القياس الكمي في الوقت الحقيقي لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها بعد نقل mRNA الاصطناعي
Summary
تحفز العديد من الجينات غير المنظمة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها ، مما يؤدي إلى سوء التشخيص. يعد تحديد الجينات التي تنظم هجرة الخلايا السرطانية وغزوها أمرا بالغ الأهمية. يقدم هذا البروتوكول طريقة للتحقيق في آثار زيادة التعبير عن الجين على هجرة وغزو الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي.
Abstract
الخلايا السرطانية شديدة الحركة والغازية وتظهر أنماط التعبير الجيني المتغيرة. إن معرفة كيفية تنظيم التغيرات في التعبير الجيني لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها أمر ضروري لفهم آليات تسلل الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة وورم خبيث. في السابق ، ثبت أن ضربة قاضية للجينات متبوعة بالقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها تمكن من تحديد الجينات المطلوبة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها. في الآونة الأخيرة ، زادت لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 من الاهتمام باستخدام mRNA الاصطناعي لأغراض علاجية. هنا ، تمت مراجعة الطريقة التي تستخدم mRNA الاصطناعية لدراسة تأثير الإفراط في التعبير الجيني على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. توضح هذه الدراسة أن التعبير الجيني المرتفع مع نقل mRNA الاصطناعي متبوعا بالقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة قد يساعد في تحديد الجينات التي تحفز هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تقدم ورقة الطريقة هذه تفاصيل مهمة حول إجراءات فحص تأثير التعبير الجيني المتغير على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.
Introduction
تلعب حركية الخلايا السرطانية دورا مهما في ورم خبيث 1,2. إن انتشار الخلايا السرطانية إلى الأنسجة السليمة المجاورة والبعيدة يجعل علاج السرطان صعبا ويساهم في تكرار 3,4. لذلك ، من الضروري فهم آليات حركة الخلايا السرطانية وتطوير الاستراتيجيات العلاجية ذات الصلة. نظرا لأن العديد من الخلايا السرطانية قد غيرت ملامح التعبير الجيني ، فمن الأهمية بمكان فهم التغييرات في ملف تعريف التعبير الجيني التي تؤدي إلى تغيير حركة الخلايا السرطانية 5,6.
تم تطوير العديد من المقايسات لقياس هجرة الخلايا في المختبر. توفر بعض المقايسات معلومات محدودة فقط بسبب السماح فقط بالقياسات في نقاط زمنية محددة ، بينما يقدم البعض الآخر معلومات شاملة عن حركة الخلايا السرطانية في الوقت الفعلي7. على الرغم من أن العديد من فحوصات حركية الخلايا هذه يمكن أن توفر نتائج كمية في وقت معين أو نقطة النهاية ، إلا أنها تفشل في توفير معلومات مفصلة بما فيه الكفاية عن التغيرات الديناميكية في معدل هجرة الخلايا خلال الفترة التجريبية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الصعب فحص التغييرات المحتملة في معدل هجرة الخلايا اعتمادا على التصميم التجريبي وأنواع الخلايا وأرقام الخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن التحقيق في آثار العلاجات غير المعقدة من خلال القياس الكمي البسيط لمقايسات الحركة التقليدية ، ولكن قد تكون هناك حاجة إلى تقدير كمي أكثر تعقيدا لدراسة التأثيرات المعقدة لمختلف العلاجات المشتركة8.
تم تطوير أداة لمراقبة التيار الكهربائي لقاع بئر لوحة العيار الدقيق المغطى بأقطاب كهربائية دقيقة9. يعيق التصاق الخلايا بسطح البئر تدفق الإلكترون ، وترتبط المعاوقة بالارتباط الكمي والنوعي للخلايا. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة في قاع البئر بقياس التصاق الخلايا وانتشارها وتكاثرها. يسمح وجود الأقطاب الكهربائية الدقيقة تحت غشاء صغير يسهل اختراقه في الغرفة العلوية بقياس هجرة الخلايا وغزوها إلى الغرفة السفلية ، مع طلاء الغرفة العلوية ببروتينات مصفوفة خارج الخلية (ECM) للسماح بالغزو10.
في السابق ، ثبت أن القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها توفر بيانات في الوقت الفعلي خلال التجربة بأكملها ، بالإضافة إلى مقارنات وتقديرات فورية في ظل ظروف تجريبية مختلفة11. في ورقة الطريقة هذه ، تم حث ضربة قاضية للجينات لاختبار دور البروتينات ذات الأهمية في هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. نظرا لأن تأثير ضربة قاضية للجين الكامل في ظل الظروف التجريبية المختبرة استغرق 3-4 أيام بعد التثقيب الكهربائي باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNAs) 8 ، فقد تم إعادة طلاء الخلايا بعد التثقيب الكهربائي وإعادة حصادها بعد 3 أيام للقياس في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة لهجرة الخلايا السرطانية وغزوها.
منظم CT10 للكيناز (Crk) و Crk-like (CrkL) عبارة عن بروتينات محول تتوسط تفاعلات البروتين والبروتين في اتجاه مجرى مسارات كيناز مستقبلات عامل النمو المختلفة ومسارات التيروزين كيناز غير المستقبلة12. تساهم المستويات المرتفعة من بروتينات Crk و CrkL في سوء التشخيص في العديد من أنواع السرطان البشرية ، بما في ذلك الورم الأرومي الدبقي13. ومع ذلك ، فمن غير الواضح كيف تؤدي بروتينات Crk و CrkL المرتفعة إلى سوء التشخيص. لذلك ، من المهم تحديد تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على وظائف الخلايا السرطانية. في السابق ، تم إجراء دراسة ضربة قاضية للجينات لإثبات أن المستويات الداخلية لبروتينات Crk و CrkL مطلوبة لهجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي وغزوها8. هنا ، تم تطوير نظام فحص معدل لمعالجة تأثير التعبير المفرط ل Crk و CrkL على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها.
في الآونة الأخيرة ، جذب التوليف في المختبر ل mRNA وتطبيقاته العلاجية اهتماما متجددا بسبب تطوير لقاحات mRNA ضد SARS-CoV-2 (استعرضه Verbeke et al.14). بالإضافة إلى ذلك ، تم إحراز تقدم ملحوظ في استخدام mRNA الاصطناعية في السرطان وأمراض أخرى15,16. يعد التثقيب الكهربائي للخلايا طريقة فعالة لتوصيل mRNA الاصطناعي والحث على التعديل الجيني العابر (تمت مراجعته بواسطة Campillo-Davo et al.17) ، ويتيح استخدام mRNA الاصطناعي التعبير الجيني السريع والفعال في الخلايا الليفية الخالدة 18. تجمع ورقة الطريقة هذه بين الإفراط في التعبير الجيني باستخدام mRNA الاصطناعي مع تحليلات الخلايا في الوقت الفعلي لدراسة هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. ومع ذلك ، فإن المخطط التجريبي المستخدم في siRNAs لا يعمل مع نقل mRNA الاصطناعي ، حيث يزداد مستوى البروتينات الخارجية بسرعة وينخفض تدريجيا عند نقل mRNA الاصطناعي18. لذلك ، تم تعديل الطريقة لإجراء تحليل في الوقت الفعلي لهجرة الخلايا وغزوها مباشرة بعد النقل دون زراعة الخلايا بشكل إضافي.
توضح ورقة الطريقة هذه أن الجمع بين القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة مع نقل الخلايا السرطانية باستخدام mRNAs الاصطناعية يوفر تحليلا سريعا وشاملا لآثار تنظيم الجينات على هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. تصف ورقة الطريقة هذه الإجراءات التفصيلية لقياس كيفية تأثر هجرة وغزو خلايا الورم الأرومي الدبقي بالتعبير المفرط عن Crk و CrkL. من خلال فحص التأثيرات المعتمدة على التركيز ل mRNA الاصطناعية على هجرة الخلايا السرطانية ، تصف الورقة بوضوح كيف أن الزيادة في مستويات البروتين تحفز هجرة الخلايا السرطانية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم نهج لتغيير تركيز هلام ECM لتقييم آثار التغيرات في التعبير الجيني على غزو الخلايا السرطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهجرة والغزو هي سمات مهمة للخلايا السرطانية. يوفر قياس حركة الخلايا السرطانية وفهم الآلية الأساسية التي تتحكم في حركة الخلايا السرطانية رؤى مهمة في التدخلات العلاجية 2,27. تم تطوير عدة طرق لدراسة هجرة الخلايا7. يعد فحص التئام الجروح باستخدام ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون مركز الكتابة الطبية في رحمة الأطفال في مدينة كانساس سيتي لتحرير هذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ناتالي A.R.T. (إلى TP) ومنحة المجلس الاستشاري لشركاء MCA من مستشفى الرحمة للأطفال (CMH) ومركز السرطان بجامعة كانساس (KUCC) (إلى TP).
Materials
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
