Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التطبيقات التقنية لمصفوفة الأقطاب الدقيقة وتسجيلات المشبك التصحيحي على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسان كنموذج واعد في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول لقياس الانقباض والفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs.

Abstract

السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق. لذلك ، يعد استخدام نماذج تقييم سلامة القلب قبل السريرية المناسبة خطوة حاسمة أثناء تطوير الدواء. حاليا ، لا يزال تقييم سلامة القلب يعتمد بشكل كبير على الدراسات التي أجريت على الحيوانات. ومع ذلك ، تعاني النماذج الحيوانية من ضعف الخصوصية الانتقالية للبشر بسبب الاختلافات الخاصة بالأنواع ، خاصة من حيث الخصائص الكهروفسيولوجية القلبية. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير نموذج موثوق به وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية. ظهرت الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) كنموذج لا يقدر بثمن في المختبر لفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ونمذجة الأمراض. يمكن الحصول على hiPSC-CMs من الأفراد ذوي الخلفيات الوراثية المتنوعة والحالات المرضية المختلفة ، مما يجعلها بديلا مثاليا لتقييم سمية القلب الناجمة عن الأدوية بشكل فردي. لذلك ، يجب وضع منهجيات للتحقيق الشامل في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs. في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل العديد من الفحوصات الوظيفية التي يمكن تقييمها على hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم. بشكل عام ، فإن دمج hiPSC-CMs في تقييم سلامة القلب قبل السريرية لديه القدرة على إحداث ثورة في تطوير الأدوية.

Introduction

تطوير الأدوية عملية طويلة ومكلفة. أفادت دراسة للعقاقير العلاجية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) بين عامي 2009 و 2018 أن متوسط التكلفة المقدرة للبحوث والتجارب السريرية المرسملة كان 985 مليون دولار لكل منتج1. السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي السبب الرئيسي لاستنزاف المخدرات والانسحاب من السوق2. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن سمية القلب بين فئات متعددة من الأدوية العلاجية3. لذلك ، يعد تقييم سلامة القلب مكونا حاسما أثناء عملية تطوير الدواء. لا يزال النموذج الحالي لتقييم سلامة القلب يعتمد اعتمادا كبيرا على النماذج الحيوانية. ومع ذلك ، يتم التعرف بشكل متزايد على الاختلافات بين الأنواع من استخدام النماذج الحيوانية كسبب رئيسي للتنبؤات غير الدقيقة لسمية القلب الناجمة عن المخدرات في المرضى من البشر4. على سبيل المثال ، يختلف مورفولوجيا إمكانات عمل القلب اختلافا كبيرا بين البشر والفئران بسبب المساهمات من تيارات إعادة الاستقطاب المختلفة5. بالإضافة إلى ذلك ، تم توثيق الأشكال التفاضلية للميوسين القلبي والحمض النووي الريبي الدائري الذي يمكن أن يؤثر على فسيولوجيا القلب بشكل جيد بين الأنواع 6,7. لسد هذه الفجوات ، من الضروري إنشاء نموذج موثوق وفعال وقائم على الإنسان لتقييم سلامة القلب قبل السريرية.

أدى الاختراع الرائد لتكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) إلى إنشاء منصات غير مسبوقة لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض. على مدى العقد الماضي ، أصبحت طرق توليد الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-CMs) التي يسببها الإنسانراسخة 8,9. اجتذبت hiPSC-CMs اهتماما كبيرا بتطبيقاتها المحتملة في نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. على سبيل المثال ، تم استخدام hiPSC-CMs لنمذجة الأنماط الظاهرية المرضية لأمراض القلب الناجمة عن الوراثة الوراثية ، مثل متلازمة QT الطويلة 10 ، واعتلال عضلة القلب الضخامي11,12 ، واعتلال عضلة القلب الموسع13,14,15. ونتيجة لذلك، تم تحديد مسارات الإشارات الرئيسية المتورطة في التسبب في أمراض القلب، والتي يمكن أن تلقي الضوء على الاستراتيجيات العلاجية المحتملة للعلاج الفعال. علاوة على ذلك ، تم استخدام hiPSC-CMs لفحص سمية القلب الناجمة عن الأدوية المرتبطة بالعوامل المضادة للسرطان ، بما في ذلك مثبطات دوكسوروبيسين وتراستوزوماب والتيروزين كيناز16،17،18 ؛ ويجري التحقيق في استراتيجيات للتخفيف من سمية القلب الناتجة عن ذلك. وأخيرا ، فإن المعلومات الجينية المحتفظ بها في hiPSC-CMs تسمح بفحص والتنبؤ بسمية القلب الناجمة عن المخدرات على كل من المستوى الفردي والسكاني19,20. بشكل جماعي ، أثبتت hiPSC-CMs أنها أداة لا تقدر بثمن للتنبؤ بسلامة القلب الشخصية.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وضع منهجيات للتحقيق بشكل شامل وفعال في الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، والتي لها أهمية كبيرة في تطبيق hiPSC-CMs نحو نمذجة الأمراض ، وفحص سمية القلب الناجم عن الأدوية ، والطب الدقيق. هنا ، نقوم بتفصيل مجموعة من الفحوصات الوظيفية لتقييم الخصائص الوظيفية ل hiPSC-CMs ، بما في ذلك قياس الانقباض ، والإمكانات الميدانية ، وإمكانات العمل ، ومعالجة الكالسيوم (Ca2 +) (الشكل 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائل الإعلام والحلول

  1. قم بإعداد وسيط صيانة hiPSC-CM عن طريق خلط زجاجة سعة 10 مل من مكمل B27 50x و 500 مل من RPMI 1640 متوسط. تخزين الوسط في 4 درجة مئوية واستخدامه في غضون شهر. قم بموازنة درجة حرارة المتوسط إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
  2. تحضير وسط البذر hiPSC-CM عن طريق خلط 20 مل من استبدال المصل و 180 مل من وسيط صيانة hiPSC-CM (تخفيف 10٪ ، v / v). في حين يفضل إعداد وسط البذر الطازج ، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 2 أسابيع. قم بموازنة الوسط إلى RT قبل الاستخدام.
  3. قم بإعداد محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية عن طريق إذابة زجاجة واحدة (10 مل) من مصفوفة الغشاء السفلي عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها واقتباس 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي في أنابيب معقمة 1.5 مل. يخزن في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. امزج 500 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء السفلي و 100 مل من وسط DMEM / F12 البارد (تخفيف 1:200 ، v / v) لصنع محلول طلاء مصفوفة الغشاء السفلي.
  4. قم بإعداد 50 مل من محلول Tyrode الذي يحتوي على 135 mM NaCl و 5.4 mM KCl و 1 mM MgCl 2 و 1.8 mM CaCl2 و 5 mM glucose و 10 mM HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام NaOH. قم بإعداد حل Tyrode الطازج في يوم التجربة.
  5. تحضير 50 مل من محلول ماصة داخل الخلايا يحتوي على 120 mM KCl و 1 mM MgCl2 و 10 mM EGTA و 10 mM HEPES. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 باستخدام KOH. Aliquot محلول ماصة داخل الخلايا في أنابيب معقمة 5 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. في يوم التجربة ، أضف MgATP حديثا إلى المحلول لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 mM.
  6. تحضير 1 مل من محلول تحميل Fura-2 AM الذي يحتوي على 2 ميكرومتر Fura-2 AM و 0.1٪ Pluronic F-127. قم بإعداد حل تحميل جديد في يوم التجربة وحمايته من الضوء.

2. قياس حركة انكماش hiPSC-CM

  1. قم بإعداد ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية إلى كل بئر من لوحات 96 بئرا. احتضن صفائح البئر 96 في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs
    1. طلب hiPSCs من معهد ستانفورد للقلب والأوعية الدموية iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). إنشاء hiPSC-CMs وفقا للمنشورات السابقة 8,9. راقب hiPSC-CMs المستزرعة في ألواح من ستة آبار تحت المجهر عند تكبير 10x.
      ملاحظة: لا تقم بفصل الخلايا عندما لا تزال تكاثرية. خلاف ذلك ، سوف تنمو الخلايا على الآبار بعد إعادة الطلاء وتؤدي إلى نتائج غير دقيقة للفحوصات الوظيفية. عادة ، توقف hiPSC-CMs الانتشار في الأيام 18-23.
    2. تأكد من أن hiPSC-CMs تنبض بقوة ولها نقاء يزيد عن 95٪. تقييم النقاء عن طريق تلطيخ المناعة ضد التروبونين القلب T ، وهي علامة محددة من الخلايا العضلية القلبية 8,9.
    3. استنشاق وسيط الصيانة وغسل الخلايا مع 1x DPBS مرتين. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا إلى كل بئر من ألواح البئر الستة واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب مراقبة مدة الحضانة بانتظام. تأكد من عدم الإفراط في هضم الخلايا لأنها ستقلل من صلاحية الخلية.
    4. قم بسحب hiPSC-CMs بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات باستخدام ماصة سعة 5 مل لإنشاء تعليق أحادي الخلية. أضف حجما متساويا من وسيط البذر hiPSC-CMs لتحييد محلول انفصال الخلايا.
    5. أجهزة الطرد المركزي hiPSC-CMs عند 300 × g لمدة 3 دقائق في RT. شفط supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 1-2 مل من وسط البذر hiPSC-CM.
    6. حدد كثافة الخلية وقابليتها للحياة باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق. باختصار ، امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع حجم متساو من التربان الأزرق ، وانقله إلى شريحة عد الخلايا ، ثم عد باستخدام عداد الخلايا ، كما هو موضح سابقا21.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية من لوحات 96 بئرا.
    2. زرع 50000 خلية لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM ووضع لوحات 96 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
    3. استبدل وسيط البذر hiPSC-CM ب 100 ميكرولتر من وسيط صيانة hiPSC-CM بعد يوم واحد من الطلاء. تغيير وسيط صيانة hiPSC-CM كل 2 أيام حتى التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بقياس حركة انكماش hiPSC-CM بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن).
    2. قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة واضبط 37 درجة مئوية كدرجة الحرارة المفضلة. قم بتشغيل المجهر والكاميرا وإمدادات CO2 .
    3. املأ سترة الماء الخاصة بحامل اللوحة بكمية مناسبة من الماء المعقم منزوع الأيونات (الشكل 2A). ضع الصفيحة المكونة من 96 بئرا على حامل اللوحة واسمح للخلايا بالتأقلم لمدة 5 دقائق على الأقل.
    4. افتح برنامج العرض ، واضبط معدل إطارات الكاميرا على 75 إطارا في الثانية (fps) ودقة الفيديو / الصورة على 1024 × 1024 بكسل. تطبيق وظيفتي التركيز البؤري التلقائي والسطوع التلقائي. تسجيل مقاطع الفيديو والصور من hiPSC-CMs.
      ملاحظة: تجنب اهتزاز جدول المجهر أثناء التسجيل.
    5. افتح برنامج المحلل للتحليل التلقائي.

3. قياس إمكانات مجال hiPSC-CM

  1. إعداد لوحات مصفوفة الغشاء السفلي المغلفة
    1. ضع بعناية قطرة 8 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية فوق منطقة قطب التسجيل لكل بئر من ألواح مصفوفة الأقطاب الدقيقة (MEA) المكونة من 48 بئرا. انظر الشكل 3A للحصول على منطقة القطب المناسب لوضع القطرات. هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على الطبقة الأحادية hiPSC-CM مركزة على الأقطاب الكهربائية. تجنب لمس الأقطاب الكهربائية في أي ظرف من الظروف.
    2. أضف 3 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات إلى المنطقة المحيطة بالآبار (الشكل 3A) من ألواح MEA المكونة من 48 بئرا لمنع تبخر محلول الطلاء. احتضان 48 بئرا من ألواح MEA في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 45-60 دقيقة.
      ملاحظة: لا تحضن لفترة طويلة جدا لمنع مصفوفة الغشاء السفلي من التجفيف.
  2. إجراء التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة معظم وسط المصفوفة خارج الخلية من سطح البئر دون لمس الأقطاب الكهربائية باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر داخل نفس الصف أو العمود الواحد.
    2. زرع 50000 خلية لكل بئر في قطرة 8 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM فوق منطقة قطب التسجيل لكل بئر من نفس الصف أو العمود.
    3. كرر الخطوتين الأخيرتين حتى يتم طلاء جميع الآبار بالخلايا. تحقق تحت المجهر من أن جميع الآبار تحتوي على تعليق hiPSC-CM. للاطلاع على الكثافة المطلوبة، انظر الشكل 3 ب.
      ملاحظة: سيتم اختراق مرفق hiPSC-CMs إذا تم تجفيف مصفوفة الغشاء السفلي تماما ، مما يجعل مرفق الخلية دون المستوى الأمثل.
    4. احتضان ألواح MEA ذات ال 48 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 لمدة 60 دقيقة.
    5. أضف ببطء ولطف 150 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM إلى كل بئر من ألواح MEA ذات ال 48 بئرا. لإضافة وسط دون تشتيت hiPSC-CMs المزروعة مسبقا ، أمسك اللوحة بزاوية 45 درجة ، وقم بإمالة طرف الماصة على جدار كل بئر ، وحرر الوسط ببطء.
      ملاحظة: إضافة متوسطة بسرعة كبيرة أو مع ضغط عال سيؤدي إلى إزاحة الخلايا العضلية القلبية الملتصقة. تجنب الاتصال المباشر مع نظام التعليق السقوط hiPSC-CM.
    6. احتضن ألواح MEA ذات ال 48 بئرا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
    7. قم بتحديث وسط البذر hiPSC-CM مع 300 ميكرولتر من وسيط صيانة hiPSC-CM بعد 1 يوم من الطلاء. تغيير وسيط صيانة hiPSC-CM كل 2 أيام قبل التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. إجراء قياس MEA بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن). في اليوم 10 بعد الطلاء ، تحقق من كثافة الطبقة الأحادية hiPSC-CM الضرب التلقائي تحت المجهر عند تكبير 10x ، والذي يجب أن يكون كما هو موضح في الشكل 3C.
    2. ضع لوحة MEA ذات ال 48 بئرا في أداة التسجيل. تسمح الشاشة التي تعمل باللمس بمراقبة درجة الحرارة (37 درجة مئوية) وحالة CO2 (5٪).
    3. افتح برنامج المستكشف. في نافذة الإعداد التجريبية، حدد تكوين القلب في الوقت الفعلي والتسجيلات المحتملة الميدانية. تطبيق تكوينات الضرب التلقائي أو الإيقاعي.
    4. في معلمات الكشف عن الإيقاع ، اضبط عتبة الكشف على 300 ميكروفولت ، والحد الأدنى لفترة الضرب إلى 250 مللي ثانية ، والحد الأقصى لفترة الضرب إلى 5 ثوان. حدد الانحدار متعدد الحدود لحساب مدة جهد الحقل (FPD).
    5. تحقق مما إذا كانت إشارة النشاط الكهربائي الأساسية ناضجة ومستقرة.
      ملاحظة: يجب أن تعكس الأشكال الموجية الناضجة التي يسجلها كل قطب كهربائي من صفيحة MEA متعددة الآبار إمكانات مجال القلب مع خصائص يمكن التعرف عليها بسهولة تتزامن مع ارتفاع إزالة الاستقطاب القلبي ومرحلة إعادة الاستقطاب ، كما هو موضح في الشكل 3D-F.
    6. الحصول على أنشطة القلب الأساسية لمدة 1-3 دقائق. إذا كانت هناك حاجة إلى علاج بالعقاقير ، أضف مركبات إلى الآبار بعد تسجيل خط الأساس. ضع اللوحة في حاضنة لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسجيل التالي.

4. قياس إمكانات عمل hiPSC-CM

  1. قم بإعداد الأطباق المغلفة بمصفوفة الغشاء السفلي عن طريق وضع 500 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية على الجزء السفلي من الزجاج من الأطباق مقاس 35 مم (الشكل 4A). احتضن الأطباق مقاس 35 مم في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. إجراء التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية من الأطباق مقاس 35 مم. زرع 50000 خلية لكل بئر في 500 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM على الجزء السفلي الزجاجي من أطباق 35 مم.
    2. احتضن الأطباق مقاس 35 مم في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. قم بإزالة وسيط البذر hiPSC-CM وأضف 2 مل من وسيط صيانة hiPSC-CM إلى الأطباق مقاس 35 مم.
      ملاحظة: يوصى بوضع طرف غير مصفى سعة 200 ميكرولتر فوق ماصة الشفط سعة 2 مل لإزالة الوسط المستهلك لتجنب لمس الخلايا.
    3. تغيير وسيط ثقافة hiPSC-CM كل 2 أيام قبل التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بإجراء قياس محتمل للإجراء بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن). قم بإعداد محلول Tyrode الطازج كما هو موضح في الخطوة 1.4. قم بإذابة أليكوت واحد من محلول ماصة داخل الخلايا وأضف MgATP طازجا إلى تركيز نهائي قدره 3 mM.
    2. اسحب الماصات الدقيقة من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب الماصة الدقيقة.
      ملاحظة: يفضل مقاومة 2-5 MΩ من الماصات الدقيقة.
    3. استبدل وسيط الصيانة hiPSC-CM بمحلول Tyrode واسمح للخلايا بالتأقلم مع محلول Tyrode لمدة 15 دقيقة (الشكل 4C). أدخل مستشعرات درجة الحرارة في الغرفة ، وضع طبق 35 مم في الغرفة كما هو موضح في الشكل 4C ، واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية (الشكل 4D).
    4. املأ الماصات الدقيقة بمحلول داخل الخلايا وأدخلها في الحامل المتصل بمنضدة رأس مضخم التصحيح المشبك (الشكل 4E). افتح برنامج التحفيز / الاستحواذ ، وقم بتحميل بروتوكول تسجيل إمكانات الإجراء ، وحدد تكوين مشبك الجهد.
    5. أدخل الماصة الدقيقة في محلول الحمام ، وحدد hiPSC-CMs المفردة المناسبة ، واضبط وخفض موضع الماصة الدقيقة بجوار الخلية المحددة باستخدام مناور دقيق. عند إدخال طرف الماصة في محلول الحمام ، تحقق من مقاومة الماصة التي يمكن ملاحظتها على شاشة الذبذبات.
    6. ضع الماصة بالقرب من الخلية ، وستنخفض النبضات الحالية قليلا لتعكس مقاومة الختم المتزايدة. ضع شفطا لطيفا بضغط سلبي لزيادة المقاومة ، والتي ستشكل جيجاسيل. تطبيق وظيفة الختم .
    7. ضع شفطا إضافيا لكسر الغشاء للحصول على تكوين تسجيل خلية كاملة. بمجرد تمزق جزء الغشاء داخل منطقة الماصة عن طريق الشفط ، يكون المحلول الداخلي في حالة توازن مع سيتوبلازم الخلية. عند هذه النقطة، قم بالتبديل من وضع مشبك الجهد (V-المشبك) إلى وضع المشبك الحالي أو عدم وجود حقن تيار (C-Clamp) باستخدام مربع حوار مكبر الصوت. اضغط على الزر تسجيل لإنشاء ملفات تسجيل محتملة للإجراء وحفظها.
      ملاحظة: يوفر تغيير الوضع تسجيلا مستمرا لإمكانات العمل التلقائي ل hiPSC-CMs عبر أي مشغل ولا بروتوكول تسجيل تحفيزي ، والذي يمكن مراقبته عند إخراج V-mon لمضخم صوت المشبك التصحيحي.

5. قياس hiPSC-CM Ca2 + عابر

  1. ارجع إلى البروتوكول السابق لإعداد غرف خلية مخصصة لتصوير Ca 2+ 21. لإعداد غرفة الخلية المغلفة بمصفوفة الغشاء السفلي ، ضع 200 ميكرولتر من محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية في غرف الخلية. احتضان غرف الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا الرطبة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  2. إجراء التفكك الأنزيمي ل hiPSC-CMs كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. البذر hiPSC-CMs
    1. قم بإزالة محلول طلاء المصفوفة خارج الخلية من غرف الخلايا. زرع 20000 خلية لكل بئر في 200 ميكرولتر من وسط البذر hiPSC-CM.
    2. استبدل وسيط البذر hiPSC-CM ب 200 ميكرولتر من وسيط صيانة hiPSC-CM بعد 1 يوم من الطلاء. تغيير وسيط صيانة hiPSC-CM كل 2 أيام قبل التسجيل.
  4. الحصول على البيانات
    1. قم بإجراء قياس Ca2+ العابر بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء (مستحسن). قم بإعداد محلول Tyrode الطازج كما هو موضح في الخطوة 1.4. قم بإعداد حل تحميل Fura-2 AM الطازج كما هو موضح في الخطوة 1.6.
    2. استنشق وسيط الصيانة hiPSC-CM واغسله بمحلول Tyrode مرتين. ضع 100 ميكرولتر من محلول تحميل Fura-2 AM واحتضنه لمدة 10 دقائق في RT.
    3. استبدل حل تحميل Fura-2 AM بمحلول Tyrode واسمح ب 5 دقائق على الأقل لإزالة الأسترة الكاملة من Fura-2 AM.
    4. أضف قطرة من زيت الغمر على الهدف 40x لمجهر فوق فلوري مقلوب مجهز بهدف غمر الزيت 40x (0.95 NA). ضع غرفة الخلية في محول المرحلة للمجهر (الشكل 5A).
    5. قم بتثبيت أسلاك التحكم في درجة الحرارة في غرفة الحمام واضبطها على 37 درجة مئوية. قم بتركيب أقطاب تحفيز المجال الكهربائي واضبط النبضات على 0.5 هرتز لمدة 20 مللي ثانية.
    6. قم بتشغيل مصدر الضوء فائق السرعة الذي يغير الطول الموجي واضبطه على وضع التبديل السريع 340 نانومتر و 380 نانومتر وفقا لتعليمات الجهاز.
    7. قم بتطبيق وقت تعرض يبلغ 20 مللي ثانية لكل من الأطوال الموجية ووقت تسجيل يبلغ 20 ثانية في البرنامج. سجل الفيديو الذي يعكس التغييرات في الوقت الفعلي ل Ca2+ عابرة في hiPSC-CMs. تصدير البيانات إلى جدول بيانات وتحليل البيانات كما هو موضح سابقا23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس حركة الانكماش وإمكانات المجال وإمكانات العمل و Ca2+ العابر ل hiPSC-CMs. يوضح الشكل 1 مخططا تخطيطيا يتضمن الهضم الإنزيمي وبذر الخلايا والصيانة وتوصيل الفحص الوظيفي. يعد تكوين الطبقة الأحادية hiPSC-CM ضروريا لقياس حركة الانكماش (الشكل 2B). ويبين الشكل 2 جيم أثرا تمثيليا لحركة الانكماش والاسترخاء ل hiPSC-CMs. يتيح برنامج المحلل تحليل آثار حركة الانكماش والاسترخاء بطريقة آلية من خلال اكتشاف بداية الانكماش وذروة الانكماش ونهاية الانكماش وذروة الاسترخاء ونهاية الاسترخاء باستخدام الإعداد الافتراضي (الشكل 2D). تستخدم سرعات قمم الانكماش والاسترخاء لتقييم قدرات الانكماش والاسترخاء ل hiPSC-CMs. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا الحصول على مسافات تشوه الانكماش والاسترخاء.

فحص MEA هو تسجيل خارج الخلية لإمكانات العمل ، والمعروفة باسم إمكانات المجال. يتطلب القياس الناجح للإمكانات الميدانية تغطية كاملة للطبقة الأحادية hiPSC-CM على جميع الأقطاب الكهربائية داخل كل بئر من صفائح MEA (الشكل 3C). يجب أن تعكس الأشكال الموجية الناضجة التي يسجلها كل قطب كهربائي إمكانات مجال القلب مع خصائص يمكن التعرف عليها بسهولة ، كما هو موضح في الشكل 3D-F. معايير الجودة المحددة هي 1) يجب أن يظهر نشاط خط الأساس ضربا تلقائيا في غضون 20-90 نبضة في الدقيقة ، 2) يجب أن يكون معدل الضرب في حدود 6 SDs محسوبة لمعدل الضرب الأساسي على جميع الآبار ، 3) يجب أن يكون معامل التباين في فترة الضرب أقل من 5٪ ، و 4) يجب أن تكون سعة إزالة الاستقطاب أكثر من 0.3 mV ، كما نشرت سابقا22. ويبين الشكل 3E الآثار المحتملة الميدانية التمثيلية ل hiPSC-CMs. يقوم برنامج المستكشف باكتشاف وتحديد الإيقاعات و FPD تلقائيا. بعد التحليل ، يمكن الحصول على فترة الضرب ، FPD ، وسعة الارتفاع (الشكل 3F). على وجه التحديد ، يتم تحديد فترة الضرب من خلال فترة الذروة إلى الذروة المزيلة للاستقطاب ، ويتم تحديد FPD من خلال الفترة الفاصلة بين ذروة إزالة الاستقطاب إلى ذروة إعادة الاستقطاب ، ويتم قياس سعة الارتفاع من خلال المسافة بين الذروة الإيجابية لإزالة الاستقطاب إلى الذروة السلبية ، كما هو موضح في الشكل 3F.

مشبك التصحيح أحادي الخلية هو المعيار الذهبي لتقييم الخصائص الكهروفسيولوجية ل hiPSC-CMs (الشكل 4B). يمكن لتسجيلات مشبك التصحيح للخلية الكاملة في وضع التثبيت الحالي تسجيل إمكانات العمل التلقائية ل hiPSC-CMs المفردة (الشكل 4F). بعد التحليل ، يمكن الحصول على العديد من المعلمات ، بما في ذلك السعة ، والحد الأقصى للإمكانات الانبساطية (MDP) ، ومدة العمل المحتملة (APD) بنسبة 30٪ و 50٪ وإعادة الاستقطاب بنسبة 90٪ (الشكل 4G).

بالنسبة للتصوير Ca2+ ، يمكن تسجيل تغييرات كثافة التألق ل hiPSC-CMs الفردية بمرور الوقت بواسطة البرنامج. ويبين الشكل 5 باء منطقة تمثيلية ل hiPSC-CMs المحملة ب Fura-2. يسمح استخدام مصدر ضوء تبديل الطول الموجي فائق السرعة بتسجيل العابرات Ca2+ من مئات من hiPSC-CMs عبر المسح الضوئي في وضع الإطار. بعد التحليل بواسطة برنامج23 المستند إلى جدول البيانات ، يمكن الحصول على نسبة F340 / F380 بمرور الوقت لكل خلية. بعد ذلك ، يمكن رسم الآثار الخام للعابرات Ca2+ المحفزة (الشكل 5C). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الحصول على معلمات مثل السعة ، Ca 2 + الانبساطي ، و Ca2 + الاضمحلال تاو (الشكل 5D).

Figure 1
الشكل 1. مخطط تخطيطي شامل للبروتوكول. في اليوم 0 ، هضم وبذور hiPSC-CMs على ألواح 96 بئرا مغلفة بمصفوفة الأغشية السفلية / لوحات MEA 48 بئرا / أطباق / غرف خلية 35 مم. اسمح بفترة نقاهة لا تقل عن 10 أيام قبل إجراء الفحوصات الوظيفية باستخدام نظام تصوير حركة الخلية و MEA ومشبك التصحيح ونظام التصوير Ca2+ . الاختصارات: MEA = مصفوفة القطب الدقيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2. قياس حركة الانقباض. (أ) نظام التصوير الحركي الخلوي. (ب) منطقة تمثيلية للطبقة الأحادية hiPSC-CM. شريط الميزان: 20 ميكرومتر (C) آثار الانكماش والاسترخاء التمثيلية ل hiPSC-CMs. (د) رسم تخطيطي لأثر الانقباض والاسترخاء يوضح بداية الانكماش وذروة الانكماش ونهاية الانكماش وذروة الاسترخاء ونهاية الاسترخاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3. قياس الإمكانات الميدانية. (أ) أعلى المناظر (يسار) لصفيحة MEA ذات 48 بئرا ، (وسط) بئر واحد مع 16 قطبا كهربائيا ، و (يمين) المنطقة التي تحتاج قطرة مصفوفة الغشاء السفلي إلى تغطيتها. أضف ما يكفي من الماء المقطر إلى خزان المياه للتعويض عن التبخر. (ب) تعليق hiPSC-CM والكثافة المطلوبة بعد إعادة الطلاء. (ج) منطقة تمثيلية للطبقة الأحادية hiPSC-CM. (د) مخططات الشكل الموجي المستمر من 16 قطبا كهربائيا في بئر واحد من صفيحة MEA ذات ال 48 بئرا. (ه) الآثار الميدانية التمثيلية المحتملة ل hiPSC-CMs. (و) رسم تخطيطي لأثر محتمل للحقل يوضح كيفية تحليل المعلمات. اختصار: FPD = المدة المحتملة للحقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4. قياس إمكانات العمل. (أ) طلاء مصفوفة الغشاء السفلي ووضع تعليق hiPSC-CMs على أطباق 35 مم. (ب) منطقة تمثيلية ل hiPSC-CMs واحدة. شريط الميزان: إعداد نظام مشبك التصحيح 20 ميكرومتر (C-E). (و) الآثار المحتملة للإجراءات التمثيلية ل hiPSC-CMs. (ز) رسم تخطيطي لأثر محتمل للفعل يوضح كيفية تحليل المعلمات. الاختصارات: APD = مدة الإجراء المحتملة ، MDP = الحد الأقصى للإمكانات الانبساطية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5. قياس Ca2+ عابر. (أ) نظام التصوير Ca2+ . (ب) منطقة تمثيلية ل Fura-2 من hiPSC-CMs المفردة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (C) ممثل Ca2+ آثار عابرة ل hiPSC-CMs. (د) رسم تخطيطي لتتبع عابر Ca2+ يوضح كيفية تحليل المعلمات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

برزت تقنية iPSC البشرية كمنصة قوية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لقياس انقباض hiPSC-CM ، وإمكانات المجال ، وإمكانات العمل ، و Ca2 + العابر. يوفر هذا البروتوكول توصيفا شاملا لانقباض hiPSC-CM والفيزيولوجيا الكهربية. تم تطبيق هذه الفحوصات الوظيفية في منشورات متعددة من مجموعتنا 12،13،18،24،25،26،27.

من الضروري استخدام hiPSC-CMs التي هي في ظروف ضرب جيدة ، وإلا فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء في القراءات ستنخفض بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، من المستحسن ضمان النقاء العالي ل hiPSC-CMs قبل القياسات. يمكن أن يؤدي وجود الخلايا العضلية غير القلبية إلى الإضرار بشكل خاص بدقة البيانات لحركة الانكماش والقياسات المحتملة الميدانية ، وكلاهما يتطلب تشكيل طبقة أحادية hiPSC-CM. وعلاوة على ذلك، لا يزال عدم نضج ال hiPSC-CMs مصدر قلق كبير يعوق التطبيق الكامل ل hiPSC-CMs في مختلف المجالات28. من المعروف أن hiPSC-CMs غير ناضجة وظيفيا في جوانب متعددة ، بما في ذلك المورفولوجيا ، والانقباض ، والفيزيولوجيا الكهربية ، ومعالجة Ca2 + ، والتمثيل الغذائي29. لذلك ، يوصى بالاحتفاظ ب hiPSC-CMs في الثقافة على الأقل حتى اليوم 30 قبل إجراء الفحوصات الوظيفية. بدلا من ذلك ، يمكن اعتماد استراتيجيات مختلفة تم وضعها لتحسين نضج hiPSC-CMs قبل إجراء الفحوصات الوظيفية30. على سبيل المثال ، أظهرت hiPSC-CMs المستزرعة في وسائط النضج الأيضية إمكانات MDP سلبية للغاية للعمل واضمحلال أسرع بكثير للعابرات Ca2 + عند مقارنتها ب hiPSC-CMs المستزرعة في وسائط RPMI العادية31. أخيرا ، هناك اختلافات من دفعة إلى أخرى من hiPSC-CMs32. وبالتالي ، ينبغي جمع البيانات على hiPSC-CMs التي تم إنشاؤها من ثلاثة تمايزات مستقلة على الأقل لنفس خطوط iPSC.

يوفر نظام التصوير الحركي الخلوي إنتاجية عالية ومنصة فعالة لقياس حركة الانكماش والاسترخاء ل hiPSC-CMs. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي هو أنه لا يقيس قوة الانقباض المباشرة ولكن بالأحرى سرعة الانكماش والاسترخاء بدلا من ذلك. بالإضافة إلى ذلك ، تختلف السرعات عندما يكون عدد hiPSC-CMs لتشكيل طبقة أحادية مختلفا. لذلك ، من الأهمية بمكان زرع 50000 خلية على وجه التحديد في كل بئر من لوحات ال 96 بئرا.

تم استخدام FPD الذي تم قياسه بواسطة MEA كبديل لمدة QT ، وبالتالي يستخدم على نطاق واسع في تقييم إطالة QT الناجمة عن المخدرات33. على غرار مدة QT ، فإن FPD تتغلب على معدل الاعتماد. لذلك ، فإن التصحيح في معدل الضرب ضروري لتفسير بيانات FPD بدقة. في هذا البروتوكول، يوصى بإجراء قياس MEA بعد 10 أيام على الأقل من الطلاء. ومع ذلك ، في بعض الأحيان يكون من الممكن أن تكون إشارة المجال المحتملة غير مستقرة بعد 10 أيام بعد الطلاء. إذا حدث هذا ، فقم بإطالة ثقافة hiPSC-CM لمدة 2-3 أيام أخرى.

تقنية مشبك التصحيح هي أداة متعددة الاستخدامات لتقييم الفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs وفحص القنوات الأيونية. العيب الرئيسي لمشبك التصحيح التقليدي هو خاصية الإنتاجية المنخفضة ، مما يعوق تطبيقه في دراسات الإنتاجية العالية. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يتطلب منحنى تعلم طويل وممارسة واسعة النطاق قبل أن يصبح المرء من ذوي الخبرة في هذه التقنية. ومع ذلك ، لا تزال تقنية المشبك التقليدية تعتبر المعيار الذهبي لفهم الفيزيولوجيا الكهربية ل hiPSC-CMs. إذا كان من الضروري تقييم APD ل hiPSC-CMs بطريقة عالية الإنتاجية ، فمن المقترح أيضا البدء بالتصوير البصري لإمكانات عمل hiPSC-CM باستخدام المستشعر المتسارع لإمكانات العمل 2 (ASAP2)21. بعد الحصول على الأهداف الأولية ، يمكن استخدام إمكانات العمل التقليدية في مزيد من الدراسات من أجل التنميط الظاهري والتحقق من الصحة بشكل أكثر دقة. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام مشبك التصحيح الآلي بشكل متزايد في مختلف المجالات ، وخاصة اعتلال القنوات. على سبيل المثال ، تميزت تيارات القنوات الأيونية التي تحملها متغيرات متعددة من قنوات hERG وقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد بمشبك التصحيح الآلي34،35،36،37. علاوة على ذلك ، تم إنشاء استخدام مشبك التصحيح الآلي في hiPSC-CMs مؤخرا38,39. لتنفيذ مشبك التصحيح الآلي ، يمكن للقراء الرجوع إلى البروتوكولاتالمنشورة مسبقا 40. مع مزايا الإنتاجية العالية والبساطة في التعامل مع الآلات ، ليس هناك شك في أن مشابك التصحيح الآلية ستلعب أدوارا أكثر أهمية في اكتشاف الأدوية وتطوير الأدوية.

يسمح استخدام صبغة حساسة ل Ca 2+ ، Fura-2 ، بقياس Ca2+ الانبساطي ل hiPSC-CMs ليكون أقل تأثرا بعوامل التحيز التجريبية مثل وقت تحميل الصبغة ، والتوزيع غير المتكافئ للصبغة ، والتبييض الضوئي. هذا مهم لتلخيص الخلل الانبساطي لأمراض القلب معينة. القيد الرئيسي هو أنه يتطلب مصدر ضوء إثارة الأشعة فوق البنفسجية ، والذي قد يكون غير متوافق مع المجهر البؤري.

باختصار ، على الرغم من التقدم المحرز مؤخرا في تقييم سمية القلب في المرحلة قبل السريرية من تطوير الدواء ، لا تزال سمية القلب واحدة من المخاوف الرئيسية المتعلقة بالسلامة. إن الدمج المتزايد ل hiPSC-CMs في عملية تقييم السلامة القياسية قبل السريرية لديه القدرة على تحسين دقة التنبؤ بالسمية للمركبات المرشحة. بالإضافة إلى ذلك ، تتيح hiPSC-CMs الخاصة بالمريض اختيار أدوية القلب الشخصية والتنبؤ بالاستجابة الضارة للأدوية. سيساعد البروتوكول الذي يستخدم العديد من الفحوصات الوظيفية الموضحة هنا على توسيع تطبيقات hiPSC-CMs في فحص الأدوية ونمذجة الأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. هو المؤسس المشارك لشركة Greenstone Biosciences ولكن ليس لديه مصالح متنافسة ، حيث أن العمل المعروض هنا مستقل تماما. ولا يعلن المؤلفون الآخرون عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نشكر بليك وو على التدقيق اللغوي للمخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 HL113006 و R01 HL141371 و R01 HL163680 و R01 HL141851 و U01FD005978 و NASA NNX16A069A (JCW) و AHA PostPhD Fellowship 872244 (GMP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Tags

الطب، العدد 186،
التطبيقات التقنية لمصفوفة الأقطاب الدقيقة وتسجيلات المشبك التصحيحي على الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, S. R.,… More

Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter