Summary
Le présent protocole décrit la conception, la fabrication et la caractérisation d’un système microfluidique capable d’aligner, d’immobiliser et de comprimer avec précision des centaines d’embryons de Drosophila melanogaster avec une intervention minimale de l’utilisateur. Ce système permet l’imagerie haute résolution et la récupération d’échantillons pour l’analyse post-stimulation et peut être mis à l’échelle pour s’adapter à d’autres systèmes biologiques multicellulaires.
Abstract
Au cours de l’embryogenèse, le mouvement cellulaire coordonné génère des forces mécaniques qui régulent l’expression et l’activité des gènes. Pour étudier ce processus, des outils tels que l’aspiration ou la compression de feuillet de couverture ont été utilisés pour stimuler mécaniquement des embryons entiers. Ces approches limitent la conception expérimentale car elles sont imprécises, nécessitent une manipulation manuelle et ne peuvent traiter que quelques embryons simultanément. Les systèmes microfluidiques ont un grand potentiel pour automatiser de telles tâches expérimentales tout en augmentant le débit et la précision. Cet article décrit un système microfluidique développé pour comprimer avec précision les embryons entiers de Drosophila melanogaster (mouche des fruits). Ce système comporte des microcanaux avec des parois latérales déformables actionnées pneumatiquement et permet l’alignement de l’embryon, l’immobilisation, la compression et la collecte post-stimulation. En parallélisant ces microcanaux en sept voies, des schémas de compression stables ou dynamiques peuvent être appliqués à des centaines d’embryons de drosophile simultanément. La fabrication de ce système sur une lamelle de verre facilite la stimulation mécanique et l’imagerie simultanées d’échantillons avec des microscopes à haute résolution. De plus, l’utilisation de matériaux biocompatibles, tels que le PDMS, et la capacité de faire circuler le fluide dans le système rendent cet appareil capable d’expériences à long terme avec des échantillons dépendants du milieu. Cette approche élimine également la nécessité d’un montage manuel qui sollicite mécaniquement les échantillons. En outre, la possibilité de collecter rapidement des échantillons à partir des microcanaux permet des analyses post-stimulation, y compris des tests -omiques qui nécessitent un grand nombre d’échantillons inaccessible avec les approches de stimulation mécanique traditionnelles. La géométrie de ce système est facilement adaptable à différents systèmes biologiques, ce qui permet à de nombreux champs de bénéficier des caractéristiques fonctionnelles décrites ici, notamment un débit d’échantillon élevé, une stimulation mécanique ou une immobilisation et un alignement automatisé.
Introduction
Les systèmes vivants subissent et répondent constamment à diverses entrées mécaniques tout au long de leur vie1. La mécanotransduction a été liée à de nombreuses maladies, notamment les troubles du développement, la perte musculaire et osseuse et les neuropathologies par des voies de signalisation directement ou indirectement affectées par l’environnement mécanique2. Cependant, les gènes et protéines qui sont régulés par stimulation mécanique3 dans les voies de signalisation mécanosensibles4 restent largement inconnus5, empêchant l’élucidation des mécanismes de régulation mécanique et l’identification de cibles moléculaires pour les maladies associées à la mécanotransduction pathologique 6,7 . Un facteur limitant dans la projection des études de mécanobiologie sur les processus physiologiques connexes est l’utilisation de cellules individuelles avec des boîtes de culture conventionnelles au lieu d’organismes multicellulaires intacts. Les organismes modèles, tels que Drosophila melanogaster (mouche des fruits), ont grandement contribué à la compréhension des gènes, des voies de signalisation et des protéines impliquées dans le développement animal 8,9,10. Néanmoins, l’utilisation de la drosophile et d’autres organismes modèles multicellulaires dans la recherche en mécanobiologie a été entravée par des défis liés aux outils expérimentaux. Les techniques conventionnelles de préparation, de tri, d’imagerie ou d’application de divers stimuli nécessitent principalement une manipulation manuelle; Ces approches prennent beaucoup de temps, nécessitent une expertise, introduisent de la variabilité et limitent le plan expérimental et la taille de l’échantillon11. Les progrès microtechnologiques récents sont une excellente ressource pour permettre de nouveaux essais biologiques avec un débit très élevé et des paramètres expérimentaux hautement contrôlés12,13,14.
Cet article décrit le développement d’un dispositif microfluidique amélioré pour aligner, immobiliser et appliquer avec précision une stimulation mécanique sous forme de compression uniaxiale à des centaines d’embryons entiers de drosophile 15 (Figure 1). L’intégration du système microfluidique avec une lamelle de couverture en verre a permis une imagerie confocale haute résolution des échantillons pendant la stimulation. Le dispositif microfluidique a également permis une collecte rapide des embryons après la stimulation pour l’exécution de tests -omiques (Figure 2). Des explications sur les considérations de conception de ce dispositif, ainsi que sur la fabrication par lithographie douce et caractérisation expérimentale, sont décrites ici. Étant donné que la fabrication d’un moule de plaquette de silicium d’un tel dispositif nécessite un revêtement uniforme de résine photosensible épaisse (épaisseur >200 μm) sur de grandes surfaces avec des tranchées à rapport d’aspect élevé (AR >5), cette méthode a considérablement modifié le protocole traditionnel de fabrication de moules photolithographiques. De cette façon, cette méthode a facilité la manipulation, l’adhérence, le revêtement, la structuration et le développement de la résine photosensible. De plus, les pièges potentiels et leurs solutions sont discutés. Enfin, la polyvalence de cette stratégie de conception et de fabrication a été démontrée à l’aide d’autres systèmes multicellulaires tels que les chambres à œufs de drosophile et les organoïdes cérébraux16.
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Protocol
1. Préparation du moule de plaquette de silicium
- Nettoyez d’abord la plaquette de silicium (voir le tableau des matières) avec de l’acétone, puis avec de l’alcool isopropylique (IPA).
- Placer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 250 °C pendant 30 minutes pour la cuisson de déshydratation (figure 3A).
- Enduire la plaquette de silicium d’hexaméthyldisilazane (HDMS) dans un four à vapeur (voir le tableau des matériaux) (température du procédé : 150 °C, pression du procédé : 2 Torr, temps de traitement : 5 min, volume HDMS : 5 μL) (Figure 3B).
- Placer une bouteille de résine photosensible SU-8 2100 (voir Tableau des matériaux) dans un four à 60 °C pendant 15 min pour réduire sa viscosité.
REMARQUE: Lors du chauffage au four, la viscosité de la résine photosensible diminue. Les résines photosensibles avec une viscosité réduite peuvent être manipulées plus facilement et peuvent être versées plus précisément sur le dessus de la plaquette. - Placer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 60 °C et verser 1 mL de la résine photosensible chauffée pour chaque pouce de plaquette jusqu’à ce que la résine photosensible recouvre la majeure partie de la surface (Figure 3C).
- Transférer la plaquette de silicium revêtue de photorésine dans un enduit d’essorage (voir le tableau des matériaux).
- Appliquer le pré-spin d’abord à 250 tr/min pendant 30 s, puis à 350 tr/min pendant 30 s supplémentaires, les deux avec une accélération de 100 tr/min (Figure 3D).
- Retirez l’excès de résine photosensible des bords de la plaquette de silicium à l’aide d’un écouvillon de salle blanche.
- Appliquer un spin d’abord à 500 tr/min pendant 15 s avec une accélération de 100 tr/min, puis à 1450 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 300 tr/min (Figure 3E).
- Retirez le cordon de bord avec un écouvillon de salle blanche.
- Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 50 °C et vaporisez de l’acétone sur la plaquette pour éliminer les imperfections et favoriser un revêtement uniforme (Figure 3F).
- Augmentez lentement la température de la plaque chauffante jusqu’à 95 °C à raison de 2 °C/min.
- Cuire doucement la plaquette de silicium à 95 °C pendant 50 min (figure 3G).
- Refroidir lentement la plaque chauffante à température ambiante à une vitesse de 2 °C/min.
- Placez la plaquette de silicium sur un aligneur de masque (voir le tableau des matériaux) et placez le photomasque par-dessus (reportez-vous à la figure supplémentaire 1 pour la géométrie du photomasque).
- Exposez la plaquette de silicium à une lumière UV de 350 mJ/cm2 (35 mW/cm2 pendant 10 s) à travers le photomasque à l’aide de l’aligneur de masque de contact (Figure 3H).
- Appliquer des cuissons consécutives post-exposition sur la plaquette de silicium en plaçant la plaquette sur une plaque chauffante à 50 °C pendant 5 min, à 65 °C pendant 5 minutes supplémentaires et enfin à 80 °C pendant 20 minutes supplémentaires (figure 3I).
- Refroidir lentement la plaquette de silicium à température ambiante à une vitesse de 2 °C/min.
- Placez un agitateur magnétique d’un diamètre légèrement inférieur à celui de la plaquette de silicium dans un bécher. Retournez la plaquette de silicium et placez-la sur le dessus du bécher.
- Placez le bécher à l’intérieur d’un autre bécher plus grand et remplissez le plus grand bécher avec une nouvelle solution de révélateur (voir le tableau des matériaux). Laissez la plaquette de silicium immergée dans le révélateur pendant 30 minutes avec l’agitateur allumé (Figure 3J).
- Transférer la plaquette de silicium dans un sonicateur à bain à ultrasons rempli du révélateur frais pendant 1 h à 40 kHz (Figure 3K).
- Lavez soigneusement la plaquette de silicium avec une solution IPA pour obtenir le moule final de la plaquette de silicium (Figure 3L).
2. Fabrication de la puce microfluidique
- Placez le moule de plaquette de silicium dans un dessiccateur avec 10 gouttes (~500 μL) de trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS, voir le tableau des matériaux) dans un petit bateau de pesée à proximité.
- Connectez le dessiccateur à une pompe à vide à environ 200 Torr pendant 30 min.
- Fermez la vanne de déshydratation et débranchez la pompe à vide pendant la nuit pour le revêtement PFOCTS.
- Préparer la solution de polydiméthylsiloxane prédurcie (PDMS) en mélangeant la base PDMS avec l’agent de durcissement (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 10:1.
- Dégazer le mélange en le plaçant dans une centrifugeuse (500 x g pendant 5 min à température ambiante).
REMARQUE: Cette centrifugation permet aux bulles de migrer vers la surface supérieure et d’être éliminées en peu de temps. - Versez la solution PDMS dégazée sur le moule de plaquette de silicium.
- Dégazez-le à nouveau pour éliminer les bulles d’air piégées sur la surface du moule.
- Faire durcir le PDMS dans un four à 60 °C pendant 1 h et 50 min (Figure 3M).
- Utiliser un scalpel pour couper les bordures de la région PDMS durcie correspondant à la géométrie de la puce microfluidique (Figure 3N).
- Décollez la partie PDMS et placez-la à l’envers sur un tapis de coupe.
- Utilisez un rasoir pour découper la pièce PDMS dans sa forme finale (Figure 3O).
- Percez les trous d’entrée et de sortie du PDMS à l’aide d’un poinçon de biopsie (voir le tableau des matériaux) ou d’une aiguille munie d’une pointe émoussée (figure 3P).
- Pour le trou d’entrée de l’embryon, utilisez un poinçon de 4 mm de diamètre.
- Pour les trous de sortie de l’embryon, utilisez un poinçon de 1,3 mm de diamètre.
- Pour le trou d’entrée de gaz, utilisez un poinçon de 2 mm.
- Utilisez un morceau de scotch pour enlever toute particule qui pourrait rester sur la surface à motifs du PDMS.
- Nettoyez une lame de verre rectangulaire de 24 mm x 60 mm d’abord avec de l’acétone, puis avec de l’IPA.
- Sécher la surface vitrée à l’aide d’un pistolet à air comprimé relié à une source d’air filtrée.
- Appliquez une cuisson de déshydratation sur la lame de verre en la plaçant sur une plaque chauffante à 250 °C pendant 2 h (figure 3Q).
- Couvrez la lame de verre avec un bécher pour éviter toute contamination de surface.
- Placez le PDMS, avec son côté à motifs vers le haut, et le verre déshydraté glissez dans un nettoyant plasma (voir le tableau des matériaux).
- Traiter le PDMS et la lame de verre avec du plasma d’oxygène à 18 W pendant 30 s.
- Placez le PDMS sur la lame de verre avec sa surface à motifs orientée vers la lame de verre pour sceller les microcanaux via une liaison covalente (Figure 3R).
- Utilisez une pince à épiler pour pousser doucement la partie PDMS contre la lame de verre afin d’assurer un contact conformationnel complet.
- Conservez la puce microfluidique terminée à température ambiante pendant la nuit pour permettre à la liaison d’atteindre sa force finale.
3. Préparation des embryons de mouches des fruits
- Permettre aux mouches adultes de l’Oregon-R de pondre des œufs sur des plaques de gélose au jus de pomme (1,5 % d’agar, 25 % de jus de pomme, 2,5 % de saccharose) et recueillir les plaques au moment de développement souhaité après la ponte pour l’expérience donnée.
NOTE: Pour les présentes expériences, les plaques ont été collectées à 140 minutes pour préparer et trier les embryons au stade de cellularisation17. - Inonder la gélose de lavage d’œuf embryonnaire (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) et agiter doucement les embryons avec un pinceau pour les déloger de l’agar.
- Transférer les embryons dans une solution d’eau de Javel à 50% pendant 90 s, en remuant de temps en temps. Filtrer les embryons à travers un tamis à tissus et laver soigneusement la solution d’eau de Javel avec de l’eau.
- Transférer les embryons dans une boîte de Petri en verre de 90 mm avec suffisamment de lavage d’œufs d’embryons pour couvrir complètement les embryons.
- Examiner les embryons avec transillumination sur un microscope à dissection et sélectionner les embryons du stade de développement souhaité pour les charger dans le dispositif microfluidique.
REMARQUE: Dans cette application, les embryons au stade de la cellularisation ont été sélectionnés. Les descriptions détaillées de la façon d’assurer une sélection appropriée des stades de développement se trouvent dans le manuel de laboratoire pour Drosophila17.
4. Application d’une stimulation mécanique aux embryons de mouches des fruits à l’aide de la puce microfluidique
- Amorcez les sept microcanaux embryonnaires en les remplissant d’IPA filtrée de 0,4 μm par l’orifice d’entrée principal de l’embryon.
- Remplacer l’IPA par de l’eau désionisée filtrée (DI) de 0,4 μm.
- Remplacez l’eau DI par une solution de lavage d’œufs d’embryons.
- Prélever environ 100 embryons présélectionnés dans la boîte de Petri en verre à l’aide d’une pipette en verre.
- Pipeter les embryons dans l’orifice d’entrée de l’embryon (Figure 4A).
- Appliquer une pression négative d’environ 3 PSI (c.-à-d. vide) à l’entrée de gaz à l’aide d’une pompe à vide portative pour ouvrir les microcanaux embryonnaires.
- Inclinez la puce microfluidique vers le bas pour que les embryons s’alignent automatiquement et s’installent dans les microcanaux embryonnaires (Figure 4B).
- Si les entrées du microcanal embryonnaire sont obstruées par plusieurs embryons entrant simultanément, inclinez la puce microfluidique vers le haut, puis à nouveau vers le bas pour éliminer le colmatage.
- En fonction du débit requis, introduisez jusqu’à 300 embryons dans les microcanaux embryonnaires.
- Une fois le chargement embryonnaire terminé, retirez le vide pour immobiliser les embryons.
- Inclinez la puce microfluidique vers l’arrière en position horizontale (figure 4C).
- Connectez une source portative à pression positive (voir le tableau des matériaux) munie d’un manomètre à l’entrée de gaz pour appliquer une compression de 3 PSI (figure 4D).
- Vérifiez continuellement le manomètre pour vous assurer qu’un niveau de compression constant est appliqué.
- Si des expériences d’imagerie en direct doivent être menées sur les embryons stimulés mécaniquement, placez la puce microfluidique sur un support de lame en verre standard au stade du microscope avec l’entrée de gaz connectée à la source de pression.
- Une fois l’expérience de compression terminée, les embryons peuvent être collectés pour une analyse en aval. Pour ce faire, appliquez d’abord le vide à l’entrée de gaz pour libérer les embryons.
- Ensuite, inclinez la puce microfluidique vers le haut pour que les embryons se déplacent vers le port d’introduction de l’embryon (Figure 4E).
- Recueillir les embryons de la puce microfluidique à l’aide d’une pipette en verre.
REMARQUE : Lors de la collecte, les effets de la compression sur le développement embryonnaire et la viabilité peuvent être étudiés en cultivant les mouches des fruits jusqu’à l’âge adulte. La capacité de traitement à haut débit du dispositif microfluidique permet également d’utiliser des embryons dans des tests omiques en aval qui nécessitent un grand nombre d’échantillons (Figure 2).
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Representative Results
Le système microfluidique est divisé en deux sous-compartiments séparés par des parois latérales PDMS déformables. Le premier compartiment est le système liquide où les embryons de drosophile sont introduits, automatiquement alignés, alignés et comprimés. Le deuxième compartiment est un système de gaz où la pression du gaz de chaque côté des canaux de compression est contrôlée via des microcanaux en cul-de-sac pour contrôler avec précision la largeur effective des canaux de compression. Le dispositif microfluidique est scellé avec une lame de verre en bas, ce qui permet une imagerie en direct à haute résolution des échantillons (figure supplémentaire 2) pour les dimensions pertinentes du dispositif microfluidique.
Les organismes multicellulaires tels que les embryons de drosophile sont sélectionnés au stade de développement embryonnaire souhaité. Dans le cas des embryons de drosophile , tous les stades de développement sont également compatibles avec cette approche puisque la taille de l’embryon ne change pas jusqu’à son éclosion. Les échantillons sélectionnés sont introduits dans le dispositif microfluidique par la grande entrée (c.-à-d. 4 mm de diamètre) à l’aide d’une micropipette en verre. Le dispositif est ensuite incliné vers le bas pour permettre aux embryons de s’écouler dans les sept canaux de compression organisés de manière parallèle. L’oreillette rétrécie qui relie l’entrée de l’embryon au canal de compression assure l’alignement automatique des embryons avant qu’ils n’atteignent l’entrée des canaux de compression. Le vide appliqué à l’entrée de gaz dévie les parois latérales déformables vers l’extérieur, augmentant la largeur effective du microcanal et permettant aux embryons d’entrer séquentiellement dans les canaux de compression. Les sept canaux de compression mesurent 22 mm de long et, en parallèle, peuvent accueillir jusqu’à 300 embryons de drosophile en une seule fois. Les canaux de compression se terminent par un goulot d’étranglement où la largeur du microcanal diminue à un niveau beaucoup plus petit que celui des échantillons, ce qui permet au fluide de s’écouler tout en conservant les embryons. Grâce à cette approche, les embryons sont concentrés dans les canaux de compression. Après l’introduction des embryons, le vide dans l’entrée de gaz est éliminé et les parois latérales des microcanaux reviennent à leur position initiale et immobilisent les embryons alignés de chaque côté. La compression peut être obtenue en appliquant une pression positive à l’entrée de gaz, ce qui dévie les parois latérales déformables vers l’intérieur et réduit la largeur effective du microcanal. La quantité de compression appliquée aux embryons peut être réglée avec précision en adaptant les dimensions des microcanaux, l’épaisseur des parois latérales déformables, le module de Young du PDMS et la pression appliquée. Après l’expérience de compression, les embryons peuvent être collectés pour une analyse en aval en appliquant un vide à l’entrée de gaz et en inclinant le dispositif microfluidique dans une autre direction.
Ce dispositif microfluidique a été fabriqué par lithographie douce18. Cependant, la fabrication de structures épaisses avec des caractéristiques de rapport d’aspect élevé à l’aide de résine photosensible ultraépaisse nécessite des écarts majeurs par rapport aux protocoles définis pour la fabrication standard (Figure 3). Avec le revêtement hexaméthyldisilazane (HDMS), les plaquettes de silicium ont été nettoyées avant le revêtement par centrifugation pour éliminer les résidus organiques et cuites au four pour éliminer l’humidité de surface. Ces étapes supplémentaires ont amélioré la liaison de l’épaisse couche de résine photosensible à la tranche de silicium. La résine photosensible a également été chauffée avant de couler pour diminuer la viscosité, ce qui était crucial pour couvrir toute la surface de la plaquette. L’épaisseur de revêtement de la photorésine cible a été obtenue en trois étapes de filature, où chaque étape de filature a progressivement éliminé l’excès de résine photosensible sans contaminer la surface de la plaquette. Inspirée des méthodes précédemment publiées19, de l’acétone a été pulvérisée, qui est l’un des solvants de la résine photosensible, sur la tranche de silicium pour éliminer les imperfections de la photorésine et augmenter l’uniformité du revêtement. Au cours des étapes de cuisson consécutives, la température a été modifiée lentement pour minimiser le stress thermique, ce qui pourrait entraîner le délaminage de la résine photosensible de la plaquette de silicium. En raison de préoccupations similaires, la température de cuisson a été réduite tout en augmentant sa durée. L’une des étapes les plus difficiles de la fabrication photolithographique de tranchées à rapport d’aspect élevé a été l’élimination de la résine photosensible non durcie après exposition aux UV. Pour maximiser la pénétration de la solution de développement dans les tranchées, la plaquette de silicium a été retournée et continuellement mélangée à la solution de développement avec un agitateur. De cette façon, la nouvelle solution de développement pourrait réagir avec et supprimer la résine photosensible non durcie. Cette étape a été suivie d’un bain à ultrasons où la résine photosensible restante a été retirée. Une fois le moule de plaquette de silicium généré avec succès, le processus de moulage de réplique standard consistait à mélanger les agents de durcissement, à dégazer, à verser, à durcir, à peler, à poinçonner et à lier au plasma pour la fabrication du dispositif microfluidique final20.
La fonctionnalité du dispositif microfluidique a été déterminée expérimentalement en chargeant des embryons de drosophile dans les canaux de compression et en appliquant une pression positive aux canaux gazeux. Les mesures de la largeur décroissante des embryons au microscope (Figure 5A) montrent comment la pression du gaz peut être utilisée pour obtenir un niveau de compression cible (Figure 5B). Les images accélérées d’embryons alignés subissant une compression démontrent également la compatibilité de ce système avec la microscopie confocale.
Figure 1 : Conception et fonction du dispositif microfluidique. Le dispositif microfluidique se compose de sept microcanaux de compression parallèles qui peuvent tester jusqu’à 300 embryons entiers de drosophile simultanément. (A) Les embryons ont été introduits dans le dispositif par l’entrée principale de l’embryon, et ils se sont alignés le long de l’axe postérieur-antérieur automatiquement lorsqu’ils sont entrés dans les microcanaux. (B) Les embryons se déplaçaient librement lorsque la pression négative était appliquée à travers l’entrée de gaz, car cela déviait les parois latérales déformables du microcanal vers l’extérieur. Cela a permis leur chargement ainsi que leur déchargement en une seule voie. Lorsque la pression négative a été supprimée, les embryons ont été immobilisés dans les microcanaux. Lorsque la pression positive a été appliquée, les parois latérales du microcanal ont comprimé les embryons en déviant vers l’intérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Flux de processus des expériences de compression microfluidique pour les études de mécanobiologie. (A) Le dispositif de mécanostimulation microfluidique à haut débit est constitué de PDMS et d’une lame de verre pour traiter des centaines d’échantillons biologiques multicellulaires. (B) Le dispositif est conçu pour fonctionner avec différents systèmes multicellulaires tels que les chambres à œufs de drosophile, les embryons de drosophile ou les organoïdes cérébraux. Ce dispositif peut appliquer des schémas de compression stables ou dynamiques aux biosystèmes. (C) Les systèmes peuvent être imagés avec un microscope confocal au fil du temps au fur et à mesure qu’ils sont compressés. Les niveaux d’expression et la localisation des protéines marquées par fluorescence en réponse à la compression peuvent être analysés. Lors de la collecte, les systèmes peuvent être analysés pour les tests post-stimulation et l’imagerie. La capacité de traitement à haut débit du dispositif microfluidique permet également aux systèmes d’être lysés et utilisés dans des tests biologiques basés sur des omiques qui nécessitent un grand nombre d’échantillons, comme le montre la figure avec un exemple d’image d’électrophorèse différentielle sur gel en 2 dimensions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Processus de fabrication du moule de plaquette de silicium avec une résine photosensible épaisse et des tranchées à rapport d’aspect élevé. (A,B) L’ensemble du processus de fabrication a commencé par la préparation de la plaquette de silicium pour le revêtement de résine photosensible. (C-G) Un épais revêtement de résine photosensible a été appliqué uniformément sur la tranche de silicium. (H,I) La résine photosensible a été modelée avec une exposition aux UV à travers le photomasque. (J-L) La résine photosensible non durcie a été retirée de la plaquette de silicium. (M-P) La partie PDMS a été fabriquée par lithographie douce. (Q,R) L’appareil a été scellé à la lame de verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Fonctionnement du dispositif microfluidique. (A) Tout d’abord, les embryons ont été pipetés dans l’entrée principale de l’embryon. (B) Deuxièmement, une pression négative a été appliquée à l’entrée de gaz, et le dispositif microfluidique a été incliné vers le bas pour permettre aux embryons de s’aligner et d’être chargés dans les microcanaux. (C) Troisièmement, la pression négative a été supprimée pour immobiliser les embryons. (D) Quatrièmement, une pression positive a été appliquée aux canaux gazeux pour comprimer les embryons. (E) Enfin, les embryons ont été prélevés dans le dispositif microfluidique en revenant à la pression négative et en inclinant le dispositif microfluidique vers le haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Mesure expérimentale du niveau de compression de l’embryon. (A) Embryons représentatifs à l’intérieur du dispositif microfluidique sous différents niveaux de pression de gaz. Bien que les embryons ne subissent pas de compression significative sous vide ou dans des états de pression neurale, ils sont comprimés lorsqu’une pression positive est appliquée. (B) La quantité de déformation compressive uniaxiale appliquée aux embryons à différents niveaux de pression de gaz (les barres d’erreur représentent l’écart type). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Compression d’organoïdes cérébraux dans un dispositif microfluidique conçu et fabriqué selon la même stratégie. (A) La compression des organoïdes cérébraux à des niveaux croissants à mesure que la pression du gaz augmente. (B) La largeur des organoïdes cérébraux à l’intérieur des microcanaux à différents niveaux de pression. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Vue de dessus du photomasque utilisé dans la fabrication photolithographique du moule de plaquette de silicium. Il existe cinq géométries de dispositifs microfluidiques identiques situées dans la zone de 4 pouces de diamètre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Vue de dessus du dispositif microfluidique utilisé dans cette étude avec les dimensions pertinentes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’article décrit le développement d’un dispositif microfluidique pour aligner, immobiliser et appliquer avec précision une stimulation mécanique à des centaines d’embryons entiers de drosophile . L’intégration du système microfluidique avec une fine lamelle de verre a permis l’imagerie d’embryons avec une microscopie confocale à haute résolution pendant la stimulation. Le dispositif microfluidique a également permis la collecte des embryons juste après la stimulation pour des tests biologiques en aval. Les considérations de conception, la méthode de fabrication et la caractérisation de ce dispositif ont été décrites en détail. Le protocole de fabrication du moule de plaquette de silicium a permis le revêtement épais uniforme de la résine photosensible avec des tranchées à rapport d’aspect élevé.
Pour que cette approche de fabrication soit couronnée de succès, il est important d’abaisser la température des étapes de cuisson et de minimiser les vitesses de chauffage et de refroidissement de la plaquette de silicium après son enrobage de résine photosensible. Si cela n’est pas fait correctement, le revêtement de résine photosensible peut facilement délaminer et modifier la géométrie du moule. Une fois que le moule de plaquette de silicium est fabriqué avec succès, il peut être copié dans des matériaux plus durables pour éviter d’endommager le moule d’origine lors des étapes consécutives de moulage de réplique PDMS, qui contiennent également des cycles de chauffage et de refroidissement21. La fabrication du dispositif microfluidique PDMS par moulage de réplique repose sur le décollement réussi des structures de paroi latérale à rapport d’aspect élevé du moule. Pour que cette étape de fabrication soit fiable, il est essentiel d’enduire correctement la surface de la plaquette de silicium d’un agent silanisant pour faciliter le pelage. Le revêtement doit également être renouvelé après la fabrication d’environ 20 dispositifs PDMS pour compenser l’élimination partielle de la couche de silane lors de chaque étape de pelage. Sinon, les parois latérales peuvent rester coincées à l’intérieur du motif de résine photosensible, rendant le moule inutilisable. Étant donné que le niveau de compression appliqué aux échantillons est fonction des propriétés mécaniques des parois latérales, il est important de maintenir la cohérence des paramètres du processus de moulage de la réplique PDMS. Le rapport, la température et la durée de l’agent de durcissement doivent être étroitement surveillés pendant la fabrication. De plus, étant donné que cette stratégie de dispositif consiste à appliquer simultanément une stimulation mécanique à un grand nombre d’organismes multicellulaires, leur agrégation à l’intérieur des microcanaux peut entraîner un colmatage. Bien que ce problème n’ait pas été rencontré avec les organismes utilisés ici, si cela se produit, il existe des solutions potentielles dans la littérature pour surmonter ce problème, telles que l’utilisation de solutions porteuses lors de l’introduction des échantillons22.
Bien que les embryons de drosophile aient été utilisés comme un organisme multicellulaire entier dans ce travail, la stratégie de conception et de fabrication présentée ici peut être appliquée à la stimulation mécanique d’autres systèmes multicellulaires en modifiant les dimensions du dispositif en conséquence (Figure 2). Cela peut être accompli en élargissant la largeur et la hauteur du microcanal central pour correspondre à celles des systèmes multicellulaires. Grâce à cette approche, les échantillons peuvent pénétrer dans les microcanaux et être comprimés de la même manière en déviant les parois latérales déformables avec une pression pneumatique positive. Pour démontrer cette approche, des dispositifs similaires ont été fabriqués pour les chambres à œufs de drosophile , ainsi que pour les organoïdes cérébraux. Ces systèmes ont permis la compression mécanique précise de ces systèmes biologiques similaire aux expériences sur les embryons de drosophile (Figure 6). De plus, comme cette approche permet de reconstituer le milieu autour des échantillons immobilisés, elle peut être très utile pour les expériences de stimulation chimique qui nécessitent un échange rapide de milieux sans perturber les échantillons. Dans l’ensemble, cette approche polyvalente combine la précision et les capacités d’automatisation à haut débit des systèmes microfluidiques tout en permettant de nouvelles études mécanologiques sur divers systèmes multicellulaires tels que de petits échantillons de tissus, des organoïdes, des embryons et des ovocytes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun intérêt financier dans les produits décrits dans ce manuscrit et n’ont rien d’autre à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (CMMI-1946456), l’Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) et le National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
