성 숙주 세포 사멸 및 장 내강으로의 살모넬라 압출을 유도합니다3; 액포 복제는 상피 횡단 침투 및 전신 확산으로 이어집니다4. 따라서 침입 및 액포 대 세포질 복제의 정도가 감염 과정에 영향을 미칩니다.
살모넬라 균 속은 숙주 범위와 질병을 일으키는 능력이 다른 수천 개의 혈청 형을 포함하여 매우 다양합니다. 예를 들어 S입니다. Typhimurium은 관련없는 여러 숙주를 감염시키고 인간 살모넬라증의 주요 원인 중 하나를 나타 내기 때문에 일반 혈청으로 정의됩니다. 다르게, S. Derby는 대부분 돼지로부터 분리되기 때문에 돼지 적응 혈청 형으로 간주되지만 인간 감염을 담당하는 혈청 형의 상위 5 위에도보고됩니다1. 그러나 상피 세포 내부의 박테리아 행동에 대한 지식은 본질적으로 S와 같은 몇 가지 참조 균주에 대한 연구로 제한됩니다. Typhimurium SL1344, 이는 살모넬라 병원성의 광대 한 자연 다양성을 나타내지 않습니다. 살모넬라균의 다양한 균주와 상피 세포의 상호 작용을 특성화하는 것은 다양한 병원성을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 이러한 이유로 많은 균주의 세포 내 거동을 빠르고 대부분 자동화된 방식으로 분석하기 위해 고처리량 형광 현미경 기반 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜에서는 96웰 이미징 플레이트에서 상피 세포의 감염을 수행하고 자동 형광 현미경을 사용하여 이미지를 획득했습니다. pCHAR-Duo 플라스미드를 형광현미경을 통해 상피세포 내부의 살모넬라균의 침윤 및 복제 표현형을 관찰하기 위해 사용하였다5. 이 플라스미드는 모든 형질전환된 박테리아 세포에 의해 구성적으로 발현되는 적색 형광 리포터 mCherry를 코딩하는 유전자와 녹색 형광 리포터 GFP를 코딩하는 유전자를 운반하며, 그의 발현은 진핵 세포의 세포질에만 존재하고 SCV에는 없는 포도당-6-인산에 의해 활성화됩니다. 따라서 플라스미드는 mCherry 및 GFP 리포터의 차별적 발현에 의해 액포와 세포질 박테리아를 구별할 수 있습니다.
현미경 이미지의 액포 및 세포질 박테리아는 일반적으로 수동 스코어링6으로 정량화되지만 이는 분석을 소수의 샘플로 제한하는 시간 소모적인 방법입니다. 따라서 무료로 제공되는 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ7을 사용하여 영역 분석과 단일 셀 분석이라는 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 면적 분석은 획득 한 각 현미경 이미지에서 상피 세포, 적색 및 녹색 살모넬라 균이 차지하는 영역의 데이터를 사용하여 전체 세포 내 박테리아 부하와 세포질 과다 복제 정도를 측정합니다. 이 방법은 저배율에서 획득한 이미지에 적용할 수 있습니다. 따라서 적은 이미지로 많은 수의 상피 세포를 채점할 수 있어 획득 시간이 단축됩니다. 단일 세포 분석은 세포 분할을 사용하여 감염된 세포의 백분율, 평균 액포 부하 및 단일 세포 분해능으로 세포질 과복제를 받는 감염된 세포의 백분율을 결정합니다.
이 프로토콜에서는 이미지 분석의 모든 단계를 수동으로 수행하도록 자세히 설명하지만 특별히 설계된 ImageJ 스크립트로 동일한 분석을 자동화할 수 있습니다. 또한 이러한 스크립트를 사용하면 배치 분석을 실행하여 여러 이미지를 자동으로 분석하여 메서드 실행 속도를 높일 수 있습니다.
Protocol
1. pCHAR-Duo 리포터 플라스미드를 운반하는 살모넬라균 에 의한 상피세포의 감염
참고: 멀티채널 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.
- 사용 직전에 96웰 이미징 플레이트를 검은색 벽과 평평한 유리 바닥으로 콜라겐으로 코팅하십시오.
- 묽은 빙초산(17. 4 M)을 화학적 후드 하에 멸균된 탈염수에 넣고 20 mM 아세트산 용액을 얻었다. 멸균 조건 하에서, 0.2 μm 공극 크기의 주사기 필터를 통해 용액을 여과한다. 용액을 0-4 °C 랙에 5분 동안 그대로 두십시오.
- 3 mg/mL 콜라겐 스톡을 미리 냉각된 20 mM 아세트산 용액에서 50 μg/mL로 희석합니다. 10 번 뒤집어 혼합 한 다음 웰당 30μL의 콜라겐 용액 (5μg의 콜라겐 / cm2)을 분주하고 콜라겐 겔화를 방지하기 위해 용액을 0-4 ° C 랙에 보관합니다.
- 웰 바닥이 콜라겐으로 완전히 덮여 있는지 확인한 다음 플레이트를 실온(RT)에서 1시간 동안 층류 상태로 둡니다.
- 용액을 부드럽게 제거하고 30μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 3회 세척합니다. 콜라겐 박리를 방지하기 위해 멀티채널 100μL 또는 50μL 피펫을 사용하십시오.
- 감염 20-24시간 전에 콜라겐 코팅 이미징 플레이트에서 INT407 상피 세포를 배양합니다.
- INT407 세포를 페니실린 100U/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL(Pen/Strep)가 보충된 10%의 소 태아 혈청(FBS)이 포함된 최소 필수 배지(이하 정의된 배양 배지)의 최소 필수 배지에서 25cm2 플라스크에서 일상적으로 배양합니다.
- INT407 플라스크를 PBS 5mL로 두 번 세척한 다음, 감염 20-24시간 전에 가습된 5%CO2 분위기에서 37°C에서 3-5분 동안 트립신-EDTA 용액 1mL로 세포를 분리합니다. 세포를 계수하고 CM에 3 x 105 cells/mL 현탁액을 준비합니다.
- 100 μL의 세포 현탁액/웰을 콜라겐 코팅 이미징 플레이트에 분주하여 100% 합류점을 얻습니다. 세포 부착을 촉진하기 위해 가습된 5%CO2 분위기에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 이어서, 100 μL의 CM을 첨가하고, 감염될 때까지 20-24 h 동안 가습된 5%CO2 분위기에서 37°C에서 인큐베이션한다(단계 1.4).
참고: 세포 내 박테리아를 이미지화하기 위해 살모넬라 균주는 Olivia Steele-Mortimer 박사가 친절하게 제공한 pCHAR-Duo 리포터 플라스미드로 형질전환됩니다. 여기에서 테스트된 균주는 프로토콜에서 다루는 표현형 다양성을 나타내고 섹션 4의 이미지 분석을 검증하기 위해 선택되었습니다. 이 연구에 사용된 균주에 대한 자세한 내용은 대표 결과를 참조하십시오.
- pCHAR-Duo 리포터 플라스미드를 운반하는 살모넬라 균주의 고정상 배양물을 준비합니다.
- 10μL 피펫 팁으로 살모넬라 글리세롤 스톡을 샘플링하고 암피실린 100μg/mL가 보충된 Luria Bertani 브로스 1mL(1리터당 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 10g)에 접종합니다.
- 접종원을 감염 전 37°C에서 20시간 동안 정적으로 배양하여 ~1 x 109 집 락 형성 단위(CFU)/mL8에 해당하는 성장 정지기에 도달합니다.
- INT407 상피 세포를 살모넬라균으로 감염시킵니다.
참고: 감염은 삼중으로 수행됩니다.- INT407 세포를 200μL의 PBS/웰로 부드럽게 세척합니다.
- CM에서 밤새 배양 된 박테리아를 희석하여 살모넬라 균 접종 물을 준비하여 감염의 다양성 (MOI)으로 정의 된 상피 세포 당 원하는 수의 CFU를 얻습니다. 여기에 MOI 100이 사용되었습니다.
- 200 μL/웰을 접종한 다음, 통기성 밀봉 멤브레인으로 플레이트를 덮고 가습된 5%CO2 분위기에서 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 접종은 감염의 시간 0으로 간주됩니다.
- 접종물을 제거하고 200μL의 PBS/웰로 부드럽게 세척한 다음 웰당 100μg/mL의 겐타마이신과 함께 200μL의 CM을 추가합니다. 통기성 밀봉 막으로 플레이트를 덮은 다음, 가습된 5%CO2 분위기에서 37°C에서 1시간 동안 배양한다.
- 겐타 마이신 100 μg / mL로 CM을 제거하고 200 μL의 PBS / 웰로 부드럽게 세척하십시오. 웰당 겐타마이신 10μg/mL와 함께 CM 200μL를 추가하고 통기성 밀봉막으로 플레이트를 덮은 다음 가습된 5%CO2 분위기에서 37°C에서 8시간 동안 배양합니다.
2. 시료 고정 및 상피세포 염색
알림: 직접적인 빛에 노출되지 않도록 샘플을 보호하십시오. 부피는 96 웰 플레이트의 웰에 대해 표시됩니다. 부피 최적화는 다양한 세포 배양 플레이트 또는 지지체에 필요합니다.
- 감염 후 8 시간에 CM을 제거하고 200 μL / 웰의 PBS로 3 회 부드럽게 세척하십시오. 흡수성 종이에 플레이트를 뒤집어 PBS를 제거합니다. 흡인을 피하십시오.
- 감염된 단분자층을 PBS 중 100μL/웰의 파라포름알데히드(PFA) 4%로 RT에서 20분 동안 고정합니다. PFA 4%를 제거하고 200μL/웰의 PBS로 3회 세척합니다. 플레이트는 4 ° C에서 최대 16-24 시간 동안 보관할 수 있습니다. 다음 단계를 진행합니다.
- 상피 세포를 염색하십시오.
참고 : DAPI (4 ', 6- 디아 미디 노 -2- 페닐 인돌) DNA 염색 (단계 2.3.1)은 핵을 염색하기위한 영역 분석에만 사용되며 고 함량 스크리닝 (HCS) 염색 (단계 2.3.2)은 전체 상피 세포를 염색하기위한 단일 세포 분석에 사용됩니다. 다른 세포 염색을 사용할 수 있지만 이미지 획득 및 분석의 최적화가 필요합니다.- 면적 분석: 100μL/웰의 DAPI(PBS 중 300nM 용액)를 분주하고 빛으로부터 보호되는 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 단일 세포 분석: RT에서 15분 동안 PBS에서 100μL/웰의 트리톤 0.1x로 투과화합니다. PBS로 3회 세척하고 PBS에서 1:2000으로 희석된 HCS 염색 100μL/웰을 분주합니다. 빛으로부터 보호되는 RT에서 30분 동안 배양합니다.
- 염색 용액을 제거하고 200μL/웰의 PBS로 3회 세척합니다. 자동 이미지 획득을 위해 50μL/웰의 PBS를 추가합니다.
3. 자동 형광 현미경을 사용한 이미지 획득
참고: 여기서는 영역 분석을 위한 3.1.1단계의 저배율(10x/0.3 NA, 1 μm/픽셀 대물렌즈)과 단일 셀 분석을 위한 3.1.2단계의 고배율(40x/0.75 NA, 0.255 μm/픽셀 대물렌즈)이 수집 프로토콜에 사용됩니다. 다른 배율을 사용할 수 있지만 이미지 획득 및 분석의 최적화가 필요합니다. 사용 가능한 현미경에서 허용하는 경우 타일이라고 하는 연속 필드의 "모자이크"인 타일 영역(TR)으로 이미지를 획득하여 큰 샘플 영역을 기록합니다. 자동 초점 절차 중에 샘플 노출을 줄이기 위해 각 타일에 대해 하나씩 설정하는 대신 TR 중앙에 자동 초점을 설정합니다.
- 세포 염색 채널(HCS 염색 및 DAPI 핵 염색의 경우 파란색 채널)에서 소프트웨어 자동 초점을 기준 z 위치로 사용합니다. 세포 염색 채널(465nm, 세포 또는 핵) 및 pCHAR-Duo 리포터 채널 mCherry(610nm, 세포 내 살모넬라균) 및 GFP(509nm, 세포질 과복제 살모넬라균)에서 이미지를 획득합니다.
- 면적 분석: 10배 배율에서 이미지 ≥10 4셀/기술 복제(즉, 기술 복제에 해당하는4 개의 타일/웰의 TR 3개 이상 권장).
참고: 단일 z-평면은 액포를 포함하는 세포와 10x 배율에서 세포질 과복제 살모넬라균 을 포함하는 세포를 모두 이미지화하기에 충분합니다. - 단일 세포 분석: 40배 배율에서 이미지≥1,000개 세포/기술 복제(즉, 기술 복제에 해당하는 16개 타일/웰의 TR 2개 이상 권장). 액포를 포함하는 세포와 세포질 과복제 살모넬라균을 포함하는 세포를 모두 이미지화하려면 여러 z 평면이 필요합니다. 최적의 z-스택을 정의합니다(8개의 z-평면을 얻기 위해 0.55μm 간격으로 3.85μm z-스택은 40x에서 세포질 과복제 살모넬라균 에 감염된 INT407 세포를 이미지화하도록 표시됨). 각 z-평면은 이후 n/8로 식별되며, n은 1(하단 z-평면에 해당)과 8(상단 z-평면에 해당) 사이에 있습니다.
- 면적 분석: 10배 배율에서 이미지 ≥10 4셀/기술 복제(즉, 기술 복제에 해당하는4 개의 타일/웰의 TR 3개 이상 권장).
- 각 수집의 출력값은 모든 필드, 채널 및 z-평면의 이미지를 포함하는 Acquisition.czi라는 파일입니다. TR을 획득한 경우 단일 Acquisition.czi 파일을 스티칭 메서드의 입력으로 사용하여 타일을 함께 융합하여 각 TR의 전체 이미지를 가져옵니다.
4. ImageJ를 이용한 이미지 분석
참고: 4.1단계와 4.2단계는 위에서 설명한 실험 및 획득을 위해 특별히 설계되었습니다. 다른 실험 설정에서는 분석 최적화가 필요할 수 있습니다. 단일 Acquisition.czi 파일의 분석에 대해 설명합니다. 배치 분석의 경우 단일 셀 분석 스크립트와 영역 분석 스크립트를 보충 파일(보충 파일 1 및 보충 파일 2)로 찾습니다. 스크립트 및 ImageJ 명령에 사용된 레이블은 아래 섹션에서 굵게 표시됩니다.
- 면적 분석
- 스크립트에서 AcquisitionTitle로 명명된 ImageJ에서 Acquisition.czi 파일을 엽니다: File > Open > AcquisitionTitle.czi. 모든 채널을 보여주는 창이 열립니다. 채널은 획득 순서에 따라 c:1-3/3으로 표시됩니다. 여기서 c:1/3은 파란색(DAPI), c:2/3은 mCherry(세포 내 살모넬라균), c:3/3은 GFP(세포질 과복제 살모넬라균)에 해당합니다.
- 랜덤 노이즈를 줄여 4.1.6단계 및 4.1.7단계에서 영역 측정을 위한 이미지를 준비합니다.
- 이미지 > 복제 > 확인을 사용하여 획득 제목 창을 복제하여 획득 제목1 창을 가져옵니다.
- 가우스 흐림 효과를 가우스 흐림 효과 > 필터 > 처리를 통해 AcquisitionTitle1에 적용합니다. 기본 시그마 값을 2로 두고 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택? 창이 열리면 예를 클릭하여 모든 채널을 처리합니다.
- 원본 파일에서 가우스 필터링된 획득 제목1을 뺍니다.프로세스별 획득 제목 > 이미지 계산기: 획득 제목을 이미지1로 선택하고 드롭다운 목록에서 빼기 작업을 선택한 다음 이미지2로 취득 제목1을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택? 창이 열립니다. 예를 클릭하여 세 이미지(채널)를 모두 처리하여 ResultsOfAcquisitionTitle 창을 가져옵니다.
- 이미지 > 컬러 > 분할 채널을 통해 채널을 분할합니다. 이제 각 채널 이미지가 별도의 창에 표시되며 ImageJ에 의해 자동으로 C-ResultsOfAcquisitionTitle로 이름이 지정됩니다. 여기서 C1-ResultsOfAcquisitionTitle은 DAPI에 해당하고, C2-ResultsOfAcquisitionTitle은 mCherry (세포 내 살모넬라 균)에 해당하며, C3-ResultsOfAcquisitionTitle은 GFP (cytosolic hyper-replicating Salmonellae)에 해당합니다.
- C1-ResultsOfAcquisitionTitle 이미지를 처리하여 상피 세포핵이 차지하는 면적을 측정합니다.
- 프로세스 > 매끄럽기로 이동하여 핵 영역 내부에 구멍으로 나타나는 핵소체를 균질화합니다.
- C1-ResultsOfAcquisitionTitle 이미지 임계값 이미지를 사용하여 배경을 제외하려면 > 임계값 > 조정: 어두운 배경을 선택하고 드롭다운 목록에서 빨간색을 선택합니다. 삼각형 자동 임계값을 설정한 다음 위쪽 슬라이더를 사용하여 핵이 빨간색으로 나타나고 배경이 검은색으로 나타날 때 최소 임계값을 설정합니다(임계값 = 100, 이 프로토콜에 적용됨).
참고: 4.1.4.2단계, 4.1.7단계, 4.2.3.6.1단계 및 4.2.4.3단계에 설명된 자동 임계값은 사용자가 각각 핵/상피 세포 및 박테리아에 가장 적합한 임계값을 수동으로 정의할 수 있는 지침으로 제안됩니다. 자동 임계값의 값은 스크립트에서 정의된 수동 임계값으로 재정의됩니다. 정의된 수동 임계값은 전체 배치 분석에 적용됩니다.
- 측정 분석 > 설정: 임계값 제한 체크를 사용하여 측정값을 임계값 픽셀로 제한하여관심 있는 측정값을 선택합니다. 임계값 픽셀이 차지하는 전체 영역에 해당하는 면적을 확인합니다(즉, C1-ResultsOfAcquisitionTitle의 핵, C2-ResultsOfAcquisitionTitle의 세포내 살모넬라균, C3-ResultsOfAcquisitionTitle의 세포질 과복제 살모넬라균). 레이블 표시를 선택하여 결과 테이블의 모든 이미지에 대한 획득 제목과 채널을 기록합니다.
- 분석 > 측정을 사용하여 핵이 차지하는 면적을 측정합니다. 측정값은 자동으로 열리는 결과 테이블에 기록됩니다.
- C2-ResultsOfAcquisitionTitle 및 C3-ResultsOfAcquisitionTitle을 처리하여 전체 세포내 살모넬라균 및 세포질 과복제 살모넬라균이 차지하는 면적을 각각 측정합니다. 4.1.4-4.1.6 단계를 약간 수정하여 따르십시오 : 4.1.4.1 단계의 스무딩 단계를 건너 뛰고 4.1.4.2 단계의 삼각형 대신 Otsu 자동 임계 값을 가이드로 사용하여 살모넬라가 빨간색으로 나타나고 배경이 검은 색으로 나타날 때 최소 임계 값 (상단 슬라이더)을 설정합니다 (임계 값 = 200 권장).
- 파일 > 다른 이름으로 저장 > 모든 파일을 사용하여 결과 테이블을 저장합니다.
- 스프레드시트에서 결과 테이블을 열어 분석된 각 AcquisitionTitle 파일의 면적 비율을 계산합니다.
- 감염 비율 계산 : 총 세포 내 살모넬라 균 (여기서는 적색 채널, C2-)이 차지하는 면적을 상피 세포 핵 (여기서는 DAPI, C1-)이 차지하는 영역으로 나눕니다.
- 과다 복제 비율 계산 : 세포질 과잉 복제 살모넬라 균 (녹색 채널, C3-)이 차지하는 면적을 총 세포 내 살모넬라 균이 차지하는 면적 (적색 채널 , C2-)으로 나눕니다.
- 단일 세포 분석
- 스크립트에서 AcquisitionTitle로 명명된 ImageJ에서 Acquisition.czi 파일을 엽니다: 파일 메뉴 > > Acquisition.czi 열기. 모든 채널과 모든 z면의 이미지를 보여주는 창이 열립니다.
- 채널을 이미지 > 색상으로 분할> 채널을 분할합니다. 이제 채널이 분리된 창에 표시되며 ImageJ에 의해 자동으로 C-AcquisitionTitle로 이름이 지정됩니다. 여기서 C1-획득 타이틀 창은 상피 세포(파란색), C2-획득 타이틀 창은 세포 내 살모넬라균(mCherry), C3-획득 타이틀 창은 세포질 하이퍼 복제 살모넬라 채널(GFP)에 해당합니다. 각 C-획득 타이틀 창에는 획득한 모든 Z 평면이 포함됩니다.
- 처리 C1-인수타이틀 창, 상피 세포에 해당, 세그먼트 세포.
- 셀 분할에 사용할 Z 평면 이미지를 선택합니다. C1-AcquisitionTitle 창을 선택하고 이미지 > 복제를 사용합니다: 선택한 z-평면의 번호(즉, z 1/8을 선택하려면 1)를 쓰고 제목 상자에 C1Zplane을 쓰고 스택 복제를 선택 취소한 다음 확인을 클릭하여 선택한 z-평면 이미지만 복제합니다. 선택한 Z 평면 이미지를 보여주는 C1Zplane이라는 창이 열립니다.
- 획득한 C1Zplane 영상을 처리하여 영상 대비를 향상시킨다. 프로세스 열기 > 대비 향상 : 포화 픽셀을 조정하고 (즉, 여기서는 1 % 사용) 정규화를 선택하십시오. 그런 다음 확인을 클릭하여 대비 향상 기술을 적용하여 대비 정규화된 C1Zplane 이미지를 얻습니다.
- 조영 정규화된 C1Zplane 이미지를 처리하여 상피 세포를 분할합니다. 프로세스 > 최대값 찾기를 사용하여 FindMaxima 메뉴를 엽니다. 먼저 모든 단일 상피 셀에 하나의 최대값만 귀속되도록 노이즈 허용 오차를 설정하기 위해 미리 보기점 선택에 플래그를 지정합니다. 플래그 가장자리 최대값 제외. 출력 유형 세그먼트 파티클을 선택하고 확인을 클릭하여 표시된 최대점당 세그먼트화된 각 파티클을 보여주는 새로운 이진 마스크와 유사한 이미지인 C1ZplaneSegmented를 얻습니다.
참고: 최대 찾기 ImageJ 알고리즘은 셀을 분할하는 데 사용됩니다. 최대값(픽셀 강도 피크)은 이미지 전체에서 감지되며 잠재적으로 셀에 해당합니다. 노이즈 임계값(노이즈 허용 오차)이 설정되고 최대값 주변의 연속 영역이 분석되어 최대값당 분할된 각 파티클, 즉 각 셀을 정의하는 이진 마스크와 같은 이미지가 생성됩니다. - C1Z평면분할 영상을 처리하여 분할된 셀의 마스크를 만듭니다. 분석 > 파티클 분석 사용: 마스크 표시 및 가장자리에서 제외 옵션을 선택합니다. 마스크에 포함할 분할된 입자의 영역 범위를 Size 매개변수에 따라 조정하여 셀 클러스터 및 세포 분획과 같이 잘못 분할된 개체를 제외합니다. 잘못 분할된 개체의 영역에 점수를 매기려면 도구 모음에서 지팡 이 추적 도구를 사용하여 막대로 입자를 선택한 다음 분석 > 측정을 열어 잘못된 개체의 영역을 측정합니다. 크기 간격(권장 범위 250-1700픽셀2)을 설정하고 확인을 클릭하여 MaskofC1Zplane세그먼트 이진 마스크를 얻습니다.
- 기본적으로 MaskOfC1ZplaneSegmented 이진 마스크에는 반전 LUT가 있습니다. 도구 모음에서 LUT 반전 > LUT 를 사용합니다.
- MaskOfC1Zplane세그먼트 이진 마스크를 처리하여 셀 분할을 수정합니다.
- 4.2.3.2단계에서 얻은 임계값 대비 정규화된 C1Z 평면 이미지입니다. 이미지 사용 > > 임계 값 조정 : 어두운 배경을 확인하십시오. 기본 자동 임계값 설정을 지정합니다. 빨간색 옵션을 선택하고 셀이 완전히 빨간색 으로 표시되고 어두운 배경이 남을 때까지 최소 컷오프 값(위쪽 막대)을 조정합니다(임계값 = 이 프로토콜에 적용된 8,000). 그런 다음 적용을 클릭하여 대비 정규화된 C1Zplane 이미지를 셀이 흰색이고 배경이 검은색인 이진 이미지로 변환합니다.
- MaskOfC1Zplane세그먼트화된 이진 마스크에서 셀 분할을 수정합니다. 프로세스 > 이미지 계산기 사용: MaskOfC1ZplaneSegmented as Image1을 선택하고 드롭다운 목록에서 연산 AND를 선택한 다음 임계값이 적용된 대비 정규화된 C1Z평면을 Image2로 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 출력 이미지는 ImageJ에 의해 C1Z평면 세그먼트 마스크의 결과로 자동으로 명명됩니다.
- C1Z 평면 마스크의 처리 결과를 분할하여 모든 단일 세그먼트 셀을 관심 영역(ROI)으로 레이블을 지정합니다. 파티클 분석을 > 분석을 사용합니다. 4.2.3.4단계에서와 같이 크기를 조정한 다음 아무 것도 표시 안 함 옵션을 선택합니다. 관리자에 추가를 선택하여 모든 파티클(세그먼트화된 셀)을 ROI 관리자 도구에 추가합니다. 또한 가장자리에서 제외를 선택합니다. 확인을 클릭합니다. ROI 관리자 메뉴 에는 ROI로 정의된 모든 파티클(세그먼트화된 셀)의 목록이 표시되며, 각각의 y 및 x 좌표로 고유하게 레이블이 지정됩니다.
- ROI 데이터를 ROI- 셀-획득 제목으로 저장.zip ROI 관리자 메뉴를 통해 추가 > 저장을 클릭합니다. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip 은 단일 세포 분석을 위해 4.2.4.6 단계에서 열립니다.
- 처리 C2-인수타이틀 세포 내에 해당하는 창 (여기서는 빨간색 채널) Salmonellae, 감염된 세포의 수 및 세포 내 액포 부하를 측정한다.
- 빨간색 채널(C2-)에서 녹색 채널(C3-)을 빼서 세포질 과복제 살모넬라균의 초점이 맞지 않는 픽셀을 제거합니다.
- 프로세스 > 이미지 계산기를 사용합니다. C2-획득 제목을 이미지1로 선택하고 드롭다운 목록에서 빼기 작업을 선택한 다음 C3-획득 제목을 이미지2로 선택합니다. 새 창 만들기를 선택하고 확인을 클릭하십시오.
- 프로세스 스택에서 예를 클릭하여 전체 z 스택에 빼기를 적용 하시겠습니까? 창. 출력 창의 이름은 스크립트에서 ResultsOfC2AcquisitionTitle 입니다.
- 프로세스 결과C2AcquisitionTitle을 사용하여 랜덤 노이즈를 줄입니다.
- 복제를 클릭하여 ResultsOfC2AcquisitionTitle 창을 클릭하여 이미지 메뉴 > 복제합니다. 중복 스택을 선택하고 확인을 눌러 ResultsOfC2AcquisitionTitle1 창을 가져옵니다.
- 가우스 흐림 효과 >> 필터 처리를 통해 ResultsOfC2AcquisitionTitle1 창에 가우스 흐림 효과를 적용합니다 Sigma 값을 2로 두거나 사용자 정의하십시오 (즉, 여기서는 Sigma : 4가 사용되었습니다). 확인을 클릭하고 프로세스 스택? 창에서 예를 클릭하여 전체 z 스택에 가우시안 블러를 적용합니다.
- 이미지 계산기 처리를 클릭하여 가우스 필터링된 ResultsOfC2AcquisitionTitle1을 ResultsOfC2AcquisitionTitle로 뺍니다>. ResultsOfC2AcquisitionTitle을 이미지1로 선택하고 드롭다운 목록에서 작업 빼기를 선택한 다음 ResultsOfC2AcquisitionTitle1을 이미지2로 선택합니다. 확인을 클릭합니다. 프로세스 스택? 창에서 예를 클릭하여 전체 z-스택에 빼기를 적용하면 C2-AcquisitionTitle 결과의 결과로 ImageJ에 의해 자동으로 명명된 창을 얻을 수 있습니다.
- C2-획득 결과 결과를 처리하여 배경에서 살모넬라균 을 분리합니다. 이미지 사용 > > 임계 값 조정 : 어두운 배경을 선택하고 Otsu 자동 임계 값을 설정합니다. 살모넬라균이 완전히 빨간색으로 나타나고 어두운 배경이 남을 때까지 최소 컷오프 값(상단 막대)을 조정합니다(임계값 = 이 프로토콜에 적용됨). 적용을 클릭하면 바이너리로 변환 창이 열립니다 : 검은 색 배경을 확인한 다음 확인을 클릭하십시오. 이제 전체 z 스택이 이진 이미지로 변환됩니다.
- 4.2.4.3단계의 C2-AcquisitionTitle 이진 창 결과: 이미지 > 스택 > 슬라이스 설정의 결과에서 액포 살모넬라 초점 평면에 해당하는 중간 Z 평면을 선택하고 선택한 z 평면의 번호를 씁니다(예: 여기서는 z: 4/8이 사용됨). 확인을 클릭합니다.
- 각 ROI(셀)에 대해 기록할 측정값을 설정합니다. 분석 > 측정 설정 사용: 각 ROI의 전체 영역에 해당하는 영역을 확인합니다. 면적 분율 및 임계값 제한을 확인하여 각 ROI에 대해 임계값 픽셀(세포 내 살모넬라균)이 차지하는 면적 분율만 기록합니다. 레이블 표시를 확인하여 모든 단일 ROI에 결과 테이블의 이미지 제목, 채널, z 평면 및 x-y 좌표를 지정합니다.
- 세포 내 살모넬라균의 선택한 z-평면을 처리하여 모든 단일 세포(ROI)에 대해 살모넬라균이 차지하는 레이블, 면적 및 %면적을 기록합니다: 파일 > 열기 4.2.3.8단계에서 저장한 ROI-cells-AcquisitionTitle.zip 파일을 열고 ROI 관리자 메뉴에서 측정을 클릭합니다. 출력은 선택한 측정값을 보고하는 테이블입니다.
- 결과 창에서 파일 > 다른 이름으로 저장을 사용하여 결과 테이블을 저장합니다.
- 스프레드시트에서 결과 테이블 열기: 레이블 세포 내 살모넬라균 이 차지하는 면적 및 %면적은 x 및 y 좌표로 고유하게 식별되는 윤곽이 있는 셀에 해당하는 각 ROI에 대해 표시됩니다.
- 살모넬라균에 대응하는 임계치화된 픽셀들이 차지하는 %면적 > 0을 나타내는 ROI에 대응하는 감염된 세포의 수를 측정한다(즉, 여기서 %면적 > 0.2%는 감염된 세포를 식별하는 것으로 간주된다). 그런 다음 전체 세포에서 감염된 세포의 백분율을 계산합니다.
- 감염된 모든 세포에 대해 액포 살모넬라가 차지하는 평균 면적 %를 계산하여 살모넬라균/세포의 액포 부하를 측정합니다.
- 빨간색 채널(C2-)에서 녹색 채널(C3-)을 빼서 세포질 과복제 살모넬라균의 초점이 맞지 않는 픽셀을 제거합니다.
- 녹색 채널(C3-AcquisitionTitle)을 처리하여 세포질 과복제 살모넬라균을 나타내는 세포 수를 측정합니다. 4.2.4.2단계에서 4.2.4.9단계까지 따르되 약간 수정해야 합니다.
- 상부 z- 평면 (여기서는 z : 7 / 8)에서 작업하는데, 이는 세포질 과복제 살모넬라 균 을 보여주는 세포가 단층에서 튀어 나오기 때문입니다. 따라서 그들은 살모넬라균을 과도하게 복제하지 않는 세포와 비교하여 다른 평면에 초점을 맞추고 있습니다.
- 높은 %면적을 나타내는 세포(ROI)를 스코어링하여 세포질 과복제 살모넬라균(녹색)을 포함하는 세포의 수를 측정합니다(예: %>면적 20%는 세포질 과복제 살모넬라균을 포함하는 세포를 식별하는 것으로 간주됨). 이어서, 4.2.4.9단계에서 점수화된 감염된 세포의 총계에 대한 살모넬라-세포질 과복제를 함유하는 세포의 백분율을 계산한다.
Representative Results
살모넬라 균주에 의한 상피 세포의 감염
이 프로토콜은 상피 세포 내 살모넬라균의 세포 침습 및 세포질 복제(그림 1A) 대 액포 부하(그림 1B)를 분석하기 위해 개발되었습니다. 프로토콜은 다음의 3가지 살모넬라 균주 S를 사용하여 검증되었습니다. 티피뮤리움 SL1344 기준 균주(S. Tm), S. 더비 ER1175 와일드타입(S. Derby wt) 및 S의 동종 돌연변이. sipA 유전자가 없는 더비 ER1175(S. 더비 ΔsipA). S. Derby ER1175 균주는 돼지로부터 분리되었고, 살모넬라 분리물의 IZSLER 감시 수집에 속한다. 균주는 프로토콜에 의해 커버되는 표현형 다양성을 나타내기 위해 선택되었다. 특히, 이러한 균주는 상피 세포 내부의 행동이 침윤 또는 복제 측면에서 이미 다른 것으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다9; 따라서 프로토콜이 세포 내 살모넬라 표현형의 차이를 정량적으로 구별 할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 유용한 대조군이었습니다. 특히, S. Tm 및 S. Derby wt는 이전에 S. Tm은 S보다 침습 및 세포 내 복제 효율이 높습니다. 더비 wt9 동안 S. Derby ΔsipA는 독성 이펙터 SipA가 하이퍼복제10,11의 발병에 결정적인 역할을 하기 때문에 하이퍼복제 손상 균주로서 첨가되었다. 이전에 S에 대해보고되었습니다. 세포질 복제가 침습 후 4 시간 후에 시작되고, 세포질 집단이 빠르게 과다 복제되어 8 시간11,12 분까지 상피 세포를 채 웁니다. 일관되게, 8 시간 긴 감염은 또한 S에서 세포질 과복제 표현형을 관찰하고 정량화하기에 적합하였다. 더비 wt 및 S. 더비 ΔsipA.
면적 분석
단계 4.1의 면적 분석은 하이퍼 복제 (hyper-replication ratio)의 측정과 함께 살모넬라 균에 의한 상피 세포의 전체 집락화 (감염 비율)의 측정을 제공합니다. 그림 2에 설명된 영역 분석 워크플로우에서는 랜덤 노이즈가 감소한 다음 채널이 독립적으로 분할 및 처리됩니다. 영역 측정에서 배경을 제외하기 위해 각 채널에 대해 임계값이 설정됩니다. 그런 다음 임계 픽셀이 차지하는 영역이 각 채널에 대해 측정됩니다. 면적 분석의 결과는 각 획득 파일에 대해 상피 세포핵(파란색 채널), 세포 내 mCherry 발현 살모넬라균(빨간색 채널) 및 mCherry와 함께 GFP(녹색 채널)를 발현하는 세포질 과복제 살모넬라가 차지하는 영역의 확장을 보고하는 테이블입니다. 감염 비율은 mCherry 발현 살모넬라가 차지하는 면적을 숙주 세포 핵이 차지하는 영역으로 나누어 계산합니다. 시험된 균주의 결과는 S. Tm은 두 S 모두에 비해 상당히 높은 감염률을 나타냅니다. 예상대로 더비 균주(그림 3A). 따라서 이러한 결과는 상피 세포를 식민지화하는 살모넬라 균주의 능력의 차이를 검출하는 면적 분석의 효능을 입증합니다. 살모넬라 과복제율은 GFP-발현 살모넬라가 차지하는 면적을 세포내 mCherry-발현 살모넬라가 차지하는 면적으로 나누어 측정한다. 하이퍼 복제를 결정하는 SipA의 역할과 일관되게 S의 하이퍼 복제 비율이 크게 감소했습니다. 더비 ΔsipA 균주는 S와 비교하여 측정되었다. 더비 중량, (그림 3B). S 간에 하이퍼복제 차이는 관찰되지 않았다. Tm 및 S. 더비 wt. 전반적으로, 영역 분석은 분석된 균주 간에 서로 다른 하이퍼복제 수준을 효과적으로 밝혀냈습니다.
단일 세포 분석
단일 세포 분석을 통해 단일 세포 분해능으로 상피 세포 내부의 살모넬라 침습 및 액포 부하 대 세포질 복제를 정량화할 수 있습니다. 4.2단계에서 설명한 대로 각 수집 파일에 대해 파란색, 빨간색 및 녹색 채널을 독립적으로 처리했습니다(그림 4). 구체적으로, 상피 세포에 해당하는 청색 채널을 단계 4.2.3에서 처리하여 세포 분할을 얻었다. 그런 다음 분할된 셀을 관심 영역(ROI) 관리자에 추가하여 y-x 좌표로 고유하게 레이블이 지정된 모든 세그먼트화된 셀에 해당하는 ROI 목록을 얻었습니다. GFP-발현 과복제성 살모넬라균의 초점이 맞지 않는 픽셀을 제거하기 위해, 녹색 채널의 픽셀을 적색 채널의 픽셀로부터 뺐다. 단일 세포 분석의 출력 표는 각 ROI에 대해, mCherry 구성 리포터 또는 GFP 세포질 반응성 리포터만을 발현하는 살모넬라가 차지하는 ROI 영역의 면적 및 백분율을 보고합니다. mCherry 만 발현하는 살모넬라 균이 차지하는 세포 면적의 백분율을 4.2.4 단계에서 처리하여 감염된 세포의 백분율과 평균 액포 부하를 계산했습니다 (그림 5A). 액포 부하의 분석은 S. Derby 균주는 S보다 훨씬 낮은 평균 액포 부하를 생성합니다. Tm(그림 5B). 반대로, S에서 감염된 세포의 백분율의 약간이고 유의하지 않은 감소 만이 관찰되었다. 더비 균주는 S와 비교됩니다. Tm(그림 5A). GFP 발현 살모넬라균 이 차지하는 세포 면적의 백분율을 4.2.5단계에서 처리하여 하이퍼복제율을 얻었다. S 간에 차이는 관찰되지 않았다. Tm 및 S. 더비 wt, 동안 S. Derby ΔsipA 는 면적 분석 결과(그림 5C) 및 과복제를 유도하는 SipA의 역할과 일치하는 과복제의 현저한 감소를 나타냈다.
그림 1: 살모넬라 세포질 과복제 및 액포 부하. (A) 살모넬라 과복제 및 (B) 고배율(40x)에서 획득한 액포 부하의 대표 이미지가 표시됩니다. 패널 B는 비-하이퍼-복제 살모넬라균(z:4/8)과 비교하여 과복제 살모넬라균(z:7/8)을 함유하는 세포의 상이한 초점 평면을 나타낸다. 흰색 스케일 바는 10μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 면적 분석의 워크플로우. 면적 분석의 워크플로우는 pCHAR-Duo 플라스미드(MOI 100)를 운반하는 살모넬라균으로 8시간 동안 감염된 INT407 세포의 대표적인 저배율(10x) 획득에 대해 표시됩니다. 먼저 랜덤 노이즈를 줄인 다음 채널을 C1, C2 및 C3으로 분할하여 독립적으로 처리합니다. 측정 영역에서 배경을 제외하기 위해 각 채널에 대해 임계값이 설정됩니다. 이어서, C1의 세포핵, C2의 모든 세포내 살모넬라, 및 C3의 시토졸 살모넬라에 상응하는 임계치화된 픽셀들에 의해서만 점유되는 영역을 각 채널에 대해 측정한다. 여기에서 분석된 이미지는 10배 배율로 획득한 4개의 타일을 스티칭하여 융합한 결과입니다. 흰색 스케일 바는 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 면적 분석 결과. 면적 분석 결과가 표시됩니다. (A) 감염률은 모든 세포내 세균을 대표하는 mCherry 발현 살모넬라균(C2 채널)이 차지하는 면적을 숙주 세포핵이 차지하는 면적(C1 채널)로 나누어 계산합니다. (B) 하이퍼-복제 비율은 세포질 하이퍼-복제 박테리아만을 나타내는 GFP-발현 살모넬라균(C3 채널)이 차지하는 면적을 모든 세포내 mCherry-발현 살모넬라균이 차지하는 면적으로 나누어 측정하였다. 각 점은 반복실험을 나타냅니다. 분석은 3 개의 생물학적 복제물에 대해 수행되었으며, 각각은 3 배로 테스트되었습니다. 검은색 선은 평균값을 나타냅니다. 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 계산되었으며 p 값이 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 세포 분석의 워크플로우. 단일 세포 분석의 워크플로우는 pCHAR-Duo 플라스미드 (MOI 100)를 운반하는 살모넬라로 8시간 동안 감염된 INT407 세포의 대표적인 고배율 획득(40x)에 대해 도시된다. 먼저 채널은 C1, C2 및 C3로 분할되어 독립적으로 처리됩니다. 상피 세포에 해당하는 청색 채널(C1)을 처리하여 세포 분할을 얻은 다음, 분할된 각 세포를 y-x 좌표로 고유하게 표지된 관심 영역(ROI)으로 정의합니다. 적색 채널(C2)은 녹색 채널(C3)을 빼서 처리하여 초점이 맞지 않는 세포질 과복제 살모넬라균을 제거하고 mCherry만 발현하는 모든 액포 살모넬라균을 남긴 다음 랜덤 노이즈를 줄이고 임계값은 측정에서 배경을 제외하도록 설정됩니다. 마지막으로, 각 ROI에 대해 액포 살모넬라가 차지하는 면적을 측정합니다. 총 세포질 GFP 발현 살모넬라균에 해당하는 녹색 채널(C3)도 유사하게 처리됩니다. 여기에서 분석 된 이미지는 16 개의 타일을 바느질로 융합 한 결과입니다. 흰색 스케일 바는 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 단일 세포 분석 결과. 단일세포 분석의 결과를 나타내었다. (A) 감염된 세포의 백분율은 세포 수를 살모넬라 균만을 발현하는 mCherry 만 차지하는 면적의 백분율로 나눈 것이고> 0.2를 총 세포 수로 나눔으로써 얻어진다. (B) 평균 액포 부하는 감염된 세포에서 살모넬라균 만을 발현하는 mCherry가 차지하는 평균 퍼센트 면적을 계산함으로써 얻어졌다. (C) 과복제율은 GFP 발현 살모넬라균이 차지하는 면적의 백분율로 세포 수를 총 감염된 세포 수≥20%로 나누어 계산하였다. 삼중 시험된 3-4개의 생물학적 복제물의 데이터가 보고됩니다. 막대는 측정의 표준 오차를 나타냅니다. 유의성은 양측 t-검정을 사용하여 계산되었으며 p 값이 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 영역 분석 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 단일 세포 분석 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
살모넬라 균이 장 상피 세포를 식민지화하는 방식은 감염 결과에 영향을 미칩니다. 침윤시, 세포질 과잉 복제는 장의 염증을 유도하는반면, 액포 복제는 전신 확산4을 유발할 수 있습니다. 살모넬라 균주는 장 상피 세포 내부를 침범하고 복제하는 능력이 다양 할 수 있습니다9. 실제로 살모넬라 균은 질병을 일으키는 능력이 다른 2,500 개 이상의 혈청 형으로 구성된 매우 다양한 속입니다. 또한 살모넬라 균은 유럽 연합에서 식 인성 발병의 가장 빈번하게보고되는 원인으로 인간 인구의 큰 확산을 나타냅니다1. 따라서 살모넬라균의 세포내 표현형을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 고처리량 방법의 가용성은 많은 수의 살모넬라 균주 간의 병독성 차이를 평가하고 궁극적으로 이 병원균의 정확하고 균주 특이적 위험 평가를 허용하는 데 매우 중요합니다.
여기에 설명된 프로토콜은 상피 세포 내부의 살모넬라균 거동을 빠르고 자동화된 방식으로 측정합니다. 상피 세포의 감염은 96웰 이미징 마이크로플레이트에서 수행되며 이미지 획득에는 자동 형광 현미경이 사용되므로 이 프로토콜은 고처리량 애플리케이션에 적합합니다. 이 프로토콜은 pCHAR-Duo 플라스미드를 이용하며, 이는 2개의 형광 리포터5의 차등 발현을 통해 액포와 세포질 살모넬라균 을 구별할 수 있게한다. 살모넬라균 의 세포 내 표현형은 종종 수동 스코어링으로 분석되는데, 이는 균주당 많은 수의 균주 및 세포 배양을 분석하는 데 적합하지 않고 작업자의 오류 및 작업자 간 변동이 발생하기 쉬운 시간 소모적인 절차입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 영역 분석과 단일 세포 분석이라는 두 가지 보완적이고 자동화된 이미지 분석이 개발되었습니다. 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 두 가지 분석을 개발했습니다. 프로토콜 실행을 가속화하기 위해 운영자 개입 없이 여러 수집 파일의 배치 분석을 위한 ImageJ 스크립트가 보조 파일로 제공됩니다.
면적 분석은 상피 세포의 핵이 특이적으로 차지하는 영역과 GFP와 함께 mCherry 또는 mCherry를 발현하는 살모넬라균 의 측정을 통해 상피 세포의 전체 집락화(감염 비율)와 과복제 수준(hyper-replication ratio)을 몇 단계로 정량화하도록 설계되었습니다. 영역 분석은 저배율에서 획득한 이미지에 적용되며, 액포와 과복제 살모넬라균 이 동일한 z-평면에 초점이 맞춰지고 현미경 필드당 많은 수의 상피 세포가 표시되어 획득 파일의 크기와 수가 줄어듭니다. 면적 분석을 통해 많은 수의 샘플에 대해 자동화되고 빠르며 계산적으로 가벼운 분석이 가능하므로 스크리닝 실험과 같은 고처리량 분석에 적합합니다.
단일 세포 분석은 세포 분할 및 세포 영역의 측정과 액포 및 세포질 과복제 살모넬라가 차지하는 면적의 백분율을 통해 얻은 단일 세포 분해능으로 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 정량화하도록 설계되었습니다. 면적 분석을 통해 특징 지어지는 상피 세포의 전체 집락화는 감염된 세포의 백분율, 평균 액포 부하 및과 복제 속도의 세 가지 정량적 매개 변수로 분해되어 전체 식민지화에 대한 각 표현형의 기여도를 평가하고 정량화 할 수 있으므로 면적 분석 결과를 보완합니다. 단일 세포 분석이 제공하는 더 많은 세부 사항은 이미지 획득 및 분석 속도가 느려집니다. 실제로, 단일 셀 해상도를 달성하기 위해, 이미지 획득은 고배율에서 수행된다. 이는 초점이 맞춰진 액포 및 세포질 살모넬라균을 모두 관찰하기 위해 여러 z-평면이 필요하고 많은 수의 상피 세포를 채점하기 위해 샘플당 많은 수의 필드를 획득해야 하므로 면적 분석과 비교하여 획득 시간이 연장됨을 의미합니다. 또한 여러 개의 대용량 수집 파일을 분석하는 것은 계산적으로 까다롭기 때문에 적절한 워크스테이션이 필요합니다(6코어, 32GB RAM 워크스테이션 사용). 따라서 단일 세포 분석은 제한된 처리량 조건에서 독립형으로 사용하거나 상피 세포 내부의 살모넬라 표현형을 더 깊이 이해하기 위해 영역 분석에 결합된 두 번째 수준 방법으로 사용할 수 있습니다.
두 가지 보완 분석은 S를 사용하여 검증되었습니다. Tm, S. 더비 wt, 그리고 S. Derby ΔsipA는 상피 세포 내부의 그들의 행동이 침습 또는 복제 측면에서 이미 다른 것으로 알려져 있기 때문에 선택되었습니다 9,10. 영역 및 단세포 분석의 결과는 프로토콜이 시험된 균주의 특성에 따라 세포내 살모넬라 표현형의 차이를 정량적으로 구별할 수 있음을 보여준다. 더욱이, 이들 결과는 단일-세포 분석이 면적 분석을 사용하여 점수화된 전체 콜로니제이션에 대한 각각의 세포내 표현형(침윤, 액포 부하 및 세포질 복제)의 기여도의 정량화를 허용한다는 것을 입증한다.
이 프로토콜은 살모넬라균의 다양한 균주의 시험관 내 병원성을 연구하기 위해 여기에 적용되었지만 상피 세포 내부의 침입 및/또는 복제에 관여하는 유전자를 식별하기 위한 무작위 돌연변이 연구와 같은 다른 응용 프로그램을 가질 수 있습니다. 또한, 상기 프로토콜은 INT407 세포 이외의 다른 세포주 내부의 살모넬라균의 거동을 분석하도록 조정될 수 있다. 또한 다른 세포 내 미생물의 세포 - 병원체 상호 작용을 연구하기위한 유사한 방법을 개발하기위한 출발점으로 사용될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 pCHAR-Duo 플라스미드를 공유해 주신 Olivia Steele-Mortimer 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 이탈리아 보건부의 자금 지원을 받아 PRC2019014 및 PRC2021004를 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well imaging microplate | Eppendorf | 30741030 | Cell culture and infection |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 59349 | Bacteria culture |
| Axio observer inverted microscope | ZEISS | Automated fluorescence microscope | |
| Axiocam 305 Mono | ZEISS | Microscope Camera | |
| Breathable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | Infection assay |
| Colibrì 5/7 | ZEISS | Led light source | |
| Collagen I rat tail | Life Technologies | A1048301 | Collagen coating |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Cell staining |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099-141 | Cell culture and infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G12664 | Infection assay |
| Glacial acetic acid | Carlo Erba | 401391 | Collagen coating |
| HCS CellMask Blue | Invitrogen | H32720 | Cell staining |
| ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) | Image processing software | |
| Minimum Essential Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | M5650-500ML | Cell culture and infection |
| Paraformaldehyde 4% | Invitrogen | FB002 | Cell fixation |
| Potassium chloride | PanReac AppliChem | 131494.1211 | PBS preparation |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 60220 | PBS preparation |
| Sodium Chloride | PanReac AppliChem | 131659.1214 | Bacteria culture and PBS preparation |
| Sodium phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | PBS preparation |
| Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap | Euroclone | ET7025 | Cell culture |
| Triton X-100 | Biorad | 1610407 | Cell staining |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | Cell culture and infection |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | Bacteria culture |
| Yeast extract | Biolife | 4122202 | Bacteria culture |
References
- European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
- Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
- Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
- Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
- Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
- Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
- Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
- Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
- Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
- Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).
