Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Automatiserad analys av intracellulära fenotyper av salmonella med ImageJ

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64263
Automatic Translation
1, 1, 1
1Risk Analysis and Genomic Epidemiology Unit, Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia-Romagna (IZSLER)

Summary

Salmonella invaderar och replikerar inuti tarmepitelceller både i Salmonella-specifika vakuoler och fria i cytosolen (hyperreplikation). Ett fluorescensmikroskopibaserat protokoll med hög genomströmning beskrivs här för att kvantifiera de intracellulära fenotyperna av Salmonella genom två komplementära bildanalyser genom ImageJ, som når encellsupplösning och poängsättning.

Abstract

Salmonella är en enterisk patogen som kan invadera tarmepitelet och replikera i enterocyter, både inuti Salmonella-specifika vakuoler och fria i cytosolen (cytosolisk hyperreplikation). Dessa olika fenotyper av intracellulär replikation driver till olika vägar för patogenes, dvs cytosolisk hyperreplikation inducerar inflammatorisk celldöd och extrudering i tarmlumen, medan vakuolär replikation leder till transepitelpenetration och systemisk spridning. Betydande ansträngningar gjordes för att skapa mikroskopiverktyg för att studera salmonellas beteende inuti invaderade celler, såsom pCHAR-Duo fluorescensreporterplasmid som möjliggör diskriminering mellan vakuolära och cytosoliska bakterier genom differentiellt uttryck av mCherry och GFP. Intracellulära fenotyper poängsätts emellertid ofta manuellt, en tidskrävande procedur som begränsar analysen till ett litet antal prover och celler. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades två kompletterande och automatiserade bildanalyser med ImageJ, en fritt tillgänglig bildanalysprogramvara. I protokollet med hög genomströmning infekterades epitelceller med Salmonella som bär pCHAR-Duo med 96-brunnsplattor. Avbildning utfördes med hjälp av ett automatiserat fluorescensmikroskop. Därefter tillämpades två bildanalysmetoder för att mäta salmonellas intracellulära beteende på olika detaljnivåer. Den första metoden mäter den totala intracellulära bakteriebelastningen och omfattningen av cytosolisk hyperreplikation. Det är snabbt och möjliggör poängsättning av ett stort antal celler och prover, vilket gör det lämpligt för analyser med hög genomströmning, såsom screeningexperiment. Den andra metoden utför encellsanalys för att bestämma andelen infekterade celler, den genomsnittliga vakuolära belastningen av Salmonella och den cytosoliska hyperreplikationshastigheten som ger större detaljer om Salmonella-beteende inuti epitelceller. Protokollen kan utföras av specifikt utformade ImageJ-skript för att automatiskt köra batchanalyser av de viktigaste stegen i Salmonella-enterocytinteraktion.

Introduction

Salmonella är det vanligaste rapporterade bakteriemedlet som orsakar utbrott av livsmedelsburna sjukdomar i Europeiska unionen1. Den primära patologiska manifestationen av Salmonella-infektion är enterit, vilket är resultatet av patogenbeteendet i tarmen efter intag och det därmed följande lokala inflammatoriska svaret2. Salmonella kan dock också spridas till extra-intestinala platser och orsaka systemisk infektion, särskilt hos immunkomprometterade individer. Typen av interaktion mellan Salmonella och tarmepitelet villkorar resultatet av infektionen. En gång i tarmlumen invaderar och replikerar Salmonella inuti tarmepitelceller. På intracellulär nivå kan Salmonella presentera två olika replikationsfenotyper, den cytosoliska hyperreplikationen och den intravakuolära långsamma replikationen inom salmonellainnehållande vakuoler (SCV). Den cytosoliska hyperreplikationen inducerar inflammatorisk värdcellsdöd och Salmonella-extrudering i tarmlumen3; Den vakuolära replikationen leder till en transepitelpenetration och systemisk spridning4. Därför påverkar omfattningen av invasion och vakuolär kontra cytosolisk replikation infektionsförloppet.

Släktet Salmonella är mycket varierat, inklusive tusentals serotyper med olika värdområden och förmågor att orsaka sjukdom. Till exempel S. Typhimurium definieras som en generalist serovar, eftersom den infekterar flera orelaterade värdar och representerar en av de främsta orsakerna till mänsklig salmonellos. Annorlunda, S. Derby anses vara en svinanpassad serovar, eftersom den mestadels är isolerad från svinen, men det rapporteras också i topp fem av de serovarer som är ansvariga för mänsklig infektion1. Kunskapen om bakteriebeteendet inuti epitelcellerna är emellertid i huvudsak begränsad till studier av några referensstammar, som S. Typhimurium SL1344, som inte representerar den stora naturliga mångfalden av Salmonella-patogenicitet. Att karakterisera interaktionen mellan olika stammar av Salmonella och epitelceller skulle bidra till att förstå deras olika patogenicitet. Av denna anledning utvecklades ett fluorescensmikroskopibaserat protokoll med hög genomströmning för att analysera det intracellulära beteendet hos ett stort antal stammar på ett snabbt och till stor del automatiserat sätt. I detta protokoll utfördes infektion av epitelceller i 96-brunns avbildningsplattor och bildförvärv gjordes med hjälp av ett automatiserat fluorescensmikroskop. pCHAR-Duo-plasmiden användes för att observera invasions- och replikationsfenotyperna av Salmonella inuti epitelceller genom fluorescerande mikroskopi5. Denna plasmid bär genen som kodar för den röda fluorescerande reportern mCherry, konstitutivt uttryckt av alla transformerade bakterieceller, och genen som kodar för den gröna fluorescerande reportern GFP, vars uttryck aktiveras av glukos-6-fosfat som uteslutande finns i cytosolen hos eukaryota celler och frånvarande i SCV. Därför tillåter plasmiden diskriminering mellan vakuolära och cytosoliska bakterier genom differentiellt uttryck av mCherry- och GFP-reportrar.

De vakuolära och cytosoliska bakterierna på mikroskopibilder kvantifieras vanligtvis med manuell poängsättning6, men detta är en tidskrävande metod som begränsar analysen till ett litet antal prover. Därför utvecklades två kompletterande och automatiserade bildanalyser med hjälp av ImageJ7, en fritt tillgänglig bildanalysprogramvara. Områdesanalysen mäter den totala intracellulära bakteriebelastningen och omfattningen av cytosolisk hyperreplikation genom att använda data från områden som upptas av epitelceller, röda och gröna Salmonellae i varje förvärvad mikroskopibild. Denna metod kan tillämpas på bilder som förvärvats med låg förstoring; Därför tillåter det att göra ett stort antal epitelceller med få bilder, vilket förkortar förvärvstiden. Encellsanalysen använder cellsegmentering för att bestämma andelen infekterade celler, den genomsnittliga vakuolära belastningen och andelen infekterade celler som genomgår cytosolisk hyperreplikation med encellsupplösning.

I detta protokoll beskrivs alla steg i bildanalysen i detalj som ska utföras manuellt, men samma analys kan automatiseras av våra specialdesignade ImageJ-skript. Dessa skript gör det också möjligt att köra batchanalyser för att automatiskt analysera flera bilder och därmed påskynda körningen av metoden.

Protocol

1. Infektion av epitelceller med Salmonella som bär pCHAR-Duo reporterplasmid

OBS: En flerkanalig pipett rekommenderas.

  1. Täck 96-brunns bildplattor med svarta väggar och planglasbotten med kollagen precis före användning.
    1. Späd isättika (17. 4 M) i sterilt demineraliserat vatten under en kemisk huva för att erhålla en 20 mM ättiksyralösning. Under sterila förhållanden, filtrera lösningen genom ett sprutfilter med 0,2 μm porstorlek. Låt lösningen ligga i ett 0-4 °C rack i 5 min.
    2. Späd 3 mg/ml kollagenstam till 50 μg/ml i förkyld 20 mM ättiksyralösning. Blanda genom att invertera 10 gånger och fördela sedan 30 μl kollagenlösning per brunn (5 μg kollagen/cm2) och förvara lösningen i ett 0-4 °C rack för att undvika kollagengelning.
    3. Se till att brunnsbottnarna är helt täckta med kollagen och lämna sedan plattan under laminärt flöde i 1 timme vid rumstemperatur (RT).
    4. Ta försiktigt bort lösningen och utför tre tvättar med 30 μl fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Använd en flerkanalig 100 μl eller 50 μl pipett för att undvika kollagenavskiljning.
  2. Odla INT407 epitelceller i kollagenbelagda bildplattor 20-24 timmar före infektion.
    1. Odla rutinmässigt INT407-celler i 25 cm2 kolvar i minimum essentiellt medium med 10 % fetalt bovint serum (FBS), nedan definierat odlingsmedium (CM), kompletterat med penicillin 100 U/ml och streptomycin 100 μg/ml (Penna/Strep).
    2. Tvätta två gånger INT407-kolvar med 5 ml PBS och lossa sedan cellerna med 1 ml trypsin-EDTA-lösning i 3-5 minuter vid 37 °C i fuktad 5% CO2-atmosfär 20-24 timmar före infektion. Räkna cellerna och förbered en 3 x 105 celler / ml suspension i CM.
    3. Dosera 100 μL cellsuspension/brunn i kollagenbelagda bildplattor för att erhålla 100% sammanflöde. Inkubera vid 37 °C i fuktad 5%CO2-atmosfär i 1 timme för att underlätta celladhesion. Tillsätt sedan 100 μl CM och inkubera vid 37 °C i fuktad 5% CO2-atmosfär i 20-24 timmar fram till infektionen (steg 1.4).
      OBS: För att avbilda intracellulära bakterier omvandlas Salmonella-stammar med pCHAR-Duo-reporterplasmiden som vänligen tillhandahölls av Dr. Olivia Steele-Mortimer. De testade stammarna här valdes för att representera fenotypdiversiteten som omfattas av protokollet och validera bildanalyserna i avsnitt 4. Se de representativa resultaten för mer information om de stammar som används i denna studie.
  3. Förbered stationära faskulturer av Salmonella-stammar som bär pCHAR-Duo-reporterplasmiden.
    1. Ta prov på salmonellaglycerolbuljongen med spetsen av en pipett på 10 μl och inokulera den i 1 ml Luria Bertani-buljong (10 g trypton, 5 g jästextrakt och 10 g natriumklorid per liter) kompletterat med ampicillin 100 μg/ml.
    2. Inkubera inokulumet statiskt vid 37 °C i 20 timmar före infektion för att nå den stationära tillväxtfasen, motsvarande ~1 x 109 kolonibildande enheter (CFU)/ml8.
  4. Infektera INT407 epitelceller med Salmonella.
    OBS: Infektioner utförs i tre exemplar.
    1. Tvätta försiktigt INT407-cellerna med 200 μL PBS/brunn.
    2. Förbered Salmonella-inokulum genom att späda bakterier över natten kultur i CM för att erhålla önskat antal CFUs per epitelcell, definierad som mångfalden av infektion (MOI). Här användes MOI 100.
    3. Inokulera 200 μl/brunn och täck sedan plattan med ett tätningsmembran som andas och inkubera vid 37 °C i fuktad 5%CO2-atmosfär i 1 h. Inokulering betraktas som tid noll av infektionen.
    4. Ta bort inokulatet och tvätta försiktigt med 200 μL PBS/brunn och tillsätt sedan 200 μL CM med gentamicin 100 μg/ml per brunn. Täck plattan med ett tätningsmembran som andas och inkubera sedan vid 37 °C i fuktad 5%CO2-atmosfär i 1 timme.
    5. Ta bort cm med gentamicin 100 μg/ml och tvätta försiktigt med 200 μl PBS/brunn. Tillsätt 200 μl CM med gentamicin 10 μg/ml per brunn, täck plattan med ett tätningsmembran som andas och inkubera sedan vid 37 °C i fuktad 5%CO2-atmosfär i 8 timmar.

2. Provfixering och epitelcellfärgning

OBS: Håll proverna skyddade från direkt ljusexponering. Volymer anges för brunnar med en 96-brunnsplatta. Volymoptimering krävs för olika cellodlingsplattor eller stöd.

  1. Vid 8 timmar efter infektion, ta bort CM och tvätta försiktigt tre gånger med 200 μl / brunn PBS. Ta bort PBS genom att invertera plattan på absorberande papper; undvik aspirering.
  2. Fixera de infekterade monolagren med 100 μl/brunn paraformaldehyd (PFA) 4% i PBS i 20 min vid RT. Ta bort PFA 4% och tvätta tre gånger med 200 μl/brunn PBS. Plattan kan förvaras i max 16-24 timmar vid 4 °C. Fortsätt med nästa steg.
  3. Fläcka epitelceller.
    OBS: DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol) DNA-fläck (steg 2.3.1) används endast för areaanalysen för att färga kärnor, och HCS-fläck (High Content Screening) (steg 2.3.2) används för encellsanalysen för att fläcka hela epitelcellen. Andra cellulära fläckar kan användas, men optimering av bildförvärv och analys krävs.
    1. Områdesanalys: dosera 100 μl/brunn DAPI (300 nM lösning i PBS) och inkubera 5 min vid RT skyddad från ljus.
    2. Encellsanalys: permeabilisera med 100 μL/brunn triton 0,1x i PBS i 15 min vid RT. Tvätta tre gånger med PBS och dosera 100 μL/brunn HCS-fläck utspädd 1:2000 i PBS. Inkubera i 30 minuter vid RT skyddad från ljus.
  4. Ta bort färgningslösningen och tvätta tre gånger med 200 μl/brunn PBS. Lägg till 50 μl/brunn PBS för automatiserad bildinsamling.

3. Bildförvärv med ett automatiserat fluorescensmikroskop

OBS: Här används låg förstoring (10x/0,3 NA, 1 μm/pixel-mål) i steg 3.1.1 för areaanalys och hög förstoring (40x/0,75 NA, 0,255 μm/pixel-målet) i steg 3.1.2 för encellsanalysen i förvärvsprotokollet. Andra förstoringar kan användas, men optimering av bildförvärv och analys krävs. Om det tillåts av det tillgängliga mikroskopet, hämta bilder som Tile Regions (TRs), en "mosaik" av angränsande fält som kallas brickor, för att registrera stora provområden. Ställ autofokusen i mitten av en TR i stället för att ställa in en för varje panel för att minska provexponeringen under autofokusproceduren.

  1. Använd programvarans autofokus i cellfärgningskanalen (blå kanal för HCS-fläck och DAPI-kärnfläck) som referens z-position. Skaffa bilder i cellfärgningskanal (465 nm, celler eller kärnor) och i pCHAR-Duo-reporterkanaler mCherry (610 nm, intracellulär Salmonellae) och GFP (509 nm, cytosolisk hyperreplikatoriserande Salmonellae).
    1. Områdesanalys: Bild ≥104 celler/tekniskt replikat (dvs. minst tre TR med fyra plattor/brunn som motsvarar ett tekniskt replikat rekommenderas) med 10x förstoring.
      OBS: Ett enda z-plan är tillräckligt för att avbilda både celler som innehåller vakuolära och celler som innehåller cytosolisk hyperreplikatorisk salmonella vid 10x förstoring.
    2. Encellsanalys: Bild ≥1 000 celler/tekniskt replikat (dvs. minst två TR med 16 plattor/brunn som motsvarar ett tekniskt replikat rekommenderas) med 40x förstoring. Flera z-plan krävs för att avbilda både celler som innehåller vakuolära och celler som innehåller cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae. Definiera den optimala z-stacken (3,85 μm z-stack med 0,55 μm intervall för att erhålla åtta z-plan indikeras för att avbilda INT407-celler infekterade med cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae vid 40x). Varje z-plan identifieras nedan som n/8, med n mellan 1 (motsvarande det nedre z-planet) och 8 (motsvarande det övre z-planet).
  2. Utdata från varje förvärv är en fil med namnet Acquisition.czi som innehåller bilder av alla fält, kanaler och z-plan. Om TR:er har förvärvats kan du smälta samman panelerna för att få en övergripande bild av varje TR med hjälp av en enda Acquisition.czi-fil som indata för sömnadsmetoden.

4. Bildanalys med ImageJ

OBS: Steg 4.1 och steg 4.2 är speciellt utformade för experimentet och förvärvet som beskrivs ovan. Andra experimentella inställningar kan kräva optimering av analysen. Analysen av en enda Acquisition.czi-fil beskrivs. För batchanalysen hittar du encellsanalysskriptet och områdesanalysskriptet som kompletterande filer (Tilläggsfil 1 och Tilläggsfil 2). Etiketter som används i skripten och ImageJ-kommandona är i fetstil i avsnitten nedan.

  1. Analys av området
    1. Öppna filen Acquisition.czi i ImageJ, med namnet AcquisitionTitle i skriptet: File > Open > AcquisitionTitle.czi. Ett fönster som visar alla kanaler öppnas. Kanalerna anges som c:1-3/3 beroende på anskaffningsorder. Här motsvarar c: 1/3 blå (DAPI), c: 2/3 till mCherry (intracellulär Salmonellae) och c: 3/3 till GFP (cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae).
    2. Minska slumpmässigt brus för att förbereda bilder för områdesmätning i steg 4.1.6 och 4.1.7.
      1. Duplicera fönstret AcquisitionTitle med Image > Duplicate > OK för att hämta fönstret AcquisitionTitle1 .
      2. Applicera Gaussisk oskärpa på AcquisitionTitle1 genom Process > Filter > Gaussian Blur. Lämna standardvärdet för Sigma som 2 och klicka på OK. En processstack? fönstret öppnas, klicka på Ja för att bearbeta alla kanaler.
      3. Subtrahera den gaussianfiltrerade AcquisitionTitle1 från originalfilen AcquisitionTitle by Process > Image Calculator: välj AcquisitionTitle som Image1, välj åtgärden Subtrahera i listrutan och välj sedan AcquisitionTitle1 som Image2. Klicka på OK. Fönstret Processstack? öppnas. Klicka på Ja för att bearbeta alla tre bilderna (kanalerna) för att få fönstret ResultsOfAcquisitionTitle.
    3. Dela kanaler genom bild > färg > delade kanaler. Varje kanalbild visas nu i ett separat fönster, automatiskt namngiven av ImageJ som C-ResultsOfAcquisitionTitle. Här motsvarar C1-ResultsOfAcquisitionTitle DAPI, C2-ResultsOfAcquisitionTitle till mCherry (intracellulär Salmonellae) och C3-ResultsOfAcquisitionTitle till GFP (cytosolic hyper-replicating Salmonellae).
    4. Bearbeta bilden C1-ResultsOfAcquisitionTitle för att mäta det område som upptas av epitelcellkärnor.
      1. Navigera till Process > Släta för att homogenisera nukleolusen som visas som hål inuti kärnområdet.
      2. Tröskel för C1-ResultsOfAcquisitionTitle-bilden för att utesluta bakgrunden med hjälp av Bild > Justera > tröskelvärde: markera Mörk bakgrund och välj Röd i listrutan. Ställ in triangelns automatiska tröskel och använd sedan det övre skjutreglaget för att ställa in det minsta tröskelvärdet när kärnorna visas röda och bakgrunden visas svart (Tröskel = 100, tillämpad i detta protokoll).
        Anmärkning: De automatiska tröskelvärden som beskrivs i stegen 4.1.4.2, 4.1.7, 4.2.3.6.1 och 4.2.4.3 föreslås som en vägledning för användaren att definiera den bäst passande tröskeln för kärnor/epitelceller respektive bakterier manuellt. Värdet för det automatiska tröskelvärdet åsidosätts i skriptet av det definierade manuella tröskelvärdet. Det definierade manuella tröskelvärdet kommer att tillämpas på hela batchanalysen.
    5. Välj demått som är intressanta genom att använda Analysera > Ange mått: Kontrollera gräns för tröskelvärde för att begränsa mätningen till tröskelvärden. Kontrollera area, motsvarande den totala ytan som upptas av tröskelpixlar (dvs. kärnor i C1-ResultsOfAcquisitionTitle, intracellulär Salmonella i C2-ResultsOfAcquisitionTitle, cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae i C3- ResultsOfAcquisitionTitle). Markera Visa etikett för att registrera förvärvstiteln och kanalen för varje bild i resultattabellen.
    6. Mät det område som upptas av kärnorna med hjälp av Analysera > mått. Mätningar registreras i resultattabellen som öppnas automatiskt.
    7. Bearbeta C2-ResultsOfAcquisitionTitle och C3-ResultsOfAcquisitionTitle för att mäta det område som upptas av övergripande intracellulär Salmonella respektive cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae. Följ steg 4.1.4-4.1.6 med några ändringar: hoppa över utjämningssteget i steg 4.1.4.1 och använd Otsu auto-tröskeln istället för triangeln i steg 4.1.4.2 som en guide för att ställa in det lägsta tröskelvärdet (övre skjutreglaget) när Salmonellae visas rött och bakgrunden visas svart (Tröskel = 200 föreslås).
    8. Spara resultattabellen med Arkiv > Spara som > Alla filer.
    9. Öppna resultattabellen i ett kalkylblad för att beräkna arealförhållanden för varje analyserad AcquisitionTitle-fil :
      1. Beräkna infektionsförhållandet: dela det område som upptas av total intracellulär Salmonellae (här röd kanal, C2-) med det område som upptas av epitelcellkärnor (här DAPI, C1-).
      2. Beräkna hyperreplikationsförhållandet: dela det område som upptas av cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae (grön kanal, C3-) med det område som upptas av total intracellulär Salmonellae (röd kanal, C2-).
  2. Encellsanalys
    1. Öppna filen Acquisition.czi i ImageJ, med namnet AcquisitionTitle i skriptet: File Menu > Open > Acquisition.czi. Ett fönster som visar bilderna på alla kanaler och alla z-plan öppnas.
    2. Dela kanalerna efter bild > färg > delade kanaler. Kanalerna visas nu i separerade fönster, automatiskt namngivna av ImageJ som C-AcquisitionTitle. Här motsvarar C1-AcquisitionTitle-fönstret epitelceller (blå), C2-AcquisitionTitle-fönstret till intracellulär Salmonellae (mCherry) och C3-AcquisitionTitle-fönstret till cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae-kanal (GFP). Varje C-AcquisitionTitle-fönster innehåller alla förvärvade z-plan.
    3. Bearbeta C1-förvärvTitel fönster, motsvarande epitelceller, för att segmentera celler.
      1. Välj den z-planbild som ska användas för cellsegmentering. Välj fönstret C1-AcquisitionTitle och använd Image > Duplicate: skriv numret på det valda z-planet (dvs. 1 för att välja z 1/8), skriv C1Zplane i rutan Titel, avmarkera Duplicate Stack och klicka sedan på OK för att bara duplicera den valda z-planebilden. Ett fönster som heter C1Zplane som visar den valda z-plansbilden öppnas.
      2. Bearbeta den erhållna C1Zplane-bilden för att förbättra bildkontrasten. Öppna process > förbättra kontrast: justera de mättade pixlarna (dvs. här används 1%) och markera Normalisera. Klicka sedan på OK för att tillämpa kontrastförbättringstekniken för att få en kontrastnormaliserad C1Zplane-bild .
      3. Bearbeta den kontrastnormaliserade C1Zplane-bilden för att segmentera epitelcellerna. Använd Process > Find Maxima för att öppna FindMaxima-menyn: Flagga först förhandsgranskningspunktsvalet för att ställa in brustolerans för att bara tillskriva en maximapunkt till varje enskild epitelcell. flagga utesluter kantmaxima. Välj utdatatyp Segmenterade partiklar och klicka på OK för att få C1ZplaneSegmented, en ny binär maskliknande bild som visar varje segmenterad partikel per maximapunkt markerad.
        Hitta Maxima ImageJ-algoritmen används för att segmentera celler. Maximapunkter (pixelintensitetstoppar) identifieras i hela bilden, vilket kan motsvara celler. En bruströskel (brustolerans) ställs in och det angränsande området runt maximapunkter analyseras för att skapa en binär maskliknande bild som definierar varje segmenterad partikel per maximapunkt, därav varje cell.
      4. Bearbeta C1ZplaneSegmented-bilden för att skapa en mask av segmenterade celler. Använd Analysera > analysera partiklar: välj alternativet Visa masker och Exkludera på kanter. Justera områdesintervallet för segmenterade partiklar som ska inkluderas i masken, motsvarande parametern Storlek , för att utesluta felaktigt segmenterade objekt som cellkluster och cellfraktioner. Om du vill poängsätta området med felaktigt segmenterade objekt använder du spårningsverktyget Trollstav i verktygsfältet: välj partikel med trollstaven och öppna sedan Analysera > mått för att mäta området för felaktiga objekt. Ställ in storleksintervallet (föreslaget intervall 250-1700 pixel2) och klicka på OK för att få den binära masken MaskofC1ZplaneSegmented .
      5. Som standard har den binära masken MaskOfC1ZplaneSegmented en inverterande LUT. Använd LUT > Invertera LUT i verktygsfältet.
      6. Bearbeta den binära masken OfC1ZplaneSegmented för att korrigera cellsegmenteringen:
        1. Tröskelkontrastnormaliserad C1Zplane-bild erhållen i steg 4.2.3.2. Använd bild > Justera > tröskelvärde: markera Mörk bakgrund. Ställ in inställningen Standard för automatisk tröskel. Välj alternativet Röd och justera det lägsta brytpunkten (övre fältet) tills cellerna ser helt röda ut och lämnar mörk bakgrund (Tröskelvärde = 8 000 tillämpas i det här protokollet). Klicka sedan på Apply för att konvertera den kontrastnormaliserade C1Zplane-bilden till en binär bild med celler i vitt och bakgrunden i svart.
        2. Korrekt cellsegmentering i binär mask med MaskOfC1ZplaneSegmented . Använd Process > Image Calculator: välj MaskOfC1ZplaneSegmented as Image1, välj åtgärden OCH i listrutan och välj sedan det tröskelbegränsade kontrastnormaliserade C1Zplane som Image2. Klicka på OK. Utdatabilden namnges automatiskt av ImageJ som resultat av mask av C1Zplane segmenterad.
      7. Processresultat av mask av C1Zplane segmenterad för att märka varje enskild segmenterad cell som en region av intresse (ROI). Använd Analysera > Analysera partiklar. Justera storlek som i steg 4.2.3.4 och välj sedan alternativet Visa ingenting. Markera Lägg till i hanteraren om du vill lägga till alla partiklar (segmenterade celler) i ROI Manager-verktyget. Markera också Exkludera på kanter. Klicka på OK. ROI Manager-menyn visar en lista över alla partiklar (segmenterade celler), definierade som ROI, unikt märkta med sina respektive y- och x-koordinater.
      8. Spara ROIs-data som ROI-cells-AcquisitionTitle.zip via ROI Manager-menyn genom att klicka på Mer > spara. ROI-cells-AcquisitionTitle.zip öppnas i steg 4.2.4.6 för encellsanalysen.
    4. Bearbeta C2-förvärvTitel fönster (här röd kanal), motsvarande intracellulär Salmonellae, för att mäta antalet infekterade celler och den intracelluolära vakuolära belastningen.
      1. Subtrahera den gröna kanalen (C3-) från den röda kanalen (C2-) för att ta bort ofokuserade pixlar i den cytosoliska hyperreplikerande Salmonellae.
        1. Använd Process > Image Calculator. Välj C2-Acquisitiontitle som Image1, välj åtgärden Subtrahera i listrutan och välj sedan C3-Acquisitiontitle som Image2. Markera Skapa nytt fönster och klicka på OK.
        2. Applicera subtraktion på hela z-stacken genom att klicka på Ja i processstacken? fönster. Utdatafönstret heter ResultsOfC2AcquisitionTitle i skriptet.
      2. Bearbeta ResultsOfC2AcquisitionTitle för att minska slumpmässigt brus.
        1. Duplicera fönstret ResultsOfC2AcquisitionTitle genom att klicka på Bildmeny > Duplicera. Markera Duplicate Stack och tryck på OK för att hämta fönstret ResultsOfC2AcquisitionTitle1 .
        2. Applicera Gaussisk oskärpa på fönstret ResultsOfC2AcquisitionTitle1 genom Process > Filter > Gaussian Blur. Lämna Sigma-värdet som 2 eller anpassa det (dvs. här användes Sigma: 4). Klicka på OK och applicera Gaussian Blur på hela z-stacken genom att klicka på Ja i fönstret Process Stack?.
        3. Subtrahera den Gaussiska filtrerade ResultsOfC2AcquisitionTitle1 till ResultsOfC2AcquisitionTitle genom att klicka på Process > Image Calculator. Välj ResultsOfC2AcquisitionTitle som Image1, välj Operation Subtrahera i listrutan och välj sedan ResultsOfC2AcquisitionTitle1 som Image2. Klicka på OK. Applicera subtraktion på hela z-stacken genom att klicka på Ja i fönstret Process Stack? för att få ett fönster som automatiskt namnges av ImageJ som resultat av resultat av C2-AcquisitionTitle.
      3. Bearbeta resultaten av resultaten av C2-förvärvTitel för att separera Salmonellae från bakgrunden. Använd bild > Justera > tröskelvärde: kontrollera Mörk bakgrund och ställ in Otsu auto-tröskel. Justera det lägsta brytpunkten (övre fältet) tills Salmonellae verkar helt röd och lämnar mörk bakgrund (Tröskel = 100 tillämpas i detta protokoll). Klicka på Apply och fönstret Konvertera till binär öppnas: kontrollera svart bakgrund och klicka sedan på OK. Hela z-stacken konverteras nu till binära bilder.
      4. Välj det mellersta Z-planet, som motsvarar det vakuolära Salmonellae-fokusplanet, i resultatet av resultat av C2-AcquisitionTitle binärt fönster från steg 4.2.4.3: Bild > staplar > Set Slice och skriv numret på det valda z-planet (t.ex. här används z: 4/8). Klicka på OK.
      5. Ställ in mätningarna som ska spelas in för varje ROI (cell). Använd Analysera > ställa in mätning: markera Area, motsvarande den totala ytan för varje ROI. Kontrollera areafraktion och gräns till tröskelvärde för att endast registrera den areafraktion som upptas av tröskelpixlar (intracellulär salmonella) för varje avkastning. Markera visningsetiketten för att märka varje enskild ROI med bildtitel, kanal, z-plan och x-y-koordinater i resultattabellen.
      6. Bearbeta det valda z-planet för intracellulär Salmonellae till skivbolag, Area och% Area ockuperat av Salmonellae för varje enskild cell (ROI): öppna ROI-cells-AcquisitionTitle.zip-filen, sparad i steg 4.2.3.8, med File > Open och klicka på Measure i ROI Manager-menyn. Utdata är en tabell som rapporterar de valda mätningarna.
      7. Spara resultattabellen med Arkiv > Spara som i resultatfönstret.
      8. Öppna resultattabellen i ett kalkylblad: etiketten Område och %Område som upptas av intracellulär Salmonellae indikeras för varje ROI, vilket motsvarar en konturerad cell som är unikt identifierad med x- och y-koordinater.
      9. Mät antalet infekterade celler som motsvarar ROI som visar en% Area > 0 upptagen av tröskelpixlar, motsvarande Salmonellae (dvs. här anses ett %Area > 0,2% identifiera infekterade celler). Beräkna sedan procentandelen infekterade celler på de totala cellerna.
      10. Mät den vakuolära belastningen av Salmonella/cell genom att beräkna medelvärdet %Yta upptagen av vakuolär Salmonellae för alla infekterade celler.
    5. Bearbeta grön kanal (C3-AcquisitionTitle) för att mäta antalet celler som visar cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae. Följ steg 4.2.4.2 till 4.2.4.9, men med vissa ändringar.
      1. Arbeta på de övre z-planen (här z: 7/8), eftersom celler som visar cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae sticker ut från monoskiktet; därför är de i fokus på ett annat plan jämfört med celler utan hyperreplikerande Salmonellae.
      2. Mät antalet celler som innehåller cytosolisk hyperreplikatorisk salmonella (grön) genom att poängsätta celler (ROI) som visar hög% Område upptaget av Salmonellae (t.ex. ett %Area > 20% anses identifiera celler som innehåller cytosolisk hyperreplikatoriserande Salmonellae). Beräkna sedan procentandelen celler som innehåller cytosolisk hyperreplikerande -Salmonellae på det totala antalet infekterade celler som poängsattes i steg 4.2.4.9.

Representative Results

Infektion av epitelceller med Salmonella-stammar
Detta protokoll utvecklades för att analysera den cellulära invasionen och den cytosoliska replikationen (figur 1A) vs vakuolär belastning (figur 1B) av Salmonella inuti epitelceller. Protokollet validerades med hjälp av följande tre salmonellastammar, S. Typhimurium SL1344 referensstam (S. Tm), S. Derby ER1175 vildtyp (S. Derby wt) och den isogena mutanten av S. Derby ER1175 utan sipA-gen (S. Derby ΔsipA). S. Derby ER1175-stammen isolerades från svin och tillhör IZSLER-övervakningssamlingen av Salmonella-isolat. Stammarna valdes ut för att representera den fenotypdiversitet som omfattas av protokollet. I synnerhet valdes dessa stammar eftersom deras beteende inuti epitelceller redan var känt för att skilja sig åt när det gäller invasion eller replikation9; Därför var de värdefulla kontroller för att testa om protokollet tillät att kvantitativt skilja skillnader i intracellulära Salmonella-fenotyper. I synnerhet S. Tm och S. Derby wt var med eftersom vi tidigare hade visat att S. Tm har högre invasion och intracellulär replikationseffektivitet än S. Derby wt9 medan S. Derby ΔsipA lades till som en hyperreplikationsförsämrad stam eftersom virulenseffektorn SipA spelar en avgörande roll i början av hyperreplikation10,11. Det har tidigare rapporterats för S. Tm att cytosolisk replikation börjar 4 timmar efter invasion, och sedan hyperreplikeras den cytosoliska populationen snabbt för att fylla epitelcellen med 8 h11,12. Konsekvent var 8 h lång infektion lämplig för att observera och kvantifiera den cytosoliska hyperreplikationsfenotypen även i S. Derby wt och S. Derby ΔsipA.

Analys av området
Områdesanalysen i steg 4.1 ger en mätning av den totala koloniseringen av epitelceller med Salmonella (infektionsförhållande), tillsammans med en mätning av hyperreplikationen (hyperreplikationsförhållandet). I arbetsflödet för områdesanalys som beskrivs i figur 2 reduceras det slumpmässiga bruset och sedan delas kanalerna upp och bearbetas oberoende av varandra. Ett tröskelvärde ställs in för varje kanal för att utesluta bakgrunden från områdesmätningen. Därefter mäts det område som upptas av tröskelpixlar för varje kanal. Resultatet av områdesanalys är en tabellrapportering, för varje förvärvsfil, förlängningen av de områden som upptas av epitelcellkärnor (blå kanal), intracellulär mCherry-uttryckande Salmonellae (röd kanal) och cytosolisk hyperreplikerande Salmonellae som uttrycker GFP (grön kanal) tillsammans med mCherry. Infektionsförhållandet beräknas genom att dividera det område som upptas av mCherry-uttryckande Salmonellae med det område som upptas av värdcellkärnor. Resultaten av de testade stammarna visade att S. Tm visar ett betydligt högre infektionsförhållande jämfört med båda S. Derbystammar, som förväntat (figur 3A). Därför visar dessa resultat effekten av områdesanalys för att upptäcka skillnader i salmonellastammarnas förmåga att kolonisera epitelceller. Salmonella-hyperreplikationsförhållandet mäts genom att dividera det område som upptas av GFP-uttryckande Salmonellae med det område som upptas av intracellulär mCherry-uttryckande Salmonellae. I enlighet med SipA:s roll vid fastställandet av hyperreplikering är ett avsevärt minskat hyperreplikationsförhållande för S. Derby ΔsipA-stam mättes jämfört med S. Derby wt, (Figur 3B). Ingen hyperreplikationsskillnad observerades mellan S. Tm och S. Derby wt. Sammantaget avslöjade områdesanalysen effektivt olika hyperreplikationsnivåer bland de analyserade stammarna.

Encellsanalys
Encellsanalysen möjliggör kvantifiering av Salmonella-invasion och vakuolär belastning kontra cytosolisk replikation inuti epitelceller med encellsupplösning. Som beskrivs i steg 4.2 bearbetades blå, röda och gröna kanaler oberoende av varandra för varje förvärvsfil (bild 4). Specifikt bearbetades den blå kanalen, som motsvarar epitelceller, i steg 4.2.3 för att erhålla cellsegmentering. Sedan lades segmenterade celler till i ROI-hanteraren (Region of Interest) för att få en lista över ROI: er, motsvarande alla segmenterade celler unikt märkta med y-x-koordinater. För att ta bort ofokuserade pixlar av GFP- som uttrycker hyperreplikerande Salmonellae, subtraherades pixlarna i den gröna kanalen från den röda kanalens. Utdatatabellen för encellsanalysrapporter, för varje ROI, området och procentandelen av ROI: s område som upptas av Salmonellae som endast uttrycker mCherry-konstitutiv reporter eller GFP-cytosolresponsiv reporter. Procentandelen av cellens yta som upptas av endast mCherry-uttryck av Salmonellae bearbetades i steg 4.2.4 för att beräkna procentandelen infekterade celler och den genomsnittliga vakuolära belastningen (figur 5A). Analys av den vakuolära belastningen visade att S. Derbystammar genererar en genomsnittlig vakuolär belastning som är betydligt lägre än S. Tm (figur 5B). Omvänt observerades endast en liten och inte signifikant minskning av andelen infekterade celler i S. Derbystammar jämfört med S. Tm (figur 5A). Procentandelen av cellens yta som upptas av GFP-uttryckande Salmonellae bearbetades i steg 4.2.5 för att erhålla hyperreplikationshastigheten. Ingen skillnad observerades mellan S. Tm och S. Derby wt, medan S. Derby ΔsipA visade en signifikant minskning av hyperreplikation, i överensstämmelse med resultatet av områdesanalysen (figur 5C) och SipA: s roll för att inducera hyperreplikation.

Figure 1
Figur 1: Salmonella cytosolisk hyperreplikation och vakuolär belastning. Representativa bilder av (A) Salmonella-hyperreplikationen och (B) den vakuolära belastningen som erhållits vid hög förstoring (40x) visas. Panel B visar de olika fokusplanen för celler som innehåller hyperreplikerande Salmonellae (z:7/8), jämfört med icke-hyperreplikerande Salmonellae (z:4/8). Vita skalstänger är 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Arbetsflöde för områdesanalysen. Arbetsflödet för områdesanalysen visas för ett representativt förvärv av INT407-celler med låg förstoring (10x) infekterade i 8 timmar med Salmonella som bär pCHAR-Duo-plasmiden (MOI 100). Först reduceras det slumpmässiga bruset, och sedan delas kanalerna upp i C1, C2 och C3 och bearbetas oberoende. Ett tröskelvärde ställs in för varje kanal för att utesluta bakgrunden från mätområdet. Därefter mäts det område som upptas av de tröskelpixlar som endast motsvarar cellkärnor i C1, alla intracellulära Salmonellae i C2 och cytosoliska Salmonellae i C3 - för varje kanal. Bilderna som analyseras här är resultaten av fyra brickor som förvärvats vid 10x förstoring smält samman genom sömnad. Vita skalstänger är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Resultat av områdesanalysen. Resultaten av områdesanalysen visas. (A) Infektionsförhållandet beräknas genom att dividera det område som upptas av mCherry-uttryckande Salmonellae (C2-kanal), som representerar alla intracellulära bakterier, med det område som upptas av värdcellskärnor (C1-kanal). (B) Hyperreplikationsförhållandet mättes genom att dividera det område som upptas av GFP-uttryckande Salmonellae (C3-kanal), som endast representerar cytosoliska hyperreplikerande bakterier, med det område som upptas av alla intracellulära mCherry-uttryckande Salmonellae. Varje punkt representerar en kopia. Analysen utfördes på tre biologiska replikat, var och en testad i tre exemplar. De svarta linjerna anger medelvärdena. Signifikansen beräknades med hjälp av ett tvåsidigt t-test och p-värden rapporteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Arbetsflöde för encellsanalysen. Arbetsflödet för encellsanalysen visas för ett representativt förvärv av hög förstoring (40x) av INT407-celler infekterade i 8 timmar med Salmonella som bär pCHAR-Duo-plasmiden (MOI 100). Först delas kanalerna upp i C1, C2 och C3 och bearbetas oberoende. Blå kanal (C1), som motsvarar epitelceller, bearbetas för att erhålla cellsegmentering, och sedan definieras varje segmenterad cell som en region av intresse (ROI) unikt märkt med y-x-koordinater. Den röda kanalen (C2) bearbetas genom att subtrahera den gröna kanalen (C3) för att avlägsna cytosolisk hyperreplikerande salmonella ur fokus, vilket gör att alla vakuolära Salmonellae endast uttrycker mCherry, och sedan reducerades slumpmässigt brus och tröskeln är inställd på att utesluta bakgrunden från mätningar. Slutligen mäts det område som upptas av vakuolära Salmonellae för varje ROI. Den gröna kanalen (C3), som motsvarar total cytosolisk GFP-uttryckande salmonella, bearbetas på liknande sätt. Bilderna som analyseras här är resultaten av 16 brickor som smälts samman genom sömnad. Vita skalstänger är 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Resultat av encellsanalysen. Resultaten av encellsanalysen visas. (A) Procentandelen infekterade celler erhålls genom att dividera antalet celler med en procentandel av ytan som upptas av endast mCherry-uttryckande Salmonellae> 0,2 med det totala antalet celler. (B) Den genomsnittliga vakuolära belastningen erhölls genom beräkning av den genomsnittliga procentuella ytan som upptas av endast mCherry som uttrycker Salmonellae i de infekterade cellerna. (C) Hyperreplikationshastigheten beräknades genom att dividera antalet celler med en procentandel av ytan som upptas av GFP-uttryckande Salmonellae≥20% med det totala antalet infekterade celler. Data från tre till fyra biologiska replikat som testats i tre exemplar rapporteras. Staplarna anger standardfelet för mätning. Signifikansen beräknades med hjälp av ett tvåsidigt t-test och p-värden rapporteras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande fil 1: Skript för områdesanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: Encellsanalysskript. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Hur Salmonella koloniserar tarmepitelceller påverkar infektionsresultatet. Vid invasion inducerar den cytosoliska hyperreplikationen inflammation i tarmen3, medan vakuolär replikation kan leda till systemisk spridning4. Salmonellastammar kan variera i sin förmåga att invadera och replikera inuti tarmepitelceller9. Faktum är att Salmonella är ett extremt varierat släkte som omfattar mer än 2 500 serovarer, som har olika förmågor att orsaka sjukdom. Dessutom är Salmonella den vanligaste rapporterade orsaken till livsmedelsburna utbrott i Europeiska unionen, vilket tyder på en stor spridning i den mänskliga befolkningen1. Därför är tillgången till tillförlitliga metoder med hög genomströmning för kvantifiering av de intracellulära fenotyperna av Salmonella av stor betydelse för att utvärdera skillnader i virulens bland ett stort antal Salmonella-stammar och i slutändan möjliggöra en korrekt och stamspecifik riskbedömning av denna patogen.

Protokollet som beskrivs här mäter salmonellas beteende inuti epitelceller på ett snabbt och automatiserat sätt. Infektionen av epitelceller utförs i 96-brunnsavbildningsmikroplattor och ett automatiserat fluorescensmikroskop används för bildförvärv, vilket gör protokollet lämpligt för applikationer med hög genomströmning. Detta protokoll utnyttjar pCHAR-Duo-plasmiden, som gör det möjligt att skilja vakuolär från cytosolisk salmonella genom det differentiella uttrycket av två fluorescerande reportrar5. De intracellulära fenotyperna av Salmonella analyseras ofta genom manuell poängsättning, ett tidskrävande förfarande som är olämpligt för analys av ett stort antal stammar och cellkulturer per stam och benäget för operatörsfel och variation mellan operatörer. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades två kompletterande och automatiserade bildanalyser, områdesanalysen och encellsanalysen. ImageJ, en fritt tillgänglig programvara, användes för att utveckla de två analyserna. För att påskynda protokollkörningen tillhandahålls ImageJ-skript för batchanalys av flera förvärvsfiler utan operatörsintervention som kompletterande filer.

Områdesanalysen utformades för att i några steg kvantifiera den totala koloniseringen av epitelceller (infektionsförhållande) och hyperreplikationsnivån (hyperreplikationsförhållandet) genom mätning av de områden som specifikt upptas av kärnorna i epitelceller och av Salmonellae som uttrycker antingen mCherry eller mCherry tillsammans med GFP. Områdesanalysen tillämpas på bilder som förvärvats vid låg förstoring, där både vakuolära och hyperreplikerande Salmonellae är i fokus i samma z-plan, och ett stort antal epitelceller visas per mikroskopiskt fält, vilket minskar storleken och antalet förvärvsfiler. Områdesanalysen möjliggör en automatiserad, snabb och beräkningslätt analys av ett stort antal prover, vilket gör den lämplig för analyser med hög genomströmning, såsom screeningexperiment.

Encellsanalysen utformades för att kvantifiera Salmonella-fenotyper inuti epitelceller med encellsupplösning, erhållen genom cellsegmentering och mätning av cellområdet och procentandelen yta som upptas av vakuolära och cytosoliska hyperreplikerande Salmonellae. Den totala koloniseringen av epitelceller som karakteriseras genom områdesanalysen är här uppdelad i tre kvantitativa parametrar, andelen infekterade celler, den genomsnittliga vakuolära belastningen och hyperreplikationshastigheten, vilket gör det möjligt att utvärdera och kvantifiera bidraget från varje fenotyp till den totala koloniseringen, vilket kompletterar resultaten av områdesanalysen. De större detaljerna som erbjuds av encellsanalysen kommer på bekostnad av långsammare bildförvärv och analys. För att uppnå encellsupplösning utförs bildförvärv vid hög förstoring. Detta innebär att flera z-plan behövs för att observera både vakuolära och cytosoliska Salmonellae i fokus och att förvärvet av ett stort antal fält per prov behövs för att poängsätta ett stort antal epitelceller, vilket förlänger förvärvstiden i jämförelse med områdesanalys. Dessutom är analysen av flera stora förvärvsfiler beräkningskrävande, vilket kräver en lämplig arbetsstation (en 6-kärnig, 32 GB RAM-arbetsstation användes). Därför kan encellsanalys användas som en fristående under begränsade genomströmningsförhållanden eller som en metod på andra nivån kopplad till områdesanalysen för att få en djupare förståelse för Salmonella-fenotyperna inuti epitelceller.

De två kompletterande analyserna validerades med hjälp av S. Tm, S. Derby wt, och S. Derby ΔsipA, vald eftersom deras beteende inuti epitelceller redan var känt för att skilja sig åt när det gäller invasion eller replikation 9,10. Resultaten av områdes- och encellsanalyserna visar att protokollet gjorde det möjligt att kvantitativt skilja skillnader i intracellulära Salmonella-fenotyper i enlighet med egenskaperna hos de testade stammarna. Dessutom visar dessa resultat att encellsanalysen möjliggör kvantifiering av bidraget från varje intracellulär fenotyp (invasion, vakuolär belastning och cytosolisk replikation) till den totala koloniseringen som poängsätts med hjälp av områdesanalysen.

Detta protokoll tillämpades här för att studera in vitro-patogenicitet hos olika salmonellastammar, men det kan ha andra tillämpningar som studier av slumpmässiga mutanter för att identifiera gener som är involverade i invasionen och / eller replikationen inuti epitelceller. Dessutom kan protokollet anpassas för att analysera salmonellas beteende i andra cellinjer än INT407-celler. Det kan också användas som utgångspunkt för att utveckla liknande metoder för att studera cell-patogeninteraktion mellan andra intracellulära mikroorganismer.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Olivia Steele-Mortimer för att ha delat pCHAR-Duo plasmid. Detta arbete finansierades av det italienska hälsoministeriet, bidrag PRC2019014 och PRC2021004.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well imaging microplate Eppendorf 30741030 Cell culture and infection
Ampicillin Sigma-Aldrich 59349 Bacteria culture
Axio observer inverted microscope ZEISS Automated fluorescence microscope
Axiocam 305 Mono ZEISS Microscope Camera
Breathable sealing membrane Sigma-Aldrich Z380059 Infection assay
Colibrì 5/7 ZEISS Led light source
Collagen I rat tail Life Technologies A1048301 Collagen coating
DAPI Invitrogen D3571 Cell staining
Fetal bovine serum Gibco 10099-141 Cell culture and infection
Gentamicin Sigma-Aldrich G12664 Infection assay
Glacial acetic acid Carlo Erba 401391 Collagen coating
HCS CellMask Blue Invitrogen H32720 Cell staining
ImageJ National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin) Image processing software
Minimum Essential Eagle's Medium Sigma-Aldrich M5650-500ML Cell culture and infection
Paraformaldehyde 4% Invitrogen FB002 Cell fixation
Potassium chloride PanReac AppliChem 131494.1211 PBS preparation
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 60220 PBS preparation
Sodium Chloride PanReac AppliChem 131659.1214 Bacteria culture and PBS preparation
Sodium phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 71640 PBS preparation
Tissue Culture Flask 25 cm2 plug seal screw cap Euroclone ET7025 Cell culture
Triton X-100 Biorad 1610407 Cell staining
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200056 Cell culture and infection
Tryptone Oxoid LP0042B Bacteria culture
Yeast extract Biolife 4122202 Bacteria culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. European Food Safety Authority & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal. 19 (12), 6971 (2021).
  2. Fattinger, S. A., Sellin, M. E., Hardt, W. D. Salmonella effector driven invasion of the gut epithelium: breaking in and setting the house on fire. Current Opinion in Microbiology. 64, 9-18 (2021).
  3. Knodler, L. A., et al. Dissemination of invasive Salmonella via bacterial-induced extrusion of mucosal epithelia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (41), 17733-17738 (2010).
  4. Fulde, M., et al. Salmonella SPI2 T3SS mediates transcytosis in polarized enterocytes in vivo. Cell Host & Microbe. , (2019).
  5. Cooper, K. G., Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. Predictable, tunable protein production in Salmonella for studying host-pathogen interactions. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 475 (2017).
  6. Klein, J. A., Grenz, J. R., Slauch, J. M., Knodler, L. A. Controlled activity of the Salmonella invasion-associated injectisome reveals its intracellular role in the cytosolic population. mBio. 8 (6), 01931 (2017).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  8. Ibarra, J. A., et al. Induction of Salmonella pathogenicity island 1 under different growth conditions can affect Salmonella-host cell interactions in vitro. Microbiology. 156 (4), 1120-1133 (2010).
  9. Tambassi, M., et al. Mutation of hilD in a Salmonella Derby lineage linked to swine adaptation and reduced risk to human health. Scientific Reports. 10 (1), 21539 (2020).
  10. Finn, C. E., Chong, A., Cooper, K. G., Starr, T., Steele-Mortimer, O. A second wave of Salmonella T3SS1 activity prolongs the lifespan of infected epithelial cells. PLoS Pathogens. 13 (4), 1006354 (2017).
  11. Knodler, L. A., Nair, V., Steele-Mortimer, O. Quantitative assessment of cytosolic Salmonella in epithelial cells. PLoS One. 9 (1), 84681 (2014).
  12. Chong, A., Starr, T., Finn, C. E., Steele-Mortimer, O. A role for the Salmonella Type III Secretion System 1 in bacterial adaptation to the cytosol of epithelial cells. Molecular Microbiology. 112 (4), 1270-1283 (2019).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 186 Salmonella intracellulära fenotyper vakuolär replikation cytosolisk hyperreplikation protokoll med hög genomströmning automatiserad bildanalys fluorescensmikroskopi ImageJ-skript
Automatiserad analys av intracellulära fenotyper av <em>salmonella</em> med ImageJ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi,… More

Berni, M., Pongolini, S., Tambassi, M. Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ. J. Vis. Exp. (186), e64263, doi:10.3791/64263 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter