Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tekniske anvendelser av mikroelektrodematrise og patchklemmeopptak på humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en lovende in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. Her beskriver vi en protokoll for måling av kontraktilitet og elektrofysiologi av hiPSC-CM.

Abstract

Narkotika-indusert kardiotoksisitet er den ledende årsaken til narkotika slitasje og tilbaketrekking fra markedet. Bruk av egnede prekliniske evalueringsmodeller for hjertesikkerhet er derfor et kritisk skritt under legemiddelutvikling. For tiden er hjertesikkerhetsvurdering fortsatt svært avhengig av dyreforsøk. Dyremodeller er imidlertid plaget av dårlig translasjonsspesifisitet for mennesker på grunn av artsspesifikke forskjeller, spesielt når det gjelder hjerteelektrofysiologiske egenskaper. Det er derfor et presserende behov for å utvikle en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering. Menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) har dukket opp som en uvurderlig in vitro-modell for legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og sykdomsmodellering. hiPSC-CM kan fås fra personer med ulik genetisk bakgrunn og ulike syke tilstander, noe som gjør dem til et ideelt surrogat for å vurdere legemiddelindusert kardiotoksisitet individuelt. Derfor må metoder for å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM etableres. I denne protokollen beskriver vi ulike funksjonelle analyser som kan vurderes på hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering. Samlet sett har inkorporering av hiPSC-CM i preklinisk hjertesikkerhetsvurdering potensial til å revolusjonere legemiddelutvikling.

Introduction

Narkotikautvikling er en lang og kostbar prosess. En studie av nye terapeutiske legemidler godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) mellom 2009 og 2018 rapporterte at den estimerte mediankostnaden for kapitalisert forskning og kliniske studier var $ 985 millioner per produkt1. Legemiddelindusert kardiotoksisitet er den viktigste årsaken til legemiddelslitasje og tilbaketrekning fra markedet2. Spesielt er kardiotoksisitet rapportert blant flere klasser av terapeutiske legemidler3. Derfor er hjertesikkerhetsvurdering en avgjørende komponent i legemiddelutviklingsprosessen. Det nåværende paradigmet for hjertesikkerhetsvurdering er fortsatt svært avhengig av dyremodeller. Imidlertid blir artsforskjeller fra bruk av dyremodeller i økende grad anerkjent som en primær årsak til unøyaktige spådommer for legemiddelindusert kardiotoksisitet hos mennesker4. For eksempel varierer morfologien til hjertets handlingspotensial vesentlig mellom mennesker og mus på grunn av bidragene fra forskjellige repolariserende strømmer5. I tillegg er differensialisoformer av hjertemyosin og sirkulære RNA som kan påvirke hjertefysiologien godt dokumentert blant art 6,7. For å bygge bro over disse hullene er det viktig å etablere en pålitelig, effektiv og menneskebasert modell for preklinisk hjertesikkerhetsvurdering.

Den banebrytende oppfinnelsen av indusert pluripotent stamcelleteknologi (iPSC) har generert enestående narkotikascreening og sykdomsmodelleringsplattformer. I løpet av det siste tiåret har metoder for å generere menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (hiPSC-CMs) blitt godt etablert 8,9. hiPSC-CMs har tiltrukket seg stor interesse for deres potensielle anvendelser i sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. For eksempel har hiPSC-CM blitt brukt til å modellere de patologiske fenotypene av hjertesykdommer forårsaket av genetisk arv, for eksempel lang QT-syndrom10, hypertrofisk kardiomyopati 11,12 og dilatert kardiomyopati13,14,15. Følgelig har viktige signalveier involvert i patogenesen av hjertesykdommer blitt identifisert, noe som kan kaste lys over potensielle terapeutiske strategier for effektiv behandling. Videre har hiPSC-CM blitt brukt til å screene legemiddelindusert kardiotoksisitet assosiert med kreftmidler, inkludert doksorubicin, trastuzumab og tyrosinkinasehemmere16,17,18; Strategier for å redusere den resulterende kardiotoksisiteten er under utredning. Endelig tillater den genetiske informasjonen som beholdes i hiPSC-CMs screening og prediksjon av legemiddelindusert kardiotoksisitet på både individ- og populasjonsnivå19,20. Samlet har hiPSC-CMs vist seg å være et uvurderlig verktøy for personlig hjertesikkerhetsprediksjon.

Det overordnede målet med denne protokollen er å etablere metoder for omfattende og effektivt å undersøke de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CM, som er av stor betydning for å anvende hiPSC-CM mot sykdomsmodellering, legemiddelindusert kardiotoksisitetsscreening og presisjonsmedisin. Her beskriver vi en rekke funksjonelle analyser for å vurdere de funksjonelle egenskapene til hiPSC-CMs, inkludert måling av kontraktilitet, feltpotensial, handlingspotensial og kalsiumhåndtering (Ca2+) (figur 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av medier og løsninger

  1. Forbered hiPSC-CM vedlikeholdsmedium ved å blande en 10 ml flaske med 50x B27 supplement og 500 ml RPMI 1640 medium. Oppbevar mediet ved 4 °C og bruk det innen en måned. Juster middels til romtemperatur (RT) før bruk.
  2. Klargjør hiPSC-CM såmedium ved å blande 20 ml serumerstatning og 180 ml hiPSC-CM vedlikeholdsmedium (10 % fortynning, v/v). Mens nytilberedt såmedium foretrekkes, kan det lagres ved 4 ° C i ikke mer enn 2 uker. Balanser mediet til RT før bruk.
  3. Forbered ekstracellulær matriksbeleggløsning ved å tine en flaske (10 ml) kjellermembranmatrise ved 4 ° C over natten og aliquoting 500 μL kjellermembranmatrise i sterile 1,5 ml rør. Oppbevares ved -20 °C for videre bruk. Bland 500 μL kjellermembranmatrise og 100 ml iskald DMEM / F12 medium (1:200 fortynning, v / v) for å lage kjellermembranmatrisebeleggløsning.
  4. Klargjør 50 ml Tyrodes oppløsning inneholdende 135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukose og 10 mM HEPES. Juster pH til 7,4 med NaOH. Forbered fersk Tyrodes løsning på forsøksdagen.
  5. Forbered 50 ml intracellulær pipetteoppløsning inneholdende 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA og 10 mM HEPES. Juster pH til 7,2 med KOH. Aliquot den intracellulære pipetteoppløsningen i sterile 5 ml rør og oppbevar den ved -20 °C. På dagen for forsøket, tilsett MgATP til løsningen for å oppnå en endelig konsentrasjon på 3 mM.
  6. Forbered 1 ml Fura-2 AM lasteløsning inneholdende 2 μM Fura-2 AM og 0,1% Pluronic F-127. Forbered ny lasteløsning på forsøksdagen og beskytt den mot lyset.

2. Måling av hiPSC-CM kontraksjonsbevegelse

  1. Forbered kjellermembranmatrisebelagte plater ved å tilsette 100 μL ekstracellulær matriksbeleggløsning til hver brønn med 96-brønnplater. Inkuber 96-brønnsplatene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten.
  2. Enzymatisk dissosiasjon av hiPSC-CM
    1. Be om hiPSCs fra Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generer hiPSC-CMs i henhold til tidligere publikasjoner 8,9. Observer hiPSC-CM-ene dyrket i seksbrønnsplater under et mikroskop ved 10x forstørrelse.
      MERK: Ikke dissosier cellene når de fortsatt er proliferative. Ellers vil cellene overgrow på brønnene etter replating og føre til unøyaktige resultater av funksjonelle analyser. Vanligvis stopper hiPSC-CM spredning på dagene 18-23.
    2. Forsikre deg om at hiPSC-CM-ene slår sterkt og har en renhet på over 95%. Vurder renheten ved immunostaining mot hjertetroponin T, en spesifikk markør for kardiomyocytter 8,9.
    3. Aspirer vedlikeholdsmediet og vask cellene med 1x DPBS to ganger. Tilsett 1 ml celleoppløsningsløsning til hver brønn i seksbrønnsplatene og inkuber i 10 minutter ved 37 °C.
      MERK: Inkubasjonsvarigheten bør overvåkes regelmessig. Pass på at du ikke overfordøyer cellene, da det vil redusere cellens levedyktighet.
    4. Pipette hiPSC-CM forsiktig opp og ned flere ganger ved hjelp av en pipette på 5 ml for å generere en encellet fjæring. Legg til et likt volum hiPSC-CMs såmedium for å nøytralisere celleoppløsningsløsningen.
    5. Sentrifuge hiPSC-CMs ved 300 x g i 3 min ved RT. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 1-2 ml hiPSC-CM såmedium.
    6. Kvantifiser celletettheten og levedyktigheten ved hjelp av en trypanblå eksklusjonsmetode. Kort sagt, bland 10 μL cellesuspensjon med et likt volum trypanblått, overfør til et celletellingslysbilde, og tell deretter ved hjelp av en celleteller, som tidligere beskrevet21.
  3. Seeding hiPSC-CMs
    1. Fjern den ekstracellulære matriksbeleggløsningen fra platene med 96 brønner.
    2. Frø 50 000 celler per brønn i 100 μL hiPSC-CM såmedium og plasser 96-brønnsplatene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten.
    3. Bytt ut hiPSC-CM-såmediet med 100 μL hiPSC-CM vedlikeholdsmedium 1 dag etter plating. Bytt vedlikeholdsmedium for hiPSC-CM hver 2. dag frem til opptak.
  4. Datainnsamling
    1. Mål hiPSC-CM kontraksjonsbevegelsen minst 10 dager etter plating (anbefalt).
    2. Slå på temperaturregulatoren og still inn 37 °C som ønsket temperatur. Slå på mikroskopet, kameraet og CO2-forsyningen .
    3. Fyll vannkappen på plateholderen med en passende mengde sterilt avionisert vann (figur 2A). Plasser 96-brønnsplaten på plateholderen og la cellene akklimatisere seg i minst 5 minutter.
    4. Åpne visningsprogramvaren, sett kameraets bildefrekvens til 75 bilder per sekund (fps) og video / bildeoppløsningen til 1024 × 1024 piksler. Bruk funksjonene autofokus og automatisk lysstyrke. Ta opp videoer og bilder av hiPSC-CMs.
      MERK: Unngå vibrasjon av mikroskoptabellen under opptak.
    5. Åpne analysatorprogramvaren for automatisk analyse.

3. Måling av hiPSC-CM feltpotensial

  1. Fremstilling av kjellermembranmatrisebelagte plater
    1. Plasser forsiktig en 8 μL dråpe av ekstracellulær matriksbeleggløsning over opptakselektrodeområdet til hver brønn i 48-brønns mikroelektrodematrise (MEA) -platene. Se figur 3A for riktig elektrodeområde for dråpeplassering. Dette trinnet er avgjørende for å holde hiPSC-CM-monolaget konsentrert på elektrodene. Unngå å berøre elektrodene under noen omstendigheter.
    2. Tilsett 3 ml sterilt avionisert vann til området rundt brønnene (figur 3A) av 48-brønns MEA-plater for å forhindre fordampning av beleggløsning. Inkuber 48-brønns MEA-plater i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 ° C, 5% CO2 i 45-60 min.
      MERK: Ikke rug for lenge for å forhindre at kjellermembranmatrisen tørker.
  2. Utfør enzymatisk dissosiasjon av hiPSC-CM som beskrevet i trinn 2.2.
  3. Seeding hiPSC-CMs
    1. Fjern det meste av det ekstracellulære matriksmediet fra brønnoverflaten uten å berøre elektrodene ved hjelp av en 200 μL pipettespiss i samme rad eller kolonne.
    2. Frø 50 000 celler per brønn i en 8 μL dråpe hiPSC-CM såmedium over opptakselektrodeområdet til hver brønn i samme rad eller kolonne.
    3. Gjenta de to siste trinnene til alle brønnene er belagt med celler. Kontroller under mikroskopet at alle brønnene har hiPSC-CM-fjæring. For ønsket tetthet, se figur 3B.
      MERK: Festing av hiPSC-CM vil bli kompromittert hvis kjellermembranmatrisen er helt tørket ut, noe som gjør cellefesting suboptimal.
    4. Inkuber de 48-brønns MEA-platene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 i 60 min.
    5. Tilsett sakte og forsiktig 150 μL hiPSC-CM såmedium til hver brønn i MEA-platene med 48 brønner. For å tilsette medium uten å spre tidligere sådde hiPSC-CMs, hold platen i en 45 ° vinkel, len pipettespissen mot veggen i hver brønn og slipp mediet sakte.
      MERK: Tilsetning av medium for raskt eller med høyt trykk vil løsne de vedlagte kardiomyocyttene. Unngå direkte kontakt med hiPSC-CM dråpefjæring.
    6. Inkuber de 48-brønns MEA-platene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten.
    7. Oppdater hiPSC-CM-såmediet med 300 μL hiPSC-CM vedlikeholdsmedium 1 dag etter plettering. Bytt vedlikeholdsmedium hiPSC-CM hver 2. dag før opptak.
  4. Datainnsamling
    1. Utfør MEA-måling minst 10 dager etter plating (anbefalt). På dag 10 etter plating, kontroller tettheten av spontan juling hiPSC-CM monolag under et mikroskop ved 10x forstørrelse, som skal være som vist i figur 3C.
    2. Plasser 48-brønns MEA-platen i opptaksinstrumentet. Berøringsskjermen gjør det mulig å observere temperaturen (37 ° C) og CO2 (5%) status.
    3. Åpne navigatorprogramvaren. I det eksperimentelle oppsettvinduet velger du Cardiac Real-time Configuration and Field Potential Recordings. Bruk spontane eller temposlåtte konfigurasjoner.
    4. I beatdeteksjonsparametere setter du deteksjonsterskelen til 300 μV, minimum slagperiode til 250 ms og maksimal slagperiode til 5 s. Velg Polynomregresjon for beregning av feltpotensiell varighet (FPD).
    5. Kontroller om det elektriske aktivitetssignalet er modent og stabilt.
      MERK: De modne bølgeformene registrert av hver elektrode fra MEA-platen med flere brønner må gjenspeile hjertefeltpotensialet med lett identifiserbare egenskaper som sammenfaller med hjertedepolariseringstoppen og repolariseringsfasen, som vist i figur 3D-F.
    6. Oppnå baseline hjerteaktiviteter i 1-3 minutter. Hvis det er behov for narkotikabehandling, legg til forbindelser i brønnene etter grunnlinjeopptak. Plasser platen i en inkubator i minst 30 minutter før neste opptak.

4. Måling av hiPSC-CM aksjonspotensial

  1. Forbered kjellermembranmatrisebelagte retter ved å plassere 500 μL ekstracellulær matriksbeleggløsning på glassbunndelen av 35 mm retter (figur 4A). Inkuber de 35 mm rettene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten.
  2. Utfør enzymatisk dissosiasjon av hiPSC-CM som beskrevet i trinn 2.2.
  3. Seeding hiPSC-CMs
    1. Fjern den ekstracellulære matriksbeleggløsningen fra 35 mm-oppvasken. Frø 50 000 celler per brønn i 500 μL hiPSC-CM såmedium på glassbunnen av 35 mm retter.
    2. Inkuber de 35 mm rettene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten. Fjern hiPSC-CM såmedium og tilsett 2 ml hiPSC-CM vedlikeholdsmedium til 35 mm oppvasken.
      MERK: Det anbefales å sette en 200 μL ikke-filtrert spiss over 2 ml aspirasjonspipetten for å fjerne det brukte mediet for å unngå å berøre celler.
    3. Bytt hiPSC-CM kulturmedium hver 2. dag før opptak.
  4. Datainnsamling
    1. Utfør måling av aksjonspotensial minst 10 dager etter plettering (anbefalt). Tilbered fersk Tyrodes løsning som beskrevet i trinn 1.4. Tine en aliquot av intracellulær pipetteløsning og tilsett MgATP til en endelig konsentrasjon på 3 mM.
    2. Trekk mikropipettene fra borosilikatglasskapillærene ved hjelp av en mikropipettetrekker.
      MERK: En motstand på 2-5 MΩ av mikropipettene foretrekkes.
    3. Bytt ut vedlikeholdsmediet hiPSC-CM med Tyrodes løsning og la cellene akklimatisere seg til Tyrodes løsning i 15 minutter (figur 4C). Sett temperatursensorene inn i kammeret, sett 35 mm parabolen i kammeret som vist i figur 4C, og juster temperaturen til 37 °C (figur 4D).
    4. Fyll mikropipettene med intracellulær løsning og sett dem inn i holderen som er koblet til patch-klemmeforsterkerens hodetrinn (figur 4E). Åpne stimulerings- / anskaffelsesprogramvaren, last inn opptaksprotokollen for handlingspotensial, og velg spenningsklemmekonfigurasjonen.
    5. Sett mikropipetten inn i badeløsningen, velg passende enkle hiPSC-CM-er, og juster og senk posisjonen til mikropipetten ved siden av den valgte cellen ved hjelp av en mikromanipulator. Når pipettespissen settes inn i badeløsningen, må du kontrollere for pipettemotstand som kan observeres på oscilloskopmonitoren.
    6. Plasser pipetten nær cellen, og strømpulsene vil avta litt for å gjenspeile den økende tetningsmotstanden. Påfør forsiktig sug med negativt trykk for å øke motstanden, noe som vil danne en gigaseal. Påfør Tetningsfunksjonen .
    7. Påfør ekstra sug for å bryte membranen for å få en helcelleopptakskonfigurasjon. Når membrandelen i pipetteområdet brister ved sug, er den interne løsningen i likevekt med cellecytoplasma. På dette tidspunktet bytter du fra spenningsklemmemodus (V-klemme) til strømklemmemodus eller ingen strøminjeksjon (C-Clamp) ved hjelp av forsterkerdialogen. trykk Record knappen for å generere og lagre handlingspotensialet opptaksfiler.
      MERK: Modusendringen gir et kontinuerlig opptak av de spontane handlingspotensialene til hiPSC-CM-er via ingen utløser og ingen stimuleringsopptaksprotokoll, som kan overvåkes ved V-mon-utgangen til patch-clamp-forsterkeren.

5. Måling av hiPSC-CM Ca2+ forbigående

  1. Se forrige protokoll for fremstilling av tilpassede cellekamre for Ca 2+ avbildning21. For fremstilling av kjellermembranen matriksbelagt cellekammer, plasser 200 μL ekstracellulær matriksbeleggløsning i cellekamrene. Inkuber cellekamrene i en fuktet cellekulturinkubator ved 37 °C, 5 % CO2 over natten.
  2. Utfør enzymatisk dissosiasjon av hiPSC-CM som beskrevet i trinn 2.2.
  3. Seeding hiPSC-CMs
    1. Fjern den ekstracellulære matriksbeleggløsningen fra cellekamrene. Frø 20.000 celler per brønn i 200 μL hiPSC-CM såmedium.
    2. Bytt ut hiPSC-CM-såmediet med 200 μL hiPSC-CM vedlikeholdsmedium 1 dag etter plettering. Bytt vedlikeholdsmedium hiPSC-CM hver 2. dag før opptak.
  4. Datainnsamling
    1. Utfør Ca2+ forbigående måling minst 10 dager etter plettering (anbefalt). Tilbered fersk Tyrodes løsning som beskrevet i trinn 1.4. Forbered fersk Fura-2 AM lasteløsning som beskrevet i trinn 1.6.
    2. Aspirer vedlikeholdsmediet hiPSC-CM og vask med Tyrodes løsning to ganger. Påfør 100 μL Fura-2 AM lasteløsning og inkuber i 10 minutter ved RT.
    3. Bytt ut Fura-2 AM-lasteløsningen med Tyrodes løsning og la det gå minst 5 minutter for fullstendig de-esterifisering av Fura-2 AM.
    4. Legg til en dråpe nedsenkningsolje på 40x-målet for et omvendt epifluorescensmikroskop utstyrt med et 40x oljenedsenkningsmål (0,95 NA). Plasser cellekammeret i mikroskopets sceneadapter (figur 5A).
    5. Monter ledningene til temperaturregulatoren i badekammeret og sett den på 37 °C. Monter de elektriske feltstimuleringselektrodene og sett pulsene på 0,5 Hz med en varighet på 20 ms.
    6. Slå på lyskilden med ultrahøyhastighets bølgelengdebryter og sett den til 340 nm og 380 nm hurtigbrytermodus i henhold til instrumentets instruksjoner.
    7. Bruk en eksponeringstid på 20 ms for både bølgelengder og en opptakstid på 20 s i programvaren. Ta opp videoen som reflekterer sanntidsendringer av Ca2+ forbigående i hiPSC-CM-er. Eksporter dataene til et regneark og analyser dataene som tidligere beskrevet23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvordan man måler kontraksjonsbevegelse, feltpotensial, handlingspotensial og Ca2+ transient av hiPSC-CMs. Et skjematisk diagram inkludert enzymatisk fordøyelse, cellesåing, vedlikehold og funksjonell analyseledning er vist i figur 1. Dannelsen av hiPSC-CM-monolaget er nødvendig for måling av kontraksjonsbevegelse (figur 2B). Et representativt spor av sammentreknings-avslapningsbevegelsen til hiPSC-CM er vist i figur 2C. Analysatorprogramvaren muliggjør analyse av kontraksjon-avslapningsbevegelsesspor på en automatisert måte ved å oppdage sammentrekningsstart, sammentrekningstopp, sammentrekningsslutt, avslapningstopp og avslapningsslutt ved hjelp av standardinnstillingen (figur 2D). Hastighetene til sammentrekning og avslapningstopper brukes til å vurdere sammentreknings- og avslapningskapasiteten til hiPSC-CMs. I tillegg kan sammentreknings- og avslapningsdeformasjonsavstander også oppnås.

MEA-analysen er den ekstracellulære registreringen av handlingspotensialer, kjent som feltpotensialer. Vellykket måling av feltpotensialer krever full dekning av hiPSC-CM-monolaget på alle elektrodene i hver brønn i MEA-platene (figur 3C). De modne bølgeformene registrert av hver elektrode må gjenspeile hjertefeltpotensialet med lett identifiserbare egenskaper, som vist i figur 3D-F. De spesifiserte kvalitetsstandardene er 1) baselineaktiviteten skal vise spontan juling innen 20-90 slag per min, 2) slagfrekvensen skal være innenfor 6 SDer beregnet for baseline slagfrekvens på alle brønnene, 3) variasjonskoeffisienten for slagperioden skal være mindre enn 5%, og 4) depolarisasjonsamplituden skal være over 0,3 mV, som tidligere publisert22. Figur 3E viser representative feltpotensielle spor av hiPSC-CM. Navigatorprogramvaren oppdager og identifiserer beats og FPD automatisk. Etter analyse kan man oppnå slagperiode, FPD og spikeamplitude (figur 3F). Spesielt bestemmes beatperioden av det depolariserende topp-til-topp-intervallet, FPD bestemmes av intervallet mellom depolariserende topp til repolarisasjonstopp, og spikeamplitude måles av avstanden mellom den depolariserende positive toppen til den negative toppen, som vist i figur 3F.

Encellet patchklemme er gullstandarden for å vurdere de elektrofysiologiske egenskapene til hiPSC-CM (figur 4B). Helcelle-patch-klemmeopptak i strømklemmemodus kan registrere de spontane handlingspotensialene til enkle hiPSC-CM-er (figur 4F). Etter analyse kan flere parametere, inkludert amplitude, maks diastolisk potensial (MDP) og handlingspotensialvarighet (APD) ved 30%, 50% og 90% repolarisering oppnås (figur 4G).

For Ca2+ -avbildning kan fluorescensintensitetsendringer av individuelle hiPSC-CM-er over tid registreres av programvaren. Et representativt område med Fura-2-belastede hiPSC-CM-er er vist i figur 5B. Bruken av en ultrahøyhastighets bølgelengdebryterlyskilde gjør det mulig å ta opp Ca2+ -transienter fra hundrevis av hiPSC-CM-er via skanning i rammemodus. Etter analysen av et regnearkbasert program23, kan F340 / F380-forholdet over tid for hver celle oppnås. Deretter kan rå spor av stimulerte Ca2+ transienter plottes (figur 5C). I tillegg kan parametere som amplitude, diastolisk Ca 2+ og Ca2 + forfall tau oppnås (figur 5D).

Figure 1
Figur 1. Samlet skjematisk diagram av protokollen. På dag 0, fordøye og frø hiPSC-CMs på kjellermembran matrisebelagte 96-brønnplater / 48-brønns MEA-plater / 35 mm servise / cellekamre. Tillat en gjenopprettingsperiode på minst 10 dager før du utfører de funksjonelle analysene ved hjelp av et cellebevegelsesbildesystem, MEA, patch-klemme og Ca2 + bildebehandlingssystem. Forkortelser: MEA = mikroelektrode array. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Måling av sammentrekningsbevegelse. (A) Cellebevegelsesbildesystemet. (B) En representativ region for hiPSC-CM-monolaget. Skala bar: 20 μm. (C) Representative sammentrekning-avslapning spor av hiPSC-CMs. (D) Skjematisk diagram over et sammentreknings-avslapningsspor som viser sammentrekningsstart, sammentrekningstopp, sammentrekningsslutt, avslapningstopp og avslapningsslutt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Måling av feltpotensial. (A) Toppvisninger av (venstre) en 48-brønns MEA-plate, (midtre) en brønn med 16 elektroder, og (høyre) området som en kjellermembranmatrisedråpe må dekke. Tilsett tilstrekkelig destillert vann til vannreservoaret for å kompensere for fordampning. (B) hiPSC-CM suspensjon og ønsket tetthet etter replating. (C) Et representativt område for hiPSC-CM-monolaget. (D) Kontinuerlige bølgeformplott fra de 16 elektrodene i en brønn i den 48-brønns MEA-platen. (E) Representative feltpotensielle spor av hiPSC-CMs. (F) Skjematisk diagram over et feltpotensialspor som viser hvordan parametrene ble analysert. Forkortelse: FPD = feltpotensiell varighet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Måling av handlingspotensial. (A) Kjellermembranmatriksbelegg og hiPSC-CMs suspensjonsplassering på 35 mm servise. (B) En representativ region av enkelt hiPSC-CMs. Skala bar: 20 μm. (C-E) Patch-clamp system oppsett. (F) Representative handlingspotensialspor av hiPSC-CMs. (G) Skjematisk diagram over et handlingspotensialspor som viser hvordan parametrene ble analysert. Forkortelser: APD = tiltakspotensialvarighet, MDP = maksimalt diastolisk potensial. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Måling av Ca2+ forbigående. (A) Bildesystemet Ca2+ . (B) En representativ region av Fura-2-lastet enkelt hiPSC-CMs. Skala bar: 100 μm. (C) Representant Ca2 + forbigående spor av hiPSC-CMs. (D) Skjematisk diagram over et Ca2+ forbigående spor som viser hvordan parametrene ble analysert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Human iPSC-teknologi har dukket opp som en kraftig plattform for sykdomsmodellering og narkotikascreening. Her beskriver vi en detaljert protokoll for måling av hiPSC-CM kontraktilitet, feltpotensial, aksjonspotensial og Ca2+ transient. Denne protokollen gir en omfattende karakterisering av hiPSC-CM kontraktilitet og elektrofysiologi. Disse funksjonelle analysene har blitt brukt i flere publikasjoner fra vår gruppe 12,13,18,24,25,26,27.

Det er viktig å bruke hiPSC-CM-ene som er i gode slagforhold, ellers vil signal-til-støy-forholdet mellom avlesningene falle dramatisk. I tillegg er det ønskelig å sikre høy renhet av hiPSC-CM før målingene. Eksistensen av ikke-kardiomyocytter kan spesielt kompromittere datanøyaktigheten av sammentrekningsbevegelse og feltpotensialmålinger, som begge krever dannelse av hiPSC-CM monolag. Videre er umodenheten til hiPSC-CM fortsatt en stor bekymring som hindrer full anvendelse av hiPSC-CM på ulike felt28. Det er kjent at hiPSC-CM er funksjonelt umodne i flere aspekter, inkludert morfologi, kontraktilitet, elektrofysiologi, Ca 2+ håndtering og metabolisme29. Derfor anbefales det å holde hiPSC-CM-ene i kulturen minst til dag 30 før du utfører funksjonelle analyser. Alternativt kan ulike strategier som er etablert for å forbedre modenheten til hiPSC-CM-er vedtas før de funksjonelle analysene30 gjennomføres. For eksempel viste hiPSC-CM-ene dyrket i metabolske modningsmedier svært negativ MDP av handlingspotensialer og betydelig raskere forfall av Ca2+ transienter sammenlignet med hiPSC-CM-ene dyrket i normale RPMI-medier31. Til slutt er det batch-til-batch-variasjoner av hiPSC-CMs32. Data bør derfor samles inn på hiPSC-CM-er generert fra minst tre uavhengige differensieringer av de samme iPSC-linjene.

Cell motion imaging-systemet gir en høy gjennomstrømning og effektiv plattform for å måle sammentreknings- og avslapningsbevegelsen til hiPSC-CMs. En stor ulempe er imidlertid at den ikke måler den direkte kontraktile kraften, men heller sammentrekningen og avslapningshastigheten i stedet. I tillegg varierer hastighetene når antall hiPSC-CM for å danne et monolag er forskjellig. Derfor er det avgjørende å frø nøyaktig 50.000 celler i hver brønn i 96-brønnsplatene.

FPD målt ved MEA har blitt brukt som surrogat for QT-varighet og er derfor mye brukt i vurdering av legemiddelindusert QT-forlengelse33. I likhet med QT-varighet slår FPD rateavhengig. Derfor er korreksjonen i slagfrekvensen nødvendig for å tolke FPD-dataene nøyaktig. I denne protokollen anbefales det at MEA-måling utføres minst 10 dager etter plating. Noen ganger er det imidlertid mulig at feltpotensialsignalet fortsatt er ustabilt etter 10 dager etter plating. Hvis dette skjer, forleng hiPSC-CM-kulturen i ytterligere 2-3 dager.

Patch-clamp-teknikken er et allsidig verktøy for å vurdere elektrofysiologien til hiPSC-CM og analysere ionkanaler. Den største ulempen med den konvensjonelle patch-klemmen er dens lave gjennomstrømningsegenskap, noe som hindrer anvendelsen i studier med høy gjennomstrømning. I tillegg krever det en lang læringskurve og omfattende praksis før man kan bli erfaren i denne teknikken. Imidlertid er den konvensjonelle patch-clamp-teknikken fortsatt ansett som gullstandarden for å forstå elektrofysiologien til hiPSC-CMs. Hvis APD for hiPSC-CM må evalueres på en høy gjennomstrømningsmåte, foreslås det også å starte med optisk avbildning av hiPSC-CM-handlingspotensial ved bruk av den akselererte sensoren for handlingspotensialer 2 (ASAP2) 21. Etter at primære mål er oppnådd, kan et konvensjonelt handlingspotensial brukes i videre studier for mer nøyaktig fenotyping og validering. I tillegg har automatisert patchklemme i økende grad blitt brukt på ulike felt, spesielt kanalopati. For eksempel har ionkanalstrømmene som bæres av flere varianter av hERG-kanaler og spenningsstyrte natriumkanaler blitt preget av automatisert patchklemme34,35,36,37. Videre er bruken av automatisert patchklemme i hiPSC-CMs nylig etablert38,39. For utførelse av automatisert patchklemme kan leserne referere til tidligere publiserte protokoller40. Med fordelene ved å være høy gjennomstrømning og enkelheten i maskinhåndtering, er det ingen tvil om at automatiserte patchklemmer vil spille flere og flere viktige roller i narkotikaforskning og narkotikautvikling.

Bruken av et ratiometrisk Ca 2+-følsomt fargestoff, Fura-2, gjør at måling av diastolisk Ca2+ av hiPSC-CM kan påvirkes mye mindre av de eksperimentelle skjevhetsfaktorene som fargestoffbelastningstid, ujevn fargefordeling og fotobleking. Dette er viktig for å rekapitulere den diastoliske dysfunksjonen av spesielle hjertesykdommer. Hovedbegrensningen er at det krever en UV-eksitasjonslyskilde, som kan være uforenlig med konfokal mikroskopi.

Oppsummert, til tross for nylige fremskritt i kardiotoksisitetsvurdering i den prekliniske fasen av legemiddelutvikling, er kardiotoksisitet fortsatt en av de ledende sikkerhetsbekymringene. Den økende inkorporeringen av hiPSC-CM i standard preklinisk sikkerhetsevalueringsprosess har potensial til å forbedre nøyaktigheten av toksisitetsprediksjon av kandidatforbindelser. I tillegg muliggjør pasientspesifikke hiPSC-CM-er personlig valg av hjertemedisin og prediksjon av bivirkninger. Protokollen ved hjelp av ulike funksjonelle analyser beskrevet her, vil bidra til å utvide anvendelsene av hiPSC-CM i narkotikascreening og sykdomsmodellering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

JCW er medstifter av Greenstone Biosciences, men har ingen konkurrerende interesser, da arbeidet som presenteres her er helt uavhengig. De andre forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Blake Wu for korrekturlesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978, og NASA NNX16A069A (JCW), og AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Tags

Medisin utgave 186
Tekniske anvendelser av mikroelektrodematrise og patchklemmeopptak på humaninduserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, S. R.,… More

Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter