Summary
I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un promettente modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Qui, dettagliamo un protocollo per misurare la contrattilità e l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM.
Abstract
La cardiotossicità indotta da farmaci è la principale causa di logoramento e ritiro dal mercato. Pertanto, l'utilizzo di appropriati modelli di valutazione della sicurezza cardiaca preclinica è un passo fondamentale durante lo sviluppo del farmaco. Attualmente, la valutazione della sicurezza cardiaca dipende ancora fortemente dagli studi sugli animali. Tuttavia, i modelli animali sono afflitti da scarsa specificità traslazionale per gli esseri umani a causa delle differenze specie-specifiche, in particolare in termini di caratteristiche elettrofisiologiche cardiache. Pertanto, vi è l'urgente necessità di sviluppare un modello affidabile, efficiente e basato sull'uomo per la valutazione preclinica della sicurezza cardiaca. I cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CM) sono emersi come un prezioso modello in vitro per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la modellizzazione della malattia. Gli hiPSC-CM possono essere ottenuti da individui con diversi background genetici e varie condizioni patologiche, rendendoli un surrogato ideale per valutare individualmente la cardiotossicità indotta da farmaci. Pertanto, è necessario stabilire metodologie per studiare in modo completo le caratteristiche funzionali delle hiPSC-CM. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio vari saggi funzionali che possono essere valutati su hiPSC-CM, tra cui la misurazione della contrattilità, del potenziale di campo, del potenziale d'azione e della manipolazione del calcio. Nel complesso, l'incorporazione di hiPSC-CM nella valutazione preclinica della sicurezza cardiaca ha il potenziale per rivoluzionare lo sviluppo di farmaci.
Introduction
Lo sviluppo di farmaci è un processo lungo e costoso. Uno studio su nuovi farmaci terapeutici approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti tra il 2009 e il 2018 ha riportato che il costo medio stimato della ricerca capitalizzata e degli studi clinici è stato di $ 985 milioni per prodotto1. La cardiotossicità indotta da farmaci è la principale causa di logoramento e ritiro dal mercato2. In particolare, la cardiotossicità è riportata tra più classi di farmaci terapeutici3. Pertanto, la valutazione della sicurezza cardiaca è una componente cruciale durante il processo di sviluppo del farmaco. L'attuale paradigma per la valutazione della sicurezza cardiaca dipende ancora fortemente dai modelli animali. Tuttavia, le differenze di specie rispetto all'uso di modelli animali sono sempre più riconosciute come causa primaria di previsioni imprecise per la cardiotossicità indotta da farmaci nei pazienti umani4. Ad esempio, la morfologia del potenziale d'azione cardiaco differisce sostanzialmente tra esseri umani e topi a causa dei contributi di diverse correnti ripolarizzanti5. Inoltre, isoforme differenziali di miosina cardiaca e RNA circolari che possono avere un impatto sulla fisiologia cardiaca sono state ben documentate tra le specie 6,7. Per colmare queste lacune, è imperativo stabilire un modello affidabile, efficiente e basato sull'uomo per la valutazione preclinica della sicurezza cardiaca.
L'invenzione rivoluzionaria della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha generato piattaforme di screening farmacologico e di modellazione delle malattie senza precedenti. Negli ultimi dieci anni, i metodi per generare cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC-CMs) sono diventati ben consolidati 8,9. Le hiPSC-CM hanno suscitato grande interesse nelle loro potenziali applicazioni nella modellizzazione delle malattie, nello screening cardiotossicologico indotto da farmaci e nella medicina di precisione. Ad esempio, le hiPSC-CM sono state utilizzate per modellare i fenotipi patologici delle malattie cardiache causate dall'eredità genetica, come la sindrome del QT lungo10, la cardiomiopatia ipertrofica 11,12 e la cardiomiopatia dilatativa13,14,15. Di conseguenza, sono state identificate le principali vie di segnalazione implicate nella patogenesi delle malattie cardiache, che possono far luce su potenziali strategie terapeutiche per un trattamento efficace. Inoltre, le hiPSC-CM sono state utilizzate per lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci associata ad agenti antitumorali, tra cui doxorubicina, trastuzumab e inibitori della tirosin-chinasi16,17,18; Sono allo studio strategie per mitigare la cardiotossicità risultante. Infine, le informazioni genetiche conservate nelle hiPSC-CM consentono lo screening e la previsione della cardiotossicità indotta da farmaci sia a livello individuale che di popolazione19,20. Collettivamente, le hiPSC-CM hanno dimostrato di essere uno strumento inestimabile per la previsione personalizzata della sicurezza cardiaca.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire metodologie per studiare in modo completo ed efficiente le caratteristiche funzionali delle hiPSC-CM, che sono di grande importanza nell'applicazione delle hiPSC-CM verso la modellizzazione della malattia, lo screening della cardiotossicità indotta da farmaci e la medicina di precisione. Qui, descriviamo in dettaglio una serie di saggi funzionali per valutare le proprietà funzionali delle hiPSC-CM, tra cui la misurazione della contrattilità, del potenziale di campo, del potenziale d'azione e della manipolazione del calcio (Ca2+) (Figura 1).
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Protocol
1. Preparazione di supporti e soluzioni
- Preparare il mezzo di mantenimento hiPSC-CM mescolando un flacone da 10 ml di supplemento 50x B27 e 500 mL di mezzo RPMI 1640. Conservare il mezzo a 4 °C e utilizzarlo entro un mese. Equilibrare il mezzo a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso.
- Preparare il terreno di semina hiPSC-CM miscelando 20 mL di siero sostitutivo e 180 mL di terreno di mantenimento hiPSC-CM (diluizione al 10%, v/v). Mentre si preferisce il terreno di semina appena preparato, può essere conservato a 4 °C per non più di 2 settimane. Equilibrare il mezzo a RT prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare scongelando un flacone (10 ml) di matrice della membrana basale a 4 °C durante la notte e aliquotando 500 μL di matrice della membrana basale in tubi sterili da 1,5 ml. Conservare a -20 °C per un ulteriore utilizzo. Miscelare 500 μL di matrice di membrana basale e 100 ml di mezzo DMEM/F12 ghiacciato (diluizione 1:200, v/v) per ottenere una soluzione di rivestimento a matrice di membrana basale.
- Preparare 50 mL di soluzione di Tyrode contenente 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glucosio e 10 mM HEPES. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Preparare la soluzione fresca di Tyrode il giorno dell'esperimento.
- Preparare 50 mL di soluzione di pipetta intracellulare contenente 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA e 10 mM HEPES. Regolare il pH a 7,2 con KOH. Aliquotare la soluzione di pipetta intracellulare in provette sterili da 5 mL e conservarla a -20 °C. Il giorno dell'esperimento, aggiungere MgATP alla soluzione per ottenere una concentrazione finale di 3 mM.
- Preparare 1 mL di soluzione di carico Fura-2 AM contenente 2 μM di Fura-2 AM e 0,1% di Pluronici F-127. Preparare una soluzione di carico fresca il giorno dell'esperimento e proteggerla dalla luce.
2. Misurazione del movimento di contrazione hiPSC-CM
- Preparare piastre rivestite con matrice di membrana basale aggiungendo 100 μL di soluzione di rivestimento di matrice extracellulare a ciascun pozzetto di piastre da 96 pozzetti. Incubare le piastre da 96 pozzetti in un incubatore per colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% di CO2 durante la notte.
- Dissociazione enzimatica di hiPSC-CMs
- Richiedi hiPSCs allo Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generare hiPSC-CMs secondo le precedenti pubblicazioni 8,9. Osservare gli hiPSC-CM coltivati in piastre a sei pozzetti al microscopio con un ingrandimento 10x.
NOTA: Non dissociare le cellule quando sono ancora proliferative. Altrimenti, le cellule cresceranno eccessivamente sui pozzetti dopo la placcatura e porteranno a risultati imprecisi dei saggi funzionali. Di solito, gli hiPSC-CM fermano la proliferazione ai giorni 18-23. - Assicurati che gli hiPSC-CM battano forte e abbiano una purezza superiore al 95%. Valutare la purezza mediante immunocolorazione contro la troponina T cardiaca, un marker specifico dei cardiomiociti 8,9.
- Aspirare il mezzo di mantenimento e lavare le celle con 1x DPBS due volte. Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare a ciascun pozzetto delle piastre a sei pozzetti e incubare per 10 minuti a 37 °C.
NOTA: La durata dell'incubazione deve essere monitorata regolarmente. Assicurati di non digerire eccessivamente le cellule in quanto ridurrà la vitalità cellulare. - Pipettare delicatamente gli hiPSC-CM su e giù più volte utilizzando una pipetta da 5 mL per generare una sospensione a cella singola. Aggiungere un volume uguale di mezzo di semina hiPSC-CMs per neutralizzare la soluzione di distacco cellulare.
- Centrifugare hiPSC-CMs a 300 x g per 3 minuti a RT. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1-2 mL di terreno di semina hiPSC-CM.
- Quantificare la densità e la vitalità delle cellule utilizzando un metodo di esclusione del blu tripano. In breve, mescolare 10 μL di sospensione cellulare con un volume uguale di blu tripano, trasferire in un vetrino di conteggio delle cellule e quindi contare utilizzando un contatore di cellule, come descritto in precedenza21.
- Richiedi hiPSCs allo Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generare hiPSC-CMs secondo le precedenti pubblicazioni 8,9. Osservare gli hiPSC-CM coltivati in piastre a sei pozzetti al microscopio con un ingrandimento 10x.
- Semina hiPSC-CM
- Rimuovere la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare dalle piastre a 96 pozzetti.
- Seminare 50.000 cellule per pozzetto in 100 μL di terreno di semina hiPSC-CM e posizionare le piastre da 96 pozzetti in un incubatore per colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% CO2 durante la notte.
- Sostituire il mezzo di semina hiPSC-CM con 100 μL di terreno di mantenimento hiPSC-CM 1 giorno dopo la placcatura. Cambiare il supporto di manutenzione hiPSC-CM ogni 2 giorni fino alla registrazione.
- Acquisizione dati
- Misurare il movimento di contrazione hiPSC-CM almeno 10 giorni dopo la placcatura (consigliato).
- Accendere il regolatore di temperatura e impostare 37 °C come temperatura preferita. Accendere il microscopio, la fotocamera e l'alimentazione di CO2 .
- Riempire la camicia d'acqua del portapiastre con una quantità appropriata di acqua deionizzata sterile (Figura 2A). Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra e lasciare che le celle si acclimatino per almeno 5 minuti.
- Aprire il software di visualizzazione, impostare la frequenza fotogrammi della fotocamera su 75 fotogrammi al secondo (fps) e la risoluzione video/immagine su 1024 × 1024 pixel. Applicare le funzioni di messa a fuoco automatica e luminosità automatica. Registra video e immagini di hiPSC-CM.
NOTA: Evitare le vibrazioni del tavolo del microscopio durante la registrazione. - Aprire il software dell'analizzatore per l'analisi automatica.
3. Misurazione del potenziale di campo hiPSC-CM
- Preparazione di piastre rivestite con matrice di membrana basale
- Posizionare con cautela una goccia da 8 μL di soluzione di rivestimento a matrice extracellulare sull'area dell'elettrodo di registrazione di ciascun pozzetto delle piastre MEA (Microelectrode Array) a 48 pozzetti. Vedere la Figura 3A per l'area appropriata dell'elettrodo per il posizionamento delle gocce. Questo passaggio è fondamentale per mantenere il monostrato hiPSC-CM concentrato sugli elettrodi. Evitare di toccare gli elettrodi in qualsiasi circostanza.
- Aggiungere 3 ml di acqua deionizzata sterile all'area circostante i pozzetti (Figura 3A) delle piastre MEA a 48 pozzetti per evitare l'evaporazione della soluzione di rivestimento. Incubare piastre MEA a 48 pozzetti in un incubatore per colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% CO2 per 45-60 min.
NOTA: Non incubare troppo a lungo per evitare che la matrice della membrana basale si asciughi.
- Eseguire la dissociazione enzimatica delle hiPSC-CM come descritto al punto 2.2.
- Semina hiPSC-CM
- Rimuovere la maggior parte del mezzo della matrice extracellulare dalla superficie del pozzo senza toccare gli elettrodi utilizzando una punta di pipetta da 200 μL all'interno della stessa singola riga o colonna.
- Seminare 50.000 cellule per pozzetto in una goccia da 8 μL di mezzo di semina hiPSC-CM sull'area dell'elettrodo di registrazione di ciascun pozzetto della stessa riga o colonna.
- Ripetere gli ultimi due passaggi fino a quando tutti i pozzetti sono stati placcati con le cellule. Controllare al microscopio che tutti i pozzetti abbiano la sospensione hiPSC-CM. Per la densità desiderata, vedere la Figura 3B.
NOTA: L'attaccamento di hiPSC-CMs sarà compromesso se la matrice della membrana basale è completamente secca, rendendo l'attacco cellulare non ottimale. - Incubare le piastre MEA a 48 pozzetti in un incubatore per colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% CO2 per 60 min.
- Aggiungere lentamente e delicatamente 150 μL di mezzo di semina hiPSC-CM a ciascun pozzetto delle piastre MEA a 48 pozzetti. Per aggiungere il mezzo senza disperdere gli hiPSC-CM precedentemente seminati, tenere la piastra con un angolo di 45°, appoggiare la punta della pipetta contro la parete di ciascun pozzetto e rilasciare lentamente il mezzo.
NOTA: L'aggiunta di terreno troppo rapidamente o con alta pressione rimuoverà i cardiomiociti aderiti. Evitare il contatto diretto con la sospensione hiPSC-CM. - Incubare le piastre MEA a 48 pozzetti in un incubatore per colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% di CO2 durante la notte.
- Rinfrescare il terreno di semina hiPSC-CM con 300 μL di terreno di mantenimento hiPSC-CM 1 giorno dopo la placcatura. Cambiare il supporto di manutenzione hiPSC-CM ogni 2 giorni prima della registrazione.
- Acquisizione dati
- Eseguire la misurazione MEA almeno 10 giorni dopo la placcatura (consigliato). Il giorno 10 dopo la placcatura, controllare la densità del monostrato hiPSC-CM a battito spontaneo al microscopio con un ingrandimento 10x, che dovrebbe essere come mostrato in Figura 3C.
- Posizionare la piastra MEA a 48 pozzetti nello strumento di registrazione. Il touch screen permette di osservare lo stato di temperatura (37 °C) e CO2 (5%).
- Aprire il software del navigatore. Nella finestra di configurazione sperimentale, selezionare Configurazione cardiaca in tempo reale e Registrazioni del potenziale sul campo. Applicare configurazioni di battitura spontanee o ritmate.
- Nei parametri di rilevamento delle battute, impostare la soglia di rilevamento su 300 μV, il periodo minimo di battimento su 250 ms e il periodo massimo di battimento su 5 s. Selezionare Regressione polinomiale per il calcolo della durata potenziale di campo (FPD).
- Controllare se il segnale di attività elettrica di base è maturo e stabile.
NOTA: Le forme d'onda mature registrate da ciascun elettrodo dalla piastra MEA multi-pozzetto devono riflettere il potenziale del campo cardiaco con caratteristiche facilmente identificabili che coincidono con il picco di depolarizzazione cardiaca e la fase di ripolarizzazione, come mostrato in Figura 3D-F. - Acquisire le attività cardiache basali per 1-3 minuti. Se è necessario un trattamento farmacologico, aggiungere composti ai pozzetti dopo la registrazione di base. Posizionare la piastra in un'incubatrice per almeno 30 minuti prima della registrazione successiva.
4. Misurazione del potenziale d'azione hiPSC-CM
- Preparare piatti rivestiti con matrice di membrana basale posizionando 500 μL di soluzione di rivestimento a matrice extracellulare sulla parte inferiore di vetro di piatti da 35 mm (Figura 4A). Incubare le stoviglie da 35 mm in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 °C, 5% di CO2 durante la notte.
- Eseguire la dissociazione enzimatica delle hiPSC-CM come descritto al punto 2.2.
- Semina hiPSC-CM
- Rimuovere la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare dai piatti da 35 mm. Seminare 50.000 cellule per pozzetto in 500 μL di terreno di semina hiPSC-CM sulla parte inferiore di vetro di piatti da 35 mm.
- Incubare le stoviglie da 35 mm in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 °C, 5% di CO2 durante la notte. Rimuovere il mezzo di semina hiPSC-CM e aggiungere 2 ml di terreno di mantenimento hiPSC-CM alle stoviglie da 35 mm.
NOTA: Si consiglia di posizionare una punta non filtrata da 200 μL sulla pipetta di aspirazione da 2 ml per rimuovere il mezzo esaurito per evitare di toccare le cellule. - Cambiare il terreno di coltura hiPSC-CM ogni 2 giorni prima della registrazione.
- Acquisizione dati
- Eseguire la misurazione del potenziale d'azione almeno 10 giorni dopo la placcatura (consigliato). Preparare la soluzione fresca di Tyrode come descritto al punto 1.4. Scongelare un'aliquota di soluzione di pipetta intracellulare e aggiungere MgATP a una concentrazione finale di 3 mM.
- Estrarre le micropipette dai capillari di vetro borosilicato utilizzando un estrattore di micropipette.
NOTA: è preferibile una resistenza di 2-5 MΩ delle micropipette. - Sostituire il mezzo di mantenimento hiPSC-CM con la soluzione di Tyrode e lasciare che le cellule si acclimatino alla soluzione di Tyrode per 15 minuti (Figura 4C). Inserire i sensori di temperatura nella camera, inserire il piatto da 35 mm nella camera come mostrato nella figura 4C e regolare la temperatura a 37 °C (figura 4D).
- Riempire le micropipette con soluzione intracellulare e inserirle nel supporto collegato all'headstage dell'amplificatore patch-clamp (Figura 4E). Aprire il software di stimolazione/acquisizione, caricare il protocollo di registrazione del potenziale d'azione e selezionare la configurazione del morsetto di tensione.
- Inserire la micropipetta nella soluzione del bagno, selezionare i singoli hiPSC-CM appropriati e regolare e abbassare la posizione della micropipetta accanto alla cella selezionata utilizzando un micromanipolatore. Quando la punta della pipetta viene inserita nella soluzione del bagno, verificare la resistenza della pipetta che può essere osservata sul monitor dell'oscilloscopio.
- Posizionare la pipetta vicino alla cella e gli impulsi di corrente diminuiranno leggermente per riflettere la crescente resistenza della tenuta. Applicare un'aspirazione delicata con pressione negativa per aumentare la resistenza, che formerà un gigaseal. Applicare la funzione Sigilla .
- Applicare un'aspirazione aggiuntiva per rompere la membrana e ottenere una configurazione di registrazione dell'intera cella. Una volta che la porzione di membrana all'interno dell'area della pipetta viene rotta mediante aspirazione, la soluzione interna è in equilibrio con il citoplasma cellulare. A questo punto, passare dalla modalità tension-clamp (V-clamp) alla modalità current-clamp o nessuna iniezione di corrente (C-Clamp) utilizzando la finestra di dialogo dell'amplificatore. Premere il pulsante Registra per generare e salvare i file di registrazione del potenziale di azione.
NOTA: Il cambio di modalità fornisce una registrazione continua dei potenziali d'azione spontanei degli hiPSC-CM tramite nessun trigger e nessun protocollo di registrazione della stimolazione, che può essere monitorato all'uscita V-mon dell'amplificatore patch-mors.
5. Misurazione del transitorio hiPSC-CM Ca2+
- Fare riferimento al protocollo precedente per la preparazione di camere cellulari personalizzate per l'imaging Ca 2+ 21. Per la preparazione della camera cellulare rivestita con matrice di membrana basale, posizionare 200 μL di soluzione di rivestimento di matrice extracellulare nelle camere cellulari. Incubare le camere cellulari in un incubatore di colture cellulari umidificate a 37 °C, 5% CO2 durante la notte.
- Eseguire la dissociazione enzimatica delle hiPSC-CM come descritto al punto 2.2.
- Semina hiPSC-CM
- Rimuovere la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare dalle camere cellulari. Seminare 20.000 cellule per pozzetto in 200 μL di terreno di semina hiPSC-CM.
- Sostituire il mezzo di semina hiPSC-CM con 200 μL di terreno di mantenimento hiPSC-CM 1 giorno dopo la placcatura. Cambiare il supporto di manutenzione hiPSC-CM ogni 2 giorni prima della registrazione.
- Acquisizione dati
- Eseguire la misurazione transitoria di Ca2+ almeno 10 giorni dopo la placcatura (consigliata). Preparare la soluzione fresca di Tyrode come descritto al punto 1.4. Preparare la nuova soluzione di carico Fura-2 AM come descritto al punto 1.6.
- Aspirare il mezzo di manutenzione hiPSC-CM e lavare due volte con la soluzione di Tyrode. Applicare 100 μL di soluzione di carico Fura-2 AM e incubare per 10 minuti a RT.
- Sostituire la soluzione di carico Fura-2 AM con la soluzione di Tyrode e attendere almeno 5 minuti per la completa disesterificazione di Fura-2 AM.
- Aggiungere una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo 40x di un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di un obiettivo ad immersione in olio 40x (0,95 NA). Posizionare la camera cellulare nell'adattatore da palcoscenico del microscopio (Figura 5A).
- Installare i fili del regolatore di temperatura nella camera da bagno e impostarlo a 37 °C. Installare gli elettrodi di stimolazione del campo elettrico e impostare gli impulsi a 0,5 Hz con una durata di 20 ms.
- Accendere la sorgente luminosa ad alta velocità di commutazione della lunghezza d'onda e impostarla sulla modalità di commutazione rapida a 340 nm e 380 nm secondo le istruzioni dello strumento.
- Applicare un tempo di esposizione di 20 ms per entrambe le lunghezze d'onda e un tempo di registrazione di 20 s nel software. Registra il video che riflette le variazioni in tempo reale dei transitori Ca2+ nelle CM hiPSC. Esportare i dati in un foglio di calcolo e analizzare i dati come descritto in precedenza23.
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Representative Results
Questo protocollo descrive come misurare il movimento di contrazione, il potenziale di campo, il potenziale d'azione e il transitorio Ca2+ delle hiPSC-CM. Un diagramma schematico che include la digestione enzimatica, la semina cellulare, il mantenimento e la conduzione del saggio funzionale è mostrato nella Figura 1. La formazione del monostrato hiPSC-CM è necessaria per la misurazione del movimento di contrazione (Figura 2B). Una traccia rappresentativa del movimento di contrazione-rilassamento delle hiPSC-CM è mostrata nella Figura 2C. Il software dell'analizzatore consente l'analisi delle tracce di movimento di contrazione-rilassamento in modo automatizzato rilevando l'inizio della contrazione, il picco di contrazione, la fine della contrazione, il picco di rilassamento e la fine del rilassamento utilizzando l'impostazione predefinita (Figura 2D). Le velocità dei picchi di contrazione e rilassamento sono utilizzate per valutare le capacità di contrazione e rilassamento delle hiPSC-CM. Inoltre, è possibile ottenere anche distanze di deformazione della contrazione e del rilassamento.
Il test MEA è la registrazione extracellulare dei potenziali d'azione, noti come potenziali di campo. La corretta misurazione dei potenziali di campo richiede una copertura completa del monostrato hiPSC-CM su tutti gli elettrodi all'interno di ciascun pozzetto delle piastre MEA (Figura 3C). Le forme d'onda mature registrate da ciascun elettrodo devono riflettere il potenziale del campo cardiaco con caratteristiche facilmente identificabili, come mostrato nella Figura 3D-F. Gli standard di qualità specificati sono 1) l'attività basale dovrebbe mostrare un battito spontaneo entro 20-90 battiti al minuto, 2) la velocità di battitura dovrebbe essere compresa tra 6 SD calcolati per la velocità di battitura basale su tutti i pozzi, 3) il coefficiente di variazione del periodo di battimento dovrebbe essere inferiore al 5% e 4) l'ampiezza di depolarizzazione dovrebbe essere superiore a 0,3 mV, come precedentemente pubblicato22. La Figura 3E mostra le potenziali tracce rappresentative di campo di hiPSC-CM. Il software del navigatore rileva e identifica automaticamente battiti e FPD. Dopo l'analisi, è possibile ottenere il periodo di battuta, l'FPD e l'ampiezza del picco (Figura 3F). In particolare, il periodo di battimento è determinato dall'intervallo depolarizzante picco-picco, FPD è determinato dall'intervallo tra picco di depolarizzazione e picco di ripolarizzazione e l'ampiezza del picco è misurata dalla distanza tra il picco positivo depolarizzante e il picco negativo, come mostrato in Figura 3F.
Il patch clamp a singola cellula è il gold standard per valutare le proprietà elettrofisiologiche delle CM hiPSC (Figura 4B). Le registrazioni patch-clamp a celle intere in modalità current-clamping possono registrare i potenziali d'azione spontanei di singoli hiPSC-CM (Figura 4F). Dopo l'analisi, è possibile ottenere diversi parametri, tra cui l'ampiezza, il potenziale diastolico massimo (MDP) e la durata del potenziale d'azione (APD) al 30%, 50% e 90% di ripolarizzazione (Figura 4G).
Per l'imaging Ca2+ , le variazioni di intensità di fluorescenza dei singoli hiPSC-CM nel tempo possono essere registrate dal software. Un'area rappresentativa degli hiPSC-CM caricati con Fura-2 è mostrata nella Figura 5B. L'utilizzo di una sorgente luminosa a commutazione di lunghezza d'onda ad altissima velocità consente la registrazione di transitori Ca2+ da centinaia di hiPSC-CM tramite scansione in modalità frame. Dopo l'analisi da parte di un programma basato su foglio di calcolo23, è possibile ottenere il rapporto F340/F380 nel tempo per ogni cella. Quindi, è possibile tracciare tracce grezze di transitori Ca2+ stimolati (Figura 5C). Inoltre, è possibile ottenere parametri come l'ampiezza, la tau di decadimento diastolica Ca2+ e Ca2+ (Figura 5D).
Figura 1. Schema generale del protocollo. Il giorno 0, digerire e seminare hiPSC-CM su piastre a 96 pozzetti rivestite con matrice basale / piastre MEA a 48 pozzetti / piatti da 35 mm / camere cellulari. Consentire un periodo di recupero di almeno 10 giorni prima di eseguire i test funzionali utilizzando un sistema di imaging del movimento cellulare, MEA, patch-clamp e sistema di imaging Ca2+ . Abbreviazioni: MEA = array di microelettrodi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Misurazione del movimento di contrazione. (A) Il sistema di imaging del movimento cellulare. (B) Una regione rappresentativa del monostrato hiPSC-CM. Barra scala: 20 μm. (C) Tracce rappresentative di contrazione-rilassamento di hiPSC-CMs. (D) Diagramma schematico di una traccia di contrazione-rilassamento che mostra l'inizio della contrazione, il picco di contrazione, la fine della contrazione, il picco di rilassamento e la fine del rilassamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. Misurazione del potenziale di campo. (A) Vista dall'alto di (a sinistra) una piastra MEA a 48 pozzetti, (al centro) un pozzetto con 16 elettrodi e (a destra) l'area che una goccia di matrice di membrana basale deve coprire. Aggiungere acqua distillata sufficiente al serbatoio dell'acqua per compensare l'evaporazione. B) sospensione hiPSC-CM e densità desiderata dopo il riplaccaggio. (C) Una regione rappresentativa del monostrato hiPSC-CM. (D) Grafici di forme d'onda continue dai 16 elettrodi in un pozzetto della piastra MEA a 48 pozzetti. (E) Tracce potenziali rappresentative di hiPSC-CM. (F) Diagramma schematico di una traccia di potenziale di campo che mostra come sono stati analizzati i parametri. Abbreviazione: FPD = durata potenziale del campo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Misurazione del potenziale d'azione. (A) Rivestimento della matrice della membrana basale e posizionamento delle sospensioni hiPSC-CMs su piatti da 35 mm. (B) Una regione rappresentativa di singoli hiPSC-CM. Barra scala: 20 μm. (C-E) Configurazione del sistema patch-clamp . (F) Tracce potenziali di azioni rappresentative di hiPSC-CMs. (G) Diagramma schematico di una traccia del potenziale d'azione che mostra come sono stati analizzati i parametri. Abbreviazioni: APD = durata del potenziale d'azione, MDP = potenziale diastolico massimo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5. Misura di Ca2+ transitorio. (A) Il sistema di imaging Ca2+ . (B) Una regione rappresentativa di singoli hiPSC-CM caricati con Fura-2. Barra scala: 100 μm. (C) Tracce transitorie rappresentative di Ca2+ di hiPSC-CMs. (D) Diagramma schematico di una traccia transitoria Ca2+ che mostra come sono stati analizzati i parametri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La tecnologia iPSC umana è emersa come una potente piattaforma per la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per misurare la contrattilità hiPSC-CM, il potenziale di campo, il potenziale d'azione e il transitorio Ca2+. Questo protocollo fornisce una caratterizzazione completa della contrattilità e dell'elettrofisiologia hiPSC-CM. Questi saggi funzionali sono stati applicati in più pubblicazioni del nostro gruppo 12,13,18,24,25,26,27.
È essenziale utilizzare gli hiPSC-CM che sono in buone condizioni di battimento, altrimenti il rapporto segnale-rumore delle letture diminuirà drasticamente. Inoltre, è auspicabile garantire l'elevata purezza degli hiPSC-CM prima delle misurazioni. L'esistenza di non-cardiomiociti potrebbe compromettere in particolare l'accuratezza dei dati del movimento di contrazione e le misurazioni del potenziale di campo, entrambi i quali richiedono la formazione di un monostrato hiPSC-CM. Inoltre, l'immaturità delle hiPSC-CM rimane una delle principali preoccupazioni che ostacola la piena applicazione delle hiPSC-CM in vari settori28. È noto che le hiPSC-CM sono funzionalmente immature in molteplici aspetti, tra cui morfologia, contrattilità, elettrofisiologia, manipolazione di Ca 2+ e metabolismo29. Pertanto, si raccomanda di mantenere le hiPSC-CM nella coltura almeno fino al giorno 30 prima di eseguire saggi funzionali. In alternativa, varie strategie che sono state stabilite per migliorare la maturità delle hiPSC-CM possono essere adottate prima di condurre i saggi funzionali30. Ad esempio, gli hiPSC-CM coltivati in terreni di maturazione metabolica hanno mostrato MDP altamente negativi dei potenziali d'azione e un decadimento significativamente più rapido dei transitori di Ca2+ rispetto agli hiPSC-CM coltivati in normali terreni RPMI31. Infine, ci sono variazioni batch-to-batch di hiPSC-CMs32. Pertanto, i dati dovrebbero essere raccolti su hiPSC-CM generati da almeno tre differenziazioni indipendenti delle stesse linee iPSC.
Il sistema di imaging del movimento cellulare fornisce una piattaforma efficiente e ad alta produttività per misurare il movimento di contrazione e rilassamento delle hiPSC-CM. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è che non misura la forza contrattile diretta, ma piuttosto la velocità di contrazione e rilassamento. Inoltre, le velocità variano quando il numero di hiPSC-CM per formare un monostrato è diverso. Pertanto, è fondamentale seminare esattamente 50.000 cellule in ciascun pozzetto delle piastre a 96 pozzetti.
FPD misurato da MEA è stato utilizzato come surrogato per la durata del QT e quindi è ampiamente utilizzato nella valutazione del prolungamento del QT indotto da farmaci33. Simile alla durata del QT, FPD sta battendo la velocità dipendente. Pertanto, la correzione della velocità di battitura è necessaria per interpretare con precisione i dati FPD. In questo protocollo, si raccomanda di eseguire la misurazione MEA almeno 10 giorni dopo la placcatura. Tuttavia, a volte è possibile che il segnale potenziale di campo sia ancora instabile dopo 10 giorni dalla placcatura. Se ciò accade, prolungare la coltura hiPSC-CM per altri 2-3 giorni.
La tecnica patch-clamp è uno strumento versatile per valutare l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM e dosare i canali ionici. Il principale svantaggio del patch-clamp convenzionale è la sua proprietà di bassa produttività, che ne ostacola l'applicazione negli studi ad alta produttività. Inoltre, richiede una lunga curva di apprendimento e una pratica approfondita prima di poter acquisire esperienza in questa tecnica. Tuttavia, la tecnica convenzionale patch-clamp è ancora considerata il gold standard per comprendere l'elettrofisiologia delle hiPSC-CM. Se l'APD di hiPSC-CMs deve essere valutato in modo ad alto rendimento, si suggerisce anche di iniziare con l'imaging ottico del potenziale d'azione hiPSC-CM utilizzando il sensore accelerato dei potenziali d'azione 2 (ASAP2)21. Dopo aver ottenuto i bersagli primari, un potenziale d'azione convenzionale può essere utilizzato in ulteriori studi per una fenotipizzazione e una convalida più accurate. Inoltre, il patch clamp automatizzato è stato sempre più utilizzato in vari campi, in particolare la canalopatia. Ad esempio, le correnti dei canali ionici trasportate da più varianti di canali hERG e canali del sodio voltaggio-dipendenti sono state caratterizzate da patch clamp automatico34,35,36,37. Inoltre, l'uso di patch clamp automatizzati nelle CM hiPSC è stato recentemente stabilito38,39. Per l'esecuzione di patch clamp automatici, i lettori possono fare riferimento ai protocolli40 pubblicati in precedenza. Con i vantaggi di un'elevata produttività e la semplicità nella gestione delle macchine, non c'è dubbio che i morsetti automatici svolgeranno un ruolo sempre più importante nella scoperta e nello sviluppo di farmaci.
L'uso di un colorante sensibile al Ca 2+, Fura-2, consente alla misurazione del Ca2+ diastolico delle CM hiPSC di essere molto meno influenzata dai fattori di polarizzazione sperimentali come il tempo di caricamento del colorante, la distribuzione irregolare del colorante e il foto-sbiancamento. Questo è importante per ricapitolare la disfunzione diastolica di particolari malattie cardiache. La limitazione principale è che richiede una sorgente luminosa di eccitazione UV, che potrebbe essere incompatibile con la microscopia confocale.
In sintesi, nonostante i recenti progressi nella valutazione della cardiotossicità nella fase preclinica dello sviluppo del farmaco, la cardiotossicità rimane uno dei principali problemi di sicurezza. La crescente incorporazione di hiPSC-CM nel processo standard di valutazione della sicurezza preclinica ha il potenziale per migliorare l'accuratezza della previsione della tossicità dei composti candidati. Inoltre, le hiPSC-CM specifiche per il paziente consentono la selezione personalizzata dei farmaci cardiaci e la previsione della risposta avversa al farmaco. Il protocollo che utilizza vari saggi funzionali qui descritti contribuirà ad espandere le applicazioni di hiPSC-CMs nello screening dei farmaci e nella modellazione delle malattie.
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Disclosures
J.C.W. è un co-fondatore di Greenstone Biosciences ma non ha interessi concorrenti, poiché il lavoro qui presentato è completamente indipendente. Gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo Blake Wu per aver revisionato il manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW) e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
References
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