Summary
本プロトコルは、最小限のユーザー介入で数百の ショウジョウバエメラノガスター 胚を整列、固定化、および正確に圧縮することができるマイクロ流体システムの設計、製造、および特性評価について説明しています。このシステムは、刺激後分析のためのサンプルの高解像度イメージングと回収を可能にし、他の多細胞生物学的システムに対応するように拡張することができます。
Abstract
胚形成中、協調的な細胞運動は、遺伝子発現および活性を調節する機械的な力を生成する。このプロセスを研究するために、吸引やカバーガラス圧縮などのツールを使用して、胚全体を機械的に刺激してきました。これらのアプローチは、不正確であり、手動処理を必要とし、同時に数個の胚しか処理できないため、実験計画を制限します。マイクロ流体システムは、スループットと精度を向上させながら、このような実験タスクを自動化する大きな可能性を秘めています。この記事では、ショウジョウバエ メラノガスター(ショウジョウバエ )胚全体を正確に圧縮するために開発されたマイクロ流体システムについて説明します。このシステムは、空気圧で作動する変形可能な側壁を備えたマイクロチャネルを備えており、胚の整列、固定化、圧縮、および刺激後の収集を可能にします。これらのマイクロチャネルを7つのレーンに並列化することにより、安定したまたは動的な圧縮パターンを数百の ショウジョウバエ 胚に同時に適用できます。このシステムをガラスカバーガラス上に製造することで、高解像度顕微鏡によるサンプルの機械的刺激とイメージングを同時に行うことができます。さらに、PDMSのような生体適合性材料の利用と、システム内を流体を流す能力により、このデバイスは媒体依存サンプルを用いた長期実験が可能です。このアプローチにより、サンプルに機械的にストレスを与える手動取り付けの必要性もなくなります。さらに、マイクロチャネルからサンプルを迅速に収集できるため、従来の機械的刺激アプローチでは達成できない大量のサンプルを必要とするオミクスアッセイを含む、刺激後の分析が可能になります。このシステムの形状は、異なる生物学的システムに対して容易に拡張可能であり、多数の分野が、高いサンプルスループット、機械的刺激または固定化、および自動アライメントを含む本明細書に記載される機能的特徴から利益を得ることを可能にする。
Introduction
生命システムは、その生涯を通じて常にさまざまな機械的入力を経験し、応答します1。メカノトランスダクションは、発達障害、筋肉や骨の喪失、機械的環境によって直接的または間接的に影響を受けるシグナル伝達経路を介した神経病理学など、多くの疾患に関連しています2。しかし、機械受容性シグナル伝達経路4における機械的刺激3によって制御される遺伝子やタンパク質はほとんど分かっておらず5、機械的制御機構の解明や病的メカノトランスダクションに関連する疾患の分子標的の同定は進んでいません6,7。.メカノバイオロジー研究を関連する生理学的プロセスに投影する際の制限要因の1つは、無傷の多細胞生物の代わりに、従来の培養皿で個々の細胞を使用することです。ショウジョウバエ(ショウジョウバエ)などのモデル生物は、動物の発生に関与する遺伝子、シグナル伝達経路、およびタンパク質の理解に大きく貢献しています8,9,10。しかし、ショウジョウバエなどの多細胞モデル生物をメカノバイオロジー研究に利用することは、実験ツールの課題によって妨げられてきました。様々な刺激を準備、ソート、イメージング、または適用するための従来の技術は、ほとんどが手動操作を必要とする。これらのアプローチは時間がかかり、専門知識を必要とし、ばらつきをもたらし、実験計画とサンプルサイズを制限します11。最近のマイクロテクノロジーの進歩は、非常に高いスループットと高度に制御された実験パラメータを備えた新しい生物学的アッセイを可能にするための優れたリソースです12、13、14。
本稿では、ショ ウジョウバエ の数百個の胚全体に一軸圧縮の形で機械的刺激を整列させ、固定し、正確に適用するための強化されたマイクロ流体デバイスの開発について説明します15(図1)。マイクロ流体システムとガラスカバーガラスの統合により、刺激中のサンプルの高解像度共焦点イメージングが可能になりました。また、マイクロ流体デバイスは、オミクスアッセイを実行するための刺激後の胚の迅速な収集を可能にしました(図2)。このデバイスの設計上の考慮事項の説明、ならびにソフトリソグラフィおよび実験的特性評価を使用した製造を本明細書に記載する。このようなデバイスのシリコンウェーハモールドを製造するには、高アスペクト比(AR)トレンチ(AR >5)を備えた大面積にわたって厚いフォトレジスト(厚さ>200μm)を均一にコーティングする必要があるため、この方法は従来のフォトリソグラフィモールド製造プロトコルを大幅に変更しました。このようにして、この方法は、フォトレジストの取り扱い、接着、コーティング、パターニング、および現像を容易にした。さらに、潜在的な落とし穴とその解決策についても説明します。最後に、この設計および製造戦略の多様性は、 ショウジョウバエ 卵室や脳オルガノイドなどの他の多細胞システムを使用して実証されました16。
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Protocol
1. シリコンウェーハモールドの準備
- シリコンウェーハ( 材料表を参照)を最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコール(IPA)で洗浄します。
- シリコンウェーハを250°Cのホットプレートに30分間置き、脱水ベークを行います(図3A)。
- シリコンウェーハをベーパープライムオーブン( 材料表を参照)でヘキサメチルジシラザン(HDMS)でコーティングします(プロセス温度:150°C、プロセス圧力:2 Torr、プロセス時間:5分、HDMS容量:5 μL)(図3B)。
- SU-8 2100フォトレジストのボトル( 材料の表を参照)を60°Cのオーブンに15分間入れて、粘度を下げます。
注:オーブンで加熱すると、フォトレジストの粘度が低下します。粘度の低いフォトレジストは、より簡単に取り扱うことができ、ウェーハの上により正確に注ぐことができます。 - シリコンウェーハを60°Cのホットプレートに置き、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、ウェーハの各インチに1 mLの加熱フォトレジストを注ぎます(図3C)。
- フォトレジスト塗布シリコンウェーハをスピンコーターに移します( 材料表を参照)。
- 最初に250 rpmで30秒間、次に350 rpmでさらに30秒間、どちらも100 rpm / sの加速でプリスピンを適用します(図3D)。
- クリーンルームスワブを使用して、シリコンウェーハの端から余分なフォトレジストを取り除きます。
- 最初に500 rpmで100 rpm / sの加速度で15秒間スピンを適用し、次に1450 rpmで30 rpm / sの加速度で30秒間スピンを適用します(図3E)。
- クリーンルームの綿棒でエッジビードを取り外します。
- シリコンウェーハを50°Cのホットプレートに置き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します(図3F)。
- ホットプレートの温度を2°C / minの速度で95°Cまでゆっくりと上昇させます。
- シリコンウェーハを95°Cで50分間ソフトベークします(図3G)。
- ホットプレートを2°C / minの速度で室温までゆっくりと冷却します。
- シリコンウェーハをマスクアライナー( 材料表を参照)に置き、その上にフォトマスクを配置します(フォトマスクの形状については 補足図1 を参照してください)。
- コンタクトマスクアライナーを使用して、フォトマスクを通してシリコンウェーハを350 mJ / cm 2のUV光(35 mW / cm2で10秒間)にさらします(図3H)。
- ウェーハを50°Cのホットプレートに5分間、65°Cでさらに5分間、最後に80°Cでさらに20分間、シリコンウェーハに連続した露光後ベークを適用します(図3I)。
- シリコンウェーハを2°C/分の速度で室温までゆっくりと冷却します。
- シリコンウェーハより少し小さい直径のマグネチックスターラーをビーカーに入れます。シリコンウェーハを逆さまにして、ビーカーの上に置きます。
- ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます( 材料の表を参照)。シリコンウェーハを現像液に30分間沈めたまま、スターラーをオンにしておきます(図3J)。
- シリコンウェーハを、40kHzで1時間、新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理器に移します(図3K)。
- シリコンウェーハをIPA溶液で徹底的に洗浄して、最終的なシリコンウェーハモールドを取得します(図3L)。
2. マイクロ流体チップの作製
- シリコンウェーハモールドを10滴(~500 μL)のトリクロロ(1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクチル)シラン(PFOCTS、 材料表を参照)と一緒にデシケーターに入れ、近くの小さな計量ボートに入れます。
- デシケーターを真空ポンプに約200Torrで30分間接続します。
- デシケーターバルブをオフにし、PFOCTSコーティングのために真空ポンプを一晩外します。
- PDMSベースと硬化剤( 材料の表を参照)を10:1の比率で混合することにより、硬化前のポリジメチルシロキサン(PDMS)溶液を調製します。
- 混合物を遠心分離機(室温で5分間500 x g )に入れて脱気します。
注意: この遠心分離により、気泡が上面に移動し、その結果、短時間で除去されます。 - 脱気したPDMS溶液をシリコンウェーハモールドに注ぎます。
- 再度脱気して、金型表面に閉じ込められた気泡を取り除きます。
- PDMSを60°Cのオーブンで1時間50分間硬化させます(図3M)。
- メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します(図3N)。
- PDMSパーツをはがし、カッティングマットの上に逆さまに置きます。
- かみそりを使用して、PDMS部品を最終的な形状にカットします(図3O)。
- 生検パンチ( 材料表を参照)または先端が鈍い針(図3P)を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。
- 胚入口穴には、直径4mmのパンチを使用します。
- 胚出口の穴には、直径1.3 mmのパンチを使用します。
- ガス入口穴には、2mmパンチを使用します。
- スコッチテープを使用して、PDMSのパターン化された表面に残っている可能性のある粒子を取り除きます。
- 24 mm x 60 mmの長方形のスライドガラスを最初にアセトンで洗浄し、次にIPAで洗浄します。
- ろ過された空気源に接続されたエアガンでガラス表面を乾燥させます。
- スライドガラスを250°Cのホットプレートに2時間置き、脱水ベークを適用します(図3Q)。
- 表面の汚染を防ぐために、スライドガラスをビーカーで覆います。
- パターン化された面を上にしてPDMSを配置し、脱水ガラスをプラズマクリーナーにスライドさせます(材料の表を参照)。
- PDMSとスライドガラスを酸素プラズマで18 Wで30秒間処理します。
- PDMSをスライドガラス上に置き、パターン化された表面をスライドガラスに向けて、共有結合 を介して マイクロチャネルをシールします(図3R)。
- ピンセットを使用してPDMS部品をスライドガラスにそっと押し付け、完全なコンフォメーション接触を確保します。
- 完成したマイクロ流体チップを室温で一晩保管し、ボンディングが最終的な強度に達するようにします。
3.ショウジョウバエ胚の調製
- オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレート(1.5%寒天、25%リンゴジュース、2.5%スクロース)に卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の所望の発育時間にプレートを集める。
注:本実験では、プレートを140分で収集し、細胞化段階17で胚を調製および選別しました。 - 寒天に胚卵洗浄液(0.12 M NaCl、0.04% Triton-X 100)を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。
- 胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌します。組織ふるいを通して胚をこすり、水で漂白剤溶液を完全に洗い流します。
- 胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄を入れた90mmガラスのペトリ皿に胚を移します。
- 解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。
注:このアプリケーションでは、細胞化段階の胚が選択されました。適切な発達段階の選択を確実にする方法の詳細な説明は、 ショウジョウバエ17の実験室ハンドブックに記載されています。
4. マイクロ流体チップを用いたショウジョウバエ胚への機械的刺激の適用
- 7つの胚マイクロチャネルすべてを、メイン胚導入ポートから0.4 μmのフィルターIPAで充填してプライミングします。
- IPAを0.4μmのろ過された脱イオン(DI)水と交換します。
- DI水を胚卵洗浄液に置き換えます。
- ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。
- 胚を胚導入ポートにピペットで入れます(図4A)。
- ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSIの負圧(つまり、真空)を適用し、胚のマイクロチャネルを開きます。
- マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列し、胚のマイクロチャネルに定着するようにします(図4B)。
- 同時に入る複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから再び下に傾けて詰まりを取り除きます。
- 必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。
- 胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。
- マイクロ流体チップを水平位置に戻します(図4C)。
- 圧力計付きのポータブル陽圧源( 材料表を参照)をガス入口に接続して、3PSI圧縮を適用します(図4D)。
- 圧力計を継続的にチェックして、一貫した圧縮レベルが適用されていることを確認します。
- 機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。
- 圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、ガス入口に真空を適用して胚を解放します。
- 次に、マイクロ流体チップを上方に傾けて、胚が胚導入口に向かって移動する(図4E)。
- ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。
注:収集時に、ショウジョウバエを成虫に成長させることによって、胚発生と生存能力に対する圧迫の影響を調査できます。マイクロ流体デバイスのハイスループット処理能力により、多数のサンプルを必要とするダウンストリームオミクスベースのアッセイで胚を使用することもできます(図2)。
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Representative Results
マイクロ流体システムは、変形可能なPDMS側壁によって分離された2つのサブコンパートメントに分割されています。最初のコンパートメントは、 ショウジョウバエ の胚が導入され、自動的に整列され、整列され、圧縮される液体システムです。2番目のコンパートメントは、圧縮チャネルの有効幅を正確に制御するために、圧縮チャネルの両側のガス圧力が行き止まりのマイクロチャネル を介して 制御されるガスシステムです。マイクロ流体デバイスは、底部がスライドガラスで密閉されているため、マイクロ流体デバイスの関連寸法に対するサンプルの高解像度ライブイメージングが可能です(補足図2)。
ショウジョウバエ胚などの多細胞生物は、所望の胚発生段階で選択される。ショウジョウバエの胚の場合、胚のサイズは孵化するまで変化しないため、すべての発生段階がこのアプローチと等しく互換性があります。選択されたサンプルは、ガラスマイクロピペットを使用して、大きな入口(すなわち、直径4mm)を通してマイクロ流体デバイスに導入されます。次に、装置を下方に傾けて、胚が平行に編成された7つの圧縮チャネルに流れ込むことができるようにします。胚の入口を圧縮チャネルに接続する狭窄心房は、胚が圧縮チャネルの入り口に到達する前に胚の自動位置合わせを保証します。ガス入口に加えられた真空は、変形可能な側壁を外側に偏向させ、有効なマイクロチャネル幅を増加させ、胚が圧縮チャネルに順次入ることを可能にする。7つの圧縮チャネルの長さは22mmで、並行して、1回の実行で最大300個のショウジョウバエ胚を収容できます。圧縮チャネルは、マイクロチャネルの幅がサンプルの幅よりもはるかに小さいレベルまで減少するボトルネックで終了し、胚を保持しながら流体が流れるようにします。このアプローチにより、胚は圧縮チャネル内に集中します。胚の導入後、ガス入口の真空が除去され、マイクロチャネル側壁が元の位置に戻り、整列した胚を両側から固定化します。圧縮は、ガス入口に陽圧を加えることによって達成することができ、それは変形可能な側壁を内側に偏向させ、有効なマイクロチャネル幅を減少させる。胚に加えられる圧縮の量は、マイクロチャネルの寸法、変形可能な側壁の厚さ、PDMSのヤング率、および加えられる圧力を調整することによって正確に調節することができる。圧縮実験後、ガス入口に真空を適用し、マイクロ流体デバイスを別の方向に傾けることにより、下流分析のために胚を採取することができる。
このマイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィ18を用いて作製した。ただし、超厚手のフォトレジストを使用して高アスペクト比の機能を持つ厚い構造を製造するには、標準的な製造用に定義されたプロトコルから大きく逸脱する必要があります(図3)。ヘキサメチルジシラザン(HDMS)コーティングに加えて、シリコンウェーハをスピンコーティング前に洗浄して有機残留物を除去し、焼成して表面の水分を除去しました。これらの余分なステップは、厚いフォトレジスト層のシリコンウェーハへの接合を強化した。フォトレジストも注ぐ前に加熱して、ウェーハ表面全体を覆うために重要な粘度を低下させました。目標のフォトレジストコーティング厚さは、ウェーハ表面を汚染することなく、各スピニングステップが余分なフォトレジストを徐々に除去する3つの紡糸ステップによって達成されました。以前に発表された方法19に触発されて、フォトレジストの溶媒の1つであるアセトンをシリコンウェーハにスプレーして、フォトレジストの欠陥を排除し、コーティングの均一性を高めました。連続したベーキングステップの間、温度は熱応力を最小限に抑えるためにゆっくりと変化し、シリコンウェーハからのフォトレジストの層間剥離につながる可能性があります。同様の懸念により、ベーキング温度は持続時間を長くしながら下げられました。高アスペクト比トレンチのフォトリソグラフィ製造における最も困難なステップの1つは、UV露光後の未硬化フォトレジストの除去でした。現像液のトレンチへの浸透を最大化するために、シリコンウェーハを逆さまにし、スターラーで現像液と連続的に混合しました。このようにして、新鮮な現像液は未硬化のフォトレジストと反応して除去することができます。この工程に続いて、残りのフォトレジストを除去した超音波浴が続いた。シリコンウェーハモールドが正常に生成されると、標準的なレプリカ成形プロセスは、最終的なマイクロ流体デバイス20を製造するための硬化剤の混合、脱気、注入、硬化、剥離、打ち抜き、およびプラズマボンディングで構成されていた。
マイクロ流体デバイスの機能性は、 ショウジョウバエの胚 を圧縮チャネルにロードし、ガスチャネルに陽圧を加えることによって実験的に決定されました。顕微鏡下での胚の減少幅の測定(図5A)は、ガス圧を使用して目標圧縮レベルを取得する方法を示しています(図5B)。圧縮を受けている整列した胚のタイムラプス画像も、このシステムと共焦点顕微鏡との互換性を示しています。
図1:マイクロ流体デバイスの設計と機能。 マイクロ流体デバイスは、最大300個の ショウジョウバエ 胚全体を同時にテストできる7つの並列圧縮マイクロチャネルで構成されています。(A)胚は主胚入口 を介して 装置に導入され、マイクロチャネルに入ると自動的に後前軸に沿って整列した。(B)ガス入口から負圧を加えると、変形可能なマイクロチャネル側壁が外側に偏向するため、胚は自由に移動しました。これにより、単一の車線としての積み込みと荷降ろしが可能になりました。陰圧が取り除かれると、胚はマイクロチャネルに固定化された。陽圧が加えられると、マイクロチャネル側壁は内側に偏向することによって胚を圧縮した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:メカノバイオロジー研究のためのマイクロ流体圧縮実験のプロセスフロー 。 (A)ハイスループットマイクロ流体メカノ刺激装置は、PDMSとスライドガラスでできており、数百の多細胞生物学的サンプルを処理します。(B)このデバイスは、ショウジョウバエの卵室、 ショウジョウバエ の 胚 、脳オルガノイドなどのさまざまな多細胞システムで動作するように調整されています。このデバイスは、バイオシステムに定常または動的な圧縮パターンを適用できます。(C)システムは、圧縮されているときに共焦点顕微鏡で経時的に画像化することができます。圧縮に応答した蛍光標識タンパク質の発現レベルおよび局在を解析することができる。収集時に、刺激後のテストとイメージングのためにシステムを分析できます。マイクロ流体デバイスのハイスループット処理能力により、2次元差動ゲル電気泳動画像例の図に示すように、システムを溶解して多数のサンプルを必要とするオミックスベースの生物学的アッセイに使用することもできます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:厚いフォトレジストと高アスペクト比のトレンチを備えたシリコンウェーハモールドの製造プロセス。 (A,B) 全体的な製造プロセスは、フォトレジストコーティング用のシリコンウェーハの準備から始まりました。(C-G)厚いフォトレジストコーティングをシリコンウェーハに均一に塗布した。(H,I)フォトレジストを、フォトマスクを通してUV露光でパターン化した。(J-L)未硬化のフォトレジストはシリコンウェハから除去した。(M-P)PDMS部品はソフトリソグラフィで作製した。(Q,R)装置をスライドガラスに密封した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マイクロ流体デバイスの動作 。 (a)まず、胚を主胚導入口にピペットで入れた。(B)第2に、ガス入口に負圧を加え、マイクロ流体デバイスを下方に傾けて、胚を整列させてマイクロチャネルに装填させた。(C)第三に、胚を固定化するために陰圧を除去した。(D)第四に、ガスチャネルに陽圧を加えて胚を圧縮した。(E)最後に、負圧に戻し、マイクロ流体デバイスを上方に傾けることにより、マイクロ流体デバイスから胚を採取した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:胚圧縮レベルの実験的測定 。 (A)異なるガス圧レベルでのマイクロ流体デバイス内の代表的な胚。胚は真空下または神経圧状態で有意な圧迫を受けませんが、陽圧が加えられると圧迫されます。(B)異なるガス圧レベルで胚に加えられた一軸圧縮ひずみの量(エラーバーは標準偏差を表す)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:同じ戦略に従って設計および製造されたマイクロ流体デバイスにおける脳オルガノイドの圧縮 。 (A)ガス圧が上昇するにつれて増加するレベルでの脳オルガノイドの圧縮。(B)さまざまな圧力レベルでのマイクロチャネル内の脳オルガノイドの幅。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1: シリコンウェハモールドのフォトリソグラフィ作製に用いたフォトマスクの上面図。直径4の領域内に5つの同一のマイクロ流体デバイス形状があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2: この研究で使用されたマイクロ流体デバイスの上面図と関連する寸法。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、何百もの ショウジョウバエ 胚全体に機械的刺激を自動的に整列させ、固定し、正確に適用するマイクロ流体デバイスの開発について説明しています。マイクロ流体システムと薄いガラスカバーガラスの統合により、刺激中に高解像度の共焦点顕微鏡で胚をイメージングすることができました。マイクロ流体デバイスは、下流の生物学的アッセイを実行するための刺激直後に胚を収集することも可能にしました。このデバイスの設計上の考慮事項、製造方法、および特性評価について詳細に説明しました。シリコンウェーハモールド製造プロトコルにより、高アスペクト比のトレンチを備えたフォトレジストの均一な厚膜が可能になりました。
この製造アプローチを成功させるには、ベーキングステップの温度を下げ、フォトレジストでコーティングした後のシリコンウェーハの加熱および冷却速度を最小限に抑えることが重要です。これを適切に行わないと、フォトレジストコーティングが簡単に剥離し、金型の形状を変更する可能性があります。シリコンウェーハモールドが正常に製造されると、加熱および冷却サイクル21も含む連続したPDMSレプリカ成形ステップ中に元のモールドが損傷するのを防ぐために、より耐久性のある材料にコピーすることができます。レプリカ成形によるPDMSマイクロ流体デバイスの製作は、高アスペクト比の側壁構造を金型から剥離することに成功することに依存しています。この製造プロセスを確実に行うには、シリコンウェーハの表面をシラン化剤で適切にコーティングして剥離を容易にすることが重要です。コーティングは、各剥離ステップ中のシラン層の部分的な除去を補うために、約20個のPDMSデバイスを製造した後にも更新する必要があります。そうしないと、側壁がフォトレジストパターンの内側に詰まり、モールドが使用できなくなる可能性があります。サンプルに適用される圧縮のレベルは側壁の機械的特性の関数であるため、PDMSレプリカ成形プロセスパラメータの一貫性を保つことが重要です。硬化剤の比率、温度、および期間は、製造中に注意深く監視する必要があります。さらに、このデバイス戦略は、多数の多細胞生物に同時に機械的刺激を加えるためのものであるため、マイクロチャネル内でのそれらの凝集は目詰まりにつながる可能性があります。この問題は、本明細書で利用される生物では経験されなかったが、これが起こる場合、試料22の導入中に担体溶液を使用するなど、この問題を克服するための文献からの潜在的な解決策がある。
本研究では ショウジョウバエの胚 を多細胞生物全体として使用しましたが、ここで紹介した設計・作製戦略は、デバイスの寸法を適宜変更することで、他の多細胞系の機械的刺激にも適用できます(図2)。これは、中央のマイクロチャネルの幅と高さを多細胞システムのものと一致するように拡大することによって達成できます。このアプローチにより、サンプルはマイクロチャネルに入り、変形可能な側壁を正の空気圧で偏向させることによって同様に圧縮することができます。このアプローチを実証するために、ショ ウジョウバエ の卵室や脳オルガノイドについても同様の装置が作製されました。これらのシステムは、 ショウジョウバエ の胚実験と同様に、これらの生物学的システムの正確な機械的圧縮を可能にしました(図6)。また、固定化した試料の周囲に媒体を補充できるため、試料を乱すことなく迅速な媒体交換を必要とする化学刺激実験にも非常に有用です。全体として、この汎用性の高いアプローチは、マイクロ流体システムの精度とハイスループットの自動化機能を組み合わせると同時に、小組織サンプル、オルガノイド、胚、卵母細胞などのさまざまな多細胞システムに関する新しいメカノバイオロジー研究を可能にします。
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Disclosures
著者は、この原稿に記載されている製品に金銭的利益はなく、他に開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団(CMMI-1946456)、空軍科学研究局(FA9550-18-1-0262)、および国立衛生研究所(R01AG06100501A1;R21AR08105201A1)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
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