Summary
Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide GABAerge neuronen gegenereerd door neuronale programmering zou een potentiële behandelingsbenadering kunnen zijn voor neurologische ontwikkelingsstoornissen. Dit protocol beschrijft de generatie en transplantatie van menselijke stamcel-afgeleide GABAerge neuronale voorlopers in de hersenen van neonatale muizen, waardoor langdurig onderzoek van geënte neuronen en evaluatie van hun therapeutisch potentieel mogelijk is.
Abstract
Een verminderd aantal of disfunctie van remmende interneuronen is een veel voorkomende bijdrage aan neurologische ontwikkelingsstoornissen. Daarom is celtherapie met behulp van interneuronen om de effecten van veranderde neuronale circuits te vervangen of te verzachten een aantrekkelijke therapeutische weg. Hiertoe is meer kennis nodig over hoe menselijke stamcel-afgeleide GABAerge interneuron-achtige cellen (hdIN's) in de loop van de tijd rijpen, integreren en functioneren in het gastheercircuit. Van bijzonder belang bij neurologische ontwikkelingsstoornissen is een beter begrip van de vraag of deze processen in getransplanteerde cellen worden beïnvloed door een evoluerend en volwassen wordend gastheerbrein. Het huidige protocol beschrijft een snelle en zeer efficiënte generatie van hdIN's uit menselijke embryonale stamcellen op basis van de transgene expressie van de transcriptiefactoren Ascl1 en Dlx2. Deze neuronale voorlopers worden eenzijdig, na 7 dagen in vitro, getransplanteerd naar de hippocampus van neonatale 2 dagen oude muizen. De getransplanteerde neuronen verspreiden zich in de ipsi- en contralaterale hippocampus van een muismodel van corticale dysplasie-focale epilepsiesyndroom en overleven tot 9 maanden na transplantatie. Deze aanpak maakt het mogelijk om de cellulaire identiteit, integratie, functionaliteit en het therapeutisch potentieel van getransplanteerde interneuronen gedurende een langere tijd te onderzoeken bij het ontwikkelen van gezonde en zieke hersenen.
Introduction
De oprichting, rijping en verfijning van neuronale netwerken vindt plaats tijdens de perinatale en vroege postnatale periode en vertegenwoordigt een cruciale tijdvensters voor de ontwikkeling van de hersenen1. Van een uitbundigheid van connectiviteit na de geboorte evolueren de hersenen naar een fijnafstemming van verbindingen die zich uitstrekken tot de adolescentie2. Bijgevolg bepalen veranderingen in genen die tijdens deze perioden tot expressie komen, evenals externe factoren of beledigingen, de aanleg van een individu voor meerdere neurologische ontwikkelingsstoornissen. Stoornissen in cognitie en motorische functie ontvouwen zich in de loop van de tijd en farmacologische behandelingen zijn beperkt, de meerderheid gericht op symptomen met het risico op ernstige bijwerkingen.
Disfunctie in gamma-aminoboterzuur (GABA) ergische remming is aangetoond dat het een belangrijke bijdrage levert aan de onderliggende oorzaak van verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen3, zoals fragiele X-syndroom, Angelman-syndroom, epilepsie, schizofrenie en autisme. GABA is de belangrijkste remmende zender van het centrale zenuwstelsel en is instrumenteel voor het handhaven van exciterende / remmende (E / I) balans, de synchronisatie van neuronale vuren en berekening. GABAerge interneuronen zijn een heterogene populatie van neuronen, met toenemende functionele complexiteit in complexere hersengebieden4 en met evolutie 5,6. Gezien de beperkte endogene regeneratieve capaciteit van het menselijk brein en de implicatie van interneurondisfunctie bij verschillende neurologische aandoeningen, kan de transplantatie van GABAerge interneuronen een veelbelovende therapeutische weg zijn om te verkennen. Langs deze lijn lijken menselijke stamcel-afgeleide GABAerge interneuron-achtige cellen (hdIN's) de meest translationele en levensvatbare bron voor dit doel te zijn in vergelijking met knaagdier allogene neuronale precursoren of andere bronnen die elders worden gebruikt7. Protocollen voor het genereren van GABAerge neuronen uit verschillende celbronnen zijn beschikbaar 8,9,10,11,12,13, maar er is meer kennis vereist over hoe hdIN's rijpen, integreren en functioneren in de loop van de tijd in een zich ontwikkelend pathologisch brein. Verschillende studies hebben veranderingen geïdentificeerd in genen die actief zijn tijdens corticale patronen, het vaststellen van neuronale connectiviteit14 en het afstemmen van fysiologische E / I-balans15. Neonatale transplantatie van hdIN's in muismodellen met bijbehorende genetische verstoringen stelt ons in staat om het samenspel tussen gastheer en transplantaat te volgen, wat kennis is die nodig is om potentiële therapeutische strategieën te bepalen.
Immunomodulatie wordt vaak en met succes gebruikt bij xenotransplantaties om te voorkomen dat een immuunrespons en afstoting van de gastheer wordt geactiveerd16. De toediening van immunosuppressieve geneesmiddelen, zoals ciclosporine A, veroorzaakt echter niertoxiciteit na chronische toediening, is arbeidsintensief vanwege de noodzaak van dagelijkse intraperitoneale injecties om stabiele systemische concentraties te bereiken, waardoor dierlijke stress17 ontstaat, en heeft off-target effecten die kunnen interageren met pathologie18. Bovendien is aangetoond dat het compromitteren van het immuunsysteem gedragsfenotypen19 verandert, met veranderingen in de overeenkomstige neuroanatomische regio's20. Transplantatie in de eerste levensweek heeft aangetoond dat het aanpassing aan getransplanteerde cellen mogelijk maakt21,22, terwijl anderen initiële overleving hebben gemeld, gevolgd door afstoting van de grafts binnen de eerste postnatale maand23,24.
Dit protocol beschrijft procedures van hdIN-generatie tot celtransplantatie bij neonatale muizen, wat resulteert in overleving op lange termijn van het transplantaat en het onderzoek mogelijk maakt naar de neuronale specificiteit, synaptische integratie, functie en therapeutisch potentieel van getransplanteerde menselijke interneuronen tijdens fysiologische en pathologische ontwikkeling.
Protocol
Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Malmö /Lund Animal Research Ethics Board, ethische vergunning nummer 12548-19, en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van het Zweedse Agentschap voor Dierenwelzijn en de EU-richtlijn 2010/63/EU voor dierproeven. C57BL6/J en Contactin-associated protein-like 2 (Cntnap2) knock-out (KO) muizen, zowel mannetjes als vrouwtjes, werden gebruikt op postnatale dag (P) 2 voor de huidige studie. Er werd gebruik gemaakt van menselijke embryonale stamcellen (hESCs). De dieren en stamcellen werden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel).
1. Generatie van de hdIN-precursoren
OPMERKING: Alle stappen in deze sectie worden uitgevoerd in een celkweekkap. De hESCs werden als feedervrije cellen op gecoate platen onderhouden met behulp van een stamcelkweekmedium en gepasseerd als kolonies.
- Voorwaartse programmering van de hESCs naar hdIN-precursoren uitvoeren (figuur 1).
OPMERKING: De forward programming-aanpak is gebaseerd op de procedure beschreven in Gonzalez-Ramos et al.8 en Yang et al.9.- Transduceer de hESCs met lentivirale vectoren die het Tet-On-systeem bevatten in een vers stamcelkweekmedium dat 10 μM ROCK-remmer (RI) bevat (zie Materiaaltabel). Bewaren bij 37 °C in de incubator.
- Verander het medium in een vers stamcelkweekmedium 16 uur na transductie en onderhoud de getransduceerde cellen op dezelfde manier als de niet-getransduceerde hESCs.
- Wanneer confluent, maak de hESCs los als afzonderlijke cellen met behulp van een celloslatingsoplossing (zie Materiaaltabel) en plaats ze in gecoate 6-well platen met een dichtheid van 3 x 105 cellen / put in stamcelkweekmedium met 10 μM RI op dag in vitro (DIV) −1.
- Vervang bij 1 DIV het kweekmedium door een N2-medium met 2 g/l doxycycline (DOX, zie materiaaltabel).
OPMERKING: DOX wordt gebruikt om transgene expressie van Ascl1 en Dlx29 te induceren, van 1 DIV tot 7 DIV, en gaat vervolgens in vivo verder door toevoeging aan het drinkwater25. - Bij 2 DIV begint een selectieperiode voor antibioticaresistentie die duurt tot 5 DIV. Voeg puromycine (puro) en hygromycine (hygro) toe aan het verse medium (zie Materiaaltabel). Wijzig het medium op 2 DIV, 4 DIV en 5 DIV.
OPMERKING: Optimaliseer de concentraties van puro en hygro vóór het differentiatieprotocol met behulp van getransduceerde en niet-getransduceerde hESCs om de overleving van alleen de cellen met de antibioticaresistentiecassettes te garanderen. In dit protocol werd 0,5 μg/ml puro en 750 μg/ml hygro gebruikt. - Bij 5 DIV eindigt de antibioticaselectieperiode. Verandering naar N2-medium aangevuld met 2 g/L DOX en 4 μM cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C, zie Materiaaltabel).
Figuur 1: Generatie van hdIN-precursoren uit hESCs door overexpressie van Ascl1 en Dlx2. (A) Schema's van het differentiatieprotocol dat wordt gebruikt voor het genereren van hdIN-precursoren. (B-E) Immunocytochemie van hdIN-precursoren bij 7 DIV voor (B) de neuronale marker MAP2, (C) de proliferatieve marker Ki67, (D) algemene nucleaire kleuring en (E) een samenvoeging van de vorige markers. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bereiding van de eencellige suspensie voor transplantatie
OPMERKING: Alle stappen in deze sectie worden uitgevoerd in de celkweekkap. Op 7 DIV worden hdIN-precursoren gedissocieerd en gebruikt voor transplantatie.
- Voer het loskoppelen van de cellen uit volgens de onderstaande stappen.
- Verwijder het medium en spoel de cellen voorzichtig af met DPBS zonder calcium en magnesium.
- Voeg 400 μL van de celloslatingsoplossing (zie materiaaltabel) toe aan elk putje van de 6-wellsplaat.
OPMERKING: Zorg voor de dekking van het hele oppervlak door de oplossing. - Incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 °C in de incubator totdat de rand van de cellen er glanzend uit begint te zien, wat wijst op enzymatische afbraak van celoppervlakeiwitten en loslating van het putoppervlak.
OPMERKING: Om de overleving van cellen te vergroten, wacht niet te lang wanneer alle cellen volledig losstaan en rondzweven. - Voeg vervolgens 600 μL vers N2-medium toe aan elke put van de 6-wellplaat om het enzym te stoppen en mechanisch met de pipet de cellen los te maken om een eencellige suspensie te verkrijgen.
- Breng de celsuspensie over in een plastic buis (15 ml) en centrifugeer bij 180 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Voer resuspensie van de cellen uit.
- Gooi het supernatant weg met behulp van een vacuümsysteem (voorzichtig, zonder de pellet te verstoren) en resuspenseer de pellet in het transplantatiemedium met 10 μM RI, 1 μg/ml DNase en 2 μg/μL DOX.
- Tel de totale cellen in de suspensie met behulp van een telkamer en een handmatige celteller en pas het volume aan tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen/μL.
- Bewaar de celsuspensie in een gesloten buis op ijs tot transplantatie gedurende maximaal 4 uur.
OPMERKING: De transplantatie moet worden uitgevoerd op dezelfde dag als de bereiding van de celsuspensie (7 DIV).
3. Intrahippocampale celtransplantatie
OPMERKING: Alle stappen in deze sectie worden uitgevoerd buiten de celkweekkap in de dierenfaciliteit. Vroege postnatale transplantatie van cellen in de hersenen werd uitgevoerd op P2, waarbij P0 de dag van de geboorte werd beschouwd.
- Bereid u voor op het transplantatie-experiment volgens de onderstaande stappen.
- Autoclaaf al het chirurgische materiaal of, indien niet mogelijk, steriliseer met een andere goedgekeurde methode.
- Monteer de injectiespuit in de houder zonder glazen capillair. Spoel de naald af met water.
OPMERKING: De naald moet 33 G zijn. - Krom 90° de punt van een insulinenaald van 30 G.
- Maak een zelfgemaakt Play-Doh-achtig podium voor het positioneren van de pup met het hoofd plat (figuur 2A).
- Haal de muizenkooi op met de moeder en pups voordat je iets voorbereidt op de operatie om ze te laten acclimatiseren aan de nieuwe omgeving.
- Maak een bakje met nat ijs en een lege kooi met wat papier voor de isofluraan.
- Verdoof de muizenpup.
- Week een stuk papier met isofluraan (zie Materiaaltabel) en plaats het in de lege kooi. Neem voorzichtig een pup en plaats deze in de kooi met het papier gedrenkt in isofluraan.
LET OP: Laat nooit minder dan drie pups bij de moeder. Niet meer dan 20-30 s isofluraan anesthesie, anders kan de pup sterven. - Controleer het effect van de anesthesie door stopzetting van de beweging.
- Plaats de pup direct na de narcose op een nat weefsel op het oppervlak van nat ijs. Houd het dier gedurende 3 minuten op ijs totdat de bovenste ledematen witachtig worden (figuur 2B, blauwe pijl). Dit duurt meestal 2-3 min.
- Gebruik deze tijd voor het laden van de spuit met de celsuspensie. Resuspendeer de cellen voorzichtig met een pipet voordat.
- Plaats de pup op het stereotaxische frame. Gebruik de oorbalken in de tegenovergestelde richting (figuur 2A, magenta pijlen).
OPMERKING: De achterkant van de oorbalken is minder puntig en omdat P2-pups geen oren hebben, gebruikt u de plattere kant om te voorkomen dat het dier pijn doet. - Controleer vanaf de zijkant of het hoofd recht is. Het hoofd moet plat zijn; gebruik het Play-Doh-achtige podium om dat aan te passen.
OPMERKING: Pups op deze leeftijd hebben hun ogen nog niet geopend, dus er hoeft geen extra stap in dit opzicht te worden gedaan. Pups hebben op deze leeftijd geen vacht, dus er is geen scheren van het gebied nodig. Er wordt geen specifieke pijnbehandeling gegeven omdat het geen open incisie op de huid is en er geen hechting bij betrokken is. - Houd de pup bedekt op ijs (bovenop tissuepapier) gedurende de gehele duur van de operatie.
LET OP: Plaats het ijs niet in direct contact met de huid van de pup.
- Week een stuk papier met isofluraan (zie Materiaaltabel) en plaats het in de lege kooi. Neem voorzichtig een pup en plaats deze in de kooi met het papier gedrenkt in isofluraan.
- Voer de injectie uit.
- Reinig het oppervlak van de huid met behulp van een zacht weefsel gedrenkt in ethanol.
- Identificeer lambda en stel de coördinaten in op nul op de digitale displayconsole van het stereotaxische instrument (figuur 2C, gele stippellijn). Sagittale en lambdoïde hechtingen zijn gemakkelijk zichtbaar voor het oog, omdat ze gevasculariseerd zijn, als rode lijnen.
OPMERKING: Als u problemen ondervindt bij het visualiseren van lambda, plaatst u een klein stukje ijs op de huid en wacht u een paar minuten totdat het is afgekoeld. Verwijder vervolgens het stuk ijs en het subtiele bleken van de huid stelt je in staat om te visualiseren. - Verplaats de injectienaald naar de gewenste coördinaten. In het beschreven protocol was het beoogde gebied de hippocampus en de coördinaten waren als volgt: anterior-posterior (AP) +0,85 en medio-lateraal (ML) +1,35.
- Gebruik een 90° gebogen insulinenaald om de schedel binnen te dringen en een klein gaatje te maken.
- Breng de injectienaald naar beneden totdat deze de schedel heeft gekruist en nul de dorso-ventrale (DV) coördinaten. Laat de naald zakken tot de gewenste DV-coördinaten. In het beschreven protocol waren de coördinaten DV −1.1.
- Injecteer volgens de vooraf bepaalde tijdsintervallen.
OPMERKING: In het beschreven protocol waren de exacte timings de volgende: (i) wacht na het afdalen naar de DV-coördinaat 3 minuten, (ii) injecteer 1 μL volume gedurende 5 minuten en (iii) nadat al het volume is geïnjecteerd, wacht 3 minuten. - Trek de naald langzaam terug.
- Beëindig de procedure.
OPMERKING: De operatie kan niet langer dan 15 minuten duren om de overleving van de pup te garanderen en schade als gevolg van de anesthesie door onderkoeling te voorkomen.- Warm de pup op met de handen totdat hij begint te bewegen voordat hij hem teruggeeft aan de moeder.
- Geef DOX in een concentratie van 1 mg/ml in 0,5% sucrose-oplossing als drinkwater gedurende ten minste 2 dagen vóór en 3 weken na transplantatie (PT) om de celdifferentiatie in vivo voort te zetten.
Figuur 2: Stereotaxische transplantatie bij pasgeboren muizenpups op P2. (A) Een Play-Doh-achtige fase voor het in positie houden van het lichaam van de pup en omgekeerde oorbalken (magenta pijlen). (B) Witte voorpoot (blauwe pijl) die wijst op de verminderde bloedstroom in dat gebied, zodat de pup anesthesie ervaart door onderkoeling. (C) Overzicht van de opstelling met de pup al bedekt met ijs over het zachte tissue papier. (c#) Gesloten zoom van het hoofd van de pup, met de injectienaald al in de hersenen ingebracht (gele stippellijn die lambda- en lambdoïde hechtingen aangeeft). Dit cijfer is een bewerking van Gonzalez Ramos et al. 27. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
Volgens het hier gepresenteerde en geïllustreerde protocol in figuur 1A, waren hdIN-precursoren nog niet proliferatief bij 7 DIV zoals gedefinieerd door (i) negatieve immunoreactiviteit voor de celcyclusmarker Ki67 en (ii) het tot expressie brengen van neuronale markers zoals microtubule-geassocieerd eiwit 2 (MAP2) (figuur 1B-E). Deze karakterisering werd uitgevoerd op overgebleven cellen die gedurende 24 uur opnieuw waren geplateerd nadat alle procedurestappen waren doorlopen. Bovendien gaf de eerder gepubliceerde genexpressieanalyse aan dat een snelle overgang van de pluripotente toestand naar een neuronaal fenotype optreedt rond 4 DIV en 7 DIV8. Over het algemeen bevestigden deze resultaten de aanwezigheid van postmitotische cellen en de afwezigheid van risico op teratoomvorming.
Vervolgens werd de overleving van de hdIN-voorlopers na vroege postnatale transplantatie in de hippocampus van wild-type (WT) muizen getest door immunohistochemie tegen de humane cytoplasmatische marker STEM121. De hdIN-voorlopers werden getransplanteerd in de rechter dorsale hippocampus van naïeve immunocompetente muizen op P2, die vervolgens werden geofferd bij P14 en 2 maanden PT. Getransplanteerde cellen werden gevonden over de hele dorsale hippocampus, evenals verspreid door het corpus callosum en de contralaterale hippocampus, op beide tijdstippen. Bovendien drukten geënte hdIN's op beide tijdstippen Ascl1 uit, een van de inductietranscriptiefactoren (aanvullende figuur 1), en waren ze niet proliferatief, zoals blijkt uit de afwezigheid van Ki67-expressie (aanvullende figuur 2).
Belangrijk is dat er geen immuunreactie of lokale ontsteking tegen de getransplanteerde cellen werd gevonden bij P14 of 2 maanden PT, zoals beoordeeld door de afwezigheid van reactieve microglia geïdentificeerd met Iba1, CD68 en galectine-3 (Gal3) (figuur 3), de mate van astrogliose bepaald door het gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) en inflammatoire cytokines zoals interleukine-1 (IL-1), en de afwezigheid van cytotoxische T-lymfocyten (CD8) (figuur 4).
Figuur 3: hdIN's op P14 en 2 maanden PT in de hippocampus van pasgeboren WT-muizen zonder immuunafstoting van het gastheerweefsel te veroorzaken. Immunofluorescentie voor Iba1-, CD68- en Gal3-markers in hersenweefsel van (A-D) de nabijheid van een ischemisch kerngebied in een elektrocoagulatieslagmuismodel (positieve controle, Ctrl +), (E-H) negatieve controledieren (Ctrl-) na 2 maanden en (M-P) P14, en (I-L) dieren die na 2 maanden celtransplantatie hebben ondergaan en (Q-T) ) P14. De witte pijlen geven enkele voorbeelden aan van bloedvaten die zichtbaar zijn aan alle kanalen als gevolg van autofluorescentie. Afkortingen: Ctx = cortex; Heup = hippocampus; DG = gyrus denteren; CA1 = cornu ammonis 1. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: hdIN's na 2 maanden PT in de hippocampus van pasgeboren WT-muizen zonder immuunafstoting van het gastheerweefsel te veroorzaken. Immunofluorescentie voor IL1-, GFAP- en CD8-markers in hersenweefsel van (A-D) de nabijheid van een ischemisch kerngebied in een elektrocoagulatieslagmuismodel (positieve controle, Ctrl +), (E-H) negatieve controledieren (Ctrl-) na 2 maanden en (I-L) dieren die na 2 maanden celtransplantatie hebben ondergaan. Afkortingen: Ctx = cortex; Heup = hippocampus; DG = gyrus denteren. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Evenzo werden hdIN-precursoren ook getransplanteerd in de hippocampus van Cntnap2 KO-muizen, een model voor autismespectrumstoornis en corticale dysplasie-focale epilepsiesyndroom. Bij de Cntnap2 KO-muizen overleefden de hdIN's inderdaad tot 9 maanden PT en werden gelokaliseerd op de injectieplaats, hoewel ze ook verspreid waren over de ipsilaterale en zelfs de contralaterale hippocampus zoals waargenomen bij de WT-muizen (figuur 5). Bovendien waren de meeste getransplanteerde hdIN's immunoreactief voor interneuronmarkers, zoals verwacht op basis van eerdere resultaten in vitro 8,26 en bij volwassen knaagdieren in vivo25.
Figuur 5: Geënte hdIN's in de hippocampus van Cntnap2 KO muizen bij 9 maanden PT. (A) Immunochemie tegen de cytoplasmatische humane marker STEM121 bij celgetransplanteerde (links) en sham (rechts) muizen. (a1 en a2) Uitvergrote beelden van STEM121 positieve cellen. (B) Immunofluorescentie voor STEM121 (magenta) en de interneuronmarkers parvalbumine (PV) en somatostatine (SST). Witte pijlen geven dubbele positieve cellen aan voor STEM121 en de respectievelijke interneuronmarker. (C) Orthogonale weergave van een getransplanteerde hdIN immunoreactieve voor STEM121 en PV. Schaalbalk: 200 μm (A en B), 100 μm (a1 en a2), 20 μm (kleine vierkante vergroting in a1 en a2 en C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Geënte hdIN's na 2 maanden PT in de hippocampus van pasgeboren WT-muizen die Ascl1 tot expressie brengen. Immunofluorescentie tegen Ascl1 en de cytoplasmatische humane marker STEM121 bij de (A) CA3 en (B) DG bij celgetransplanteerde WT-muizen. (a) Vergroot beeld van een STEM121 positieve cel. De witte pijlen geven dubbele positieve cellen aan voor STEM121 en Ascl1. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Post-mitotisch geënte hdIN's op 2 maanden PT in de hippocampus van pasgeboren WT-muizen. Immunofluorescentie tegen de proliferatieve marker Ki67 en de cytoplasmatische humane marker STEM121 bij (A) naïeve en (B) celgetransplanteerde WT-muizen. b) Vergroot beeld van een STEM121-positieve cel. De gele pijl geeft een cel aan die positief is voor Ki67 en negatief voor STEM121. De witte pijl geeft cellen aan die positief zijn voor STEM121 en negatief voor Ki67. Het witte sterretje wijst op een laterale ventrikel. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een robuuste, snelle, eenvoudige en breed toegankelijke methodologie om hdIN-precursoren in vitro te genereren en het gebruik ervan als vroege interventionele celtherapie in preklinische modellen van neurologische ontwikkelingsstoornissen.
Hoewel sommige van de karakteristieke fenotypen van neurologische ontwikkelingsstoornissen ontstaan tijdens de adolescentie of volwassenheid, zijn pathofysiologische veranderingen al aanwezig tijdens de vroege ontwikkeling. Om deze reden zou vroege interventie zeer gerechtvaardigd zijn voor het bereiken van gunstige effecten door te handelen in kritieke hersenontwikkelingsperioden vóór symptomatologie of klinische manifestatie. In de toekomst zullen genetische screening en de ontwikkeling van biomarkers profylactische of presymptomatische behandeling bieden, wat een game changer voor die patiënten vormt. Daarom werden hdIN-precursoren vroeg na de geboorte getransplanteerd in het Cntnap2 KO-muismodel wanneer epileptogene veranderingen in het neuronale netwerk mogelijk28 aan de gang zijn en op een tijdstip waarop cellulaire veranderingen zijn beschreven in dit diermodel29. Het is echter belangrijk om rekening te houden met de mogelijke valkuilen van leeftijdsextrapolatie en de timing van bepaalde processen in de muis versus het menselijk brein.
Het hier gepresenteerde differentiatieprotocol richt zich op de procedure zelf en is gebaseerd op het gebruik van transcriptiefactoren, die een snelle en zeer efficiënte programmering van stamcellen mogelijk maken in vergelijking met andere protocollen elders op basis van kleine moleculen10,30. Een mogelijk nadeel van deze aanpak zou de vereiste voor lentivirale vectoren kunnen zijn, die een risico op insertionele mutagenese met zich meebrengt. Twee kritieke stappen in het protocol zijn de toevoeging van de antibiotica en het anti-mitotische middel aan het medium om te selecteren op cellen die de transcriptiefactoren tot expressie brengen en proliferatieve cellen te elimineren, waardoor het risico op teratoomvorming wordt vermeden. Hoewel in deze studie alleen hdIN-precursoren werden getest, wordt verwacht dat de procedure haalbaar zal zijn met andere celbronnen en programmerings- / differentiatieprotocollen. Niettemin moeten andere neuronale subtypen en/of modellen worden gevalideerd.
De leeftijd van de hdIN-precursor voor transplantatie, 7 DIV, werd bepaald op basis van (i) de afwezigheid van proliferatieve cellen, beoordeeld op immunoreactiviteit tegen Ki67, (ii) samen met de eerder gerapporteerde waarneming van afnames in de expressie van pluripotentiegenen zoals POU5F1 en het verschijnen van de neuronale marker MAP2 en de interneuronmarker GAD1 op dat tijdstip8 . Het oorspronkelijke werk dat dit protocol beschrijft, voerde echter transplantaties uit bij 14 DIV na DOX-terugtrekking9. Dit roept vragen op over de vraag of DOX in het drinkwater van de moeder cellen kan bereiken die via de melk in de hersenen van zogende pups zijn geënt, of dat 7 DIV DOX-inductie voldoende is om het GABAerge lot vast te stellen. Hoewel Yang et al. 14 dagen DOX identificeerden als voldoende om stabiele neuronale cellen in vitro9 te genereren, detecteerden Gonzalez-Ramos et al.8 GAD1-genexpressie al bij 7 DIV, wat aangeeft dat de downstream-activering van GAD67 door Ascl1 en Dlx2 op dit moment al heeft plaatsgevonden. Vandaar dat patroonvorming is begonnen bij 7 DIV en mogelijk minder afhankelijk is van de DOX-behandeling. Bovendien wijst bewijs bij knaagdieren en mensen op de aanwezigheid van DOX in moedermelk 31,32, en de hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat getransplanteerde hdIN's immunoreactief waren voor Ascl1 na 2 weken en 2 maanden PT en interneuronmarkers later op 9 maanden PT. Binnen de geënte populatie werden naast PV- en SST-positieve neuronen ook andere markers voor subpopulaties van interneuronen gevonden in lagere hoeveelheden, zoals calretinine (CR) en calbindin (CB).
Een uitdagend aspect van deze procedure is de coördinatie van de timings voor zowel differentiatie als de leeftijd van de pups. Meestal duurt de muizendracht 21 dagen na het opzetten van de paringskooi, hoewel dit soms kan variëren. Dit scenario treedt niet op bij het uitvoeren van celtransplantaties bij volwassen knaagdieren wanneer alles zorgvuldig kan worden gepland en geregeld. Toch kan dit eenvoudig worden verzacht door twee tot drie paringskooien op te zetten met een interval van 2 dagen of twee tot drie differentiatiepartijen met een time-lapse van 2 dagen van elkaar.
Hoewel de muizen die in deze studie werden gebruikt noch immunodeficiënt noch immunosuppressief waren, overleefden de getransplanteerde cellen tot 9 maanden in vivo, en markers van immuunreactie tegen xenogene cellen of lokale ontsteking werden niet waargenomen bij P14 of 2 maanden PT. Immuunafstoting van getransplanteerde xenogene cellen wordt geactiveerd tegen MHC / peptiden, en de belangrijkste cellulaire mediatoren van transplantaatafstoting zijn T-lymfocyten en microgliale cellen33, 34. Daarom werd immunoreactiviteit op markers van T-cellen, evenals reactieve microglia, onderzocht. Er werden geen tekenen van immuunafstoting van de getransplanteerde cellen in het gastheerweefsel gedetecteerd, noch door niveaus van reactieve microglia, noch door de aanwezigheid van T-lymfocyten bij WT-muizen bij P14 of 2 maanden. Bovendien werd geen lokale ontsteking waargenomen op basis van de beoordeelde niveaus van astrogliose en inflammatoire cytokines. Deze uitkomst kan gedeeltelijk afhankelijk zijn van neonatale immuuntolerantie 35,36,37, waargenomen door andere celidentiteiten, locaties en diermodellen35,38. Englund et al. identificeerden regionale verschillen in de uitkomst van de getransplanteerde cellen in termen van migratie en rijping, inclusief de observatie van getransplanteerde cellen in de aangrenzende witte stof35.
Ten slotte werd een grotere dispersie van de getransplanteerde cellen in de hippocampus waargenomen in vergelijking met andere studies die transplanteerden in volwassen knaagdieren, waarbij hdIN's bleven als een geënte kern25. Deze dispersie verschilde ook van de resultaten die eerder door Yang et al.9 werden waargenomen, wat in dit geval kan worden verklaard door de leeftijd van de cellen op het moment van transplantatie.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de Swedish Research Council (Grant Number: 2016-02605, M.A.), de Swedish Brain Foundation F02021-0369 (M.A.), de Crafoord Foundation (M.A.) en het Horizon 2020-programma van de Europese Unie (H2020-MSCA-ITN-2016) in het kader van het Marie Skłodowska-Curie Innovative Training Network-project Training4CRM No. 722779 (M.K.). We zijn enorm dankbaar voor de hulp van Andrés Miguez, van het laboratorium van Josep Maria Canals (Laboratorium voor Stamcellen en Regeneratieve Geneeskunde, Universiteit van Barcelona), voor het onderwijzen van stereotaxische celtransplantatie bij P2 pasgeboren muizen, en Mackenzie Howard, groepsleider aan de Universiteit van Texas in Austin, voor het advies en de voorlopige coördinaten voor celtransplantatie in de hippocampus van P2 pasgeboren muizen. We bedanken Susanne Geres voor het assisteren bij de verzorging van dieren en Ling Cao voor de hulp bij het verwerken van weefsel, evenals studenten die op de een of andere manier hebben bijgedragen aan de studie en specifiek Diana Hatamian. Ten slotte zijn sommige van de afbeeldingen die zijn gebruikt om dit artikel te illustreren, gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G needle | B Braun | 4656300 | |
| 33 G needle for Hamilton syringe | Hamilton | 7762-06 | |
| 4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell detachment solution use for splitting cells (hESC and hdIN precursors) |
| Adjustable volume pipettes 10, 20, 200, 1000 µL | |||
| Alexa Fluor Plus 488/555/647 | Thermo Fisher | 1:1000 | |
| Anti-CD68 (Rat) | Bio-Rad | MCA1957 | 1:200 |
| Anti-CD8 (Rabbit) | Abcam | 203035 | 1:200 |
| Anti-Galectin 3 (Goat) | R&D systems | AF1197 | 1:500 |
| Anti-GFAP (Guiena Pig) | Synaptic systems | 173004 | 1:500 |
| Anti-Iba1 (Rabbit) | WAKO | 19119741 | 1:500 |
| Anti-IL1 (Goat) | Santa Cruz Biotech | SC-106 | 1:400 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab16667 | 1:250 |
| Anti-Ki67 (Rabbit) | Novocastra | NCL-Ki67p | 1:250 |
| Anti-MAP2 (Chicken) | Abcam | ab5392 | 1:2000 |
| Anti-Mash1 (Ascl1) | Abcam | ab74065 | 1:1000 |
| Anti-Parvalbumin (Rabbit) | Swant | PV 27 | 1:5000 |
| Anti-Somatostatin (Rat) | Millipore | MAB354 | 1:150 |
| Anti-STEM121 (Mouse) | Takara Bio | Y40410 | 1:400 |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | VECTOR Laboratories | SP-2001 | |
| B6.129(Cg)-Cntnap2tm1Pele/J | Jackson Laboratory | 17482 | Animal model |
| Biotinylated Horse anti-Mouse | VECTOR Laboratories | BA-2001 | 1:200 |
| Burker Chamber | Thermo Fisher Scientific | 10628431 | |
| C57BL/6J | Janvier Labs | Animal model | |
| Centrifuge | For 15 mL tubes | ||
| Confocal microscope | Nikon | Confocal A1RHD microscope | |
| Costar 6-well Clear TC-treated | Corning | 3516 | |
| Cy3 Streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | 1:200 |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma | C1768 | 4 µM |
| DAB Substrate Kit, Peroxidase (With Nickel) | VECTOR Laboratories | SK-4100 | |
| Digital Stereotax | KOPF | Model 940 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Use for the N2 medium |
| DNase I Solution | STEMCELL Technologies | 7900 | 1 µg/mL |
| Doxycyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | 2 µg/mL |
| DPBS -/- | Gibco | 14190144 | |
| Epifluorescence microscope | Olympus | BX51 Microscope | |
| Ethanol | Solveco | 70%, 95%, 99.8% | |
| FUW-rTA | Addgene | 20342 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Ascl1-T2A-puromycin | Addgene | 97329 | Lentiviral vector |
| FUW-TetO-Dlx2-IRES-hygromycin | Addgene | 97330 | Lentiviral vector |
| H1 (WA01) ESC | WiCell | WA01 | Human embryonic stem cell line under a MTA agreement |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | 18304 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 7634-01 | 5 µL |
| HBSS | Gibco | 14175095 | No calcium, No magnesium - Transplantation medium |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:1000 |
| Hygromycin B | Gibco (Invitrogen) | 10687010 | |
| Incubator | 5% CO2, 37 °C | ||
| Isoflurane Baxter | Apoteket AB | ||
| Manual cell counter | VWR | 720-1984 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-free | Corning | 354277 | For the coating |
| Methanol | Merck Millipore | 1060091000 | |
| Microscope Coverslips 24 x 60 mm | Thermo Scientific | BBAD02400500#A113MNZ#0## | |
| Microscope Slides | VWR | 631-1551 | |
| Microscope Software | Olympus | CellSens | |
| Mounting media | Merck | 10981 | PVA-Dabco |
| Mouse adaptor to stereotax | RWD | 68030 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Kit Basal Medium and 5X Supplement - Stem cell culture medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045 | 1M |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Pertex | HistoLab | 811 | |
| Pipet Filler | |||
| Play-Doh | |||
| Puromycin (Dihydrochloride) | Gibco | A1113803 | |
| Round cover glasses thickness No. 1.5H (tol. ± 5 μm) 13 mm Ø | Marienfeld | MARI0117530 | For immunocytochemistry |
| Serum | Thermo Fisher | Goat, Donkey, Horse | |
| Sterile pipette tips | For volumes 0.1-1000 µL | ||
| Sterile serological pipettes | 5, 10, 25 mL | ||
| Sterile water Braun | B Braun | 3626873 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | For 0.5% Sucrose solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Tubes | Sarstedt | 15 ml, Eppendorf 1.5 mL | |
| Tweezer | VWR | ||
| Ultra pure water | MilliQ Water System | ||
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 µM |
References
- Kostović, I., Jovanov-Milošević, N. The development of cerebral connections during the first 20-45 weeks' gestation. Seminars in Fetal and Neonatal. 11 (6), 415-422 (2006).
- Innocenti, G. M., Price, D. J. Exuberance in the development of cortical networks. Nature Reviews Neuroscience. 6 (12), 955-965 (2005).
- Tang, X., Jaenisch, R., Sur, M. The role of GABAergic signalling in neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neuroscience. 22 (5), 290-307 (2021).
- Kepecs, A., Fishell, G. Interneuron cell types are fit to function. Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: Comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Radonjić, N. V., et al. Diversity of cortical interneurons in primates: The role of the dorsal proliferative niche. Cell Reports. 9 (6), 2139-2151 (2014).
- Turner, D. A., Shetty, A. K. Clinical prospects for neural grafting therapy for hippocampal lesions and epilepsy. Neurosurgery. 52 (3), 632-644 (2003).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Yang, N., et al. Generation of pure GABAergic neurons by transcription factor programming. Nature Methods. 14 (6), 621-628 (2017).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Yuan, F., et al. Induction of human somatostatin and parvalbumin neurons by expressing a single transcription factor LIM homeobox 6. eLife. 7, 37382 (2018).
- Fandel, T. M., et al. Transplanted human stem cell-derived interneuron precursors mitigate mouse bladder dysfunction and central neuropathic pain after spinal cord injury. Cell Stem Cell. 19 (4), 544-557 (2016).
- Noakes, Z., et al. Human pluripotent stem cell-derived striatal interneurons: Differentiation and maturation in vitro and in the rat brain. Stem Cell Reports. 12 (2), 191-200 (2019).
- Parikshak, N. N., Gandal, M. J., Geschwind, D. H. Systems biology and gene networks in neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. Nature Reviews Genetics. 16 (8), 441-458 (2015).
- Marín, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Sloan, D. J., Wood, M. J., Charlton, H. M. The immune response to intracerebral neural grafts. Trends in Neurosciences. 14 (8), 341-346 (1991).
- Diehl, R., et al. Immunosuppression for in vivo research: State-of-the-art protocols and experimental approaches. Cellular & Molecular Immunology. 14 (2), 146-179 (2017).
- Osman, M. M., et al. Cyclosporine-A as a neuroprotective agent against stroke: Its translation from laboratory research to clinical application. Neuropeptides. 45 (6), 359-368 (2011).
- Quinnies, K. M., Cox, K. H., Rissman, E. F. Immune deficiency influences juvenile social behavior and maternal behavior. Behavioral Neuroscience. 129 (3), 331-338 (2015).
- Fernandes, D. J., et al. Mouse models of immune dysfunction: their neuroanatomical differences reflect their anxiety-behavioural phenotype. Molecular Psychiatry. 27 (7), 3047-3055 (2022).
- Lund, R. D., Rao, K., Hankin, M. H., Kunz, H. W., Gill, T. J. Transplantation of retina and visual cortex to rat brains of different ages. Maturation, connection patterns, and immunological consequences. Annals of the New York Academy of Sciences. 495, 227-241 (1987).
- Olsson, M., Bentlage, C., Wictorin, K., Campbell, K., Björklund, A. Extensive migration and target innervation by striatal precursors after grafting into the neonatal striatum. Neuroscience. 79 (1), 57-78 (1997).
- Mattis, V. B., et al. Neonatal immune-tolerance in mice does not prevent xenograft rejection. Experimental Neurology. 254, 90-98 (2014).
- Nato, G., et al. Immune-tolerance to human iPS-derived neural progenitors xenografted into the immature cerebellum is overridden by species-specific differences in differentiation timing. Scientific Reports. 11, 651 (2021).
- Allison, T., et al. Defining the nature of human pluripotent stem cell-derived interneurons via single-cell analysis. Stem Cell Reports. 16 (10), 2548-2564 (2021).
- Waloschková, E., et al. Human stem cell-derived GABAergic interneurons establish efferent synapses onto host neurons in rat epileptic hippocampus and inhibit spontaneous recurrent seizures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13243 (2021).
- Gonzalez Ramos, A. Enhancing neuronal inhibition by cell and gene therapy as a novel treatment for epilepsy. , Lund University, Faculty of Medicine. PhD thesis (2022).
- Paterno, R., et al. Hippocampal gamma and sharp-wave ripple oscillations are altered in a Cntnap2 mouse model of autism spectrum disorder. Cell Reports. 37 (6), 109970 (2021).
- Penagarikano, O., et al. Absence of CNTNAP2 leads to epilepsy, neuronal migration abnormalities, and core autism-related deficits. Cell. 147 (1), 235-246 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Angeletti, B., et al. An in vivo doxycycline-controlled expression system for functional studies of the retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (2), 755-760 (2003).
- Doxycycline. Drugs and Lactation Database (LactMed). , National Library of Medicine. Bethesda, MD. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK500561 (2021).
- Barker, R. A., Widner, H. Immune problems in central nervous system cell therapy. NeuroRX. 1 (4), 472-481 (2004).
- Hoornaert, C. J., et al. Concise review: Innate and adaptive immune recognition of allogeneic and xenogeneic cell transplants in the central nervous system. Stem Cells Translational Medicine. 6 (5), 1434-1441 (2017).
- Englund, U., Fricker-Gates, R. A., Lundberg, C., Bjorklund, A., Wictorin, K. Transplantation of human neural progenitor cells into the neonatal rat brain: Extensive migration and differentiation with long-distance axonal projections. Experimental Neurology. 173 (1), 1-21 (2002).
- Fainstein, N., Ben-Hur, T. Brain region-dependent rejection of neural precursor cell transplants. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 136 (2018).
- Denham, M., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, 11 (2012).
- Miguez, A., et al. In vivo progressive degeneration of Huntington's disease patient-derived neurons reveals human-specific pathological phenotypes. bioRxiv. , (2022).
