Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

P3HR1 सेल लाइन से एपस्टीन-बार वायरस का अलगाव और परिमाणीकरण

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64279
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Summary

यह प्रोटोकॉल फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट के साथ वायरल लिटिक चक्र को प्रेरित करने पर मानव पी 3एचआर 1 सेल लाइन से एपस्टीन-बार वायरस कणों के अलगाव की अनुमति देता है। डीएनए को बाद में वायरल तैयारी से निकाला जाता है और वायरल कण एकाग्रता को मापने के लिए वास्तविक समय पीसीआर के अधीन किया जाता है।

Abstract

एपस्टीन-बार वायरस (ईबीवी), औपचारिक रूप से मानव हर्पीसवायरस 4 (एचएचवी -4) के रूप में नामित, पहला पृथक मानव ट्यूमर वायरस है। दुनिया की लगभग 90-95% वयस्क आबादी ईबीवी से संक्रमित है। आणविक जीव विज्ञान और इम्यूनोलॉजी में हालिया प्रगति के साथ, इन विट्रो और विवो प्रयोगात्मक मॉडल दोनों के आवेदन ने कई बीमारियों में ईबीवी के रोगजनन के साथ-साथ ईबीवी से जुड़े ट्यूमरजेनिसिस में गहरी और सार्थक अंतर्दृष्टि प्रदान की है। इस विज़ुअलाइज़ किए गए प्रयोग पेपर का उद्देश्य पी 3 एचआर 1 सेल लाइन की कोशिकाओं से ईबीवी वायरल कणों के अलगाव का अवलोकन प्रदान करना है, इसके बाद वायरल तैयारी का परिमाणीकरण होता है। पी 3 एचआर 1 कोशिकाएं, मूल रूप से मानव बर्किट लिम्फोमा से अलग, पी 3 एचआर 1 वायरस का उत्पादन कर सकती हैं, जो एक टाइप 2 ईबीवी तनाव है। ईबीवी लिटिक चक्र को इन पी 3एचआर 1 कोशिकाओं में फोरबोल 12-माइरिसिटेट 13-एसीटेट (पीएमए) के साथ उपचार द्वारा प्रेरित किया जा सकता है, जिससे ईबीवी वायरल कण उत्पन्न होते हैं।

ईबीवी कणों के अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, पी 3एचआर 1 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए और पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम में 5% सीओ2 के लिए संवर्धित किया जाता है जिसमें 35 एनजी / एमएल पीएमए होता है। इसके बाद, कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 8 मिनट के लिए कल्चर माध्यम को 120 x g की गति से सेंट्रीफ्यूज किया जाता है। वायरस युक्त सुपरनैटेंट को तब एकत्र किया जाता है और ईबीवी कणों को पेलेट करने के लिए 90 मिनट के लिए 16,000 x g की गति से काटा जाता है। वायरल पेलेट को फिर से एक पूर्ण आरपीएमआई -1640 माध्यम में फिर से निलंबित किया जाता है। इसके बाद तैयारी में ईबीवी कणों की एकाग्रता का आकलन करने के लिए डीएनए निष्कर्षण और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर होता है।

Introduction

एपस्टीन-बार वायरस (ईबीवी) पहला मानव ट्यूमर वायरस हैजिसे अलग किया गया है। ईबीवी, जिसे औपचारिक रूप से मानव हर्पीसवायरस 4 (एचएचवी -4)2 के रूप में जाना जाता है, हर्पीस वायरस परिवार के गामा हर्पीस वायरस उपपरिवार का हिस्सा है और लिम्फोक्रिप्टोवायरस जीनस का प्रोटोटाइप है। दुनिया की लगभग 90-95% वयस्क आबादीवायरस से संक्रमित है। ज्यादातर मामलों में, प्रारंभिक संक्रमण जीवन के पहले 3 वर्षों के भीतर होता है और स्पर्शोन्मुख होता है, हालांकि, यदि किशोरावस्था के दौरान बाद में संक्रमण होता है, तो यह संक्रामक मोनोन्यूक्लिओसिस4 नामक बीमारी को जन्म दे सकता है। ईबीवी आराम करने वाली बी कोशिकाओं को संक्रमित करने में सक्षम है जो उन्हें प्रोलिफेरेटिव बी लिम्फोब्लास्ट बनने के लिए प्रेरित करता है जिसमें वायरस अव्यक्त रूप से संक्रमित अवस्था5 को स्थापित और बनाए रखता है। ईबीवी किसी भी समय फिर से सक्रिय हो सकता है और इस प्रकार आवर्तक संक्रमण का कारण बनसकता है।

पिछले 50 वर्षों में, कुछ वायरस और मानव विकृतियों के विकास के बीच संबंध तेजी से स्पष्ट हो गया है, और आज यह अनुमानलगाया गया है कि सभी मानव कैंसर का 15% से 20% वायरल संक्रमण से संबंधित है। ईबीवी सहित दाद वायरस, इस प्रकार केट्यूमर वायरस के कुछ सबसे अच्छे अध्ययन किए गए उदाहरण हैं। वास्तव में, ईबीवी कई प्रकार की मानव विकृतियों का कारण बन सकता है, जैसे कि बर्किट लिम्फोमा (बीएल), हॉजकिन लिंफोमा (एचएल), बड़े बी सेल लिम्फोमा को फैलाना, और इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड मेजबान 9,10 में लिम्फोप्रोलिफेरेटिव रोग। ईबीवी को प्रणालीगत ऑटोम्यून्यून रोगों के विकास से भी जोड़ा गया है। इन ऑटोइम्यून विकारों के कुछ उदाहरण रूमेटोइड गठिया (आरए), पॉलीमायोसिटिस-डर्माटोमायोसिटिस (पीएम-डीएम), प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई), मिश्रित संयोजी ऊतक रोग (एमसीटीडी), और स्जोग्रेन सिंड्रोम (एसएस) 11 हैं। ईबीवी सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) 12 के विकास से भी जुड़ा हुआ है।

इनमें से कई बीमारियों का अध्ययन या मॉडलिंग सेल कल्चर, चूहों या अन्य जीवों का उपयोग करके की जा सकती है जो ईबीवी से संक्रमित हैं। यही कारण है कि कोशिकाओं या जीवों को संक्रमित करने के लिए ईबीवी कणों की आवश्यकता होती है, चाहे इन विट्रो में या विवो मॉडल 13,14,15,16 में, इसलिए एक ऐसी तकनीक विकसित करने की आवश्यकता है जो कम लागत पर वायरल कणों के अलगाव की अनुमति देती है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत सुलभ सेल लाइन से ईबीवी कणों को मज़बूती से अलग करने और वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग करके कणों की मात्रा निर्धारित करने का एक आसान तरीका प्रदान करता है, जो लागत प्रभावी है और अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से उपलब्ध है। यह कई अन्य तरीकों की तुलना में है जिन्हें विभिन्न सेल लाइनों17,18,19,20 से ईबीवी को अलग करने के लिए वर्णित किया गया है।

पी 3एचआर -1 एक बीएल सेल लाइन है जो निलंबन में बढ़ती है और ईबीवी टाइप 2 स्ट्रेन से गुप्त रूप से संक्रमित होती है। यह सेल लाइन एक ईबीवी उत्पादक है और इसे वायरल कणों का उत्पादन करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इस पांडुलिपि का लक्ष्य एक ऐसी विधि का प्रदर्शन करना है जो पी 3 एचआर -1 सेल लाइन से ईबीवी कणों के अलगाव की अनुमति देता है, इसके बाद वायरल स्टॉक का परिमाणीकरण होता है जिसका उपयोग बाद में इन विट्रो और विवो ईबीवी प्रयोगात्मक मॉडल दोनों के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नोट: ईबीवी को संभावित रूप से जैव-खतरनाक सामग्री माना जाना चाहिए, और इस प्रकार जैव सुरक्षा स्तर 2 नियंत्रण या उच्चतर के तहत संभाला जाना चाहिए। एक लैब कोट के साथ-साथ दस्ताने भी पहने जाने चाहिए। यदि छींटों के संपर्क में आने की संभावना है, तो आंखों की सुरक्षा पर भी विचार किया जाना चाहिए। निम्नलिखित प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित की जानी चाहिए।

1. पी 3 एचआर 1 कोशिकाओं की गिनती

  1. सेंट्रीफ्यूजिंग और रीसेम्पिंग कोशिकाएं
    1. सेल निलंबन को चल रहे पी 3एचआर 1 सेल कल्चर के 100 मिमी कल्चर प्लेट (या टी -25 फ्लास्क) से 80% कंफ्लुएंसी पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। पी 3 एचआर -1 कोशिकाओं का सीडिंग घनत्व 1 x 106 कोशिकाएं / एमएल है। पूर्ण आरपीएमआई संस्कृति माध्यम (79% आरपीएमआई संस्कृति माध्यम, 20% भ्रूण बोवाइन सीरम, 1% पेन-स्ट्रेप एंटीबायोटिक) को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बनाए रखें, और हर 3-4 दिनों में पारित करें।
    2. 120 x g पर 8 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनैटेंट को छोड़ दें, सेल पेलेट को पूर्ण आरपीएमआई कल्चर माध्यम के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें, और अच्छी तरह से मिलाएं (इस समाधान को निलंबन ए के रूप में संदर्भित किया जाएगा)।
  2. मतगणना के लिए सेल निलंबन की तैयारी
    1. सेल सस्पेंशन ए के 2 μL को 8 μL कल्चर माध्यम के साथ मिलाकर एक पतला सेल सस्पेंशन B तैयार करें। निलंबन C प्राप्त करने के लिए निलंबन B में 0.4% ट्रिपैन ब्लू का 10 μL जोड़ें।
  3. हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गिनती
    1. हेमोसाइटोमीटर पर एक ग्लास कवरस्लिप रखें और निलंबन सी के 10 μL लोड करें। हेमोसाइटोमीटर को एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे रखें और 40x माइक्रोस्कोप उद्देश्य (चित्रा 1) का उपयोग करके हेमोसाइटोमीटर कक्ष के चार चतुर्थांशों में से प्रत्येक में नीली नहीं होने वाली कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
    2. ट्रिपैन नीले दाग मृत कोशिकाओं को नीले रंग में रंगते हैं; इन कोशिकाओं की गणना न करें, न ही कोशिकाएं जो प्रत्येक हेमोसाइटोमीटर क्वाड्रंट के शीर्ष, नीचे, दाएं या बाएं सीमाओं में से किसी को छू रही हैं।
    3. निम्न सूत्र का उपयोग करके प्रति एमएल कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करें:
      Equation 1
      नोट: गिने गए चतुर्थांशों की संख्या चार है, और 10-4 एमएल हेमोसाइटोमीटर पर वर्गों का आयतन है। जिन चार चतुर्थांशों की गणना की जानी चाहिए, उन्हें चित्र 1 में हरे रंग में दर्शाया गया है। सूत्र में गिने गए कुल कोशिकाएँ चतुर्थांश 1, 2, 3 और 4 में कोशिकाओं की संख्या का योग है। चित्रा 1 में नीले रंग में दर्शाए गए कोशिकाओं की गणना की जानी चाहिए, जबकि लाल रंग में कोशिकाओं को नहीं गिना जाना चाहिए क्योंकि वे क्वाड्रंट के शीर्ष, दाएं, नीचे या बाएं सीमाओं को छू रहे हैं।

Figure 1
चित्रा 1: हेमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग करके सेल गिनती। प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चार चतुर्थांश गिने जाते हैं; इन चतुर्थांशों को हरे रंग में दर्शाया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के चरण 1.3.3 में इंगित सूत्र में गिने गए कुल कोशिकाओं को क्वाड्रंट 1, 2, 3 और 4 में कोशिकाओं की संख्या का योग है। नीले रंग में इंगित कोशिकाओं की गणना की जानी चाहिए, जबकि लाल रंग में कोशिकाओं को नहीं गिना जाना चाहिए क्योंकि वे क्वाड्रंट के शीर्ष, दाएं, नीचे या बाएं सीमाओं को छू रहे हैं कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. संस्कृति के लिए प्लेट तैयार करना

  1. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल सस्पेंशन ए की मात्रा रखें। आवश्यक मात्रा सेल गिनती पर निर्भर है। वॉल्यूम को इस तरह समायोजित करें कि 100 मिमी कल्चर प्लेट के लिए कोशिकाओं की संख्या लगभग 2.2 x 106 कोशिकाएं हैं।
  2. ट्यूब में पूर्ण संस्कृति माध्यम के 5 एमएल जोड़ें और फिर ट्यूब की सामग्री को 100 मिमी संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें। संस्कृति प्लेट में 80 μL डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) जोड़ें।
    नोट: डीएमएसओ प्रकाश संवेदनशील है, इसलिए इसे प्रकाश प्रतिरोधी कंटेनर में संग्रहीत किया जाना चाहिए या एल्यूमीनियम पन्नी जैसी अपारदर्शी सामग्री के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  3. ट्यूब में 1 मिलीग्राम / एमएल फोरबोल 12-माइरिसिटेट 13-एसीटेट (पीएमए) का 350 μL जोड़ें। पीएमए की अंतिम एकाग्रता 35 एनजी / एमएल होनी चाहिए, और डीएमएसओ की 0.08% होनी चाहिए।
    सावधानी: पीएमए विषाक्त, संक्षारक और कार्सिनोजेनिक है, इसलिए इसे अत्यधिक देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। पीएमए प्रकाश संवेदनशील है, इसलिए इसे प्रकाश प्रतिरोधी कंटेनर में संग्रहीत किया जाना चाहिए या एल्यूमीनियम पन्नी जैसी अपारदर्शी सामग्री के साथ कवर किया जाना चाहिए।
  4. कल्चर माध्यम के 4.27 एमएल जोड़ें ताकि कुल मात्रा 10 एमएल हो। झुककर ट्यूब की सामग्री को मिलाएं, फिर सामग्री को 100 मिमी संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें। प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर छोड़ दें।

3. एपस्टीन-बार वायरस कणों का प्रेरण और अलगाव

  1. इनक्यूबेटर में 5 दिनों के बाद, कोशिकाओं को छर्रों को छर्रों के लिए 8 मिनट के लिए 120 x g पर प्लेट की सामग्री को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल-मुक्त, वायरस युक्त सुपरनैटेंट इकट्ठा करें और सेल पेलेट को त्याग दें।
  2. वायरस के कणों को पेलेट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 16,000 x g पर सुपरनैटेंट को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें और वायरस पेलेट को 5 एमएल कल्चर माध्यम में फिर से निलंबित करें।
    नोट: फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) का उपयोग कल्चर माध्यम के बजाय वायरस गोली को फिर से निलंबित करने के लिए किया जा सकता है।
  3. वायरल निलंबन को 20 ट्यूबों में प्राप्त किया जाता है, जिनमें से प्रत्येक में वायरल निलंबन का 250 μL होता है। निलंबन को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. वायरल कणों से डीएनए निष्कर्षण

सावधानी: फिनोल को संभालते समय अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए, क्योंकि यह विषाक्त और संक्षारक है और इसमें गंभीर जलन पैदा करने की क्षमता है। फिनोल प्रकाश संवेदनशील है और प्रकाश या हवा के संपर्क में आने पर ऑक्सीकरण करता है। इसे एक प्रकाश प्रतिरोधी कंटेनर में स्टोर करें या वैकल्पिक रूप से फिनोल ट्यूब को एल्यूमीनियम पन्नी जैसी अपारदर्शी सामग्री के साथ कवर करें।

  1. डीएनए से प्रोटीन का पृथक्करण
    1. 250 μL ट्यूबों में से एक में TrisCl-संतृप्त फिनोल के 500 μL जोड़ें। गुलाबी इमल्शन प्राप्त करने के लिए 100 μL पानी (जलीय चरण की मात्रा बढ़ाने के लिए) और भंवर को अच्छी तरह से जोड़ें। 9650 x g पर 15 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  2. डीएनए वर्षा
    1. सतह पर तैरने वाला (पारदर्शी, जलीय चरण) इकट्ठा करें और इसे एक नए 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. ठंडे सोडियम एसीटेट (3 एम, पीएच 5.2) के सतह पर तैरने वाले की मात्रा के 1/10 के बराबर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। 20 mg/mL ग्लाइकोजन का 1 μL जोड़ें और पिपेटिंग द्वारा मिलाएं।
      नोट: यह चरण वैकल्पिक है, लेकिन ग्लाइकोजन के अतिरिक्त डीएनए वर्षा को बढ़ाता है और साथ ही डीएनए गोली की कल्पना करना आसान बनाता है।
    3. ठंडे 100% इथेनॉल की सतह पर तैरने वाले की मात्रा का तीन गुना जोड़ें। रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रक्रिया को बाद में फिर से शुरू करने के लिए यहां रोका जा सकता है। नमूना 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, या वैकल्पिक रूप से रात भर। रात भर भंडारण डीएनए वर्षा को बढ़ाता है और इस प्रकार अनुशंसित है।
  3. वायरल डीएनए को अलग करना
    1. अगले दिन, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 9650 x g पर और डीएनए गोली प्राप्त करने के लिए सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    2. गोली को 1 एमएल ठंडे 70% इथेनॉल के साथ तीन बार धोएं, सेंट्रीफ्यूज को 15 मिनट के लिए 9650 x g पर धोएं, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
    3. लगभग 10 मिनट के लिए गोली को हवा में सुखाएं। न्यूक्लियस-मुक्त आसुत जल (डीएनए गोली के आकार के आधार पर) के 10-50 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
    4. नमूनों को बाद में प्रसंस्करण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ताकि अधिकतम डीएनए विघटन सुनिश्चित किया जा सके और इसके बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण हो सके। वैकल्पिक रूप से, सीधे चरण 5 के साथ आगे बढ़ें।

5. डीएनए एकाग्रता और शुद्धता की जांच

  1. एक नाजुक टास्क वाइपर के साथ माइक्रोस्पेक्ट्रोफोटोमीटर के पेडस्टल को साफ करने के बाद, डीएनए तैयारी का 1 μL लोड करें।
  2. नमूने में डीएनए की एकाग्रता पर ध्यान दें। दोनों Equation 2 पर अवशोषण के अनुपात की जांच करें। Equation 3 डीएनए 260 एनएम पर अवशोषित होगा, प्रोटीन 280 एनएम पर, और फिनोल जैसे कार्बनिक पदार्थ 230 एनएम पर अवशोषित होंगे। वास्तविक समय पीसीआर के लिए 1.8-2 का अनुपात पर्याप्त माना जाता है।

6. वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा परिमाणीकरण

  1. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी
    1. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में एसवाईबीआर हरे रियल-टाइम पीसीआर मिश्रण के 5 μL रखें। प्रत्येक ट्यूब में 7.5 pmol/μL फॉरवर्ड प्राइमर का 1 μL और 7.5 pmol/μL रिवर्स प्राइमर का 1 μL जोड़ें। फॉरवर्ड प्राइमर अनुक्रम: 5'-CCCTAGTGGTTTCGACACA-3'; रिवर्स प्राइमर अनुक्रम: 5'-ACTTGCAATGCTCTAGGCG-3'। ईबीवी जीनोम कॉपी संख्या निर्धारित करने के लिए प्रवर्धित जीन एपस्टीन-बार वायरस छोटा आरएनए 2 (ईबर -2) जीन है।
    2. ट्यूबों में से एक में, चरण 4 से न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 2 μL और वायरल डीएनए के 1 μL जोड़ें। प्रतिक्रिया मिश्रण की कुल मात्रा 10 μL है।
      नोट: नमूने में डीएनए की एकाग्रता के आधार पर, एक कमजोर पड़ने वाले कदम की आवश्यकता हो सकती है। कमजोर पड़ने वाले कारक एफ को नोट किया जाना चाहिए और चरण 6.3 में सूत्र में एकीकृत किया जाएगा।
    3. अन्य ट्यूब तैयार करें जो ज्ञात ईबीवी जीनोम कॉपी नंबर (1000, 2000, 5000, 10,000 और 54,000 प्रतियों) के साथ मानकों के रूप में उपयोग किए जाएंगे।
  2. पीसीआर मिश्रण को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सक्रियण के प्रारंभिक चरण से शुरू करें, फिर क्रमशः 15 सेकंड और 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस और 58 डिग्री सेल्सियस (एनीलिंग) पर 40 चक्र चलाएं।
  3. प्रति मानक ट्यूब ईबीवी जीनोम प्रतियों की संख्या के लॉग के खिलाफ मानकों के सीटी मानों को प्लॉट करके एक क्यूपीसीआर मानक वक्र उत्पन्न करें। मानक वक्र प्लॉट समीकरण को नियोजित करते हुए, प्रेरित वायरल डीएनए युक्त पीसीआर ट्यूब में ईबीवी जीनोम प्रतियों की संख्या प्राप्त करें। फिर, प्रेरित वायरल तैयारी की एकाग्रता की गणना करने के लिए निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करें:
    Equation 4
    जहां एक्स मानक वक्र से प्राप्त ईबीवी जीनोम प्रतियों की संख्या है और एफ प्रति पीसीआर प्रतिक्रिया में उपयोग किए जाने वाले डीएनए को स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला कमजोर पड़ने वाला कारक है।

7. वायरल कणों की जैविक गतिविधि/संक्रामकता की जांच

  1. बीसी -3 कोशिकाओं को 100 मिमी कल्चर प्लेट से 80% कंफ्लुएंसी पर 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। पी 3 एचआर -1 कोशिकाओं का सीडिंग घनत्व 1 x 106 कोशिकाएं / एमएल है। पूर्ण आरपीएमआई संस्कृति माध्यम (79% आरपीएमआई संस्कृति माध्यम, 20% भ्रूण बोवाइन सीरम, 1% पेन-स्ट्रेप एंटीबायोटिक) को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बनाए रखें, और हर 3-4 दिनों में पारित करें।
  2. बीसी -3 कोशिकाओं की गणना उसी तरह करें जैसे पी 3 एचआर -1 कोशिकाओं को चरण 1 का पालन करके गिना गया था। 96-वेल प्लेट में, प्रत्येक कुएं में 105 बीसी -3 कोशिकाएं जोड़ें। परिणामों के महत्व को सुनिश्चित करने और त्रुटियों को कम करने के लिए तीन, छह, नौ या 12 कुओं का उपयोग करें।
  3. चरण 6.3 में निर्धारित वायरल तैयारी की एकाग्रता के आधार पर प्रत्येक कुएं में वायरल स्टॉक की मात्रा जोड़ें। एमओआई अलग-अलग हो सकता है, और इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन संक्रमण के लिए सबसे अच्छा एमओआई प्रकट करेगा (2-50 की एमओआई रेंज की सिफारिश की जाती है)। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में मौजूद मिश्रण की कुल मात्रा 250 μL है।
    1. आवश्यक मात्रा निर्धारित करने के लिए, वायरल स्टॉक की एकाग्रता ज्ञात होनी चाहिए, और एक एमओआई का चयन किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि एमओआई 2 है, तो जोड़े गए वायरल कणों की संख्या कोशिकाओं की संख्या से दोगुनी होनी चाहिए। सूत्र का उपयोग करके आवश्यक वायरल स्टॉक के आयतन V की गणना करें: Equation 5, जिसमें n वायरल कणों की संख्या आवश्यक है, और C वायरल स्टॉक की ज्ञात एकाग्रता है
  4. 5 दिनों के लिए 96-वेल प्लेट की सामग्री को इनक्यूबेट करें। 5 दिनों के बाद, प्रत्येक कुएं की सामग्री को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. वायरस युक्त संस्कृति माध्यम से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 8 मिनट के लिए 120 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल छर्रों के साथ-साथ सतह पर तैरने वाले कणों को डीएनए निष्कर्षण के अधीन करें, जिसके बाद प्रत्येक अंश में वायरल जीनोम की उपस्थिति की जांच करने के लिए वास्तविक समय पीसीआर परिमाणीकरण किया जाता है, इस प्रकार वायरल कणों की संक्रामकता का आकलन किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रक्रिया का लक्ष्य ज्ञात वायरल टिटर के साथ एक निलंबन में ईबीवी कणों को अलग करना है, जिसका उपयोग बाद में ईबीवी संक्रमण को मॉडल करने के लिए किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रक्रिया से उच्चतम ईबीवी उपज प्राप्त करने के लिए विभिन्न अभिकर्मकों की इष्टतम सांद्रता का उपयोग करना अत्यंत महत्वपूर्ण है।

पीएमए और डीएमएसओ की सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक अनुकूलन परीक्षण किया गया था जो ईबीवी कणों की उच्चतम संख्या उत्पन्न करेगा (चित्रा 2)। 0.8% की डीएमएसओ एकाग्रता और 35 एनजी / 1 एल की पीएमए एकाग्रता इष्टतम थी और इसके परिणामस्वरूप उच्च ईबीवी सांद्रता हुई। अनुकूलन प्रोटोकॉल से प्राप्त वायरल कणों की एकाग्रता 917,471 वायरल कण /

Figure 2
चित्रा 2: ईबीवी डीएनए प्रतियां / एमएल फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) के साथ पी 3एचआर -1 कोशिकाओं के प्रेरण पर प्राप्त होती हैं। पी 3 एचआर -1 कोशिकाओं (105 कोशिकाओं) को अकेले सुसंस्कृत किया गया था या यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीएमए और डीएमएसओ की विभिन्न सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया था। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन को इंगित करती हैं. कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए पीएमए / पीएमए और डीएमएसओ-उपचारित कोशिकाओं की तुलना में एक छात्र का टी-टेस्ट किया गया था; * पी < 0.05 इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस प्रोटोकॉल को प्रभावी माना जाने के लिए, चरण 6 को वायरल कणों की उचित एकाग्रता को प्रकट करना चाहिए, और चरण 7 को यह दिखाना चाहिए कि ये वायरल कण वास्तव में संक्रामक हैं। चरण 7 में उपयोग की जाने वाली बीसी -3 सेल लाइन ईबीवी-नकारात्मक है, इसलिए नकारात्मक नियंत्रणों में ईबीवी जीनोम कॉपी संख्याओं का परिमाणीकरण करने पर (जो इस प्रोटोकॉल के अधीन नहीं थे), कोई ईबीवी डीएनए का पता नहीं लगाया जाना चाहिए।

हालांकि, ईबीवी डीएनए को निम्नलिखित कारणों से प्रयोगात्मक कुओं (जो इस प्रोटोकॉल के अधीन थे) के कोशिकाओं और संस्कृति माध्यम दोनों में पाया जाना चाहिए: बीसी -3 कोशिकाओं को संक्रमित करने वाला ईबीवी इन कोशिकाओं के अंदर प्रतिकृति करेगा, इस तथ्य के लिए लेखांकन कि ईबीवी डीएनए सेल गोली में पता लगाया जाएगा और प्रतिकृति पर, बीसी -3 कोशिकाएं वायरल कणों को बाहर की ओर बहा देंगी; इस प्रकार, ईबीवी डीएनए को संस्कृति माध्यम सुपरनैटेंट (डीएनए निष्कर्षण के बाद) में पाया जाएगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ईबीवी कणों का उत्पादन इस वायरस के जीव विज्ञान के साथ-साथ इससे संबंधित बीमारियों को समझने के लिए आवश्यक है। यहां हमने पी 3 एचआर -1 सेल लाइन से इन कणों के उत्पादन का वर्णन किया। यह सेल लाइन एकमात्र ईबीवी-निर्माता लाइन नहीं है; वास्तव में, ईबीवी कणों को बी 95-8 कोशिकाओं21,22 के साथ-साथ राजी सेल लाइन18,19 से भी अलग किया गया है। एन-ब्यूटिरेट के साथ इन कोशिकाओं में ईबीवी लिटिक चक्र को प्रेरित किया गया है। वैकल्पिक रूप से, 12-ओ-टेट्राडेकेनॉयलफोरबोल-13-एसीटेट (टीपीए) जैसे फोरबोल एस्टर, जिसे फोरबोल 12-मायरिस्टेट-13-एसीटेट (पीएमए) के रूप में भी जाना जाता है, का उपयोग किया जा सकता है। कुल मिलाकर, यहां दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग पी 3 एचआर -1 लाइन के बजाय इन कोशिकाओं को नियोजित करके किया जा सकता है। हालांकि, बी 95-8 लाइन एक कपास-शीर्ष इमली (सैगुइनस ओडिपस) से ली गई थी जिसे वर्तमान में गंभीर रूप से लुप्तप्राय प्राइमेट प्रजाति23 के रूप में वर्गीकृत किया गया है; इसलिए, यह लाइन शायद ही कभी विक्रेताओं द्वारा इसकी बिक्री और शिपिंग पर प्रतिबंध के साथ बेची जाती है। यूनाइटेड किंगडम के बाहर सभी आदेशों के लिए जंगली जीवों और वनस्पतियों (CITES) की लुप्तप्राय प्रजातियों में अंतर्राष्ट्रीय व्यापार पर सम्मेलन द्वारा एक लाइसेंस भी आवश्यक है। जबकि राजी सेल लाइन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, प्रतिकृति वायरल डीएनए का संश्लेषण और वायरल कैप्सिड एंटीजन (वीसीए) का उत्पादनरसायनों 24,25 द्वारा प्रेरण के बाद इन कोशिकाओं में नहीं होता है। हालांकि, इन्हें पी 3 एचआर -1 कोशिकाओं20 से अलग ईबीवी के साथ सुपरइंफेक्शन के बाद पूरक द्वारा आसानी से प्रेरित किया जा सकता है।

ईबीवीकण26 की गणना के लिए प्रत्यक्ष पट्टिका परख की अनुपस्थिति के कारण, हमने वास्तविक समय पोलीमरेज़-चेन प्रतिक्रिया पर भरोसा किया। परिमाणीकरण के अन्य तरीके हैं जो हमारे उद्देश्य के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकते हैं, जैसे कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस या पीसीआर फ्लोरोसेंट जांच को नियोजित करते हैं जो बढ़ी हुई विशिष्टता प्रदान कर सकते हैं। जीनोम कॉपी मानकों का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर का विकल्प इस तथ्य पर आधारित है कि यह अधिकांश प्रयोगशालाओं के लिए आसानी से सुलभ है, कम श्रमसाध्य, कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण, और अधिक लागत-कुशल27। इसलिए, परिमाणीकरण के अन्य तरीके समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकते हैं और उपलब्धता और अनुभव के आधार पर उपयोग किया जा सकता है।

यहां दिए गए प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक चरण 2.1 में कोशिकाओं की चढ़ाना और प्लेट के आकार के लिए अनुशंसित सीमा के भीतर सेल नंबर के साथ सीडिंग है। कोशिकाओं की कम संख्या वायरल कणों की कम सांद्रता पैदा करती है, जबकि बड़ी संख्या में कोशिकाएं प्लेट को भीड़ करती हैं, कोशिकाओं के विकास और प्रतिकृति को रोकती हैं, और इसलिए वायरस के लिटिक चक्र को धीमा कर देती हैं। यही कारण है कि चरण 1 में कोशिकाओं की गिनती करते समय अत्यधिक सावधानी बरतनी चाहिए, निलंबन ए की आवश्यक मात्रा की गणना करना, और अंत में चरण 2 में कोशिकाओं को चढ़ाना।

प्रोटोकॉल की एक सीमा यह धारणा है कि ईबीवी जीनोम की एक प्रति एक वायरल कण से मेल खाती है। हालांकि यह धारणा प्रशंसनीय है, क्या ऐसे कण दोषपूर्ण या अपूर्ण हैं, इस परख का उपयोग करके पता नहीं लगाया जा सकता है। चूंकि ईबीवी के लिए कोई पट्टिका गठन परख नहीं है जैसा कि कई अन्य वायरस के लिए है, इसलिए वास्तविक समय पीसीआर के बाद डीएनए निष्कर्षण वायरल तैयारी को निर्धारित करने के लिए एक स्वीकृत विधि बनी हुई है। एक और सीमा यह है कि वायरस एक निरंतर स्तनधारी सेल लाइन से प्रेरित होता है जो पासिंग के कई दौर पर उत्परिवर्तन जमा कर सकता है। इस तरह के उत्परिवर्तन वायरस को प्रभावित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संभवतः वायरस के विवो या एक्स विवो गुणों में बदलाव हो सकता है। एक संभावित समाधान नियमित रूप से सेलुलर और वायरल जीनोम को अनुक्रमित करना होगा। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को कुछ अंशों के बाद छोड़ दिया जा सकता है और संस्कृति को पिछले मार्गों की कम संख्या के साथ तरल नाइट्रोजन-संग्रहीत सेल नमूने से नए सिरे से फिर से शुरू किया जा सकता है। यह भी ध्यान देने योग्य है कि पी 3 एचआर -1 सेल लाइन से प्राप्त ईबीवी कणों में ईबीएनए 2 एंटीजन की कमी होती है, जो आमतौर पर बी लिम्फोसाइटों में व्यक्त की जाती है जो कुल28 में छह वायरल परमाणु प्रोटीन के हिस्से के रूप में ईबीवी से गुप्त रूप से संक्रमित होते हैं। ईबीएनए 2 प्रोटीन जीन के प्रमोटरों को सक्रिय करता है जो ईबीवी विलंबता के प्रकार III से जुड़े प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ईबीएनए 2 की कमी वाले ईबीवी सीबीएच चूहों में ट्यूमर बनाने में सक्षम है, और यह कि पी 3एचआर -1 सेल लाइन इसलिए ईबीवी पॉजिटिव लिम्फोमा29 का एक उपयोगी मॉडल बनी हुई है। दूसरी ओर, पी 3एचआर -1 कोशिकाओं से ईबीवी का उपयोग नियंत्रण के रूप में ईबीएनए 2-पॉजिटिव ईबीवी का उपयोग करते समय ईबीएनए 2 द्वारा निभाई गई भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। सारांश में, एक निरंतर पी 3 एचआर -1 सेल लाइन से प्राप्त ईबीवी का एक महत्वपूर्ण शोध मूल्य है; इसका उपयोग जीव विज्ञान, संक्रामकता, विषाणु, साथ ही ईबीवी के कई अन्य गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम के लिए वित्त पोषण को असमार रिसर्च फंड, लेबनानी नेशनल काउंसिल फॉर साइंटिफिक रिसर्च (एल-सीएनआरएस) और अमेरिकन यूनिवर्सिटी ऑफ बेरूत में मेडिकल प्रैक्टिस प्लान (एमपीपी) से ईआर को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100x20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 187
P3HR1 सेल लाइन से एपस्टीन-बार वायरस का अलगाव और परिमाणीकरण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S.,… More

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter