Real-time kwantitatieve meting van tumorcelmigratie en -invasie na synthetische mRNA-transfectie
Summary
Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.
Abstract
Tumorcellen zijn zeer beweeglijk en invasief en vertonen veranderde genexpressiepatronen. Kennis van hoe veranderingen in genexpressie de migratie en invasie van tumorcellen reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van tumorcelinfiltratie in naburige gezonde weefsels en metastase. Eerder werd aangetoond dat gen-knockdown, gevolgd door de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie, de identificatie van de genen mogelijk maakt die nodig zijn voor tumorcelmigratie en -invasie. Onlangs hebben de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 de belangstelling voor het gebruik van synthetisch mRNA voor therapeutische doeleinden vergroot. Hier werd de methode met synthetisch mRNA herzien om het effect van genoverexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Deze studie toont aan dat verhoogde genexpressie met synthetische mRNA-transfectie gevolgd door impedantie-gebaseerde real-time meting kan helpen bij het identificeren van de genen die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Dit methodedocument geeft belangrijke details over de procedures voor het onderzoeken van het effect van veranderde genexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen.
Introduction
De beweeglijkheid van tumorcellen speelt een cruciale rol bij metastase 1,2. De verspreiding van tumorcellen naar naburige en afgelegen gezonde weefsels maakt de behandeling van kanker moeilijk en draagt bij aan recidief 3,4. Daarom is het essentieel om de mechanismen van de beweeglijkheid van tumorcellen te begrijpen en relevante therapeutische strategieën te ontwikkelen. Aangezien veel tumorcellen veranderde genexpressieprofielen hebben, is het cruciaal om te begrijpen welke veranderingen in het genexpressieprofiel leiden tot een veranderde beweeglijkheid van de tumorcellen 5,6.
Er zijn verschillende testen ontwikkeld om celmigratie in vitro te meten. Sommige tests bieden slechts beperkte informatie omdat metingen alleen op specifieke tijdstippen mogelijk zijn, terwijl andere uitgebreide informatie bieden over de beweeglijkheid van tumorcellen in realtime7. Hoewel veel van deze tests op het gebied van celmotiliteit kwantitatieve resultaten kunnen opleveren op een bepaald moment of het eindpunt, geven ze onvoldoende gedetailleerde informatie over dynamische veranderingen in de snelheid van celmigratie gedurende de experimentele periode. Bovendien kan het moeilijk zijn om mogelijke veranderingen in de celmigratiesnelheid te onderzoeken, afhankelijk van het experimentele ontwerp, de celtypen en het aantal cellen. Bovendien kunnen de effecten van ongecompliceerde behandelingen worden onderzocht door de eenvoudige kwantificering van traditionele motiliteitstests, maar meer geavanceerde kwantificering kan nodig zijn om de complexe effecten van verschillende gecombineerde behandelingen te bestuderen8.
Er is een instrument ontwikkeld voor het bewaken van de elektrische stroom van een microtiterplaat die goed is bedekt met micro-elektroden9. De hechting van cellen aan het oppervlak van de put belemmert de elektronenstroom en de impedantie correleert met de kwantitatieve en kwalitatieve binding van de cellen. De aanwezigheid van de micro-elektroden op de bodem van de put maakt het mogelijk om de adhesie, verspreiding en proliferatie van cellen te meten. De aanwezigheid van de micro-elektroden onder een microporeus membraan van de bovenste kamer maakt het mogelijk om celmigratie en invasie in de onderste kamer te meten, waarbij de bovenste kamer is gecoat met extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten om invasie mogelijk te maken10.
Eerder werd aangetoond dat op impedantie gebaseerde real-time metingen van tumorcelmigratie en -invasie real-time gegevens opleveren tijdens het hele experiment, evenals onmiddellijke vergelijkingen en kwantificeringen onder verschillende experimentele omstandigheden11. In dat methodedocument werd gen-knockdown geïnduceerd om de rol van eiwitten die van belang zijn bij de migratie en invasie van tumorcellen te testen. Aangezien een volwaardig gen-knockdown-effect onder de geteste experimentele omstandigheden 3-4 dagen duurde na elektroporatie met kleine interfererende RNA’s (siRNA’s)8, werden de cellen na de elektroporatie opnieuw geplateerd en 3 dagen later opnieuw geoogst voor de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie.
CT10-regulator van kinase (Crk) en Crk-like (CrkL) zijn adaptoreiwitten die eiwit-eiwitinteracties stroomafwaarts van verschillende groeifactorreceptorkinaseroutes en niet-receptortyrosinekinaseroutes bemiddelen12. Verhoogde niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten dragen bij aan een slechte prognose bij verschillende vormen van kanker bij de mens, waaronder glioblastoom13. Het is echter onduidelijk hoe verhoogde Crk- en CrkL-eiwitten leiden tot een slechte prognose. Daarom is het belangrijk om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op tumorcelfuncties te definiëren. Eerder werd een gen-knockdown-studie uitgevoerd om aan te tonen dat endogene niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten nodig zijn voor glioblastoomcelmigratie en -invasie8. Hier is een aangepast testsysteem ontwikkeld om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen aan te pakken.
Onlangs hebben de in vitro synthese van mRNA en de therapeutische toepassingen ervan hernieuwde aandacht getrokken door de ontwikkeling van de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 (beoordeeld door Verbeke et al.14). Bovendien is er opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het gebruik van synthetisch mRNA bij kanker en andereziekten15,16. De elektroporatie van cellen is een effectieve methode om synthetisch mRNA af te leveren en voorbijgaande genetische modificatie te induceren (beoordeeld door Campillo-Davo et al.17), en het gebruik van synthetisch mRNA maakt snelle en efficiënte genexpressie in onsterfelijke fibroblasten mogelijk 18. Dit methodedocument combineert genoverexpressie met behulp van synthetisch mRNA met real-time celanalyses om migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Het experimentele schema dat voor siRNA’s wordt gebruikt, werkt echter niet met synthetische mRNA-transfectie, omdat het niveau van exogene eiwitten snel toeneemt en geleidelijk afneemt bij synthetische mRNA-transfectie18. Daarom is de methode aangepast om de real-time analyse van celmigratie en -invasie direct na de transfectie uit te voeren zonder de cellen extra te kweken.
Dit methodedocument toont aan dat het combineren van impedantie-gebaseerde real-time metingen met de transfectie van tumorcellen met synthetische mRNA’s een snelle en uitgebreide analyse oplevert van de effecten van gen-upregulatie op tumorcelmigratie en -invasie. Dit methodedocument beschrijft gedetailleerde procedures om te meten hoe de migratie en invasie van glioblastoomcellen worden beïnvloed door de overexpressie van Crk en CrkL. Door de concentratie-afhankelijke effecten van synthetisch mRNA op tumorcelmigratie te onderzoeken, beschrijft het artikel duidelijk hoe een toename van eiwitniveaus de migratie van tumorcellen stimuleert. Daarnaast wordt een benadering gepresenteerd om de concentratie van de ECM-gel te variëren om de effecten van veranderingen in genexpressie op tumorcelinvasie te beoordelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Migratie en invasie zijn belangrijke kenmerken van tumorcellen. Het meten van de beweeglijkheid van tumorcellen en het begrijpen van het onderliggende mechanisme dat de beweeglijkheid van tumorcellen regelt, bieden cruciale inzichten in therapeutische interventies 2,27. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om celmigratie te bestuderen7. De wondgenezingstest met behulp van krassen of kweekinzetstukken is een eenvoudige en veelgebruikte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken het Medical Writing Center van Children’s Mercy Kansas City voor het redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Natalie’s A.R.T. Foundation (aan T.P.) en door een MCA Partners Advisory Board-subsidie van Children’s Mercy Hospital (CMH) en het University of Kansas Cancer Center (KUCC) (aan TP).
Materials
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
