Summary
Dit protocol maakt de isolatie van Epstein-Barr-virusdeeltjes uit de menselijke P3HR1-cellijn mogelijk bij het induceren van de virale lytische cyclus met phorbol 12-myristate 13-acetaat. DNA wordt vervolgens geëxtraheerd uit het virale preparaat en onderworpen aan real-time PCR om de virale deeltjesconcentratie te kwantificeren.
Abstract
Het Epstein-Barr-virus (EBV), formeel aangeduid als Humaan herpesvirus 4 (HHV-4), is het eerste geïsoleerde menselijke tumorvirus. Bijna 90-95% van de volwassen wereldbevolking is besmet met EBV. Met de recente vooruitgang in moleculaire biologie en immunologie heeft de toepassing van zowel in vitro als in vivo experimentele modellen diep en betekenisvol inzicht gegeven in de pathogenese van EBV bij veel ziekten en in EBV-geassocieerde tumorigenese. Het doel van dit gevisualiseerde experimenteerartikel is om een overzicht te geven van de isolatie van EBV-virale deeltjes uit cellen van de P3HR1-cellijn, gevolgd door kwantificering van het virale preparaat. P3HR1-cellen, oorspronkelijk geïsoleerd uit een humaan Burkitt-lymfoom, kunnen een P3HR1-virus produceren, een EBV-stam van type 2. De EBV-lytische cyclus kan in deze P3HR1-cellen worden geïnduceerd door behandeling met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA), waardoor EBV-virale deeltjes ontstaan.
Met behulp van dit protocol voor de isolatie van EBV-deeltjes worden P3HR1-cellen gedurende 5 dagen gekweekt bij 37 °C en 5% CO2 in volledig RPMI-1640-medium met 35 ng / ml PMA. Vervolgens wordt het kweekmedium gedurende 8 minuten met een snelheid van 120 x g gecentrifugeerd om de cellen te pelleteren. Het virusbevattende supernatant wordt vervolgens verzameld en met een snelheid van 16.000 x g gedurende 90 minuten afgesponnen om de EBV-deeltjes te pelleteren. De virale pellet wordt vervolgens geresuspendeerd in een volledig RPMI-1640-medium. Dit wordt gevolgd door DNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR om de concentratie van EBV-deeltjes in het preparaat te beoordelen.
Introduction
Het Epstein-Barr-virus (EBV) is het eerste menselijke tumorvirus dat is geïsoleerd1. EBV, formeel aangeduid als Humaan herpesvirus 4 (HHV-4)2, maakt deel uit van de gamma herpesvirus subfamilie van de herpesvirusfamilie en is het prototype van het lymfocryptovirus geslacht. Bijna 90-95% van de volwassen wereldbevolking is besmet met het virus3. In de meeste gevallen treedt de eerste infectie op binnen de eerste 3 jaar van het leven en is asymptomatisch, maar als de infectie later tijdens de adolescentie optreedt, kan dit aanleiding geven tot een ziekte die infectieuze mononucleosis4 wordt genoemd. EBV is in staat om rustende B-cellen te infecteren, waardoor ze proliferatieve B-lymfoblasten worden waarin het virus een latent geïnfecteerde toestand vestigt en handhaaft5. EBV kan op elk moment reactiveren en zo leiden tot terugkerende infecties6.
In de afgelopen 50 jaar is de associatie tussen sommige virussen en de ontwikkeling van menselijke maligniteiten steeds duidelijker geworden, en vandaag wordt geschat dat 15% tot 20% van alle menselijke kankers gerelateerd zijn aan virale infecties7. De herpesvirussen, waaronder EBV, zijn enkele van de best bestudeerde voorbeelden van dit soort tumorvirussen8. In feite kan EBV vele soorten menselijke maligniteiten veroorzaken, zoals Burkitt-lymfoom (BL), Hodgkin-lymfoom (HL), diffuus grootcellig B-cellymfoom en lymfoproliferatieve ziekten bij immuungecompromitteerde gastheren 9,10. Ebv is ook aangetoond geassocieerd te zijn met de ontwikkeling van systemische auto-immuunziekten. Enkele voorbeelden van deze auto-immuunziekten zijn reumatoïde artritis (RA), polymyositis-dermatomyositis (PM-DM), systemische lupus erythematosus (SLE), gemengde bindweefselziekte (MCTD) en het syndroom van Sjögren (SS)11. EBV wordt ook geassocieerd met de ontwikkeling van inflammatoire darmziekte (IBD)12.
Veel van deze ziekten kunnen worden bestudeerd of gemodelleerd met behulp van celkweek, muizen of andere organismen die zijn geïnfecteerd met EBV. Daarom zijn EBV-deeltjes nodig om cellen of organismen te infecteren, of het nu in vitro of in vivo modellenzijn 13,14,15,16, vandaar de noodzaak om een techniek te ontwikkelen die isolatie van virale deeltjes tegen lage kosten mogelijk maakt. Het hier beschreven protocol biedt richtlijnen voor een eenvoudige manier om EBV-deeltjes betrouwbaar te isoleren uit een relatief toegankelijke cellijn en om de deeltjes te kwantificeren met behulp van real-time PCR, dat kosteneffectief en direct beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Dit in vergelijking met verschillende andere methoden die zijn beschreven om EBV te isoleren van verschillende cellijnen 17,18,19,20.
P3HR-1 is een BL-cellijn die groeit in suspensie en latent is geïnfecteerd met een EBV type 2-stam. Deze cellijn is een EBV-producent en kan worden geïnduceerd om virale deeltjes te produceren. Het doel van dit manuscript is om een methode te demonstreren die de isolatie van EBV-deeltjes uit de P3HR-1-cellijn mogelijk maakt, gevolgd door kwantificering van de virale voorraad die later kan worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo EBV-experimentele modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: EBV moet worden beschouwd als een potentieel biologisch gevaarlijk materiaal en moet daarom worden behandeld onder bioveiligheidsniveau 2-containment of hoger. Een laboratoriumjas en handschoenen moeten worden gedragen. Als er potentieel is voor blootstelling aan spatten, moet ook oogbescherming worden overwogen. De volgende procedure moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast.
1. De P3HR1-cellen tellen
- Cellen centrifugeren en resuspenderen
- Breng de celsuspensie over van een kweekplaat van 100 mm (of T-25 kolf) van een doorlopende P3HR1-celcultuur bij 80% samenvloeiing naar een conische buis van 15 ml. De zaaidichtheid van P3HR-1 cellen is 1 x 106 cellen / ml. Handhaven in volledige RPMI kweekmedium (79% RPMI kweekmedium, 20% Foetaal Runderserum, 1% Pen-Strep antibioticum) bij 37 °C en 5% CO2, en passage om de 3-4 dagen.
- Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 120 x g. Gooi na centrifugatie het supernatant weg, resuspenseer de celpellet in 1 ml volledig RPMI-kweekmedium en meng goed (deze oplossing wordt suspensie A genoemd).
- De celsuspensie voorbereiden voor het tellen
- Bereid een verdunde celsuspensie B door 2 μL celsuspensie A te mengen met 8 μL kweekmedium. Voeg 10 μL van 0,4% trypan blue toe aan suspensie B om suspensie C te verkrijgen. Meng het preparaat goed door voorzichtig pipetteren.
- Cellen tellen met behulp van een hemocytometer
- Plaats een glazen deklip op de hemocytometer en laad 10 μL suspensie C. Plaats de hemocytometer onder een lichtmicroscoop en tel het aantal cellen dat niet blauw gekleurd is in elk van de vier kwadranten van de hemocytometerkamer met behulp van het 40x microscoopobjectief (figuur 1).
- Trypan blauw kleurt dode cellen blauw; tel deze cellen niet, noch cellen die een van de bovenste, onderste, rechter- of linkerranden van elk hemocytometerkwadrant raken.
- Bereken de concentratie van cellen per ml met behulp van de volgende formule:
OPMERKING: Het aantal getelde kwadranten is vier en 10-4 ml is het volume van de vierkanten op de hemocytometer. De vier kwadranten die geteld moeten worden, zijn in figuur 1 in het groen weergegeven. Totaal aantal cellen geteld in de formule is de som van het aantal cellen in kwadranten 1, 2, 3 en 4. Cellen die in figuur 1 in blauw worden weergegeven, moeten worden geteld, terwijl cellen in rood niet mogen worden geteld omdat ze de boven-, rechter-, onder- of linkerrand van het kwadrant raken.
Figuur 1: Celtelling met behulp van een hemocytometerkamer. Vier kwadranten worden geteld met behulp van een lichtmicroscoop; deze kwadranten zijn in het groen weergegeven. Totaal aantal cellen Geteld in de formule aangegeven in stap 1.3.3 van het hier beschreven protocol is de som van het aantal cellen in kwadranten 1, 2, 3 en 4. Cellen die in blauw zijn aangegeven, moeten worden geteld, terwijl cellen in rood niet mogen worden geteld omdat ze de boven-, rechter-, onder- of linkerranden van het kwadrant raken Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Het bord voorbereiden op cultuur
- Plaats een volume celsuspensie A in een conische buis van 15 ml. Het vereiste volume is afhankelijk van het aantal cellen. Pas het volume zodanig aan dat het aantal cellen ongeveer 2,2 x 106 cellen is voor een kweekplaat van 100 mm.
- Voeg 5 ml compleet kweekmedium toe aan de buis en breng vervolgens de inhoud van de buis over op een kweekplaat van 100 mm. Voeg 80 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe aan de kweekplaat.
OPMERKING: DMSO is lichtgevoelig, daarom moet het worden bewaard in een lichtbestendige container of worden bedekt met een ondoorzichtig materiaal zoals aluminiumfolie. - Voeg 350 μL 1 mg/ml phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) toe aan de buis. De uiteindelijke concentratie van PMA moet 35 ng/ml zijn en die van DMSO moet 0,08% zijn.
LET OP: PMA is giftig, corrosief en kankerverwekkend, daarom moet het met uiterste zorg worden behandeld. PMA is lichtgevoelig, daarom moet het worden bewaard in een lichtbestendige container of worden bedekt met een ondoorzichtig materiaal zoals aluminiumfolie. - Voeg 4,27 ml kweekmedium toe zodat het totale volume 10 ml is. Meng de inhoud van de buis door te kantelen en breng de inhoud vervolgens over op een kweekplaat van 100 mm. Laat de plaat 5 dagen in een celkweekincubator staan bij 37 °C, 5% CO2.
3. Inductie en isolatie van Epstein-Barr-virusdeeltjes
- Na 5 dagen in de incubator, centrifugeer de inhoud van de plaat op 120 x g gedurende 8 minuten om de cellen te pelleteren. Verzamel het celvrije, virusbevattende supernatant en gooi de celpellet weg.
- Centrifugeer het supernatant bij 16.000 x g gedurende 90 minuten bij 4 °C om de virusdeeltjes te pelleteren. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de viruskorrel in 5 ml kweekmedium.
OPMERKING: Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) kan worden gebruikt om de viruskorrel te resuspenderen in plaats van kweekmedium. - Aliquot de virale suspensie verkregen in 20 buizen, die elk 250 μL van de virale suspensie bevatten. Bewaar de suspensie bij -80 °C.
4. DNA-extractie uit virale deeltjes
LET OP: Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van fenol, omdat het giftig en corrosief is en het vermogen heeft om ernstige brandwonden te veroorzaken. Fenol is lichtgevoelig en oxideert bij contact met licht of lucht. Bewaar het in een lichtbestendige container of bedek de fenolbuis met een ondoorzichtig materiaal zoals aluminiumfolie.
- Scheiding van eiwitten uit DNA
- Voeg 500 μL TrisCl-verzadigd fenol toe aan een van de 250 μL-buizen. Voeg 100 μL water toe (om het volume van de waterige fase te vergroten) en vortex goed om een roze emulsie te verkrijgen. Centrifugeer gedurende 15 min bij 9650 x g.
- DNA neerslag
- Verzamel het supernatant (transparante, waterige fase) en breng het over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg een equivalent toe van 1/10 van het volume koud natriumacetaat van het supernatant (3 M, pH 5,2) en meng door op en neer te pipetteren. Voeg 1 μL 20 mg/ml glycogeen toe en meng door te pipetteren.
OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar de toevoeging van glycogeen verbetert de DNA-neerslag en maakt het gemakkelijker om de DNA-pellet te visualiseren. - Voeg drie keer het volume koude 100% ethanol van het supernatant toe. Bewaren bij -80 °C 's nachts.
OPMERKING: De procedure kan hier worden gestopt om op een later tijdstip te worden hervat. Het monster kan gedurende 1 uur bij -80 °C of als alternatief 's nachts worden bewaard. Nachtelijke opslag verbetert de DNA-neerslag en wordt daarom aanbevolen.
- Het isoleren van het virale DNA
- De volgende dag centrifugeer je bij 9650 x g gedurende 15 min bij 4 °C en gooi je het supernatant weg om een DNA-pellet te verkrijgen.
- Was de pellet drie keer met 1 ml koude 70% ethanol, centrifugeer op 9650 x g gedurende 15 minuten en gooi het supernatant weg.
- Droog de pellet ongeveer 10 minuten aan de lucht. Resuspendeer de pellet in 10-50 μL nucleasevrij gedestilleerd water (afhankelijk van de grootte van de DNA-pellet).
- Bewaar de monsters bij -20 °C voor latere verwerking of bij 4 °C 's nachts om een maximale dna-oplossing te garanderen, gevolgd door opslag bij -20 °C. U kunt ook direct doorgaan met stap 5.
5. Controle van dna-concentratie en zuiverheid
- Na het reinigen van het voetstuk van een microspectrofotometer met een delicate taakwisser, laadt u 1 μL van het DNA-preparaat.
- Let op de concentratie van het DNA in het monster. Controleer de absorptieverhoudingen bij zowel als
. DNA absorbeert bij 260 nm, eiwitten bij 280 nm en organische stoffen zoals fenol bij 230 nm. Een verhouding van 1,8-2 wordt voldoende geacht voor real-time PCR.
. DNA absorbeert bij 260 nm, eiwitten bij 280 nm en organische stoffen zoals fenol bij 230 nm. Een verhouding van 1,8-2 wordt voldoende geacht voor real-time PCR.6. Kwantificering door real-time polymerasekettingreactie
- Bereiding van de PCR-reactiemengsels
- Plaats 5 μL van een SYBR groene real-time PCR mix in 0,2 ml PCR buizen. Voeg aan elke buis 1 μL 7,5 pmol/μL voorwaartse primer en 1 μL 7,5 pmol/μL omgekeerde primer toe. Voorwaartse primervolgorde: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; omgekeerde primersequentie: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Het gen dat is versterkt om het EBV-genoomkopienummer te bepalen, is het kleine RNA 2(EBER-2)-gen van het Epstein-Barr-virus .
- Voeg aan een van de buisjes 2 μL nucleasevrij water en 1 μL viraal DNA uit stap 4 toe. Het totale volume van het reactiemengsel is 10 μL.
OPMERKING: Afhankelijk van de concentratie van DNA in het monster, kan een verdunningsstap nodig zijn. De verdunningsfactor F moet worden genoteerd en zal worden geïntegreerd in de formule in stap 6.3. - Bereid andere buizen voor die als standaarden zullen worden gebruikt met bekende EBV-genoomkopienummers (1000, 2000, 5000, 10.000 en 54.000 kopieën).
- Laat de PCR-mengsels beginnen met een eerste stap van activering bij 95 °C gedurende 5 minuten, vervolgens 40 cycli bij 95 °C en 58 °C (gloeien) gedurende respectievelijk 15 s en 30 s.
- Genereer een qPCR-standaardcurve door de Ct-waarden van de normen uit te zetten tegen het logboek van het aantal EBV-genoomkopieën per standaardbuis. Met behulp van de standaard curve plot vergelijking, leidt u het aantal EBV-genoomkopieën af in de PCR-buis die het geïnduceerde virale DNA bevat. Gebruik vervolgens de volgende formule om de concentratie van het geïnduceerde virale preparaat te berekenen:
Waarbij X het aantal EBV-genoomkopieën is dat is afgeleid van de standaardcurve en F de verdunningsfactor is die wordt gebruikt voor het opzetten van het DNA dat per PCR-reactie wordt gebruikt.
7. Controle op biologische activiteit/infectiviteit van de virale deeltjes
- Breng BC-3 cellen over van een 100 mm kweekplaat bij 80% confluentie naar een conische buis van 15 ml. De zaaidichtheid van P3HR-1 cellen is 1 x 106 cellen / ml. Handhaven in volledige RPMI kweekmedium (79% RPMI kweekmedium, 20% Foetaal Runderserum, 1% Pen-Strep antibioticum) bij 37 °C en 5% CO2, en passage om de 3-4 dagen.
- Tel de BC-3-cellen op dezelfde manier als de P3HR-1-cellen werden geteld door stap 1 te volgen. Voeg aan een plaat met 96 putten 105 BC-3-cellen toe aan elke put. Gebruik drie, zes, negen of 12 putten om de betekenis van de resultaten te garanderen en fouten te minimaliseren.
- Voeg een volume virale bouillon toe aan elk putje, afhankelijk van de concentratie van het virale preparaat bepaald in stap 6.3. De MOI kan variëren en optimalisatie van dit protocol zal de beste MOI voor infectie onthullen (een MOI-bereik van 2-50 wordt aanbevolen). Zorg ervoor dat het totale volume van het mengsel in elke put 250 μL is.
- Om het vereiste volume te bepalen, moet de concentratie van de virale voorraad bekend zijn en moet een MOI worden geselecteerd. Als de MOI bijvoorbeeld 2 is, moet het aantal toegevoegde virale deeltjes tweemaal het aantal cellen zijn. Bereken het volume V van de virale voorraad dat nodig is met behulp van de formule:
, waarbij n het aantal benodigde virale deeltjes is en C de bekende concentratie van de virale voorraad
- Om het vereiste volume te bepalen, moet de concentratie van de virale voorraad bekend zijn en moet een MOI worden geselecteerd. Als de MOI bijvoorbeeld 2 is, moet het aantal toegevoegde virale deeltjes tweemaal het aantal cellen zijn. Bereken het volume V van de virale voorraad dat nodig is met behulp van de formule:
- Incubeer de inhoud van de 96-well plaat gedurende 5 dagen. Breng na 5 dagen de inhoud van elk putje over in een buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de buisjes op 120 x g gedurende 8 minuten om de cellen te scheiden van het virusbevattende kweekmedium. Onderwerp de celpellets en de supernatanten aan DNA-extractie gevolgd door real-time PCR-kwantificering om te controleren op de aanwezigheid van virale genomen in elke fractie, waardoor de infectiviteit van de virale deeltjes wordt beoordeeld.
, waarbij n het aantal benodigde virale deeltjes is en C de bekende concentratie van de virale voorraadSubscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van deze procedure is om EBV-deeltjes te isoleren in een suspensie met bekende virale titer, die vervolgens kan worden gebruikt om EBV-infectie te modelleren. Het is dus van het grootste belang om optimale concentraties van de verschillende reagentia te gebruiken om de hoogste EBV-opbrengst uit de procedure te halen.
Een optimalisatiestudie werd uitgevoerd om de concentraties PMA en DMSO te bepalen die het hoogste aantal EBV-deeltjes zouden opleveren (figuur 2). Een DMSO-concentratie van 0,8% en een PMA-concentratie van 35 ng/μL waren optimaal en resulteerden in hoge EBV-concentraties. De concentratie van virale deeltjes verkregen uit het optimalisatieprotocol was 917.471 virale deeltjes / μL.
Figuur 2: EBV DNA-kopieën/ml verkregen bij inductie van P3HR-1-cellen met phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA). P3HR-1-cellen (105 cellen) werden alleen gekweekt of geïnduceerd met verschillende concentraties PMA en DMSO met behulp van het hier beschreven protocol. De foutbalken geven de standaarddeviatie aan. De t-test van een student werd uitgevoerd door PMA / PMA en DMSO-behandelde cellen te vergelijken met controlecellen; * geeft p < 0,05 aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om dit protocol als effectief te beschouwen, moet stap 6 een redelijke concentratie van virale deeltjes onthullen en stap 7 moet aantonen dat deze virale deeltjes inderdaad besmettelijk zijn. De BC-3-cellijn die in stap 7 wordt gebruikt, is EBV-negatief, dus bij kwantificering van de EBV-genoomkopienummers in negatieve controles (die niet aan dit protocol zijn onderworpen), mag er geen EBV-DNA worden gedetecteerd.
EBV-DNA moet echter worden gedetecteerd in zowel de cellen als het kweekmedium van de experimentele putten (die aan dit protocol zijn onderworpen), om de volgende redenen: EBV die BC-3-cellen infecteert, zal zich in deze cellen repliceren, rekening houdend met het feit dat EBV-DNA zal worden gedetecteerd in de celpellet en bij replicatie zullen BC-3-cellen virale deeltjes naar buiten werpen; ebv-DNA zal dus worden gedetecteerd in het kweekmedium supernatant (na DNA-extractie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De productie van EBV-deeltjes is noodzakelijk voor het begrijpen van de biologie van dit virus en de bijbehorende ziekten. Hier beschreven we de productie van deze deeltjes uit de P3HR-1 cellijn. Deze cellijn is niet de enige EBV-producentenlijn; in feite zijn EBV-deeltjes ook geïsoleerd uit B95-8-cellen21,22 en de Raji-cellijn18,19. De EBV-lytische cyclus is in deze cellen geïnduceerd met n-butyraat. Als alternatief kunnen phorbolesters zoals 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetaat (TPA), ook bekend als phorbol 12-myristate-13-acetaat (PMA), worden gebruikt. Over het algemeen kan het hier beschreven protocol worden gebruikt met behulp van deze cellen in plaats van de P3HR-1-lijn. De B95-8-lijn is echter afgeleid van een katoenen tamarin (Saguinus oedipus) die momenteel is geclassificeerd als een ernstig bedreigde primatensoort23; vandaar dat deze lijn zelden wordt verkocht door verkopers met beperkingen op de verkoop en verzending ervan. Een vergunning is ook vereist door de overeenkomst inzake de internationale handel in bedreigde in het wild levende dier- en plantensoorten (CITES) voor alle bestellingen buiten het Verenigd Koninkrijk. Hoewel de Raji-cellijn in de handel verkrijgbaar is, treden de synthese van replicatief viraal DNA en de productie van viraal capsid-antigeen (VCA) niet op in deze cellen na inductie door chemicaliën24,25. Deze kunnen echter gemakkelijk worden geïnduceerd door complementatie na superinfectie met EBV geïsoleerd uit P3HR-1-cellen20.
Vanwege de afwezigheid van een directe plaquetest voor de inventarisatie van EBV-deeltjes26, vertrouwden we op een real-time polymerase-kettingreactie. Er zijn andere methoden van kwantificering die even goed kunnen werken voor ons doel, zoals immunofluorescentie of PCR met behulp van fluorescerende sondes die een verbeterde specificiteit kunnen bieden. De keuze voor real-time PCR met behulp van genoomkopiestandaarden is gebaseerd op het feit dat dit gemakkelijk toegankelijk is voor de meeste laboratoria, minder bewerkelijk, minder technisch uitdagend en kostenefficiënter27. Daarom kunnen andere kwantificeringsmethoden even goed werken en kunnen ze worden gebruikt op basis van beschikbaarheid en ervaring.
Een van de meest kritieke stappen in het protocol dat hier wordt beschreven, is het plateren van cellen in stap 2.1 en het zaaien met een celnummer binnen het bereik dat wordt aanbevolen voor de grootte van de plaat. Een laag aantal cellen levert een lage concentratie virale deeltjes op, terwijl een groot aantal cellen de plaat zou verdringen, de groei en replicatie van cellen zou remmen en zo de lytische cyclus van het virus zou vertragen. Dit is de reden waarom uiterste voorzichtigheid moet worden betracht bij het tellen van de cellen in stap 1, het berekenen van het vereiste volume suspensie A en ten slotte het platleggen van de cellen in stap 2.
Een beperking van het protocol is de aanname dat één kopie van het EBV-genoom overeenkomt met één viraal deeltje. Hoewel deze veronderstelling plausibel is, kan met deze test niet worden gedetecteerd of dergelijke deeltjes defect of onvolledig zijn. Aangezien er geen plaquevormingstests zijn voor EBV zoals voor veel andere virussen, blijft DNA-extractie gevolgd door real-time PCR een geaccepteerde methode om het virale preparaat te kwantificeren. Een andere beperking is dat het virus wordt geïnduceerd door een continue zoogdiercellijn die mutaties kan accumuleren bij vele rondes van passaging. Dergelijke mutaties kunnen het virus zelf beïnvloeden, wat mogelijk resulteert in veranderde in vivo of ex vivo eigenschappen van het virus. Een mogelijke oplossing zou zijn om regelmatig het cellulaire en virale genoom te sequencen. Als alternatief kunnen cellen na een paar passages worden weggegooid en kan de cultuur opnieuw worden opgestart vanuit een vloeibaar stikstof-opgeslagen celmonster met een laag aantal eerdere passages. Het is ook vermeldenswaard dat de EBV-deeltjes verkregen uit de P3HR-1-cellijn het EBNA2-antigeen missen, dat meestal tot expressie komt in B-lymfocyten die latent zijn geïnfecteerd met EBV, als onderdeel van zes virale nucleaire eiwitten in totaal28. Het EBNA2-eiwit activeert de promotors van genen die eiwitten tot expressie brengen die geassocieerd zijn met het type III van EBV-latentie. Recente studies hebben echter aangetoond dat EBNA2-deficiënte EBV in staat is om tumoren te vormen bij CBH-muizen, en dat de P3HR-1 cellijn daarom een nuttig model van EBV-positieve lymfomen blijft29. Aan de andere kant kan EBV uit P3HR-1-cellen worden gebruikt om de rollen van EBNA2 te bestuderen terwijl een EBNA2-positieve EBV als controle wordt gebruikt. Kortom, EBV verkregen uit een continue P3HR-1 cellijn heeft een significante onderzoekswaarde; het kan worden gebruikt om de biologie, infectiviteit, virulentie en vele andere eigenschappen van EBV te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Financiering voor dit werk werd ondersteund door subsidies aan ER van het Asmar Research Fund, de Libanese Nationale Raad voor Wetenschappelijk Onderzoek (L-CNRS) en het Medical Practice Plan (MPP) aan de Amerikaanse Universiteit van Beiroet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | AB0620 | Should be autoclaved before use |
| 0.2-10 µL Microvolume Filter Tips | Corning | 4807 | Should be autoclaved before use |
| 0.5-10 µL Pipette | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4488 | |
| 1000 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µL Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100x20 mm Cuture Plates | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µL Pipette | BrandTech | 704774 | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 430791 | |
| 200 µL Filtered Pipette Tips | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 430828 | |
| CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| DNase/RNase Free Water | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Custom Made Primers |
| EBV DNA Control (Standards) | Vircell | MBC065 | |
| Ethanol (Laboratory Reagent Grade) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrifuge | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Glycogen Solution | Qiagen | 158930 | |
| Hemocytometer | BOECO | BOE 01 | |
| Inverted Light Microscope | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Microcentrifuge Tube | Costar (Corning) | 3621 | Should be autoclaved before use |
| P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biowest | L0022 | |
| Phenol | VWR | 20599.297 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Pipette Filler | Thermo Scientific | 9501 | |
| Precision Wipes | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Culture Medium | Sigma | R7388 | |
| SL 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004030 | |
| Sodium Acetate | Riedel-de Haën (Honeywell) | 25022 | |
| Spectrophotomer | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Trypan Blue Solution | Sigma | T8154 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific | 4121 |
References
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
- Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
- Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
- Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
- Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
- Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
- El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
- Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
- Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
- Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
- Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
- Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
- Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
- Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
- Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
- Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
- Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
- Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
- Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
- Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
- Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
- Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
- Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
- Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
- Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
- Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).
