Præsenteret her er en protokol til generering af formalinfikserede, paraffinindlejrede cellepelletkontroller til immunhistokemi.
Positive og negative kontroller med kendt ekspression af målproteiner er afgørende for udviklingen af immunohistokemiske (IHC) assays. Mens vævskontrol er gavnlig for velkarakteriserede proteiner med definerede vævs- og cellulære ekspressionsmønstre, er de mindre egnede til den indledende udvikling af IHC-assays til nye, dårligt karakteriserede eller allestedsnærværende udtrykte proteiner. Alternativt, på grund af deres standardiserede karakter, kan cellepellets, herunder kræftcellelinjer med definerede protein- eller transkriptionsekspressionsniveauer (f.eks. Høj, medium og lav ekspression), transficerede overekspressive cellelinjer eller cellelinjer med gener slettet gennem celletekniske teknologier som CRISPR, tjene som værdifulde kontroller, især til den indledende antistofkarakterisering og udvælgelse. For at disse cellepiller kan anvendes i udviklingen af IHC-assays til formalinfikserede, paraffinindlejrede væv, skal de behandles og indlejres på en måde, der rekapitulerer de procedurer, der anvendes til vævsbehandling. Denne protokol beskriver en proces til oprettelse og behandling af formalinfaste, paraffinindlejrede cellepelletkontroller, der kan bruges til udvikling af IHC-metoder.
Immunohistokemi (IHC) er en af de mest almindeligt anvendte assays i undersøgende og diagnostisk patologi. Afhængigt af konteksten og analysen bruges IHC til at hjælpe med kræftdiagnose1,2, forudsige behandlingsrespons3,4, identificere patogener5, karakterisere celletyper i syge væv6 og studere biologiske veje og vævsresponser 7,8. I alle situationer er det grundlæggende princip for et IHC-assay, at et antistof binder specifikt til et mål af interesse, oftest et protein, og denne bindingshændelse visualiseres efterfølgende i et vævsafsnit9. En af de største udfordringer ved ethvert IHC-assay er imidlertid at sikre, at antistofferne specifikt detekterer måletfor interesse 10. Antistofspecificitet er en udfordring i de fleste immunassays, men immunhistokemi giver unikke udfordringer, idet der ikke er nogen sekundære foranstaltninger, såsom molekylvægt, til at skelne mellem specifik og uspecifik mærkning. Dette er især besværligt, når man evaluerer dårligt karakteriserede eller allestedsnærværende udtrykte mål, der mangler veldefinerede cellulære lokaliseringsmønstre. Derfor er robuste kontroller, der kan hjælpe med at karakterisere bindingsspecificitet, kritiske, når man udvikler et nyt IHC-assay10.
For mål, der er veldefinerede med karakteristiske cellulære ekspressionsmønstre, anvendes vævskontroller ofte i IHC-metodeudvikling. Baseret på et væld af tidligere data kan man afgøre, om antistoffet mærker vævet, cellen og det subcellulære rum, hvori det vides at blive udtrykt, og at det ikke mærker vævskomponenter, hvor det ikke skal være til stede11. Vævskontrol er imidlertid af begrænset anvendelse for dårligt karakteriserede, nye mål uden kendte ekspressionsmønstre eller for proteiner, der udtrykkes bredt og mangler forskellige ekspressionsmønstre. I begge disse scenarier gør manglen på et veldefineret udtryksmønster det umuligt at skelne specifikt fra ikke-specifik mærkning i væv. I disse situationer tilbyder cellepiller en værdifuld alternativ IHC-kontrol. Cellepelletskontroller kan omfatte: kræft eller andre cellelinjer, der har endogene eller iboende / ikke-inducerede ekspressionsniveauer af det interessante protein, og hvis proteinekspression kan karakteriseres ved western blotting, flowcytometriske analyser eller ekstrapoleres fra transkriptionel profilering; konstruerede cellelinjer, der enten overudtrykker proteinet af interesse eller får det kodende gen af interesse slettet; eller celler, der er blevet behandlet under særlige betingelser for at inducere proteinekspression eller signalerende hændelser af interesse (f.eks. phosphorylering)10,12. Velkarakteriserede proteinekspressionsniveauer i cellelinjer giver også mulighed for evaluering af følsomheden af et assay ved hjælp af et panel af cellelinjer med høj, medium, lav og fraværende proteinekspression. Derudover kan manipulerede cellepiller være værdifulde artsspecifikke kontroller for veterinærarter, for hvilke der kan være begrænset karakterisering eller tilgængelig vævskontrol13. Mens cellepiller har deres begrænsninger, såsom det begrænsede proteom, der er til stede i cellelinjer, der ikke afspejler det forskellige proteom i væv, tjener de som passende kontroller til at bekræfte, at antistoffet kan detektere målet af interesse samt udelukke vilkårlig binding af det primære antistof, sekundært antistof eller andre regenter i assay10.
De fleste væv i diagnostisk og undersøgende patologi er fastgjort i neutral bufferet formalin, dehydreret i en række alkoholer, ryddet i xylen og behandlet og indlejret i paraffinvoks. Formalinfiksering tværbinder proteiner og fiksering og hvert yderligere trin i vævsbehandling kan direkte påvirke proteiner og antistoffers evne til at detektere dem 9,14. Derfor er det vigtigt, at alle kontroller, der anvendes i et IHC-assay, gennemgår de samme fikserings-, vævsbehandlings- og indlejringsprocedurer. Denne artikel beskriver de unikke overvejelser om at behandle og integrere dyrkede celler til at fungere som kontroller til udvikling af IHC-assays i formalinfikseret paraffinindlejret væv, hvor metoden primært fokuserer på håndtering og behandling af cellepellet i et histologisk laboratorium.
Denne protokol beskriver en metode til at generere formalinfikserede, paraffinindlejrede cellepellets, der kan bruges som kontroller til downstream immunohistokemi og in situ hybridiseringsundersøgelser. De histologimetoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes på en bred vifte af kræft- og primære cellelinjer og tilpasser primært rutinemæssige histologiteknikker til fremstilling af disse pellets17,18. Når de behandles og indlejres, kan pellets bruges på samme måde som væv. Dette inkluderer brug af dem med varmeinducerede og enzymatiske antigenhentningsprotokoller til immunohistokemiske eksperimenter. Et mål med de metoder, der anvendes i denne protokol, er at bevare cellernes morfologi og antigenicitet gennem hele processen. Derfor anvendes EDTA, som er relativt skånsom med hensyn til ændringer i både morfologi og antigenicitet, til at løsne cellerne. Dette betyder ikke, at andre tilgange, såsom fysisk forstyrrelse, ikke er levedygtige; Enhver tilgang til at løsne celler bør dog sikre, at cellerne ikke skades i processen. Det andet formål med denne protokol er at fiksere og behandle cellerne på en måde, der ligner væv, ved hjælp af det samme fikseringsmiddel, fikseringsforhold, behandlingsplan (fiksering, dehydrering, rydning og paraffininfiltration) og indlejringsteknikker, så de kan tjene som sammenlignelige kontroller til nedstrøms assays. Derfor bør fikserings- og behandlingsmetoderne, der anvendes til at generere cellepellets, efterligne de tilgange, der anvendes til væv.
Den protokol, der er beskrevet i denne rapport, er ikke tilpasset til at håndtere celler med smitsomme stoffer, såsom celler inficeret med patogene bakterier eller vira, da celler løsnes, opsamles og centrifugeres før fiksering. Efterforskere kan overveje protokoller til at fikse cellerne før løsrivelse, men dette ville kræve yderligere optimering for at indsamle cellerne uden at forstyrre cellemorfologien. Desuden kræver fikseringstider og håndteringsbetingelser for celler med infektiøse agenser yderligere overvejelser baseret på det infektiøse middel og tilhørende institutionelle biosikkerhedsprotokoller.
Formalinfaste, paraffinindlejrede cellepiller er unikt fordelagtige ved at have veldefinerede proteinekspressionsniveauer10. Mens kræft og endogene cellelinjer tilbyder et udvalg af celler med varierende niveauer af proteinekspression, gør genteknologiske teknologier det muligt for forskere at modellere proteinekspressionen gennem overekspressive proteiner af interesse og brugen af CRISPR-teknologier til at udskære eller indsætte kodningsgener af interesse20,21 . Ulempen ved overudtrykte proteiner i cellelinjer er, at de er dårlige mål for følsomheden af et assay, da de muligvis ikke repræsenterer endogene proteinniveauer22. I modsætning hertil kan både endogene cellelinjer og kræftcellelinjer bedre repræsentere endogene ekspressionsniveauer, og CRISPR-medieret sletning af kodningsgenet i en beslægtet linje kan tjene som en tilsvarende negativ kontrol. Desuden er endogene cellelinjer eller kræftcellelinjer med varierende niveauer af proteinekspression ideelle til titreringseksperimenter til at vælge endelige antistoffortyndinger og bedst forstå følsomheden af et assay (figur 2). Beslutningen om, hvilke cellelinjer der skal bruges, skal baseres på individuelle eksperimentelle behov og vil ofte bruge en kombination af tilgange.
Ud over at evaluere, om et antistof kan detektere proteinet af interesse, kan et panel af cellelinjer bruges til at definere et antistofs specificitet. For eksempel kan et panel af cellelinjer, der individuelt udtrykker en familie af nært beslægtede proteiner, bruges til at teste, om et antistof er specifikt for et individuelt protein, eller om det også detekterer andre nært beslægtede proteiner. Mere detaljerede kontroller kan indebære brug af cellelinjer, der enten gennem CRISPR-knock-in eller gennem overekspression udtrykker proteiner med punktmutationer, der ikke kan gennemgå specifikke signalhændelser, der detekteres (f.eks. mutation i specifikke fosforyleringssteder, når man vurderer et fosfospecifikt antistof). Selv om der er tale om mere komplekse fremgangsmåder, kan det være nødvendigt at bekræfte, at antistoffet kun anvendes etiketter under særlige omstændigheder10.
Det er vigtigt at bemærke, at genetiske manipulationer af cellelinjer muligvis ikke genererer en homogen cellepopulation. For eksempel er transfektionseffektiviteten i overekspression af cellelinjer typisk ikke 100%, og nogle celler overudtrykker muligvis ikke proteinet af interesse. Inkludering af FLAG eller et relateret tag i transfektionen, der kan detekteres med standardmetoder, kan være nyttigt til at vurdere transfektionseffektiviteten af cellelinjen23. Dette kan være nyttigt både for at afgøre, om transfektion var vellykket og udelukke manglende detektion på grund af proteinekspressionen, og for at tjene som reference for den forventede andel af celler, der skal udtrykke proteinet af interesse.
In situ hybridisering (ISH) kan også være et gavnligt værktøj til at karakterisere målgenekspressionen i cellepiller og informere IHC-metodeudvikling10. Ved screening af antistoffer kan det være informativt at vide, hvornår transkriptet og dermed det potentielle protein kan påvises. Derudover kan cellepellet ISH-screening være gavnlig for ISH-metodeudvikling. Mens specificitet er mindre hyppigt et problem for ISH-assays, er det stadig vigtigt at have passende kontroller og lignende overvejelser til udvikling og udnyttelse af kontroller, der kan anvendes på ISH-undersøgelser.
Vævsmikroarrays skabes ved at fjerne kerner fra donorblokke og overføre disse kerner, ofte i et gittermønster, til en modtagerparaffinblok. I sidste ende indeholder modtagerblokken et spektrum af prøver i en enkelt blok, hvilket gør det muligt for alle prøverne i blokken at gennemgå identiske IHC-procedurer og giver mulighed for direkte sammenligning af flere prøver på samme dias24,25. Da cellepiller er relativt ensartede populationer, kan de nøjagtigt repræsenteres af 1 mm kerner, hvilket gør dem ideelle kandidater til optagelse i lignende arrays. Ved hjælp af et cellepelletarray er det muligt at inkludere cellepiller med varierende udtryksniveauer, cellepellets, der unikt udtrykker relaterede proteiner, og cellepellets, der udtrykker orthologs af proteinet af interesse fra forskellige arter i et enkelt dias (figur 3). Dette gør det muligt at evaluere alle cellepiller samtidigt under ensartede forhold på en hurtig måde, samtidig med at brugen af reagenser25 minimeres.
Et mindste startcellepelletvolumen på 2 ml indsamlet fra otte T175-kolber anbefales til denne protokol. Dette volumen giver mulighed for produktion og arkivering af flere cellepelletblokke, så cellepelletskontroller kan standardiseres over længere perioder, og der kan oprettes flere cellepelletarrays fra en given pellet. Lavere cellepelletvolumener kan bruges, når man beskæftiger sig med primære patientafledte cellelinjer, langsomt voksende cellelinjer, eller når forholdene begrænser prøvens volumen. Selvfølgelig vil lavere startvolumener forstærke den negative virkning af ethvert celletab under fiksering og forberedelse af pelleten og vil begrænse det materiale, der er tilgængeligt til downstream-processer. Det er især vigtigt at være forsigtig, når du fjerner fikseringsmiddel efter centrifugering, for at minimere ethvert tilknyttet tab. For lavere prøvevolumener kan et 1,5 ml centrifugerør med låg bruges til at pelletere cellerne. Disse rør kan gennemskæres i længderetningen med et blad til behandling.
I lighed med vævsfiksering er cellefiksering i denne pille afgørende for nedstrøms IHC-vurderinger. For at opnå fuldstændig fiksering bruger vi mindst et 10: 1 formalin til cellepelletforhold og inverterer det koniske rør for at opretholde cellerne i suspension. Hvis cellerne ikke er i suspension på tidspunktet for fiksering, er der risiko for ufuldstændig eller utilstrækkelig fiksering, hvilket vil påvirke downstream immunolabeling. Ofte manifesterer dette sig som stærk mærkning i periferien og tab af mærkning i midten af pelleten eller mærkning af variabel intensitet i hele pelleten.
Denne protokol bruger Histogel, som primært består af hydroxyethylagarose, til både at binde cellepellet og gøre det muligt for cellerne at blive jævnt fordelt i hele cellepelleten. Uden det bliver celler komprimeret og mister deres cytomorfologiske detaljer. Disse cytomorfologiske detaljer er ofte vigtige under antistofscreening, da de giver yderligere oplysninger om, hvorvidt antistoffet er mærket i det relevante subcellulære rum (f.eks. Kernen, cytoplasmaet eller plasmamembranen). I modsætning hertil kan for meget gel resultere i lavere celletætheder i pelleten, hvilket fører til, at cellerne distribueres bredt og reducerer cellenumrene pr. Sektion.
Denne protokol kan rutinemæssigt bruges til at udvikle IHC-kontroller. De materialer, der er nødvendige for at skabe disse pellets, er almindelige i undersøgelsesbiologi og histologilaboratorier, og metoderne er ligetil og nemme at tilpasse. Mens cellepiller har begrænsninger som IHC-kontroller, fungerer de som gode værktøjer til indledende antistofscreening og supplerer andre vævskontroller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne anerkende samarbejdet mellem vores kolleger i Genentechs forskningsorganisation og især patologikernelaboratorierne (P-core), der har bidraget til udviklingen af disse metoder gennem årene.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
Flex 100 | Epredia | 8101 | |
Flex 95 | Epredia | 8201 | |
Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
Xylenes | VWR | 89370-088 |