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Medicine

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.

Abstract

La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado. Por lo tanto, el uso de modelos preclínicos apropiados de evaluación de seguridad cardíaca es un paso crítico durante el desarrollo de fármacos. Actualmente, la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los estudios en animales. Sin embargo, los modelos animales están plagados de poca especificidad traslacional para los humanos debido a las diferencias específicas de la especie, particularmente en términos de características electrofisiológicas cardíacas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro invaluable para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Los hiPSC-CM se pueden obtener de individuos con diversos antecedentes genéticos y diversas afecciones enfermas, lo que los convierte en un sustituto ideal para evaluar individualmente la cardiotoxicidad inducida por fármacos. Por lo tanto, es necesario establecer metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de las hiPSC-CM. En este protocolo, detallamos varios ensayos funcionales que pueden evaluarse en hiPSC-CM, incluida la medición de contractilidad, potencial de campo, potencial de acción y manejo de calcio. En general, la incorporación de hiPSC-CM en la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca tiene el potencial de revolucionar el desarrollo de fármacos.

Introduction

El desarrollo de fármacos es un proceso largo y costoso. Un estudio de nuevos medicamentos terapéuticos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) entre 2009 y 2018 informó que el costo medio estimado de la investigación capitalizada y los ensayos clínicos fue de $ 985 millones por producto1. La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado2. En particular, la cardiotoxicidad es reportada entre múltiples clases de fármacos terapéuticos3. Por lo tanto, la evaluación de la seguridad cardíaca es un componente crucial durante el proceso de desarrollo del fármaco. El paradigma actual para la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los modelos animales. Sin embargo, las diferencias de especies con respecto al uso de modelos animales son cada vez más reconocidas como una causa primaria de predicciones inexactas para la cardiotoxicidad inducida por fármacos en pacientes humanos4. Por ejemplo, la morfología del potencial de acción cardíaca difiere sustancialmente entre humanos y ratones debido a las contribuciones de diferentes corrientes de repolarización5. Además, las isoformas diferenciales de miosina cardíaca y ARN circulares que pueden afectar la fisiología cardíaca han sido bien documentadas entre las especies 6,7. Para cerrar estas brechas, es imperativo establecer un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca.

La innovadora invención de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha generado plataformas sin precedentes de detección de fármacos y modelado de enfermedades. Durante la última década, los métodos para generar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) sehan establecido bien 8,9. Los hiPSC-CM han atraído un gran interés en sus aplicaciones potenciales en el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y la medicina de precisión. Por ejemplo, los hiPSC-CM se han utilizado para modelar los fenotipos patológicos de las enfermedades cardíacas causadas por la herencia genética, como el síndrome de QT largo10, la miocardiopatía hipertrófica 11,12 y la miocardiopatía dilatada13,14,15. En consecuencia, se han identificado vías de señalización clave implicadas en la patogénesis de las enfermedades cardíacas, que pueden arrojar luz sobre posibles estrategias terapéuticas para un tratamiento efectivo. Además, los hiPSC-CM se han utilizado para detectar cardiotoxicidad inducida por fármacos asociada con agentes anticancerosos, incluyendo doxorrubicina, trastuzumab e inhibidores de la tirosina cinasa16,17,18; Se están investigando estrategias para mitigar la cardiotoxicidad resultante. Finalmente, la información genética retenida en los hiPSC-CMs permite el tamizaje y la predicción de la cardiotoxicidad inducida por fármacos tanto a nivel individual como poblacional19,20. En conjunto, los hiPSC-CM han demostrado ser una herramienta invaluable para la predicción personalizada de la seguridad cardíaca.

El objetivo general de este protocolo es establecer metodologías para investigar de manera integral y eficiente las características funcionales de las hiPSC-CM, que son de gran importancia en la aplicación de hiPSC-CM hacia el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por medicamentos y la medicina de precisión. Aquí, detallamos una serie de ensayos funcionales para evaluar las propiedades funcionales de los hiPSC-CM, incluida la medición de la contractilidad, el potencial de campo, el potencial de acción y el manejo del calcio (Ca2+) (Figura 1).

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Protocol

1. Preparación de medios y soluciones

  1. Prepare el medio de mantenimiento hiPSC-CM mezclando un frasco de 10 ml de suplemento 50x B27 y 500 ml de medio RPMI 1640. Conservar el medio a 4 °C y utilizarlo en el plazo de un mes. Equilibre el medio a la temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
  2. Preparar el medio de siembra hiPSC-CM mezclando 20 ml de reemplazo sérico y 180 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM (dilución al 10%, v/v). Si bien se prefiere el medio de siembra recién preparado, se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Equilibre el medio a RT antes de usarlo.
  3. Preparar la solución de recubrimiento de matriz extracelular descongelando un frasco (10 ml) de matriz de membrana basal a 4 °C durante la noche y alícuota 500 μL de matriz de membrana basal en tubos estériles de 1,5 ml. Conservar a -20 °C para su uso posterior. Mezcle 500 μL de matriz de membrana basal y 100 ml de medio DMEM/F12 helado (dilución 1:200, v/v) para hacer una solución de recubrimiento de matriz de membrana basal.
  4. Prepare 50 ml de solución de Tyrode que contenga 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucosa y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH. Prepare la solución fresca de Tyrode el día del experimento.
  5. Preparar 50 ml de solución de pipeta intracelular que contenga 120 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.2 con KOH. Alícuota la solución de pipeta intracelular en tubos estériles de 5 ml y almacénela a -20 °C. El día del experimento, agregue MgATP a la solución para lograr una concentración final de 3 mM.
  6. Preparar 1 ml de solución de carga de Fura-2 AM que contenga 2 μM de Fura-2 AM y 0,1% de Pluronic F-127. Prepare una solución de carga fresca el día del experimento y protéjala de la luz.

2. Medición del movimiento de contracción hiPSC-CM

  1. Prepare placas recubiertas de matriz de membrana basal agregando 100 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular a cada pocillo de placas de 96 pocillos. Incubar las placas de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
  2. Disociación enzimática de hiPSC-CMs
    1. Solicite hiPSCs al Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generar hiPSC-CMs según las publicaciones anteriores 8,9. Observe los hiPSC-CM cultivados en placas de seis pocillos bajo un microscopio con un aumento de 10x.
      NOTA: No disocie las células cuando todavía son proliferativas. De lo contrario, las células crecerán demasiado en los pocillos después del rechapado y conducirán a resultados inexactos de los ensayos funcionales. Por lo general, los hiPSC-CM detienen la proliferación en los días 18-23.
    2. Asegúrese de que los hiPSC-CM laten con fuerza y tengan una pureza superior al 95%. Evaluar la pureza mediante inmunotinción contra troponina T cardíaca, un marcador específico de cardiomiocitos 8,9.
    3. Aspirar el medio de mantenimiento y lavar las células con 1x DPBS dos veces. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular a cada pocillo de las placas de seis pocillos e incubar durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: La duración de la incubación debe ser monitoreada regularmente. Asegúrese de no digerir demasiado las células, ya que reducirá la viabilidad celular.
    4. Pipete suavemente hiPSC-CMs hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una pipeta de 5 ml para generar una suspensión de una sola celda. Agregue un volumen igual de medio de siembra hiPSC-CM para neutralizar la solución de desprendimiento celular.
    5. Centrifugar hiPSC-CMs a 300 x g durante 3 min a RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1-2 mL de medio de siembra hiPSC-CM.
    6. Cuantificar la densidad celular y la viabilidad utilizando un método de exclusión de azul de tripano. Brevemente, mezcle 10 μL de suspensión celular con un volumen igual de azul de tripano, transfiéralo a un portaobjetos de conteo de células y luego cuente con un contador de celdas, como se describió anteriormente21.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las placas de 96 pocillos.
    2. Sembrar 50.000 células por pocillo en 100 μL de medio de siembra hiPSC-CM y colocar las placas de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
    3. Reemplace el medio de siembra hiPSC-CM con 100 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días hasta la grabación.
  4. Adquisición de datos
    1. Mida el movimiento de contracción de hiPSC-CM al menos 10 días después de la colocación (recomendado).
    2. Encienda el controlador de temperatura y ajuste 37 °C como temperatura preferida. Encienda el microscopio, la cámara y el suministro deCO2 .
    3. Llene la camisa de agua del soporte de la placa con una cantidad adecuada de agua desionizada estéril (Figura 2A). Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa y permita que las celdas se aclimaten durante al menos 5 minutos.
    4. Abra el software de visualización, ajuste la velocidad de fotogramas de la cámara a 75 fotogramas por segundo (fps) y la resolución de vídeo/imagen a 1024 × 1024 píxeles. Aplique las funciones de enfoque automático y brillo automático. Grabe videos e imágenes de hiPSC-CMs.
      NOTA: Evite la vibración de la mesa del microscopio durante la grabación.
    5. Abra el software del analizador para el análisis automático.

3. Medición del potencial de campo hiPSC-CM

  1. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal
    1. Coloque cuidadosamente una gota de 8 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos (MEA) de 48 pocillos. Consulte la Figura 3A para conocer el área de electrodo adecuada para la colocación de gotas. Este paso es crítico para mantener la monocapa hiPSC-CM concentrada en los electrodos. Evite tocar los electrodos en cualquier circunstancia.
    2. Agregue 3 ml de agua desionizada estéril al área que rodea los pozos (Figura 3A) de las placas MEA de 48 pocillos para evitar la evaporación de la solución de recubrimiento. Incubar placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante 45-60 min.
      NOTA: No incubar durante demasiado tiempo para evitar que la matriz de la membrana basal se seque.
  2. Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la mayor parte del medio de la matriz extracelular de la superficie del pozo sin tocar los electrodos utilizando una punta de pipeta de 200 μL dentro de la misma fila o columna.
    2. Sembrar 50.000 células por pocillo en una gota de 8 μL de medio de siembra hiPSC-CM sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de la misma fila o columna.
    3. Repita los dos últimos pasos hasta que todos los pocillos hayan sido chapados con celdas. Verifique bajo el microscopio que todos los pozos tengan la suspensión hiPSC-CM. Para la densidad deseada, consulte la figura 3B.
      NOTA: La unión de hiPSC-CM se verá comprometida si la matriz de la membrana basal está completamente seca, lo que hace que la unión celular sea subóptima.
    4. Incubar las placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante 60 min.
    5. Agregue lenta y suavemente 150 μL de medio de siembra hiPSC-CM a cada pocillo de las placas MEA de 48 pocillos. Para añadir medio sin dispersar hiPSC-CM previamente sembrados, sostenga la placa en un ángulo de 45°, apoye la punta de la pipeta contra la pared de cada pocillo y suelte el medio lentamente.
      NOTA: Agregar medio demasiado rápido o con alta presión desalojará los cardiomiocitos adheridos. Evite el contacto directo con la suspensión de caída hiPSC-CM.
    6. Incubar las placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
    7. Refresque el medio de siembra hiPSC-CM con 300 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.
  4. Adquisición de datos
    1. Realice la medición de MEA al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). En el día 10 después del recubrimiento, verifique la densidad de la monocapa hiPSC-CM de batido espontáneo bajo un microscopio con un aumento de 10x, que debe ser como se muestra en la Figura 3C.
    2. Coloque la placa MEA de 48 pocillos en el instrumento de grabación. La pantalla táctil permite observar el estado de temperatura (37 °C) y CO2 (5%).
    3. Abra el software del navegador. En la ventana de configuración experimental, seleccione Configuración cardíaca en tiempo real y Registros de potencial de campo. Aplicar configuraciones de batido espontáneas o de ritmo.
    4. En los parámetros de detección de latidos, establezca el umbral de detección en 300 μV, el período de latido mínimo en 250 ms y el período máximo de latido en 5 s. Seleccione Regresión polinómica para el cálculo de la duración potencial de campo (FPD).
    5. Compruebe si la señal de actividad eléctrica de referencia está madura y estable.
      NOTA: Las formas de onda maduras registradas por cada electrodo de la placa MEA de pocillos múltiples deben reflejar el potencial del campo cardíaco con características fácilmente identificables que coincidan con el pico de despolarización cardíaca y la fase de repolarización, como se muestra en la Figura 3D-F.
    6. Adquirir las actividades cardíacas basales durante 1-3 min. Si se necesita tratamiento farmacológico, agregue compuestos a los pocillos después del registro inicial. Coloque la placa en una incubadora durante al menos 30 minutos antes de la siguiente grabación.

4. Medición del potencial de acción de hiPSC-CM

  1. Prepare platos recubiertos con matriz de membrana basal colocando 500 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular en la parte inferior de vidrio de platos de 35 mm (Figura 4A). Incubar los platos de 35 mm en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
  2. Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las placas de 35 mm. Sembrar 50.000 células por pocillo en 500 μL de medio de siembra hiPSC-CM en la parte inferior de vidrio de platos de 35 mm.
    2. Incubar los platos de 35 mm en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche. Retire el medio de siembra hiPSC-CM y agregue 2 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM a los platos de 35 mm.
      NOTA: Se recomienda colocar una punta no filtrada de 200 μL sobre la pipeta de aspiración de 2 ml para eliminar el medio gastado y evitar tocar las células.
    3. Cambie el medio de cultivo hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.
  4. Adquisición de datos
    1. Realice la medición del potencial de acción al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). Prepare la solución fresca de Tyrode como se describe en el paso 1.4. Descongelar una alícuota de solución de pipeta intracelular y añadir MgATP a una concentración final de 3 mM.
    2. Extraiga las micropipetas de los capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de micropipetas.
      NOTA: Se prefiere una resistencia de 2-5 MΩ de las micropipetas.
    3. Reemplace el medio de mantenimiento hiPSC-CM con la solución de Tyrode y permita que las células se aclimaten a la solución de Tyrode durante 15 minutos (figura 4C). Inserte los sensores de temperatura en la cámara, coloque el plato de 35 mm en la cámara como se muestra en la Figura 4C y ajuste la temperatura a 37 °C (Figura 4D).
    4. Llene las micropipetas con solución intracelular e insértelas en el soporte conectado al cabezal del amplificador de abrazadera de conexión (Figura 4E). Abra el software de estimulación/adquisición, cargue el protocolo de grabación del potencial de acción y seleccione la configuración de pinza de voltaje.
    5. Inserte la micropipeta en la solución de baño, seleccione las hiPSC-CM individuales adecuadas y ajuste y baje la posición de la micropipeta junto a la célula seleccionada utilizando un micromanipulador. Cuando se inserte la punta de la pipeta en la solución de baño, compruebe la resistencia de la pipeta que se puede observar en el monitor del osciloscopio.
    6. Coloque la pipeta cerca de la celda y los pulsos de corriente disminuirán ligeramente para reflejar la creciente resistencia del sellado. Aplique una succión suave con presión negativa para aumentar la resistencia, que formará un gigasellado. Aplique la función Sellado .
    7. Aplique succión adicional para romper la membrana y obtener una configuración de grabación de celda completa. Una vez que la porción de membrana dentro del área de la pipeta se rompe por succión, la solución interna está en equilibrio con el citoplasma celular. En este punto, cambie del modo de abrazadera de voltaje (abrazadera en V) al modo de abrazadera de corriente o sin inyección de corriente (abrazadera C) utilizando el cuadro de diálogo del amplificador. Pulse el botón Grabar para generar y guardar los archivos de grabación de acción potencial.
      NOTA: El cambio de modo proporciona un registro continuo de los potenciales de acción espontánea de los hiPSC-CM a través de un protocolo de grabación sin disparador ni estimulación, que se puede monitorear en la salida V-mon del amplificador patch-clamp.

5. Medición del transitorio hiPSC-CM Ca2+

  1. Consulte el protocolo anterior para preparar cámaras celulares personalizadas para imágenes de Ca2+ 21. Para la preparación de la cámara celular recubierta de matriz de la membrana basal, coloque 200 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular en las cámaras celulares. Incubar las cámaras celulares en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
  2. Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las cámaras celulares. Sembrar 20.000 células por pocillo en 200 μL de medio de siembra hiPSC-CM.
    2. Reemplace el medio de siembra hiPSC-CM con 200 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.
  4. Adquisición de datos
    1. Realice la medición transitoria de Ca2+ al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). Prepare la solución fresca de Tyrode como se describe en el paso 1.4. Prepare una solución de carga Fura-2 AM fresca como se describe en el paso 1.6.
    2. Aspirar el medio de mantenimiento hiPSC-CM y lavar dos veces con la solución de Tyrode. Aplicar 100 μL de solución de carga Fura-2 AM e incubar durante 10 min a RT.
    3. Reemplace la solución de carga Fura-2 AM con la solución de Tyrode y espere al menos 5 minutos para la desesterificación completa de Fura-2 AM.
    4. Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite 40x (0.95 NA). Coloque la cámara celular en el adaptador de etapa del microscopio (Figura 5A).
    5. Instale los cables del controlador de temperatura en la cámara de baño y configúrela a 37 °C. Instale los electrodos de estimulación del campo eléctrico y ajuste los pulsos a 0,5 Hz con una duración de 20 ms.
    6. Encienda la fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad y configúrela en el modo de conmutación rápida de 340 nm y 380 nm de acuerdo con las instrucciones del instrumento.
    7. Aplique un tiempo de exposición de 20 ms para ambas longitudes de onda y un tiempo de grabación de 20 s en el software. Grabe el video reflejando los cambios en tiempo real de Ca2+ transitorio en hiPSC-CMs. Exporte los datos a una hoja de cálculo y analice los datos como se describió anteriormente23.

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Representative Results

Este protocolo describe cómo medir el movimiento de contracción, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+ de hiPSC-CM. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático que incluye la digestión enzimática, la siembra celular, el mantenimiento y la conducción funcional del ensayo. La formación de la monocapa hiPSC-CM es necesaria para la medición del movimiento de contracción (Figura 2B). Un rastro representativo del movimiento de contracción-relajación de hiPSC-CMs se muestra en la Figura 2C. El software analizador permite el análisis de trazas de movimiento de contracción y relajación de forma automatizada mediante la detección del inicio de la contracción, el pico de contracción, el final de la contracción, el pico de relajación y el final de relajación utilizando la configuración predeterminada (Figura 2D). Las velocidades de los picos de contracción y relajación se utilizan para evaluar las capacidades de contracción y relajación de las hiPSC-CM. Además, también se pueden obtener distancias de contracción y deformación de relajación.

El ensayo MEA es el registro extracelular de potenciales de acción, conocidos como potenciales de campo. La medición exitosa de los potenciales de campo requiere una cobertura completa de la monocapa hiPSC-CM en todos los electrodos dentro de cada pocillo de las placas MEA (Figura 3C). Las formas de onda maduras registradas por cada electrodo deben reflejar el potencial del campo cardíaco con características fácilmente identificables, como se muestra en la Figura 3D-F. Los estándares de calidad especificados son 1) la actividad basal debe mostrar un latido espontáneo dentro de 20-90 latidos por minuto, 2) la tasa de latido debe estar dentro de 6 SD calculada para la tasa de latido de referencia en todos los pocillos, 3) el coeficiente de variación del período de latido debe ser inferior al 5%, y 4) la amplitud de despolarización debe ser superior a 0.3 mV, como se publicó anteriormente22. La Figura 3E muestra trazas de potencial de campo representativas de hiPSC-CMs. El software del navegador detecta e identifica ritmos y FPD automáticamente. Después del análisis, se puede obtener el período de latido, el FPD y la amplitud del pico (Figura 3F). Específicamente, el período de latido está determinado por el intervalo de pico a pico de despolarización, FPD está determinado por el intervalo entre el pico de despolarización y el pico de repolarización, y la amplitud del pico se mide por la distancia entre el pico positivo de despolarización y el pico negativo, como se muestra en la Figura 3F.

La pinza de parche unicelular es el estándar de oro para evaluar las propiedades electrofisiológicas de los hiPSC-CM (Figura 4B). Las grabaciones de pinzas de parche de células enteras en modo de sujeción de corriente pueden registrar los potenciales de acción espontánea de hiPSC-CM individuales (Figura 4F). Después del análisis, se pueden obtener varios parámetros, incluida la amplitud, el potencial diastólico máximo (MDP) y la duración del potencial de acción (APD) al 30%, 50% y 90% de repolarización (Figura 4G).

Para las imágenes de Ca2+, el software puede registrar los cambios de intensidad de fluorescencia de los hiPSC-CM individuales a lo largo del tiempo. En la Figura 5B se muestra un área representativa de los hiPSC-CM cargados con Fura-2. El uso de una fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad permite la grabación de transitorios de Ca2+ de cientos de hiPSC-CM a través del escaneo en modo de cuadro. Después del análisis por un programa basado en hojas de cálculo23, se puede obtener la relación F340/F380 a lo largo del tiempo para cada celda. Luego, se pueden trazar rastros brutos de transitorios estimulados de Ca2+ (Figura 5C). Además, se pueden obtener parámetros como la amplitud, la diastólica Ca 2+ y el Ca2+ tau de decaimiento (Figura 5D).

Figure 1
Figura 1. Diagrama esquemático general del protocolo. El día 0, digerir y sembrar hiPSC-CMs en placas de 96 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal/placas MEA de 48 pocillos/placas de 35 mm/cámaras celulares. Permita un período de recuperación de al menos 10 días antes de realizar los ensayos funcionales utilizando un sistema de imágenes de movimiento celular, MEA, patch-clamp y sistema de imágenes Ca2+ . Abreviaturas: MEA = matriz de microelectrodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Medición del movimiento de contracción. (A) El sistema de imágenes de movimiento celular. (B) Una región representativa de la monocapa hiPSC-CM. Barra de escala: 20 μm. (C) Trazas representativas de contracción-relajación de hiPSC-CMs. (D) Diagrama esquemático de una traza de contracción-relajación que muestra el inicio de la contracción, el pico de contracción, el extremo de la contracción, el pico de relajación y el final de la relajación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Medición del potencial de campo. (A) Vistas superiores de (izquierda) una placa MEA de 48 pocillos, (medio) un pozo con 16 electrodos, y (derecha) el área que una gota de matriz de membrana basal necesita cubrir. Agregue suficiente agua destilada al depósito de agua para compensar la evaporación. (B) suspensión hiPSC-CM y la densidad deseada después del rechapado. (C) Una región representativa de la monocapa hiPSC-CM. (D) Gráficos de forma de onda continua de los 16 electrodos en un pocillo de la placa MEA de 48 pocillos. (E) Trazas potenciales representativas de campo de hiPSC-CMs. (F) Diagrama esquemático de una traza de potencial de campo que muestra cómo se analizaron los parámetros. Abreviatura: FPD = duración potencial del campo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Medición del potencial de acción. (A) Recubrimiento de matriz de membrana basal y colocación de suspensión hiPSC-CMs en platos de 35 mm. (B) Una región representativa de un solo hiPSC-CMs. Barra de escala: 20 μm. (C-E) Configuración del sistema de patch-clamp. (F) Trazas potenciales de acción representativa de hiPSC-CMs. (G) Diagrama esquemático de una traza de potencial de acción que muestra cómo se analizaron los parámetros. Abreviaturas: APD = duración del potencial de acción, MDP = potencial diastólico máximo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Medición de transitorio Ca2+ . (A) El sistema de imágenes Ca2+ . (B) Una región representativa de HiPSC-CM individuales cargados con Fura-2. Barra de escala: 100 μm. (C) Trazas transitorias representativas de Ca2+ de hiPSC-CMs. (D) Diagrama esquemático de una traza transitoria de Ca2+ que muestra cómo se analizaron los parámetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La tecnología iPSC humana se ha convertido en una plataforma poderosa para el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Aquí, describimos un protocolo detallado para medir la contractilidad de hiPSC-CM, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+. Este protocolo proporciona una caracterización integral de la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CM. Estos ensayos funcionales han sido aplicados en múltiples publicaciones de nuestro grupo 12,13,18,24,25,26,27.

Es esencial utilizar los hiPSC-CM que están en buenas condiciones de batido, de lo contrario, la relación señal-ruido de las lecturas disminuirá drásticamente. Además, es deseable garantizar la alta pureza de los hiPSC-CM antes de las mediciones. La existencia de no cardiomiocitos podría comprometer particularmente la precisión de los datos del movimiento de contracción y las mediciones de potencial de campo, las cuales requieren la formación de monocapa hiPSC-CM. Además, la inmadurez de los MC-hiPSC sigue siendo una preocupación importante que dificulta la plena aplicación de los MC-hiPSC en diversos campos28. Se sabe que los hiPSC-CM son funcionalmente inmaduros en múltiples aspectos, incluyendo morfología, contractilidad, electrofisiología, manejo de Ca 2+ y metabolismo29. Por lo tanto, se recomienda mantener los hiPSC-CM en el cultivo al menos hasta el día 30 antes de realizar ensayos funcionales. Alternativamente, se pueden adoptar varias estrategias que se han establecido para mejorar la madurez de los hiPSC-CM antes de realizar los ensayos funcionales30. Por ejemplo, los hiPSC-CMs cultivados en medios de maduración metabólica exhibieron MDP altamente negativo de potenciales de acción y una desintegración significativamente más rápida de los transitorios de Ca2+ en comparación con los hiPSC-CMs cultivados en medios RPMI normales31. Finalmente, hay variaciones de lote a lote de hiPSC-CMs32. Por lo tanto, se deben recopilar datos sobre hiPSC-CM generados a partir de al menos tres diferenciaciones independientes de las mismas líneas iPSC.

El sistema de imágenes de movimiento celular proporciona un alto rendimiento y una plataforma eficiente para medir el movimiento de contracción y relajación de los hiPSC-CM. Sin embargo, una desventaja importante es que no mide la fuerza contráctil directa, sino más bien la velocidad de contracción y relajación. Además, las velocidades varían cuando el número de hiPSC-CMs para formar una monocapa es diferente. Por lo tanto, es crucial sembrar exactamente 50,000 células en cada pocillo de las placas de 96 pocillos.

La FPD medida por MEA se ha utilizado como sustituto de la duración del intervalo QT y, por lo tanto, se utiliza ampliamente para evaluar la prolongación del intervalo QT inducida por fármacos33. Similar a la duración del QT, el FPD está superando a la tasa dependiente. Por lo tanto, la corrección en la tasa de batido es necesaria para interpretar con precisión los datos de FPD. En este protocolo, se recomienda que la medición de MEA se realice al menos 10 días después del recubrimiento. Sin embargo, a veces es posible que la señal de potencial de campo siga siendo inestable después de 10 días después del recubrimiento. Si esto sucede, prolongue el cultivo de hiPSC-CM durante otros 2-3 días.

La técnica patch-clamp es una herramienta versátil para evaluar la electrofisiología de hiPSC-CMs y ensayar canales iónicos. La principal desventaja de la abrazadera de parche convencional es su propiedad de bajo rendimiento, lo que dificulta su aplicación en estudios de alto rendimiento. Además, requiere una larga curva de aprendizaje y una amplia práctica antes de que uno pueda adquirir experiencia en esta técnica. Sin embargo, la técnica convencional de patch-clamp todavía se considera el estándar de oro para comprender la electrofisiología de hiPSC-CMs. Si el APD de hiPSC-CMs necesita ser evaluado de una manera de alto rendimiento, también se sugiere comenzar con imágenes ópticas del potencial de acción de hiPSC-CM utilizando el sensor acelerado de potenciales de acción 2 (ASAP2)21. Después de obtener los objetivos primarios, se puede utilizar un potencial de acción convencional en estudios adicionales para un fenotipado y validación más precisos. Además, la pinza de parche automatizada se ha empleado cada vez más en diversos campos, especialmente en la canalopatía. Por ejemplo, las corrientes del canal iónico transportadas por múltiples variantes de canales hERG y canales de sodio dependientes de voltaje se han caracterizado por la abrazadera de parche automatizada34,35,36,37. Además, recientemente se ha establecido el uso de abrazaderas de parche automatizadas en hiPSC-CMs38,39. Para la ejecución de la pinza de parche automatizada, los lectores pueden consultar los protocolos publicados anteriormente40. Con las ventajas de ser de alto rendimiento y la simplicidad en el manejo de la máquina, no hay duda de que las abrazaderas de parche automatizadas desempeñarán un papel cada vez más importante en el descubrimiento y desarrollo de fármacos.

El uso de un colorante sensible al Ca 2+ ratiométrico, Fura-2, permite que la medición del Ca2+ diastólico de los hiPSC-CM se vea mucho menos afectada por los factores de sesgo experimental, como el tiempo de carga del tinte, la distribución desigual del tinte y el fotoblanqueo. Esto es importante para recapitular la disfunción diastólica de enfermedades cardíacas particulares. La principal limitación es que requiere una fuente de luz de excitación UV, que puede ser incompatible con la microscopía confocal.

En resumen, a pesar del progreso reciente en la evaluación de la cardiotoxicidad en la fase preclínica del desarrollo de fármacos, la cardiotoxicidad sigue siendo una de las principales preocupaciones de seguridad. La creciente incorporación de hiPSC-CM en el proceso estándar de evaluación preclínica de seguridad tiene el potencial de mejorar la precisión de la predicción de toxicidad de los compuestos candidatos. Además, los hiPSC-CM específicos del paciente permiten la selección personalizada de fármacos cardíacos y la predicción de respuestas adversas a los fármacos. El protocolo que utiliza varios ensayos funcionales descritos aquí ayudará a ampliar las aplicaciones de hiPSC-CM en la detección de fármacos y el modelado de enfermedades.

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Disclosures

J.C.W. es cofundador de Greenstone Biosciences, pero no tiene intereses en competencia, ya que el trabajo presentado aquí es completamente independiente. Los otros autores declaran que no hay intereses en conflicto.

Acknowledgments

Agradecemos a Blake Wu por corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 y NASA NNX16A069A (JCW), y AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

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References

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Medicina Número 186
Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos
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