Summary
Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.
Abstract
A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.
Introduction
O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto1. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado2. Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas3. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. O paradigma atual para a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de modelos animais. No entanto, as diferenças de espécies em relação ao uso de modelos animais são cada vez mais reconhecidas como a principal causa de previsões imprecisas para a cardiotoxicidade induzida por drogas em pacientes humanos4. Por exemplo, a morfologia do potencial de ação cardíaca difere substancialmente entre humanos e camundongos devido às contribuições de diferentes correntes de repolarização5. Além disso, isoformas diferenciais de miosina cardíaca e RNAs circulares que podem afetar a fisiologia cardíaca têm sido bem documentadas entre as espécies 6,7. Para preencher essas lacunas, é imperativo estabelecer um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca.
A invenção inovadora da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) gerou plataformas sem precedentes de triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Na última década, métodos para gerar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) tornaram-se bem estabelecidos 8,9. Os CM-hiPSC têm atraído grande interesse em suas potenciais aplicações na modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Por exemplo, os CM-hiPSC têm sido utilizados para modelar os fenótipos patológicos de doenças cardíacas causadas por herança genética, como a síndrome do QT longo10, a cardiomiopatia hipertrófica 11,12 e a cardiomiopatia dilatada13,14,15. Consequentemente, foram identificadas as principais vias de sinalização implicadas na patogênese das doenças cardíacas, o que pode lançar luz sobre possíveis estratégias terapêuticas para um tratamento eficaz. Além disso, os CM-hiPSC têm sido utilizados para rastrear a cardiotoxicidade induzida por drogas associada a agentes anticancerígenos, incluindo doxorrubicina, trastuzumabe e inibidores da tirosina quinase16,17,18; estratégias para mitigar a cardiotoxicidade resultante estão sob investigação. Por fim, a informação genética retida nas CME-hiPSC permite a triagem e a predição da cardiotoxicidade induzida por fármacos tanto em nível individual quanto populacional19,20. Coletivamente, os hiPSC-CMs provaram ser uma ferramenta inestimável para a previsão personalizada da segurança cardíaca.
O objetivo geral deste protocolo é estabelecer metodologias para investigar de forma abrangente e eficiente as características funcionais dos CM-hiPSC, que são de grande importância na aplicação de CMhiPSC para modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Aqui, detalhamos uma série de ensaios funcionais para avaliar as propriedades funcionais dos CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio (Ca2+) (Figura 1).
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Protocol
1. Preparação de meios e soluções
- Prepare o meio de manutenção hiPSC-CM misturando um frasco de 10 mL de suplemento de 50x B27 e 500 mL de meio RPMI 1640. Conservar o meio a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês. Equilibre a temperatura média a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
- Preparar o meio de semeadura hiPSC-CM misturando 20 mL de reposição sérica e 180 mL de meio de manutenção hiPSC-CM (diluição a 10%, v/v). Embora o meio de semeadura recém-preparado seja preferido, ele pode ser armazenado a 4 °C por não mais de 2 semanas. Equilibre o meio para RT antes de usar.
- Preparar a solução de revestimento da matriz extracelular descongelando um frasco (10 mL) de matriz de membrana basal a 4 °C durante a noite e alíquota de 500 μL de matriz de membrana basal em tubos estéreis de 1,5 mL. Conservar a -20 °C para posterior utilização. Misture 500 μL de matriz de membrana basal e 100 mL de meio DMEM/F12 gelado (diluição 1:200, v/v) para fazer uma solução de revestimento de matriz de membrana basal.
- Preparar 50 ml de solução de Tyrode contendo 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucose e 10 mM de HEPES. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Prepare a solução fresca de Tyrode no dia da experiência.
- Preparar 50 mL de solução de pipeta intracelular contendo 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA e 10 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,2 com KOH. Aliquotar a solução de pipeta intracelular em tubos estéreis de 5 ml e armazená-la a -20 °C. No dia do experimento, adicionar MgATP à solução para atingir uma concentração final de 3 mM.
- Preparar 1 mL de solução de carga de Fura-2 AM contendo 2 μM de Fura-2 AM e F-127 Plurônico a 0,1%. Prepare uma solução de carregamento fresca no dia do experimento e proteja-a da luz.
2. Medição do movimento de contração hiPSC-CM
- Prepare placas revestidas de matriz de membrana basal adicionando 100 μL de solução de revestimento de matriz extracelular a cada poço de placas de 96 poços. Incubar as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
- Dissociação enzimática de hiPSC-CMs
- Solicite hiPSCs do Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Gerar hiPSC-CMs de acordo com as publicações anteriores 8,9. Observe os CMs hiPSC cultivados em placas de seis poços sob um microscópio com ampliação de 10x.
NOTA: Não dissociar as células quando elas ainda estiverem proliferativas. Caso contrário, as células crescerão demais nos poços após o replating e levarão a resultados imprecisos dos ensaios funcionais. Normalmente, os CMs hiPSC param a proliferação nos dias 18-23. - Certifique-se de que os hiPSC-CMs estão batendo fortemente e têm uma pureza de mais de 95%. Avaliar a pureza por imunomarcação contra troponina T cardíaca, um marcador específico de cardiomiócitos 8,9.
- Aspirar o meio de manutenção e lavar as células com 1x DPBS duas vezes. Adicionar 1 ml de solução de descolamento celular a cada alvéolo das placas de seis poços e incubar durante 10 min a 37 °C.
NOTA: A duração da incubação deve ser monitorizada regularmente. Certifique-se de não digerir excessivamente as células, pois isso reduzirá a viabilidade celular. - Pipete suavemente hiPSC-CMs para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de 5 mL para gerar uma suspensão de célula única. Adicione um volume igual de meio de semeadura hiPSC-CMs para neutralizar a solução de descolamento celular.
- Centrífuga hiPSC-CMs a 300 x g por 3 min no RT. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1-2 mL de meio de semeadura hiPSC-CM.
- Quantifique a densidade celular e a viabilidade usando um método de exclusão de azul de tripano. Resumidamente, misture 10 μL de suspensão celular com um volume igual de azul de tripano, transfira para uma lâmina de contagem de células e, em seguida, conte usando um contador de células, conforme descrito anteriormente21.
- Solicite hiPSCs do Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Gerar hiPSC-CMs de acordo com as publicações anteriores 8,9. Observe os CMs hiPSC cultivados em placas de seis poços sob um microscópio com ampliação de 10x.
- Semeadura hiPSC-CMs
- Remova a solução de revestimento da matriz extracelular das placas de 96 poços.
- Semear 50.000 células por poço em 100 μL de meio de semeadura hiPSC-CM e colocar as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura celular umidificada a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
- Substitua o meio de semeadura hiPSC-CM por 100 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias até a gravação.
- Aquisição de dados
- Meça o movimento de contração do hiPSC-CM pelo menos 10 dias após o plaqueamento (recomendado).
- Ligue o controlador de temperatura e defina 37 °C como a temperatura preferida. Ligue o microscópio, a câmera e a fonte de CO2 .
- Encher a camisa de água do suporte da placa com uma quantidade adequada de água desionizada estéril (Figura 2A). Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa e permita que as células se aclimatem por pelo menos 5 minutos.
- Abra o software de visualização, defina a taxa de quadros da câmera para 75 quadros por segundo (fps) e a resolução de vídeo/imagem para 1024 × 1024 pixels. Aplique as funções de foco automático e brilho automático. Grave vídeos e imagens de hiPSC-CMs.
NOTA: Evite a vibração da mesa do microscópio durante a gravação. - Abra o software analisador para análise automática.
3. Medição do potencial de campo hiPSC-CM
- Preparação de placas revestidas de matriz de membrana basal
- Coloque cuidadosamente uma gota de 8 μL de solução de revestimento de matriz extracelular sobre a área do eletrodo de gravação de cada poço das placas de matriz de microeletrodos (MEA) de 48 poços. Consulte a Figura 3A para a área apropriada do eletrodo para a colocação de gotículas. Esta etapa é fundamental para manter a monocamada hiPSC-CM concentrada nos eletrodos. Evite tocar nos eletrodos em qualquer circunstância.
- Adicionar 3 mL de água desionizada estéril à área ao redor dos poços (Figura 3A) das placas MEA de 48 poços para evitar a evaporação da solução de revestimento. Incubar placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 por 45-60 min.
NOTA: Não incube por muito tempo para evitar que a matriz da membrana basal seque.
- Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.
- Semeadura hiPSC-CMs
- Remova a maior parte do meio da matriz extracelular da superfície do poço sem tocar nos eletrodos usando uma ponta de pipeta de 200 μL dentro da mesma linha ou coluna única.
- Semear 50.000 células por poço em uma gota de 8 μL de meio de semeadura hiPSC-CM sobre a área do eletrodo de registro de cada poço da mesma linha ou coluna.
- Repita os dois últimos passos até que todos os poços tenham sido banhados com células. Verifique ao microscópio se todos os poços têm a suspensão hiPSC-CM. Para a densidade desejada, consulte a Figura 3B.
NOTA: A fixação de hiPSC-CMs será comprometida se a matriz da membrana basal estiver completamente seca, tornando a fixação celular subótima. - Incubar as placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 por 60 min.
- Adicione lenta e suavemente 150 μL de meio de semeadura hiPSC-CM a cada poço das placas MEA de 48 poços. Para adicionar o meio sem dispersar os hiPSC-CMs previamente semeados, segure a placa em um ângulo de 45°, incline a ponta da pipeta contra a parede de cada poço e solte o meio lentamente.
NOTA: Adicionar meio muito rapidamente ou com alta pressão irá desalojar os cardiomiócitos aderidos. Evite o contato direto com a suspensão de queda hiPSC-CM. - Incubar as placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
- Atualizar o meio de semeadura hiPSC-CM com 300 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.
- Aquisição de dados
- Realizar a medição de MEA pelo menos 10 dias após o revestimento (recomendado). No dia 10 pós-plaqueamento, verificar a densidade da monocamada de hiPSC-CM de batimento espontâneo sob um microscópio com ampliação de 10x, que deve ser como mostrado na Figura 3C.
- Coloque a placa MEA de 48 poços no instrumento de gravação. O ecrã táctil permite observar o estado da temperatura (37 °C) e do CO2 (5%).
- Abra o software do navegador. Na janela de configuração experimental, selecione Configuração em tempo real cardíaca e gravações de potencial de campo. Aplique configurações de batida espontâneas ou cadenciadas.
- Nos parâmetros de detecção de batimento, defina o limiar de detecção para 300 μV, o período mínimo de batimento para 250 ms e o período de batimento máximo para 5 s. Selecione Regressão polinomial para o cálculo da duração potencial do campo (FPD).
- Verifique se o sinal de atividade elétrica de linha de base está maduro e estável.
NOTA: As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo da placa MEA de múltiplos poços devem refletir o potencial do campo cardíaco com características facilmente identificáveis que coincidem com o pico de despolarização cardíaca e a fase de repolarização, como mostra a Figura 3D-F. - Adquira as atividades cardíacas basais por 1-3 min. Se o tratamento medicamentoso for necessário, adicione compostos aos poços após o registro basal. Coloque a placa em uma incubadora por pelo menos 30 minutos antes da próxima gravação.
4. Medição do potencial de ação hiPSC-CM
- Preparar pratos revestidos de matriz de membrana basal colocando 500 μL de solução de revestimento de matriz extracelular na parte de fundo de vidro de placas de 35 mm (Figura 4A). Incubar as placas de 35 mm em incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
- Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.
- Semeadura hiPSC-CMs
- Remova a solução de revestimento de matriz extracelular das placas de 35 mm. Semeia 50.000 células por poço em 500 μL de meio de semeadura hiPSC-CM na parte inferior de vidro de placas de 35 mm.
- Incubar as placas de 35 mm em incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite. Remova o meio de semeadura hiPSC-CM e adicione 2 mL de meio de manutenção hiPSC-CM às placas de 35 mm.
NOTA: Recomenda-se colocar uma ponta não filtrada de 200 μL sobre a pipeta de aspiração de 2 mL para remover o meio gasto para evitar o toque nas células. - Altere o meio de cultura hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.
- Aquisição de dados
- Realizar a medição do potencial de ação pelo menos 10 dias após o chapeamento (recomendado). Preparar a solução fresca de Tyrode, conforme descrito no passo 1.4. Descongelar uma alíquota de solução de pipeta intracelular e adicionar MgATP a uma concentração final de 3 mM.
- Puxe as micropipetas dos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipeta.
NOTA: É preferível uma resistência de 2-5 MΩ das micropipetas. - Substitua o meio de manutenção hiPSC-CM pela solução de Tyrode e deixe que as células se acostumem à solução de Tyrode por 15 minutos (Figura 4C). Insira os sensores de temperatura na câmara, coloque o prato de 35 mm na câmara, como mostrado na Figura 4C, e ajuste a temperatura para 37 °C (Figura 4D).
- Encher as micropipetas com solução intracelular e inseri-las no suporte ligado ao headstage do amplificador patch-clamp (Figura 4E). Abra o software de estimulação/aquisição, carregue o protocolo de gravação do potencial de ação e selecione a configuração de pinça de tensão.
- Insira a micropipeta na solução de banho, selecione os hiPSC-CMs únicos apropriados e ajuste e diminua a posição da micropipeta ao lado da célula selecionada usando um micromanipulador. Quando a ponta da pipeta for inserida na solução de banho, verifique se há resistência da pipeta que pode ser observada no monitor do osciloscópio.
- Posicione a pipeta perto da célula e os pulsos de corrente diminuirão ligeiramente para refletir a crescente resistência à vedação. Aplique uma sucção suave com pressão negativa para aumentar a resistência, que formará um gigaseal. Aplique a função Selar .
- Aplique sucção adicional para quebrar a membrana para obter uma configuração de gravação de célula inteira. Uma vez que a porção da membrana dentro da área da pipeta é rompida por sucção, a solução interna está em equilíbrio com o citoplasma celular. Neste ponto, mude do modo de grampo de tensão (grampo em V) para o modo de grampo de corrente ou sem injeção de corrente (C-Clamp) usando a caixa de diálogo do amplificador. Pressione o botão Gravar para gerar e salvar os possíveis arquivos de gravação da ação.
NOTA: A mudança de modo fornece um registro contínuo dos potenciais de ação espontânea de hiPSC-CMs através de nenhum gatilho e nenhum protocolo de gravação de estimulação, que pode ser monitorado na saída V-mon do amplificador patch-prancha.
5. Medição do transiente hiPSC-CM Ca2+
- Consulte o protocolo anterior para preparar câmaras celulares personalizadas para imagens Ca 2+ 21. Para a preparação da câmara celular revestida de matriz de membrana basal, coloque 200 μL de solução de revestimento de matriz extracelular nas câmaras celulares. Incubar as câmaras celulares em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
- Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.
- Semeadura hiPSC-CMs
- Remova a solução de revestimento da matriz extracelular das câmaras celulares. Semear 20.000 células por poço em 200 μL de meio de semeadura hiPSC-CM.
- Substitua o meio de semeadura hiPSC-CM por 200 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.
- Aquisição de dados
- Realize a medição transitória de Ca2+ pelo menos 10 dias após o revestimento (recomendado). Preparar a solução fresca de Tyrode, conforme descrito no passo 1.4. Preparar a solução de carregamento Fura-2 AM fresca, conforme descrito no passo 1.6.
- Aspirar o meio de manutenção hiPSC-CM e lavar com a solução de Tyrode's duas vezes. Aplicar 100 μL de solução de carregamento Fura-2 AM e incubar por 10 min no RT.
- Substitua a solução de carregamento Fura-2 AM pela solução da Tyrode e aguarde pelo menos 5 minutos para a desesterificação completa da Fura-2 AM.
- Adicione uma gota de óleo de imersão na objetiva de 40x de um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 40x (0,95 NA). Coloque a câmara celular no adaptador de palco do microscópio (Figura 5A).
- Instale os fios do controlador de temperatura na câmara de banho e defina-a para 37 °C. Instale os eletrodos de estimulação de campo elétrico e ajuste os pulsos em 0,5 Hz com uma duração de 20 ms.
- Ligue a fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra-alta velocidade e configure-a para o modo de comutação rápida de 340 nm e 380 nm, de acordo com as instruções do instrumento.
- Aplique um tempo de exposição de 20 ms para ambos os comprimentos de onda e um tempo de gravação de 20 s no software. Grave o vídeo refletindo as mudanças em tempo real do transiente Ca2+ em CMs hiPSC. Exporte os dados para uma planilha e analise os dados conforme descrito anteriormente23.
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Representative Results
Este protocolo descreve como medir o movimento de contração, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+ de CM-hiPSC. Um diagrama esquemático incluindo a digestão enzimática, a semeadura celular, a manutenção e a condução do ensaio funcional é mostrado na Figura 1. A formação da monocamada hiPSC-CM é necessária para a medição do movimento de contração (Figura 2B). Um traço representativo do movimento de contração-relaxamento dos CM-hiPS é mostrado na Figura 2C. O software analisador permite a análise de traços de movimento de contração-relaxamento de forma automatizada, detectando o início da contração, o pico de contração, o fim da contração, o pico de relaxamento e o fim do relaxamento usando a configuração padrão (Figura 2D). As velocidades dos picos de contração e relaxamento são utilizadas para avaliar as capacidades de contração e relaxamento dos CM-hiPSC. Além disso, distâncias de deformação de contração e relaxamento também podem ser obtidas.
O ensaio MEA é o registro extracelular de potenciais de ação, conhecidos como potenciais de campo. A medição bem-sucedida dos potenciais de campo requer cobertura total da monocamada hiPSC-CM em todos os eletrodos dentro de cada poço das placas MEA (Figura 3C). As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo devem refletir o potencial do campo cardíaco com características facilmente identificáveis, como mostra a Figura 3D-F. Os padrões de qualidade especificados são 1) a atividade basal deve mostrar um batimento espontâneo dentro de 20-90 batimentos por minuto, 2) a taxa de batimento deve estar dentro de 6 DPs calculados para a taxa de batimento basal em todos os poços, 3) o coeficiente de variação do período de batimento deve ser inferior a 5% e 4) a amplitude de despolarização deve ser superior a 0,3 mV, conforme publicado anteriormente22. A Figura 3E mostra traços representativos de potencial de campo de hiPSC-CMs. O software de navegação detecta e identifica batidas e FPD automaticamente. Após a análise, pode-se obter o período de batimento, a FPD e a amplitude do pico (Figura 3F). Especificamente, o período de batimento é determinado pelo intervalo pico-pico de despolarização, o FPD é determinado pelo intervalo entre o pico de despolarização e o pico de repolarização e a amplitude de pico é medida pela distância entre o pico positivo de despolarização e o pico negativo, como mostrado na Figura 3F.
A pinça de remendo de célula única é o padrão-ouro para avaliar as propriedades eletrofisiológicas dos CM-hiPSC (Figura 4B). Registros de patch-clamp de células inteiras no modo de pinçamento de corrente podem registrar os potenciais de ação espontânea de hiPSC-CMs únicos (Figura 4F). Após análise, vários parâmetros, incluindo a amplitude, o potencial diastólico máximo (MDP) e a duração do potencial de ação (DPA) a 30%, 50% e 90% de repolarização podem ser obtidos (Figura 4G).
Para imagens Ca2+, as mudanças de intensidade de fluorescência de hiPSC-CMs individuais ao longo do tempo podem ser registradas pelo software. Uma área representativa dos hiPSC-CMs carregados de Fura-2 é mostrada na Figura 5B. O uso de uma fonte de luz de comutação de comprimento de onda de altíssima velocidade permite a gravação de transientes Ca2+ de centenas de hiPSC-CMs por meio de varredura em modo de quadro. Após a análise por um programa baseado em planilha23, a relação F340/F380 ao longo do tempo para cada célula pode ser obtida. Em seguida, traços brutos de transientes de Ca2+ estimulados podem ser plotados (Figura 5C). Além disso, parâmetros como amplitude, Ca 2+ diastólica e tau de decaimento de Ca2+ podem ser obtidos (Figura 5D).
Figura 1. Diagrama esquemático geral do protocolo. No dia 0, digerir e semear hiPSC-CMs em placas de 96 poços revestidas com matriz de membrana basal/placas MEA de 48 poços/placas de 35 mm/câmaras celulares. Aguarde um período de recuperação de pelo menos 10 dias antes de realizar os ensaios funcionais usando um sistema de imagem de movimento celular, MEA, patch-clamp e sistema de imagem Ca2 +. Abreviaturas: MEA = matriz de microeletrodos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Medição do movimento de contração. (A) O sistema de imagem de movimento celular. (B) Uma região representativa da monocamada hiPSC-CM. Barra de escala: 20 μm. (C) Traços representativos de contração-relaxamento de hiPSC-CMs. (D) Diagrama esquemático de um traço de contração-relaxamento mostrando o início da contração, o pico da contração, o fim da contração, o pico do relaxamento e o fim do relaxamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Medição do potencial de campo. (A) Vistas superiores de (esquerda) uma placa MEA de 48 poços, (meio) um poço com 16 eletrodos e (direita) a área que uma matriz de membrana basal-gota precisa cobrir. Adicione água destilada suficiente ao reservatório de água para compensar a evaporação. (B) suspensão hiPSC-CM e a densidade desejada após o replating. (C) Uma região representativa da monocamada hiPSC-CM. (D) Gráficos de forma de onda contínua dos 16 eletrodos em um poço da placa MEA de 48 poços. (E) Traços de potencial de campo representativos de CM-hiPSC. (F) Diagrama esquemático de um traço de potencial de campo mostrando como os parâmetros foram analisados. Abreviação: FPD = duração potencial do campo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Medição do potencial de ação. (A) Revestimento de matriz de membrana basal e colocação de suspensão de hiPSC-CMs em placas de 35 mm. (B) Uma região representativa de CM-hiPSC únicos. Barra de escala: 20 μm. (C-E) Patch-clamp configuração do sistema. (F) Vestígios de potencial de ação representativa de CM-hiPSC. (G) Diagrama esquemático de um traço de potencial de ação mostrando como os parâmetros foram analisados. Abreviaturas: APD = duração do potencial de ação, MDP = potencial diastólico máximo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Medição de Ca2+ transitório. (A) O sistema de imagem Ca2 +. (B) Uma região representativa de CMs hiPSC únicos carregados de Fura-2. Barra de escala: 100 μm. (C) Traços transitórios representativos de Ca2+ de hiPSC-CMs. (D) Diagrama esquemático de um traço transitório Ca2+ mostrando como os parâmetros foram analisados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.
É essencial usar os hiPSC-CMs que estão em boas condições de batida, caso contrário, a relação sinal-ruído das leituras cairá drasticamente. Além disso, é desejável garantir a alta pureza dos CM-hiPSC antes das medições. A existência de não-cardiomiócitos poderia comprometer particularmente a precisão dos dados de medidas de movimento de contração e potencial de campo, ambas as quais requerem a formação de monocamada de CM-hiPSC. Além disso, a imaturidade dos CME-hiPSC continua sendo uma grande preocupação que dificulta a plena aplicação dos CM-hiPSC em diversas áreas28. Sabe-se que os CM-hiPSC são funcionalmente imaturos em múltiplos aspectos, incluindo morfologia, contratilidade, eletrofisiologia, manuseio de Ca 2+ e metabolismo29. Portanto, recomenda-se manter os CM-hiPSC na cultura pelo menos até o dia 30 antes de realizar ensaios funcionais. Alternativamente, várias estratégias que foram estabelecidas para melhorar a maturidade dos CM-hiPSC podem ser adotadas antes da realização dos ensaios funcionais30. Por exemplo, os CM-hiPSC cultivados em meios de maturação metabólica exibiram MDP altamente negativo de potenciais de ação e decaimento significativamente mais rápido de transientes de Ca2+ quando comparados com os CMs hiPSC cultivados em meios RPMI normais31. Finalmente, existem variações de lote para lote de hiPSC-CMs32. Assim, devem ser coletados dados sobre as CME-hiPSC geradas a partir de pelo menos três diferenciações independentes das mesmas linhas de iPSC.
O sistema de imagem de movimento celular fornece uma plataforma eficiente e de alto rendimento para medir o movimento de contração e relaxamento dos CMs hiPSC. No entanto, uma grande desvantagem é que ele não mede a força contrátil direta, mas sim a velocidade de contração e relaxamento. Além disso, as velocidades variam quando o número de hiPSC-CMs para formar uma monocamada é diferente. Portanto, é crucial semear precisamente 50.000 células em cada poço das placas de 96 poços.
A FPD medida pelo MEA tem sido usada como substituta para a duração do QT e, portanto, é amplamente utilizada na avaliação do prolongamento do QT induzido por drogas33. Semelhante à duração do QT, o FPD é dependente da taxa de superação. Portanto, a correção na taxa de batida é necessária para interpretar com precisão os dados do FPD. Neste protocolo, recomenda-se que a medição do MEA seja realizada pelo menos 10 dias após o plaqueamento. No entanto, às vezes é possível que o sinal potencial de campo ainda seja instável após 10 dias após o revestimento. Se isso acontecer, prolongue a cultura hiPSC-CM por mais 2-3 dias.
A técnica patch-clamp é uma ferramenta versátil para avaliar a eletrofisiologia de CMs hiPSC e testar canais iônicos. A principal desvantagem do patch-clamp convencional é sua propriedade de baixo rendimento, o que dificulta sua aplicação em estudos de alto rendimento. Além disso, requer uma longa curva de aprendizado e uma prática extensiva antes que alguém possa se tornar experiente nesta técnica. No entanto, a técnica convencional patch-clamp ainda é considerada o padrão-ouro para entender a eletrofisiologia dos CM-hiPSC. Se a DPA de hiPSC-CMs precisa ser avaliada de maneira de alto rendimento, sugere-se também iniciar com imagens ópticas do potencial de ação do hiPSC-CM usando o sensor acelerado de potenciais de ação 2 (ASAP2)21. Após a obtenção dos alvos primários, um potencial de ação convencional pode ser utilizado em estudos futuros para fenotipagem e validação mais precisas. Além disso, o patch clamp automatizado tem sido cada vez mais empregado em vários campos, especialmente canalopatia. Por exemplo, as correntes de canal iônico transportadas por múltiplas variantes de canais hERG e canais de sódio dependentes de tensão têm sido caracterizadas por grampo de remendo automatizado34,35,36,37. Além disso, o uso de grampo de patch automatizado em hiPSC-CMs foi estabelecido recentemente38,39. Para a execução de patch clamp automatizado, os leitores podem consultar protocolos publicados anteriormente40. Com as vantagens de ter um alto rendimento e a simplicidade no manuseio de máquinas, não há dúvida de que os grampos de remendo automatizados desempenharão papéis cada vez mais importantes na descoberta e no desenvolvimento de medicamentos.
O uso de um corante sensível ao Ca 2+ ratiométrico, o Fura-2, permite que a medição do Ca2+ diastólico de hiPSC-CMs seja muito menos afetada pelos fatores de viés experimental, como tempo de carregamento do corante, distribuição desigual do corante e fotobranqueamento. Isso é importante para recapitular a disfunção diastólica de determinadas doenças cardíacas. A principal limitação é que requer uma fonte de luz de excitação UV, que pode ser incompatível com a microscopia confocal.
Em resumo, apesar dos recentes progressos na avaliação da cardiotoxicidade na fase pré-clínica do desenvolvimento de medicamentos, a cardiotoxicidade continua a ser uma das principais preocupações de segurança. A crescente incorporação de hiPSC-CMs no processo padrão de avaliação de segurança pré-clínica tem o potencial de melhorar a precisão da previsão de toxicidade de compostos candidatos. Além disso, os CM-hiPSC específicos do paciente permitem a seleção personalizada de medicamentos cardíacos e a previsão de resposta adversa a medicamentos. O protocolo usando vários ensaios funcionais descritos aqui ajudará a expandir as aplicações de hiPSC-CMs na triagem de medicamentos e modelagem de doenças.
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Disclosures
J.C.W. é co-fundador da Greenstone Biosciences, mas não tem interesses concorrentes, pois o trabalho apresentado aqui é completamente independente. Os demais autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos a Blake Wu pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW), e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | D35-20-1.5-N | Patch clamp |
| 50x B27 supplements | Life Technologies | 17504-044 | hiPSC-CM culture medium |
| 6-well culture plate | E & K Scientific | EK-27160 | hiPSC-CM culture |
| 96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3603 | Contraction motion measurement |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | Enzymatic dissociation |
| Axion's Integrated Studio (AxIS) | Axion Biosystems | navigator software | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | BF 100-50-10, | Patch clamp |
| CaCl2 1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | Tyrode’s solution |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10228 | Cell counting |
| CytoView 48-well MEA plates | Axion Biosystems | M768-tMEA-48B | MEA |
| DMEM/F12 | Gibco/Life Technologies | 12634028 | Extracellular matrix medium |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | Intracellular pipette solution |
| EPC 10 USB patch clamp amplifier | Warner Instruments | 89-5000 | Patch clamp |
| Fura-2, AM, cell permeant | ThermoFisher Scientific | F1221 | Ca2+ transient measurement |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tyrode’s solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s solution |
| hiPSCs | Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank | ||
| KCl | Sigma-Aldrich | 529552 | Tyrode’s solution |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher Scientific | 10828-028 | hiPSC-CM seeding medium |
| KOH 8 M | Sigma-Aldrich | P4494 | Intracellular pipette solution |
| Lambda DG 4 | Sutter Instrument Company | Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source | |
| Luna-FL automated fluorescence cell counter | WISBIOMED | LB-L20001 | Cell counting |
| Maestro Pro MEA system | Axion Biosystems | MEA | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Extracellular matrix medium |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Intracellular pipette solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Tyrode’s solution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | Tyrode’s solution |
| NaOH 10 M | Sigma-Aldrich | 72068 | Tyrode’s solution |
| NIS Elements AR | |||
| Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) | ThermoFisher Scientific | P3000MP | Ca2+ transient measurement |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 11875-119 | hiPSC-CM culture medium |
| Sony SI8000 Cell Motion Imaging System | Sony Biotechnology | Contraction motion measurement | |
| Sutter Micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | Patch clamp |
| Trypan blue stain | Life Technologies | T10282 | Cell counting |
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