Summary

Generazione di un modello di decidualizzazione artificiale del topo con ovariectomia per la ricerca sulla decidualizzazione endometriale

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Qui, descriviamo il metodo per generare un modello di decidualizzazione artificiale usando il topo ovariectomizzato, un classico esperimento di decidualizzazione endometriale nel campo di ricerca della decidualizzazione endometriale.

Abstract

La decidualizzazione endometriale è un processo di differenziazione unico dell’endometrio, strettamente correlato alle mestruazioni e alla gravidanza. La compromissione della decidualizzazione porta a vari disturbi dell’endometrio, come l’infertilità, l’aborto spontaneo ricorrente e la nascita pretermine. Lo sviluppo e l’uso del modello di decidualizzazione endometriale negli studi riproduttivi sono stati un punto culminante per i ricercatori riproduttivi per molto tempo. Il topo è stato ampiamente utilizzato nello studio della riproduzione e della decidualizzazione. Esistono tre modelli murini ben consolidati per quanto riguarda la decidualizzazione, vale a dire la decidualizzazione naturale della gravidanza (NPD), la decidualizzazione artificiale (AD) e la decidualizzazione in vitro (IVD). Tra questi, AD è considerato un modello affidabile per la decidualizzazione del mouse, che è facile da implementare e vicino a NPD. Questo articolo si concentra su un metodo modificato del processo di generazione e applicazione del modello di decidualizzazione artificiale del topo con ovariectomia per evitare effetti ovarici, che possono ottenere risultati altamente riproducibili con piccole variazioni all’interno del gruppo. Questo metodo fornisce un modello animale buono e affidabile per lo studio della decidualizzazione endometriale.

Introduction

Con lo sviluppo della tecnologia di riproduzione assistita dall’uomo, l’attuale tasso di gravidanza clinica di fecondazione in vitro-trasferimento di embrioni (IVF-ET) ha raggiunto o addirittura superato quello della gravidanza naturale. Nonostante ciò, molte pazienti nella pratica clinica della riproduzione assistita si sottopongono ancora a trasferimenti multipli di embrioni ma non riescono a ottenere la gravidanza come desiderato. Tuttavia, il suo specifico meccanismo molecolare non è ancora chiaro, quindi l’intervento clinico è inefficace, che è una delle sfide significative che la medicina riproduttiva deve affrontare 1,2.

I fattori endometriali rappresentano circa i due terzi delle cause del fallimento della fecondazione in vitro3. L’impianto dell’embrione umano è diviso in tre fasi: posizionamento, adesione e invasione 4,5,6. L’endometrio materno subisce una serie di cambiamenti per andare incontro all’arrivo dell’embrione. La formazione di un “periodo finestra” di impianto fornisce condizioni favorevoli per l’impianto dell’embrione 7,8.

Nella maggior parte dei mammiferi, dopo che la blastocisti aderisce all’epitelio luminale dell’utero, le cellule stromali che circondano la blastocisti iniziano rapidamente a proliferare e differenziarsi, e il rapido rimodellamento del mesenchima cambia la sua forma e funzione, portando all’impianto dell’embrione 5,9,10. Il rapido aumento del volume e del peso del sito consente alla blastocisti di essere incorporata nello stroma uterino, un processo noto come decidualizzazione11. Lo stroma endometriale si differenzia e si rimodella in preparazione alla gravidanza, mentre la transizione delle cellule stromali fornisce spazio e nuove connessioni di segnalazione per le cellule deciduali per svolgere le loro funzioni12,13. Le cellule stromali si trasformano in cellule deciduali e secernono molti fattori iconici come la prolattina (PRL), la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile 1 (Igfbp1) e così via. Gli studi hanno dimostrato che la decidualizzazione anormale è una delle ragioni principali del fallimento dell’impianto dell’embrione, ma la causa della decidualizzazione anormale non è ancora chiara e deve essere ulteriormente chiarita 1,14.

Il modello di decidualizzazione artificiale del topo è essenziale per studiare il processo fisiologico e i meccanismi molecolari alla base della decidualizzazione. La decidualizzazione artificiale (AD) si riferisce principalmente al processo di decidualizzazione endometriale stabilito da metodi artificiali per simulare la gravidanza o il ciclo mestruale. In termini di morfologia, c’è poca differenza complessiva tra decidualizzazione della gravidanza e decidualizzazione artificiale15,16. Le ghiandole uterine esistono nell’endometrio prima della formazione decidua e scompaiono dopo la decidualizzazione. Per quanto riguarda l’espressione genica, è stata identificata solo una leggera differenza tra la decidualizzazione naturale della gravidanza (NPD) e l’AD15. Di conseguenza, il modello di decidualizzazione artificiale nei topi può simulare la decidualizzazione della gravidanza per esplorare la patogenesi sconosciuta e il nuovo trattamento delle malattie riproduttive umane.

NPD, AD e decidualizzazione in vitro (IVD) sono tre metodi per ottenere la decidualizzazione del topo. Il modello NPD dipende dalla gravidanza naturale ed è più vicino allo stato fisiologico materno, compresi gli effetti degli embrioni. Confrontare le differenze tra siti di impianto e non impianto è un approccio più fisiologico e conveniente per studiare la decidualizzazione. Il modello AD è stato sviluppato utilizzando un’iniezione intrauterina di olio di sesamo come stimolante per indurre la decidualizzazione in un topo femmina pseudogravido accoppiato con maschi vasectomizzati per evitare l’impatto degli embrioni. Entrambi i modelli NPD e AD svolgono ruoli essenziali in diversi scopi di ricerca, ma non possono evitare il fallimento dell’accoppiamento e le differenze all’interno del gruppo causate dalle diverse attività del metabolismo ormonale materno. IVD è un metodo che dipende dal trattamento combinato di estrogeni e progesterone a livello cellulare, che richiede condizioni sperimentali più rigorose e capacità operativa. Tuttavia, il modello in vitro non può simulare completamente la risposta deciduale in condizioni fisiologiche15. Pertanto, proponiamo un metodo di induzione semplice e migliorato modificato dall’AD tradizionale per ridurre l’effetto degli ormoni endogeni sulla decidualizzazione. Basato sul garantire il successo dell’induzione della decidualizzazione, è più vicino allo stato fisiologico e più adatto per esperimenti che devono escludere fattori embrionali.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l’uso e la cura degli animali della Scuola medica dell’Università di Nanchino (n. 20171202). Tutte le operazioni seguono le linee guida nazionali e dell’agenzia per la cura e l’uso degli animali. NOTA: I topi sono stati allevati in un ambiente specifico privo di agenti patogeni (SPF), con una temperatura di 22 °C ± 1 °C, umidità relativa del 50% ± 1%, un ciclo luce/buio di 12 h/12 h e libero accesso al ci…

Representative Results

Gli indici del modello di decidualizzazione del topo includono la morfologia generale dell’utero, il rapporto di massa dell’utero decidualizzato e non decidualizzato, la morfologia istologica dell’endometrio e il livello di espressione delle molecole marcatrici di decidualizzazione. La morfologia generale dell’utero artificiale decidualizzato dei topi indotto dall’olio è più vicina a quella dell’utero in gravidanza. Il corpo uterino diventa spesso e la cavità uterina diventa più piccola del lato non indotto. Il volum…

Discussion

La decidualizzazione nei topi è un processo spontaneo che dipende dalla presenza di embrioni, che è diverso dagli esseri umani. Tuttavia, è stato scoperto che la stimolazione artificiale come l’iniezione uterina di perle di vetro e la lacerazione uterina può indurre la decidualizzazione dell’endometrio anziché degli embrioni. Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che molti fattori potrebbero indurre deciduali o partecipare alla decidualizzazione, come l’iniezione di ormoni steroidei, prostaglandine e fattori inibito…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della National Nature Science Foundation of China (82001629, XQS), del Youth Program of Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (BK20200116, XQS) e del Jiangsu Province Postdoctoral Research Funding (2021K277B, XQS).

Materials

Estrogen Sigma E2758 Hormone supplement
Progesterone Sigma P0130 Hormone supplement
Sesame oil  Sigma S3547 Hormone supplement
Sodium pentobarbital  Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd. Anaesthesia
Meloxicam injection Qilu Animal Health Products Co., Ltd Analgesia
Alkaline phophatase stain kit(kaplow's/azo coupling method) Solarbio G1480 Alkaline phophatase stain
Eosin Servicebio G1005-2 HE stain
Hematoxylin Servicebio G1005-1 HE stain
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix Vazyme Q711-02 qPCR
70% ethanol Lircon ZH1120090 Disinfect
Iodophor Runzekang RZK-DF Disinfect
Erythromycin Eye Ointment Guangzhou Baiyunshan Mice eyeball protect
4-0 suture Ethicon W329 Incision suture
10% formalin Yulu L25010118 Tissue fix
Optimal cutting temperature compound Sakura 4583 Ssection
Trizol reagent Ambion 15596018 qPCR

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Cite This Article
Zhang, Y., Zhang, Z., Kang, N., Sheng, X. Generation of a Mouse Artificial Decidualization Model with Ovariectomy for Endometrial Decidualization Research. J. Vis. Exp. (185), e64278, doi:10.3791/64278 (2022).

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