Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tekniske anvendelser af mikroelektrodearray- og patch-klemmeoptagelser på humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er opstået som en lovende in vitro-model til lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og sygdomsmodellering. Her beskriver vi en protokol til måling af kontraktilitet og elektrofysiologi af hiPSC-CM'er.

Abstract

Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er den førende årsag til nedslidning af lægemidler og tilbagetrækning fra markedet. Derfor er brug af passende prækliniske modeller til vurdering af hjertesikkerhed et kritisk skridt under lægemiddeludvikling. I øjeblikket er hjertesikkerhedsvurdering stadig meget afhængig af dyreforsøg. Dyremodeller er imidlertid plaget af dårlig translationel specificitet for mennesker på grund af artsspecifikke forskelle, især med hensyn til hjerteelektrofysiologiske egenskaber. Der er således et presserende behov for at udvikle en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model til præklinisk hjertesikkerhedsvurdering. Humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er opstået som en uvurderlig in vitro-model til lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og sygdomsmodellering. hiPSC-CM'er kan fås fra personer med forskellig genetisk baggrund og forskellige syge tilstande, hvilket gør dem til en ideel surrogat til at vurdere lægemiddelinduceret kardiotoksicitet individuelt. Derfor er det nødvendigt at etablere metoder til omfattende undersøgelse af hiPSC-CM'ers funktionelle egenskaber. I denne protokol beskriver vi forskellige funktionelle assays, der kan vurderes på hiPSC-CM'er, herunder måling af kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og calciumhåndtering. Samlet set har inkorporeringen af hiPSC-CM'er i præklinisk hjertesikkerhedsvurdering potentialet til at revolutionere lægemiddeludviklingen.

Introduction

Lægemiddeludvikling er en lang og dyr proces. En undersøgelse af nye terapeutiske lægemidler godkendt af US Food and Drug Administration (FDA) mellem 2009 og 2018 rapporterede, at de anslåede medianomkostninger ved kapitaliseret forskning og kliniske forsøg var $ 985 millioner pr. Produkt1. Lægemiddelinduceret kardiotoksicitet er den hyppigste årsag til nedslidning af lægemidler og tilbagetrækning fra markedet2. Især rapporteres kardiotoksicitet blandt flere klasser af terapeutiske lægemidler3. Derfor er vurdering af hjertesikkerhed en afgørende komponent under lægemiddeludviklingsprocessen. Det nuværende paradigme for vurdering af hjertesikkerhed er stadig meget afhængigt af dyremodeller. Artsforskelle fra brugen af dyremodeller anerkendes imidlertid i stigende grad som en primær årsag til unøjagtige forudsigelser for lægemiddelinduceret kardiotoksicitet hos humane patienter4. For eksempel adskiller morfologien af hjertehandlingspotentiale sig væsentligt mellem mennesker og mus på grund af bidragene fra forskellige repolariserende strømme5. Derudover er differentielle isoformer af hjertemyosin og cirkulære RNA'er, der kan påvirke hjertefysiologien, veldokumenterede blandt art 6,7. For at bygge bro over disse huller er det bydende nødvendigt at etablere en pålidelig, effektiv og menneskebaseret model for præklinisk hjertesikkerhedsvurdering.

Den banebrydende opfindelse af induceret pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har genereret hidtil usete lægemiddelscreenings- og sygdomsmodelleringsplatforme. I løbet af det sidste årti er metoder til at generere menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) blevet veletablerede 8,9. hiPSC-CM'er har tiltrukket stor interesse for deres potentielle anvendelser inden for sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og præcisionsmedicin. For eksempel er hiPSC-CM'er blevet brugt til at modellere de patologiske fænotyper af hjertesygdomme forårsaget af genetisk arv, såsom langt QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilateret kardiomyopati13,14,15. Derfor er der identificeret vigtige signalveje, der er impliceret i patogenesen af hjertesygdomme, som kan kaste lys over potentielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Desuden er hiPSC-CM'er blevet brugt til at screene lægemiddelinduceret kardiotoksicitet forbundet med kræftmidler, herunder doxorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehæmmere16,17,18; Strategier til at afbøde den resulterende kardiotoksicitet er ved at blive undersøgt. Endelig giver den genetiske information, der opbevares i hiPSC-CM'er, mulighed for screening og forudsigelse af lægemiddelinduceret kardiotoksicitet på både individ- og befolkningsniveau19,20. Samlet set har hiPSC-CM'er vist sig at være et uvurderligt værktøj til personlig forudsigelse af hjertesikkerhed.

Det overordnede mål med denne protokol er at etablere metoder til omfattende og effektivt at undersøge de funktionelle egenskaber ved hiPSC-CM'er, som er af stor betydning for anvendelse af hiPSC-CM'er til sygdomsmodellering, lægemiddelinduceret kardiotoksicitetsscreening og præcisionsmedicin. Her beskriver vi en række funktionelle assays for at vurdere de funktionelle egenskaber ved hiPSC-CM'er, herunder måling af kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og calcium (Ca2+) håndtering (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af medier og løsninger

  1. Forbered hiPSC-CM vedligeholdelsesmedium ved at blande en 10 ml flaske 50x B27 supplement og 500 ml RPMI 1640 medium. Mediet opbevares ved 4 °C og bruger det inden for en måned. Ækvilibrer mediet til stuetemperatur (RT) før brug.
  2. Der fremstilles hiPSC-CM-såmedium ved at blande 20 ml serumerstatning og 180 ml hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium (10% fortynding, v/v). Mens frisklavet såmedium foretrækkes, kan det opbevares ved 4 °C i højst 2 uger. Ækvilibrer mediet til RT før brug.
  3. Forbered ekstracellulær matrixbelægningsopløsning ved at optø en flaske (10 ml) kældermembranmatrix ved 4 ° C natten over og alicitere 500 μL kældermembranmatrix i sterile 1,5 ml rør. Opbevares ved -20 °C til videre brug. Bland 500 μL kældermembranmatrix og 100 ml iskold DMEM/F12-medium (1:200 fortynding, v/v) for at fremstille opløsning af kældermembranmatrixbelægning.
  4. Der fremstilles 50 ml Tyrodes opløsning indeholdende 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glucose og 10 mM HEPES. Juster pH-værdien til 7,4 med NaOH. Forbered frisk Tyrodes opløsning på forsøgsdagen.
  5. Der fremstilles 50 ml intracellulær pipetteopløsning indeholdende 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA og 10 mM HEPES. Juster pH til 7,2 med KOH. Aliquot den intracellulære pipetteopløsning i sterile 5 ml rør og opbevares ved -20 °C. På forsøgsdagen tilsættes frisk MgATP til opløsningen for at opnå en endelig koncentration på 3 mM.
  6. Der fremstilles 1 ml Fura-2 AM-lasteopløsning indeholdende 2 μM Fura-2 AM og 0,1 % Pluronic F-127. Forbered frisk lasteopløsning på dagen for eksperimentet og beskyt den mod lyset.

2. Måling af hiPSC-CM sammentrækningsbevægelse

  1. Forbered kældermembranmatrixbelagte plader ved at tilføje 100 μL ekstracellulær matrixbelægningsopløsning til hver brønd med 96-brøndplader. Inkubere pladerne med 96 brønde i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
  2. Enzymatisk dissociation af hiPSC-CM'er
    1. Anmod om hiPSC'er fra Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generer hiPSC-CM'er i henhold til de tidligere publikationer 8,9. Overhold hiPSC-CM'erne dyrket i seks-brøndsplader under et mikroskop ved 10x forstørrelse.
      BEMÆRK: Dissocier ikke cellerne, når de stadig er proliferative. Ellers vil cellerne vokse på brøndene efter replating og føre til unøjagtige resultater af de funktionelle assays. Normalt stopper hiPSC-CM'er spredning på dag 18-23.
    2. Sørg for, at hiPSC-CM'erne slår kraftigt og har en renhed på over 95%. Vurder renheden ved immunostaining mod hjertetroponin T, en specifik markør for kardiomyocytter 8,9.
    3. Aspirer vedligeholdelsesmediet og vask cellerne med 1x DPBS to gange. Der tilsættes 1 ml celleaftagningsopløsning til hver brønd på de seks brøndplader, og der inkuberes i 10 minutter ved 37 °C.
      BEMÆRK: Inkubationsvarigheden skal overvåges regelmæssigt. Sørg for ikke at overfordøje cellerne, da det vil reducere cellens levedygtighed.
    4. Pipetter forsigtigt hiPSC-CM'er op og ned flere gange ved hjælp af en 5 ml pipette for at generere en encellet suspension. Tilsæt et lige stort volumen hiPSC-CMs såmedium for at neutralisere celleløsningen.
    5. Centrifuge hiPSC-CM'er ved 300 x g i 3 minutter ved RT. Aspirer supernatanten og suspenderer cellepelleten i 1-2 ml hiPSC-CM såmedium.
    6. Kvantificer celletætheden og levedygtigheden ved hjælp af en trypanblå udelukkelsesmetode. Bland kort 10 μL cellesuspension med et lige stort volumen trypanblåt, overfør til et celletællingsdias, og tæl derefter ved hjælp af en celletæller, som tidligere beskrevet21.
  3. Seedning hiPSC-CM'er
    1. Fjern den ekstracellulære matrixbelægningsopløsning fra 96-brøndpladerne.
    2. Frø 50.000 celler pr. brønd i 100 μL hiPSC-CM såmedium og læg de 96 brøndplader i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
    3. Udskift hiPSC-CM-såmediet med 100 μL hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium 1 dag efter plettering. Skift hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium hver 2. dag indtil optagelse.
  4. Dataindsamling
    1. Mål hiPSC-CM-sammentrækningsbevægelsen mindst 10 dage efter plettering (anbefales).
    2. Tænd for temperaturregulatoren, og indstil 37 °C som den foretrukne temperatur. Tænd for mikroskopet, kameraet og CO2 - forsyningen.
    3. Fyld vandkappen på pladeholderen med en passende mængde sterilt deioniseret vand (figur 2A). Placer pladen med 96 brønde på pladeholderen, og lad cellerne akklimatisere sig i mindst 5 minutter.
    4. Åbn visningssoftwaren, indstil kameraets billedhastighed til 75 billeder i sekundet (fps) og video-/billedopløsningen til 1024 × 1024 pixels. Anvend autofokus- og autolysstyrkefunktionerne. Optag videoer og billeder af hiPSC-CM'er.
      BEMÆRK: Undgå vibrationer i mikroskopbordet under optagelse.
    5. Åbn analysatorsoftwaren til automatisk analyse.

3. Måling af hiPSC-CM-feltpotentiale

  1. Fremstilling af kældermembranmatrixbelagte plader
    1. Anbring forsigtigt en 8 μL dråbe ekstracellulær matrixbelægningsopløsning over optageelektrodeområdet for hver brønd i 48-brønds mikroelektrode array (MEA) plader. Se figur 3A for det relevante elektrodeområde til dråbeplacering. Dette trin er afgørende for at holde hiPSC-CM-monolaget koncentreret på elektroderne. Undgå at røre elektroderne under nogen omstændigheder.
    2. Tilsæt 3 ml sterilt deioniseret vand til området omkring brøndene (figur 3A) på MEA-pladerne med 48 brønde for at forhindre fordampning af belægningsopløsningen. Inkubere 48-brønds MEA-plader i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 45-60 min.
      BEMÆRK: Inkuber ikke for længe for at forhindre kældermembranmatrixen i at tørre.
  2. Udfør enzymatisk dissociation af hiPSC-CM'er som beskrevet i trin 2.2.
  3. Seedning hiPSC-CM'er
    1. Fjern det meste af det ekstracellulære matrixmedium fra brøndoverfladen uden at røre elektroderne ved hjælp af en 200 μL pipettespids inden for samme enkeltrække eller søjle.
    2. Frø 50.000 celler pr. brønd i en 8 μL dråbe hiPSC-CM-såmedium over optageelektrodeområdet i hver brønd i samme række eller kolonne.
    3. Gentag de sidste to trin, indtil alle brønde er belagt med celler. Kontroller under mikroskopet, at alle brønde har hiPSC-CM-suspensionen. For den ønskede tæthed, se figur 3B.
      BEMÆRK: Fastgørelse af hiPSC-CM'er vil blive kompromitteret, hvis kældermembranmatrixen er helt udtørret, hvilket gør cellefastgørelse suboptimal.
    4. Inkubere MEA-pladerne med 48 brønde i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 i 60 min.
    5. Tilsæt langsomt og forsigtigt 150 μL hiPSC-CM-såmedium til hver brønd af MEA-pladerne med 48 brønde. For at tilføje medium uden at sprede tidligere såede hiPSC-CM'er skal du holde pladen i en 45 ° vinkel, læne pipettespidsen mod væggen i hver brønd og frigøre mediet langsomt.
      BEMÆRK: Tilføjelse af medium for hurtigt eller med højt tryk vil løsne de klæbede kardiomyocytter. Undgå direkte kontakt med hiPSC-CM drop suspensionen.
    6. Inkubere de 48-brønds MEA-plader i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2 natten over.
    7. Opdater hiPSC-CM-såmediet med 300 μL hiPSC-CM vedligeholdelsesmedium 1 dag efter plettering. Skift hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium hver 2. dag før optagelse.
  4. Dataindsamling
    1. Udfør MEA-måling mindst 10 dage efter plettering (anbefales). På dag 10 efter plettering kontrolleres tætheden af spontant slående hiPSC-CM-monolag under et mikroskop ved 10x forstørrelse, hvilket skal være som vist i figur 3C.
    2. Placer 48-brønds MEA-pladen i optageinstrumentet. Berøringsskærmen gør det muligt at observere temperaturen (37 °C) og CO2 (5%) status.
    3. Åbn navigatorsoftwaren. I det eksperimentelle opsætningsvindue skal du vælge Cardiac Real-time Configuration og Field Potential Recordings. Anvend spontane eller tempofyldte slagkonfigurationer.
    4. I slagdetekteringsparametre skal du indstille detektionstærskel til 300 μV, minimum slagperiode til 250 ms og maksimal slagperiode til 5 s. Vælg Polynomisk regression til beregning af feltpotentialevarighed (FPD).
    5. Kontroller, om det grundlæggende elektriske aktivitetssignal er modent og stabilt.
      BEMÆRK: De modne bølgeformer, der registreres af hver elektrode fra MEA-pladen med flere brønde, skal afspejle hjertefeltpotentialet med let identificerbare egenskaber, der falder sammen med hjertedepolariseringsspidsen og repolariseringsfasen, som vist i figur 3D-F.
    6. Anskaf de grundlæggende hjerteaktiviteter i 1-3 min. Hvis der er behov for lægemiddelbehandling, tilsættes forbindelser til brøndene efter baselineoptagelse. Placer pladen i en inkubator i mindst 30 minutter før næste optagelse.

4. Måling af hiPSC-CM-aktionspotentiale

  1. Forbered kældermembranmatrixbelagte tallerkener ved at placere 500 μL ekstracellulær matrixbelægningsopløsning på glasbunddelen af 35 mm skåle (figur 4A). Inkuber de 35 mm skåle i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
  2. Udfør enzymatisk dissociation af hiPSC-CM'er som beskrevet i trin 2.2.
  3. Seedning hiPSC-CM'er
    1. Fjern den ekstracellulære matrixbelægningsopløsning fra 35 mm skålene. Frø 50.000 celler pr. brønd i 500 μL hiPSC-CM såmedium på glasbunden del af 35 mm skåle.
    2. Inkuber de 35 mm skåle i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 natten over. Fjern hiPSC-CM-såmediet, og tilsæt 2 ml hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium til 35 mm-skålene.
      BEMÆRK: Det anbefales at lægge en 200 μL ikke-filtreret spids over 2 ml aspirationspipetten for at fjerne det brugte medium for at undgå at røre celler.
    3. Skift hiPSC-CM-kulturmediet hver 2. dag før optagelse.
  4. Dataindsamling
    1. Udfør måling af aktionspotentiale mindst 10 dage efter plettering (anbefales). Der fremstilles frisk tyrodopløsning som beskrevet i trin 1.4. Optø en alikvote af intracellulær pipetteopløsning og tilsæt MgATP frisk til en slutkoncentration på 3 mM.
    2. Træk mikropipetterne fra borosilikatglaskapillærer ved hjælp af en mikropipettettrækker.
      BEMÆRK: En modstand på 2-5 MΩ af mikropipetterne foretrækkes.
    3. Udskift hiPSC-CM-vedligeholdelsesmediet med Tyrodes opløsning, og lad cellerne akklimatisere sig til Tyrodes opløsning i 15 minutter (figur 4C). Temperatursensorerne indsættes i kammeret, 35 mm skålen anbringes i kammeret som vist i figur 4C, og temperaturen justeres til 37 °C (figur 4D).
    4. Fyld mikropipetterne med intracellulær opløsning, og sæt dem i holderen, der er tilsluttet patch-clamp-forstærkeren (figur 4E). Åbn stimulerings-/anskaffelsessoftwaren, indlæs handlingspotentialeoptagelsesprotokollen, og vælg spændingsklemmekonfigurationen.
    5. Indsæt mikropipetten i badopløsningen, vælg passende enkelte hiPSC-CM'er, og juster og sænk mikropipettens position ved siden af den valgte celle ved hjælp af en mikromanipulator. Når pipettespidsen indsættes i badopløsningen, skal du kontrollere, om der er pipettemodstand, der kan observeres på oscilloskopmonitoren.
    6. Placer pipetten tæt på cellen, og strømimpulserne vil falde lidt for at afspejle den stigende tætningsmodstand. Påfør skånsomt sug med undertryk for at øge modstanden, som vil danne en gigaseal. Anvend funktionen Forsegling .
    7. Påfør yderligere sug for at bryde membranen for at få en konfiguration af hele cellen. Når membrandelen i pipetteområdet er brudt ved sugning, er den indre opløsning i ligevægt med cellecytoplasmaet. På dette tidspunkt skal du skifte fra spændingsklemmetilstand (V-klemme) til strømklemmetilstand eller ingen strømindsprøjtning (C-klemme) ved hjælp af forstærkerdialogen. Tryk på Optage knappen for at generere og gemme handlingspotentialet optagelsesfiler.
      BEMÆRK: Tilstandsændringen giver en kontinuerlig registrering af hiPSC-CM'ers spontane handlingspotentialer via ingen trigger og ingen stimuleringsoptagelsesprotokol, som kan overvåges ved V-mon-udgangen fra patch-clamp-forstærkeren.

5. Måling af hiPSC-CM Ca2+ transient

  1. Se den tidligere protokol til forberedelse af tilpassede cellekamre til Ca 2+ billeddannelse21. Til fremstilling af kældermembranmatrixbelagt cellekammer anbringes 200 μL ekstracellulær matrixbelægningsopløsning i cellekamrene. Inkuber cellekamrene i en befugtet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5% CO2 natten over.
  2. Udfør enzymatisk dissociation af hiPSC-CM'er som beskrevet i trin 2.2.
  3. Seedning hiPSC-CM'er
    1. Fjern den ekstracellulære matrixbelægningsopløsning fra cellekamrene. Frø 20.000 celler pr. brønd i 200 μL hiPSC-CM såmedium.
    2. Udskift hiPSC-CM-såmediet med 200 μL hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium 1 dag efter plettering. Skift hiPSC-CM-vedligeholdelsesmedium hver 2. dag før optagelse.
  4. Dataindsamling
    1. Udfør Ca2+ forbigående måling mindst 10 dage efter plettering (anbefales). Der fremstilles frisk tyrodopløsning som beskrevet i trin 1.4. Forbered frisk Fura-2 AM lasteopløsning som beskrevet i trin 1.6.
    2. Aspiranter hiPSC-CM-vedligeholdelsesmediet, og vask med Tyrodes opløsning to gange. Påfør 100 μL Fura-2 AM-lasteopløsning, og inkuber i 10 minutter ved RT.
    3. Udskift Fura-2 AM-lasteløsningen med Tyrodes opløsning, og lad mindst 5 minutter være til fuldstændig de-esterificering af Fura-2 AM.
    4. Tilsæt en dråbe nedsænkningsolie på 40x målet for et omvendt epifluorescensmikroskop udstyret med et 40x olienedsænkningsmål (0,95 NA). Placer cellekammeret i mikroskopets trinadapter (figur 5A).
    5. Installer temperaturregulatorledningerne på badekammeret, og indstil det til 37 °C. Installer de elektriske feltstimuleringselektroder og indstil impulserne til 0,5 Hz med en varighed på 20 ms.
    6. Tænd for den ultrahurtige bølgelængdeomskiftende lyskilde, og indstil den til 340 nm og 380 nm hurtigskifttilstand i henhold til instrumentets instruktioner.
    7. Anvend en eksponeringstid på 20 ms for begge bølgelængder og en optagetid på 20 s i softwaren. Optag videoen, der afspejler realtidsændringer af Ca2+ forbigående i hiPSC-CM'er. Eksportér dataene til et regneark, og analysér dataene som tidligere beskrevet23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokol beskriver, hvordan man måler sammentrækningsbevægelsen, feltpotentialet, handlingspotentialet og Ca2+ forbigående hiPSC-CM'er. Et skematisk diagram, der inkluderer enzymatisk fordøjelse, cellesåning, vedligeholdelse og funktionel assayledning, er vist i figur 1. Dannelsen af hiPSC-CM-monolaget er nødvendig for sammentrækningsbevægelsesmålingen (figur 2B). Et repræsentativt spor af hiPSC-CM'ernes sammentræknings-afslapningsbevægelse er vist i figur 2C. Analysatorsoftwaren muliggør analyse af sammentræknings-afslapningsbevægelsesspor på en automatiseret måde ved at registrere sammentrækningsstart, sammentrækningstop, sammentrækningsafslutning, afslapningstop og afslapningstop ved hjælp af standardindstillingen (figur 2D). Hastighederne af sammentrækning og afslapningstoppe bruges til at vurdere sammentræknings- og afslapningskapaciteten hos hiPSC-CM'er. Derudover kan der også opnås sammentræknings- og afslapningsdeformationsafstande.

MEA-assay er den ekstracellulære registrering af handlingspotentialer, kendt som feltpotentialer. Vellykket måling af feltpotentialer kræver fuld dækning af hiPSC-CM-monolaget på alle elektroderne i hver brønd i MEA-pladerne (figur 3C). De modne bølgeformer, der registreres af hver elektrode, skal afspejle hjertefeltpotentialet med let identificerbare egenskaber, som vist i figur 3D-F. De specificerede kvalitetsstandarder er 1) baselineaktiviteten skal vise et spontant slag inden for 20-90 slag pr. min., 2) slagfrekvensen skal være inden for 6 SD'er beregnet for baseline-slagfrekvensen på alle brøndene, 3) variationskoefficienten for slagperioden skal være mindre end 5%, og 4) depolariseringsamplituden skal være over 0,3 mV, som tidligere offentliggjort22. Figur 3E viser repræsentative feltpotentielle spor af hiPSC-CM'er. Navigatorsoftwaren registrerer og identificerer automatisk beats og FPD. Efter analyse kan taktperiode, FPD og spike amplitude opnås (figur 3F). Specifikt bestemmes slagperioden af det depolariserende peak-to-peak-interval, FPD bestemmes af intervallet mellem depolariserende peak til repolarisationstop, og spike amplitude måles ved afstanden mellem den depolariserende positive top til den negative top, som vist i figur 3F.

Enkeltcelleplaster er guldstandarden til vurdering af de elektrofysiologiske egenskaber ved hiPSC-CM'er (figur 4B). Helcelle-patch-clamp-optagelser i strømspændingstilstand kan registrere de spontane handlingspotentialer for enkelte hiPSC-CM'er (figur 4F). Efter analyse kan der opnås flere parametre, herunder amplitude, maks. diastolisk potentiale (MDP) og aktionspotentialevarighed (APD) ved 30%, 50% og 90% repolarisering (figur 4G).

For Ca2+ billeddannelse kan fluorescensintensitetsændringer af individuelle hiPSC-CM'er over tid registreres af softwaren. Et repræsentativt område af Fura-2-belastede hiPSC-CM'er er vist i figur 5B. Brugen af en ultrahøjhastigheds bølgelængdeskiftende lyskilde gør det muligt at optage Ca2+ transienter fra hundredvis af hiPSC-CM'er via scanning af rammetilstand. Efter analysen af et regnearksbaseret program23 kan F340/F380-forholdet over tid for hver celle opnås. Derefter kan rå spor af stimulerede Ca2+ transienter afbildes (figur 5C). Derudover kan parametre som amplitude, diastolisk Ca 2+ og Ca2+ henfald tau opnås (figur 5D).

Figure 1
Figur 1. Samlet skematisk diagram over protokollen. På dag 0 fordøjes og frøes hiPSC-CM'er på kældermembranmatrixbelagte 96-brøndsplader / 48-brønds MEA-plader / 35 mm skåle / cellekamre. Tillad en gendannelsesperiode på mindst 10 dage, før du udfører de funktionelle assays ved hjælp af et cellebevægelsesbilleddannelsessystem, MEA, patch-klemme og Ca2+ billeddannelsessystem. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2. Måling af sammentrækningsbevægelse. (A) Cellebevægelsesbilleddannelsessystemet. (B) Et repræsentativt område af hiPSC-CM-monolaget. Skalastang: 20 μm. (C) Repræsentative sammentræknings-afslapningsspor af hiPSC-CM'er. (D) Skematisk diagram over et sammentræknings-afslapningsspor, der viser sammentrækningsstart, sammentrækningstop, sammentrækningsende, afslapningstop og afslapningsafslutning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3. Måling af feltpotentiale. (A) Øverste visning af (venstre) en 48-brønds MEA-plade, (midterste) en brønd med 16 elektroder og (højre) det område, som en kældermembranmatrixdråbe skal dække. Tilsæt tilstrækkeligt destilleret vand til vandreservoiret for at kompensere for fordampning. B) hiPSC-CM-suspension og den ønskede massefylde efter omplantning. (C) Et repræsentativt område af hiPSC-CM-monolaget. (D) Kontinuerlig bølgeform plotter fra de 16 elektroder i en brønd af 48-brønds MEA-pladen. (E) Repræsentative feltpotentielle spor af hiPSC-CM'er. (F) Skematisk diagram over et feltpotentialespor, der viser, hvordan parametrene blev analyseret. Forkortelse: FPD = feltpotentiale varighed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Måling af handlingspotentiale. (A) Kældermembranmatrixbelægning og hiPSC-CMs ophængningsplacering på 35 mm skåle. (B) En repræsentativ region af enkelte hiPSC-CM'er. Skalalinje: 20 μm. (C-E) Opsætning af patch-clamp-system. F) Repræsentative søgsmål potentielle spor af hiPSC-CM'er. (G) Skematisk diagram over et handlingspotentialespor, der viser, hvordan parametrene blev analyseret. Forkortelser: APD = handlingspotentiale varighed, MDP = maksimalt diastolisk potentiale. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5. Måling af Ca2+ forbigående. (A) Ca2+ billeddannelsessystemet. (B) Et repræsentativt område af Fura-2-belastede enkelt hiPSC-CM'er. Skalastang: 100 μm. (C) Repræsentativ Ca2+ forbigående spor af hiPSC-CM'er. (D) Skematisk diagram over en Ca2+ forbigående sporing, der viser, hvordan parametrene blev analyseret. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Human iPSC-teknologi er opstået som en stærk platform for sygdomsmodellering og lægemiddelscreening. Her beskriver vi en detaljeret protokol til måling af hiPSC-CM-kontraktilitet, feltpotentiale, handlingspotentiale og Ca2+ forbigående. Denne protokol giver en omfattende karakterisering af hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funktionelle assays er blevet anvendt i flere publikationer fra vores gruppe 12,13,18,24,25,26,27.

Det er vigtigt at bruge hiPSC-CM'erne, der er i gode slagforhold, ellers vil signal-støj-forholdet mellem aflæsningerne falde dramatisk. Derudover er det ønskeligt at sikre den høje renhed af hiPSC-CM'er før målingerne. Eksistensen af ikke-kardiomyocytter kan især kompromittere datanøjagtigheden af sammentrækningsbevægelse og feltpotentialemålinger, som begge kræver dannelse af hiPSC-CM-monolag. Desuden er hiPSC-CM'ernes umodenhed fortsat et stort problem, der hindrer den fulde anvendelse af hiPSC-CM'er på forskellige områder28. Det er kendt, at hiPSC-CM'er er funktionelt umodne i flere aspekter, herunder morfologi, kontraktilitet, elektrofysiologi, Ca 2+ håndtering og metabolisme29. Derfor anbefales det at holde hiPSC-CM'erne i kulturen mindst indtil dag 30, før der udføres funktionelle assays. Alternativt kan forskellige strategier, der er etableret for at forbedre modenheden af hiPSC-CM'er, vedtages, før de funktionelle assays30 udføres. For eksempel udviste hiPSC-CM'erne dyrket i metaboliske modningsmedier meget negative MDP af handlingspotentialer og signifikant hurtigere henfald af Ca2+ transienter sammenlignet med hiPSC-CM'er dyrket i normale RPMI-medier31. Endelig er der batch-til-batch variationer af hiPSC-CMs32. Der bør derfor indsamles data om hiPSC-CM'er, der genereres fra mindst tre uafhængige differentieringer af de samme iPSC-linjer.

Cellebevægelsesbilleddannelsessystemet giver en høj kapacitet og effektiv platform til at måle sammentrækning og afslapningsbevægelse af hiPSC-CM'er. En stor ulempe er imidlertid, at den ikke måler den direkte kontraktile kraft, men snarere sammentrækningen og afslapningshastigheden i stedet. Derudover varierer hastighederne, når antallet af hiPSC-CM'er, der danner et monolag, er anderledes. Derfor er det afgørende at så præcis 50.000 celler i hver brønd af de 96 brøndplader.

FPD målt ved MEA er blevet brugt som surrogat for QT-varighed og anvendes således i vid udstrækning til vurdering af lægemiddelinduceret QT-forlængelse33. I lighed med QT-varighed er FPD afhængig af slagfrekvens. Derfor er korrektionen i slagfrekvensen nødvendig for præcist at fortolke FPD-dataene. I denne protokol anbefales det, at MEA-måling udføres mindst 10 dage efter plettering. Nogle gange er det dog muligt, at feltpotentialesignalet stadig er ustabilt efter 10 dage efter plettering. Hvis dette sker, forlænges hiPSC-CM-kulturen i yderligere 2-3 dage.

Patch-clamp-teknikken er et alsidigt værktøj til vurdering af elektrofysiologien af hiPSC-CM'er og analyse af ionkanaler. Den største ulempe ved den konventionelle patch-clamp er dens lave gennemstrømningsegenskab, hvilket hindrer dens anvendelse i undersøgelser med høj kapacitet. Derudover kræver det en lang indlæringskurve og omfattende praksis, før man kan blive erfaren i denne teknik. Imidlertid betragtes den konventionelle patch-clamp-teknik stadig som guldstandarden for at forstå elektrofysiologien af hiPSC-CM'er. Hvis APD'en for hiPSC-CM'er skal evalueres på en høj gennemstrømningsmåde, foreslås det også at starte med optisk billeddannelse af hiPSC-CM-handlingspotentiale ved hjælp af den accelererede sensor for handlingspotentialer 2 (ASAP2)21. Efter at primære mål er opnået, kan et konventionelt handlingspotentiale bruges i yderligere undersøgelser til mere nøjagtig fænotypning og validering. Derudover er automatiseret patch clamp i stigende grad blevet anvendt på forskellige områder, især kanalopati. For eksempel er ionkanalstrømmene, der bæres af flere varianter af hERG-kanaler og spændingsstyrede natriumkanaler, blevet kendetegnet ved automatiseret patchklemme34,35,36,37. Desuden er brugen af automatiseret patch clamp i hiPSC-CM'er blevet etableret for nylig38,39. Til udførelse af automatiseret patch klemme kan læsere henvise til tidligere offentliggjorte protokoller40. Med fordelene ved at være høj kapacitet og enkelheden i maskinhåndtering er der ingen tvivl om, at automatiserede patchklemmer vil spille flere og flere vigtige roller i lægemiddelopdagelse og lægemiddeludvikling.

Brugen af et ratiometrisk Ca 2+-følsomt farvestof, Fura-2, gør det muligt at måle diastolisk Ca2+ af hiPSC-CM'er at blive meget mindre påvirket af de eksperimentelle biasfaktorer såsom farveindlæsningstid, ujævn farvefordeling og fotoblegning. Dette er vigtigt at rekapitulere den diastoliske dysfunktion af bestemte hjertesygdomme. Hovedbegrænsningen er, at den kræver en UV-excitationslyskilde, som kan være uforenelig med konfokal mikroskopi.

Sammenfattende kan det siges, at kardiotoksicitet på trods af de seneste fremskridt inden for kardiotoksicitetsvurdering i den prækliniske fase af lægemiddeludviklingen fortsat er et af de største sikkerhedsproblemer. Den voksende inkorporering af hiPSC-CM'er i den prækliniske standardsikkerhedsevalueringsproces har potentiale til at forbedre nøjagtigheden af toksicitetsforudsigelse af kandidatforbindelser. Derudover muliggør patientspecifikke hiPSC-CM'er personlig valg af hjertemedicin og forudsigelse af negativt lægemiddelrespons. Protokollen ved hjælp af forskellige funktionelle assays beskrevet her vil hjælpe med at udvide anvendelserne af hiPSC-CM'er i lægemiddelscreening og sygdomsmodellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W. er medstifter af Greenstone Biosciences, men har ingen konkurrerende interesser, da det arbejde, der præsenteres her, er helt uafhængigt. De øvrige forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Blake Wu for korrekturlæsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 og NASA NNX16A069A (JCW) og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Tags

Medicin udgave 186
Tekniske anvendelser af mikroelektrodearray- og patch-klemmeoptagelser på humaninducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, S. R.,… More

Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter