Summary
该协议允许在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导病毒裂解循环时从人P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。随后从病毒制剂中提取DNA,并进行实时PCR以量化病毒颗粒浓度。
Abstract
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV),正式名称为 人类疱疹病毒4 (HHV-4),是第一个分离的人类肿瘤病毒。世界上近90-95%的成年人口感染了EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展, 体外 和 体内 实验模型的应用为EBV在许多疾病的发病机制以及EBV相关的肿瘤发生提供了深刻而有意义的见解。这篇可视化实验论文的目的是概述从P3HR1细胞系细胞中分离EBV病毒颗粒,然后对病毒制剂进行定量。P3HR1细胞最初是从人伯基特淋巴瘤中分离出来的,可以产生P3HR1病毒,这是一种2型EBV毒株。通过用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)处理,可以在这些P3HR1细胞中诱导EBV裂解循环,产生EBV病毒颗粒。
使用该协议分离EBV颗粒,将P3HR1细胞在含有35ng / mL PMA的完整RPMI-1640培养基中在37°C和5%CO2 下培养5天。随后,将培养基以120× g 的速度离心8分钟以沉淀细胞。然后收集含病毒的上清液并以16,000× g 的速度旋转90分钟以沉淀EBV颗粒。然后将病毒沉淀重悬于完整的RPMI-1640培养基中。随后进行DNA提取和定量实时PCR,以评估制剂中EBV颗粒的浓度。
Introduction
EB病毒(EBV)是第一个被分离出来的人类肿瘤病毒1。EB病毒,正式名称为 人类疱疹病毒4 (HHV-4)2,是疱疹病毒家族的γ疱疹病毒亚科的一部分,是 淋巴密码病毒 属的原型。世界上近90-95%的成年人口感染了该病毒3。在大多数情况下,初始感染发生在生命的前 3 年内并且是无症状的,但是,如果感染发生在青春期后期,则可能会引起称为传染性单核细胞增多症的疾病4。EBV能够感染静息的B细胞,诱导它们成为增殖的B淋巴母细胞,其中病毒建立并维持潜伏感染状态5。EB病毒可以随时重新激活,从而导致复发性感染6。
在过去的50年中,某些病毒与人类恶性肿瘤发展之间的关联变得越来越明显,今天估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关7。疱疹病毒,包括EB病毒,是这些类型肿瘤病毒中研究得最好的例子8。事实上,EBV可引起多种类型的人类恶性肿瘤,如伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤和免疫功能低下的宿主的淋巴组织增生性疾病9,10。EB病毒也被证明与系统性自身免疫性疾病的发展有关。这些自身免疫性疾病的一些例子是类风湿性关节炎 (RA)、多发性肌炎-皮肌炎 (PM-DM)、系统性红斑狼疮 (SLE)、混合性结缔组织病 (MCTD) 和干燥综合征 (SS)11。EB病毒也与炎症性肠病(IBD)的发展有关12。
许多这些疾病可以使用细胞培养物,小鼠或其他感染EBV的生物体进行研究或建模。这就是为什么需要EBV颗粒来感染细胞或生物体,无论是体外还是体内模型13,14,15,16,因此需要开发一种能够以低成本分离病毒颗粒的技术。此处描述的方案提供了一种简单的方法,可以从相对容易获得的细胞系中可靠地分离EBV颗粒,并使用实时荧光定量PCR对颗粒进行定量,这是经济高效的,并且大多数实验室都可以轻松获得。这是与已经描述的从不同细胞系中分离EBV的其他几种方法相比17,18,19,20。
P3HR-1是一种在悬浮液中生长并潜伏感染EBV 2型菌株的BL细胞系。该细胞系是EBV生产者,可以诱导产生病毒颗粒。本手稿的目的是展示一种允许从P3HR-1细胞系中分离EBV颗粒的方法,然后对病毒储液进行定量,以后可用于 体外 和 体内 EBV实验模型。
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Protocol
注意:EB病毒应被视为潜在的生物危害性材料,因此应在生物安全2级或更高遏制下处理。应穿实验室外套和手套。如果有可能接触到飞溅物,还应考虑保护眼睛。以下程序应在生物安全柜中进行。
1. 计数 P3HR1 细胞
- 离心和重悬细胞
- 将细胞悬液从正在进行的P3HR1细胞培养物的100 mm培养板(或T-25烧瓶)中以80%汇合度转移到15 mL锥形管中。P3HR-1 细胞的接种密度为 1 x 106 个细胞/mL。在37°C和5%CO2下维持在完全RPMI培养基(79%RPMI培养基,20%胎牛血清,1%Pen-Strep抗生素)中,每3-4天传代一次。
- 以120 x g 离心8分钟。离心后,弃去上清液,将细胞沉淀重悬于1mL完全RPMI培养基中,并充分混合(该溶液将称为悬浮液A)。
- 准备细胞悬液以进行计数
- 通过将 2 μL 细胞悬液 A 与 8 μL 培养基混合来制备稀释的细胞悬液 B。向悬浮液 B 中加入 10 μL 0.4% 台盼蓝以获得悬浮液 C.通过轻轻移液充分混合制剂。
- 使用血细胞计数器计数细胞
- 将玻璃盖玻片放在血细胞计数器上并加载10μL悬浮液C.将血细胞计数器置于光学显微镜下,并使用40倍显微镜物镜计数血细胞计数器室四个象限中每个象限中未染成蓝色的细胞数量(图1)。
- 台盼蓝将死细胞染成蓝色;不要计数这些细胞,也不要计数接触每个血细胞计数器象限的任何顶部、底部、右侧或左侧边界的细胞。
- 使用以下公式计算每毫升细胞浓度:
注意:计数的象限数为四个,10-4 mL是血细胞计数器上方块的体积。应该计数的四个象限在 图1中以绿色表示。公式中 计数的单元格总数 是象限 1、2、3 和 4 中单元格数的总和。 应计数图 1 中以蓝色表示的单元格,而不应计数红色单元格,因为它们接触象限的上、右、下或左边框。
图1:使用血细胞计数器室进行细胞计数。 使用光学显微镜计数四个象限;这些象限以绿色表示。此处描述的协议的步骤1.3.3中指示的公式中 计数的细胞总数 是象限1,2,3和4中细胞数的总和。应计算蓝色表示的单元格,而红色单元格不应计数,因为它们触及象限的顶部、右侧、底部或左侧边框 请单击此处查看此图的大图。
2. 准备培养板
- 将一定体积的细胞悬液 A 放入 15 mL 锥形管中。所需的体积取决于细胞计数。调整体积,使100 mm培养板的细胞数量约为2.2 x 106 个细胞。
- 向管中加入 5 mL 完全培养基,然后将管中的内容物转移到 100 mm 培养板中。向培养板中加入 80 μL 二甲基亚砜 (DMSO)。
注意:DMSO对光敏感,因此应存放在耐光容器中或用铝箔等不透明材料覆盖。 - 向试管中加入 350 μL 1 mg/mL 佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 (PMA)。PMA的最终浓度应为35 ng/mL,DMSO的最终浓度应为0.08%。
注意:PMA有毒,腐蚀性和致癌性,因此应格外小心地处理。PMA对光敏感,因此应存放在耐光容器中或用铝箔等不透明材料覆盖。 - 加入 4.27 mL 培养基,使总体积为 10 mL。通过倾斜混合管的内容物,然后将内容物转移到100mm培养板中。将板在细胞培养箱中在37°C,5%CO2下放置5天。
3. EB病毒颗粒的诱导和分离
- 在培养箱中5天后,将板的内容物以120× g 离心8分钟以沉淀细胞。收集无细胞,含病毒的上清液并丢弃细胞沉淀。
- 将上清液在4°C下以16,000× g 离心90分钟以沉淀病毒颗粒。弃去上清液并将病毒沉淀重悬于5mL培养基中。
注意:磷酸盐缓冲盐水(PBS)可用于重悬病毒沉淀而不是培养基。 - 将获得的病毒悬液等分到 20 个试管中,每个管含有 250 μL 病毒悬液。将悬浮液储存在-80°C。
4. 从病毒颗粒中提取DNA
注意:处理苯酚时应格外小心,因为它有毒且具有腐蚀性,并且能够引起严重烧伤。苯酚对光敏感,与光或空气接触时会氧化。将其存放在耐光容器中,或者用铝箔等不透明材料覆盖苯酚管。
- 从DNA中分离蛋白质
- 将 500 μL TrisCl 饱和苯酚加入 250 μL 试管之一中。加入 100 μL 水(以增加水相的体积)并充分涡旋以获得粉红色乳液。以9650 x g 离心15分钟。
- 脱氧核糖核酸沉淀
- 收集上清液(透明水相)并将其转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。
- 加入相当于上清液体积的1/10的冷醋酸钠(3M,pH 5.2),并通过上下移液混合。加入 1 μL 20 mg/mL 糖原,通过移液混合。
注意:此步骤是可选的,但添加糖原可增强DNA沉淀,并使DNA沉淀更容易可视化。 - 加入三倍于上清液体积的冷100%乙醇。在-80°C下储存过夜。
注意:可以在此处停止该过程,以便稍后恢复。样品可以在-80°C下储存1小时,或者过夜。过夜储存可增强DNA沉淀,因此建议使用。
- 分离病毒基因
- 第二天,在4°C下以9650× g 离心15分钟,弃去上清液以获得DNA沉淀。
- 用1mL冷的70%乙醇洗涤沉淀三次,以9650× g 离心15分钟,弃去上清液。
- 将颗粒风干约10分钟。将沉淀重悬于10-50μL无核酸酶蒸馏水中(取决于DNA沉淀的大小)。
- 将样品储存在-20°C下进行后续处理,或在4°C下过夜,以确保最大的DNA溶解度,然后在-20°C下储存。 或者,直接继续执行步骤 5。
5. 检查DNA浓度和纯度
- 用精密的任务擦拭器清洁显微分光光度计的基座后,加载 1 μL DNA 制备物。
- 注意样品中DNA的浓度。检查两者的吸光度比和。DNA将在260 nm吸收,蛋白质将在280 nm吸收,而苯酚等有机物质将在230 nm吸收。1.8-2的比率被认为足以进行实时荧光定量PCR。
6. 通过实时聚合酶链反应进行定量
- PCR反应混合物的制备
- 将 5 μL 的 SYBR 绿色实时荧光定量 PCR 混合物放入 0.2 mL PCR 管中。向每个试管中加入 1 μL 7.5 pmol/μL 正向引物和 1 μL 7.5 pmol/μL 反向引物。正向引物序列:5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3';反向引物序列:5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'。扩增以确定EBV基因组拷贝数的基因是 EB病毒小RNA 2(EBER-2) 基因。
- 向其中一个试管中加入步骤 4 中的 2 μL 无核酸酶水和 1 μL 病毒 DNA。反应混合物的总体积为10μL。
注意:根据样品中DNA的浓度,可能需要稀释步骤。应注意稀释因子F,并将在步骤6.3中整合到公式中。 - 准备其他将用作具有已知EBV基因组拷贝数(1000,2000,5000,10,000和54,000拷贝)的标准品的试管。
- 运行PCR混合物,首先在95°C下活化5分钟,然后在95°C和58°C(退火)下分别运行40个循环15秒和30秒。
- 通过将标准的Ct值与每个标准管的EBV基因组拷贝数的对数绘制来生成qPCR标准曲线。采用标准曲线图方程,得出含有诱导病毒DNA的PCR管中EBV基因组拷贝数。然后,使用以下公式计算诱导的病毒制剂的浓度:
其中X是从标准曲线得出的EBV基因组拷贝数,F是用于建立每个PCR反应使用的DNA的稀释因子。
7. 检查病毒颗粒的生物活性/感染性
- 将BC-3细胞从80%汇合度的100 mm培养板转移到15 mL锥形管中。P3HR-1 细胞的接种密度为 1 x 106 个细胞/mL。在37°C和5%CO2下维持在完全RPMI培养基(79%RPMI培养基,20%胎牛血清,1%Pen-Strep抗生素)中,每3-4天传代一次。
- 以与通过步骤1计数P3HR-1细胞相同的方式计数BC-3细胞。向96孔板中,向每个孔中加入10个5 BC-3 细胞。使用 3 个、6 个、9 个或 12 个孔来确保结果的重要性并最大限度地减少误差。
- 根据步骤6.3中确定的病毒制剂的浓度,向每个孔中加入一定体积的病毒储备液。MOI 可能会有所不同,并且该协议的优化将揭示感染的最佳 MOI(建议 MOI 范围为 2-50)。确保每个孔中存在的混合物的总体积为 250 μL。
- 要确定所需的体积,应知道病毒储液的浓度,并应选择MOI。例如,如果MOI为2,则添加的病毒颗粒数量应该是细胞数量的两倍。使用以下公式计算所需病毒储液的体积 V : ,n 是所需的病毒颗粒数,C 是已知浓度的病毒储液
- 将96孔板的内容物孵育5天。5天后,将每个孔的内容物转移到1.5 mL管中。
- 将试管以120× g 离心8分钟,以将细胞与含病毒的培养基分离。对细胞沉淀和上清液进行DNA提取,然后进行实时PCR定量,以检查每个部分中是否存在病毒基因组,从而评估病毒颗粒的感染性。
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Representative Results
该程序的目标是在具有已知病毒滴度的悬浮液中分离EBV颗粒,随后可用于模拟EBV感染。因此,使用不同试剂的最佳浓度以获得最高的EBV产量至关重要。
进行优化试验以确定产生最多EBV颗粒的PMA和DMSO浓度(图2)。DMSO浓度为0.8%,PMA浓度为35 ng/μL是最佳的,并导致高EBV浓度。从优化方案获得的病毒颗粒浓度为917,471个病毒颗粒/μL。
图 2:用佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 (PMA) 诱导 P3HR-1 细胞时获得的 EBV DNA 拷贝/mL。 P3HR-1细胞(105 个细胞)单独培养或使用此处描述的方案用不同浓度的PMA和DMSO诱导。误差线表示标准偏差。对PMA / PMA和DMSO处理的细胞与对照细胞进行了比较的学生t检验;* 表示 p < 0.05。 请点击此处查看此图的大图。
为了使该协议被认为是有效的,步骤6应显示合理浓度的病毒颗粒,步骤7应显示这些病毒颗粒确实具有传染性。步骤7中使用的BC-3细胞系是EBV阴性的,因此在定量阴性对照(未受此协议约束)中的EBV基因组拷贝数时,不应检测到EBV DNA。
然而,EBV DNA应在实验孔(经受此协议约束)的细胞和培养基中检测,原因如下:感染BC-3细胞的EBV将在这些细胞内复制,考虑到EBV DNA将在细胞沉淀中检测到的事实,并且在复制时,BC-3细胞会将病毒颗粒脱落到外部;因此,将在培养基上清液中检测EBV DNA(DNA提取后)。
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Discussion
EBV颗粒的产生对于了解该病毒的生物学及其相关疾病是必要的。在这里,我们描述了从P3HR-1细胞系中产生这些颗粒的过程。该细胞系不是唯一的EBV生产者系;事实上,EBV颗粒也已从B95-8细胞21,22以及Raji细胞系18,19中分离出来。EBV裂解循环已在这些细胞中用正丁酸盐诱导。或者,可以使用佛波醇酯,例如12-O-十四烷酰佛波-13-乙酸酯(TPA),也称为佛波醇12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)。总体而言,此处详述的方案可用于使用这些细胞而不是P3HR-1系。然而,B95-8系来源于棉顶狨(Saguinus oedipus),目前被归类为极度濒危的灵长类物种23;因此,这条线很少被供应商出售,对其销售和运输有限制。《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)还要求联合王国境外的所有订单获得许可证。虽然Raji细胞系是市售的,但在被化学物质诱导后,复制病毒DNA的合成和病毒衣壳抗原(VCA)的产生不会在这些细胞中发生24,25。然而,这些可以很容易地通过与从P3HR-1细胞20分离的EBV重叠感染后的互补诱导。
由于没有用于计数EBV颗粒26的直接斑块测定,我们依赖于实时聚合酶链反应。还有其他定量方法可能同样适用于我们的目的,例如使用荧光探针的免疫荧光或PCR,可以提供增强的特异性。选择使用基因组拷贝标准品的实时荧光定量PCR是基于这样一个事实,即大多数实验室都可以轻松获得,费力更低,技术挑战性更小,并且更具成本效益27。因此,其他量化方法也可以同样有效,可以根据可用性和经验使用。
此处详述的协议中最关键的步骤之一是在步骤2.1中对细胞进行电镀,并在板尺寸推荐的范围内接种细胞编号。少量细胞产生低浓度的病毒颗粒,而大量细胞会挤满板,抑制细胞的生长和复制,从而减缓病毒的裂解周期。这就是为什么在步骤1中计数细胞,计算所需的悬浮液A体积,并在步骤2中最后电镀细胞时应格外小心。
该协议的局限性是假设EBV基因组的一个拷贝对应于一个病毒颗粒。虽然这种假设是合理的,但这种颗粒是否有缺陷或不完全不能用这种测定法来检测。由于没有像许多其他病毒那样对EBV进行斑块形成测定,因此DNA提取和实时PCR仍然是定量病毒制备的公认方法。另一个限制是病毒是由连续的哺乳动物细胞系诱导的,该细胞系可能在多轮传代中积累突变。这种突变可能会影响病毒本身,可能导致病毒的 体内 或 离体 特性改变。一个潜在的解决方案是定期对细胞和病毒基因组进行测序。或者,可以在几次传代后丢弃细胞,并且可以从先前传代次数较少的液氮储存细胞样品重新开始培养。还值得注意的是,从P3HR-1细胞系获得的EBV颗粒缺乏EBNA2抗原,EBNA2抗原通常在潜伏感染EBV的B淋巴细胞中表达,作为六种病毒核蛋白的一部分,总共28种。EBNA2蛋白激活表达与EBV潜伏期III型相关的蛋白质的基因启动子。然而,最近的研究表明,EBNA2缺陷的EBV能够在CBH小鼠中形成肿瘤,因此P3HR-1细胞系仍然是EBV阳性淋巴瘤的有用模型29。另一方面,来自P3HR-1细胞的EBV可用于研究EBNA2所起的作用,同时使用EBNA2阳性EBV作为对照。综上所述,从连续的P3HR-1细胞系获得的EBV具有重要的研究价值;它可用于研究EBV的生物学,传染性,毒力以及许多其他特性。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作的资金得到了阿斯马尔研究基金、黎巴嫩国家科学研究委员会(L-CNRS)和贝鲁特美国大学医疗实践计划(MPP)对ER的赠款的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
100x20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
DMSO | Amresco | 0231 | |
DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
Phenol | VWR | 20599.297 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
References
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