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Summary

Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell’aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l’invasione delle cellule tumorali in tempo reale.

Abstract

Le cellule tumorali sono altamente mobili e invasive e mostrano modelli di espressione genica alterati. La conoscenza di come i cambiamenti nell’espressione genica regolano la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali è essenziale per comprendere i meccanismi di infiltrazione delle cellule tumorali nei tessuti sani vicini e le metastasi. In precedenza, è stato dimostrato che il knockdown genico seguito dalla misurazione in tempo reale basata sull’impedenza della migrazione e dell’invasione delle cellule tumorali consente l’identificazione dei geni necessari per la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali. Recentemente, i vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 hanno aumentato l’interesse per l’utilizzo di mRNA sintetico per scopi terapeutici. Qui, il metodo che utilizza l’mRNA sintetico è stato rivisto per studiare l’effetto della sovraespressione genica sulla migrazione e l’invasione delle cellule tumorali. Questo studio dimostra che l’elevata espressione genica con trasfezione sintetica di mRNA seguita da una misurazione in tempo reale basata sull’impedenza può aiutare a identificare i geni che stimolano la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali. Questo documento fornisce importanti dettagli sulle procedure per esaminare l’effetto dell’espressione genica alterata sulla migrazione e l’invasione delle cellule tumorali.

Introduction

La motilità delle cellule tumorali gioca un ruolo cruciale nelle metastasi ^1,2. La diffusione delle cellule tumorali ai tessuti sani vicini e remoti rende difficile il trattamento del cancro e contribuisce alla recidiva ^3,4. Pertanto, è essenziale comprendere i meccanismi della motilità delle cellule tumorali e sviluppare strategie terapeutiche pertinenti. Poiché molte cellule tumorali hanno profili di espressione genica alterati, è fondamentale capire quali cambiamenti nel profilo di espressione genica portano ad un’alterazione della motilità delle cellule tumorali ^5,6.

Sono stati sviluppati diversi saggi per misurare la migrazione cellulare in vitro. Alcuni test forniscono solo informazioni limitate a causa della possibilità di misurazioni solo in punti temporali specifici, mentre altri offrono informazioni complete sulla motilità delle cellule tumorali in tempo reale⁷. Sebbene molti di questi saggi di motilità cellulare possano fornire risultati quantitativi in un dato momento o nel punto finale, non riescono a fornire informazioni sufficientemente dettagliate sui cambiamenti dinamici nel tasso di migrazione cellulare durante il periodo sperimentale. Inoltre, può essere difficile esaminare i potenziali cambiamenti nel tasso di migrazione cellulare a seconda del disegno sperimentale, dei tipi di cellule e del numero di cellule. Inoltre, gli effetti di trattamenti non complicati possono essere studiati con la semplice quantificazione dei tradizionali saggi di motilità, ma può essere necessaria una quantificazione più sofisticata per studiare gli effetti complessi di vari trattamenti combinati⁸.

E’ stato messo a punto uno strumento per monitorare la corrente elettrica di una piastra per microtitolazione sul fondo di un pozzetto ricoperto di microelettrodi⁹. L’adesione delle cellule alla superficie del pozzetto ostacola il flusso di elettroni e l’impedenza è correlata al legame quantitativo e qualitativo delle cellule. La presenza dei microelettrodi sul fondo del pozzetto consente di misurare l’adesione, la diffusione e la proliferazione cellulare. La presenza dei microelettrodi sotto una membrana microporosa della camera superiore consente di misurare la migrazione e l’invasione cellulare nella camera inferiore, con la camera superiore rivestita con proteine della matrice extracellulare (ECM) per consentire l’invasione¹⁰.

In precedenza, è stato dimostrato che le misurazioni in tempo reale basate sull’impedenza della migrazione e dell’invasione delle cellule tumorali forniscono dati in tempo reale durante l’intero esperimento, nonché confronti e quantificazioni istantanei in varie condizioni sperimentali¹¹. In quel documento, il knockdown genico è stato indotto per testare il ruolo delle proteine di interesse nella migrazione e nell’invasione delle cellule tumorali. Poiché un effetto di knockdown genico in piena regola nelle condizioni sperimentali testate ha richiesto 3-4 giorni dopo l’elettroporazione con piccoli RNA interferenti (siRNA)⁸, le cellule sono state ripiastrate dopo l’elettroporazione e riraccolte 3 giorni dopo per la misurazione in tempo reale basata sull’impedenza della migrazione e dell’invasione delle cellule tumorali.

CT10 regolatore della chinasi (Crk) e Crk-like (CrkL) sono proteine adattatrici che mediano le interazioni proteina-proteina a valle di varie vie chinasici del recettore del fattore di crescita e vie tirosin-chinasici non recettoriali¹². Livelli elevati di proteine Crk e CrkL contribuiscono a una prognosi infausta in diversi tumori umani, tra cui il glioblastoma¹³. Tuttavia, non è chiaro come le proteine Crk e CrkL elevate portino a una prognosi infausta. Pertanto, è importante definire l’effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulle funzioni delle cellule tumorali. In precedenza, è stato eseguito uno studio di knockdown genico per dimostrare che i livelli endogeni delle proteine Crk e CrkL sono necessari per la migrazione e l’invasione delle cellule di glioblastoma⁸. Qui, è stato sviluppato un sistema di analisi modificato per affrontare l’effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulla migrazione e l’invasione delle cellule tumorali.

Recentemente, la sintesi in vitro dell’mRNA e le sue applicazioni terapeutiche hanno attirato una rinnovata attenzione a causa dello sviluppo dei vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 (revisionato da Verbeke et ^al.14). Inoltre, sono stati compiuti notevoli progressi nell’uso dell’mRNA sintetico nel cancro e in altre malattie^15,16. L’elettroporazione delle cellule è un metodo efficace per fornire mRNA sintetico e indurre modificazioni genetiche transitorie (revisionato da Campillo-Davo et al.17), e l’uso di mRNA sintetico consente un’espressione genica rapida ed efficiente nei fibroblasti immortalizzati ¹⁸. Questo documento combina la sovraespressione genica utilizzando l’mRNA sintetico con analisi cellulari in tempo reale per studiare la migrazione e l’invasione delle cellule tumorali. Tuttavia, lo schema sperimentale utilizzato per i siRNA non funziona con la trasfezione di mRNA sintetico, poiché il livello di proteine esogene aumenta rapidamente e diminuisce gradualmente dopo la trasfezione di mRNA sintetico¹⁸. Pertanto, il metodo è stato modificato per eseguire l’analisi in tempo reale della migrazione e dell’invasione cellulare subito dopo la trasfezione senza coltivare ulteriormente le cellule.

Questo documento dimostra che la combinazione di misurazioni in tempo reale basate sull’impedenza con la trasfezione di cellule tumorali con mRNA sintetici fornisce un’analisi rapida e completa degli effetti della sovraregolazione genica sulla migrazione e sull’invasione delle cellule tumorali. Questo documento descrive procedure dettagliate per misurare come la migrazione e l’invasione delle cellule di glioblastoma sono influenzate dalla sovraespressione di Crk e CrkL. Esaminando gli effetti dipendenti dalla concentrazione dell’mRNA sintetico sulla migrazione delle cellule tumorali, l’articolo descrive chiaramente come un aumento dei livelli proteici stimoli la migrazione delle cellule tumorali. Inoltre, viene presentato un approccio di variazione della concentrazione del gel ECM per valutare gli effetti dei cambiamenti nell’espressione genica sull’invasione delle cellule tumorali.

Protocol

1. Sintesi dell’mRNA NOTA: Per la sintesi dell’mRNA, tutti i reagenti e le apparecchiature devono essere trattati in modo speciale per inattivare le RNasi prima dell’uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo. Linearizzazione del DNANOTA: I cDNA murini di CrkI e CrkL sono stati clonati nel vettore di espressione pFLAG-CMV-5a per aggiungere il tag de…

Representative Results

Le proteine Crk e CrkL svolgono un ruolo importante nella motilità di molti tipi di cellule, tra cui i neuroni22, le cellule T23, i fibroblasti 18,19 e una varietà di cellule tumorali13. Poiché le proteine Crk e CrkL sono state segnalate per essere elevate nel glioblastoma24,25,26, in questo lavoro sono stati studiati gli effetti della sovraespressione di CrkI, una …

Discussion

La migrazione e l’invasione sono caratteristiche importanti delle cellule tumorali. La misurazione della motilità delle cellule tumorali e la comprensione del meccanismo sottostante che controlla la motilità delle cellule tumorali forniscono informazioni critiche sugli interventi terapeutici ^2,27. Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la migrazione cellulare⁷. Il test di guarigione delle ferite che utilizza graffi o inserti d…

Materials

AlphaImager HP	ProteinSimple	92-13823-00	Agarose gel imaging system
α-Tubulin antibody	Sigma	T9026	Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000)
CIM-plate 16	Agilent Technologies, Inc	5665825001	Cell invasion and migration plates
Crk antibody	BD Biosciences	610035	Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500)
CrkL antibody	Santa Cruz	sc-319	Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500)
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	ATCC	302002	Cell culture medium
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CV	Buffer used to wash cells
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30910.03	Culture medium supplement
Heracell VIOS 160i CO2 incubator	Thermo Scientific	51030285	CO2 incubator
IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32210	Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000)
IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody	Li-Cor	926-32211	Secondary antibody for Western blot analysis  (dilution 1:10,000)
Lithium chloride	Invitrogen	AM9480	Used for RNA precipitation
Matrigel matrix	Corning	354234	Extracellular matrix (ECM) gel
MEGAscript T7 transcription kit	Invitrogen	AM1334	Used for RNA synthesis
Millennium RNA markers	Invitrogen	AM7150	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Mini centrifuge	ISC BioExpress	C1301P-ISC	Used to spin down cells
Mouse brain QUICK-Clone cDNA	TaKaRa	637301	Source of genes (inserts) for cloning
NanoQuant	Tecan	M200PRO	Nucleic acid quantification system
Neon electroporation system	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Electroporation system1
Neon transfection system 10 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK1025	Electroporation kit
Neon transfection system 100 µL kit	ThermoFisher Scientific	MPK10096	Electroporation kit
NorthernMax denaturing gel buffer	Invitrogen	AM8676	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax formaldehyde load dye	Invitrogen	AM8552	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
NorthernMax running buffer	Invitrogen	AM8671	Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis
Nuclease-free water	Teknova	W3331	Used for various reactions during mRNA synthesis
Odyssey CLx Imager	Li-Cor		Imager for Western blot analysis
pcDNA3.1/myc-His	Invitrogen	V80020	The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned
pFLAG-CMV-5a	Millipore Sigma	E7523	Source of the FLAG epitope tag
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Sigma	P2069	Used for DNA extraction
PmeI	New England BioLabs	R0560L	Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis
Poly(A) tailing kit	Invitrogen	AM1350	Used for poly(A) tail reaction
Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style)	Corning	353003	Used for culturing cells before transfection
Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style)	Corning	353001	Used for culturing transfected cells
Proteinase K	Invitrogen	25530049	Used to remove protein in the reaction mixture
Purifier Axiom Class II, Type C1	Labconco Corporation	304410001	Biosafety cabinet for sterile handling of cells
Resuspension Buffer R	ThermoFisher Scientific		A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information.
RNaseZap	Invitrogen	AM9780	RNA decontamination solution
Scepter	Millipore	C85360	Handheld automated cell counter
ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit	Cellscript	C-SCMT0625	Used for capping reaction
ScriptCap m7G capping system	Cellscript	C-SCCE0625	Used for capping reaction
Sodium dodecyl sulfate solution	Invitrogen	15553-035	Detergent used for the proteinase K reaction
Sorvall Legend XT centrifuge	Thermo Scientific	75004532	Benchtop centrifuge to spin down cells
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	Used for dissociation of cells
U-118MG	ATCC	HTB15	An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient
Vinculin antibody	Sigma	V9131	Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000)
xCELLigence RTCA DP	Agilent Technologies, Inc	380601050	Instrument used for real-time cell analysis
1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?).