Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64281

Summary

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

Abstract

배아 발생 동안 조정 된 세포 이동은 유전자 발현과 활성을 조절하는 기계적 힘을 생성합니다. 이 과정을 연구하기 위해 흡인 또는 커버 슬립 압축과 같은 도구를 사용하여 전체 배아를 기계적으로 자극했습니다. 이러한 접근 방식은 부정확하고 수동 처리가 필요하며 동시에 몇 개의 배아만 처리할 수 있으므로 실험 설계를 제한합니다. 미세 유체 시스템은 처리량과 정밀도를 높이면서 이러한 실험 작업을 자동화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기사에서는 전체 초 파리 멜라노가스터(초 파리) 배아를 정밀하게 압축하기 위해 개발된 미세 유체 시스템에 대해 설명합니다. 이 시스템은 공압으로 작동되는 변형 가능한 측벽이 있는 마이크로채널을 특징으로 하며 배아 정렬, 고정화, 압축 및 자극 후 수집을 가능하게 합니다. 이러한 마이크로 채널을 7 개의 레인으로 병렬화함으로써 꾸준하거나 역동적 인 압축 패턴을 수백 개의 초파리 배아에 동시에 적용 할 수 있습니다. 유리 커버슬립에 이 시스템을 제작하면 고해상도 현미경으로 샘플을 동시에 기계적 자극과 이미징할 수 있습니다. 또한 PDMS와 같은 생체 적합성 재료를 활용하고 시스템을 통해 유체를 흐르게 하는 기능으로 인해 이 장치는 매체 의존형 샘플로 장기간 실험할 수 있습니다. 이 접근 방식은 또한 기계적으로 시료에 스트레스를 주는 수동 장착의 필요성을 제거합니다. 또한 마이크로채널에서 샘플을 신속하게 수집할 수 있는 기능은 기존의 기계적 자극 접근 방식으로는 얻을 수 없는 많은 샘플 수를 필요로 하는 -omics 분석을 포함하여 자극 후 분석을 가능하게 합니다. 이 시스템의 기하학적 구조는 다양한 생물학적 시스템으로 쉽게 확장 가능하여, 많은 분야가 높은 샘플 처리량, 기계적 자극 또는 고정화, 및 자동 정렬을 포함하여 여기에 설명된 기능적 특징으로부터 이익을 얻을 수 있도록 합니다.

Introduction

살아있는 시스템은 일생 동안 다양한 기계적 입력을 지속적으로 경험하고 반응합니다1. 기계 변환은 발달 장애, 근육 및 뼈 손실,기계적 환경에 의해 직간접적으로 영향을 받는 신호 경로를 통한 신경병리를 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다2. 그러나 기계감응성 신호전달 경로4에서 기계적 자극3에 의해 조절되는 유전자와 단백질은크게 알려지지 않은 상태로 남아 있으며5, 기계적 조절 메커니즘의 해명 및 병리학적 기계변환과 관련된 질병에 대한 분자 표적의 식별을 방해합니다.6,7 . 기계 생물학 연구를 관련 생리적 과정에 투영하는 데있어 한 가지 제한 요소는 손상되지 않은 다세포 유기체 대신 기존 배양 접시가있는 개별 세포를 사용하는 것입니다. 초파리 멜라노가스터(초파리)와 같은 모델 유기체는 동물 발달에 관여하는 유전자, 신호 경로 및 단백질을 이해하는 데 크게 기여했습니다 8,9,10. 그럼에도 불구하고 기계 생물학 연구에서 초파리 및 기타 다세포 모델 유기체를 사용하는 것은 실험 도구의 문제로 인해 방해를 받았습니다. 다양한 자극을 준비, 분류, 이미징 또는 적용하기위한 기존의 기술은 대부분 수동 조작이 필요합니다. 이러한 접근 방식은 시간이 많이 걸리고 전문 지식이 필요하며 변동성을 도입하고 실험 설계 및 표본 크기를 제한합니다11. 최근의 마이크로 기술 발전은 매우 높은 처리량과 고도로 제어 된 실험 매개 변수12,13,14로 새로운 생물학적 분석을 가능하게하는 훌륭한 리소스입니다.

이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 단축 압축 형태로 기계적 자극을 정렬, 고정 및 정확하게 적용하기 위한 향상된 미세유체 장치의 개발에 대해 설명합니다15(그림 1). 미세 유체 시스템과 유리 커버 슬립의 통합은 자극 동안 샘플의 고해상도 컨포칼 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 -omics 분석을 실행하기 위한 자극 후 배아의 빠른 수집을 가능하게 했습니다(그림 2). 이 장치의 설계 고려 사항에 대한 설명과 소프트 리소그래피 및 실험 특성화를 사용한 제조가 여기에 설명되어 있습니다. 이러한 장치의 실리콘 웨이퍼 몰드를 만들려면 높은 종횡비 (AR) 트렌치 (AR >5)가있는 넓은 영역에 두꺼운 포토 레지스트 (두께 >200μm)를 균일하게 코팅해야하기 때문에이 방법은 기존의 포토 리소그래피 금형 제작 프로토콜을 상당히 수정했습니다. 이러한 방식으로, 이 방법은 포토레지스트의 취급, 접착, 코팅, 패터닝 및 개발을 용이하게 하였다. 또한 잠재적 인 함정과 그 해결책에 대해 논의합니다. 마지막으로, 이 설계 및 제조 전략의 다양성은 초파리 난실 및 뇌 오가노이드16과 같은 다른 다세포 시스템을 사용하여 입증되었습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 실리콘 웨이퍼 몰드의 제조

  1. 실리콘 웨이퍼( 재료 표 참조)를 먼저 아세톤으로 청소한 다음 이소프로필 알코올(IPA)로 청소합니다.
  2. 탈수 베이크를 위해 실리콘 웨이퍼를 250°C 핫 플레이트에 30분 동안 놓습니다(그림 3A).
  3. 증기 프라임 오븐에서 실리콘 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔(HDMS)으로 코팅합니다(재료 참조)(공정 온도: 150°C, 공정 압력: 2Torr, 공정 시간: 5분, HDMS 부피: 5μL)(그림 3B).
  4. SU-8 2100 포토레지스트 한 병( 재료 표 참조)을 60°C 오븐에 15분 동안 넣어 점도를 줄입니다.
    알림: 오븐에서 가열하면 포토레지스트의 점도가 감소합니다. 점도가 낮은 포토레지스트는 더 쉽게 취급할 수 있으며 웨이퍼 위에 더 정확하게 주입할 수 있습니다.
  5. 실리콘 웨이퍼를 60°C 핫 플레이트에 놓고 포토레지스트가 표면의 대부분을 덮을 때까지 웨이퍼의 각 인치에 대해 가열된 포토레지스트 1mL를 붓습니다(그림 3C).
  6. 포토레지스트 코팅된 실리콘 웨이퍼를 스핀 코터로 옮깁니다( 재료 표 참조).
  7. 먼저 250rpm에서 30초 동안 사전 스핀을 적용한 다음 350rpm에서 100rpm/s 가속도로 30초 동안 적용합니다(그림 3D).
  8. 클린 룸 면봉을 사용하여 실리콘 웨이퍼의 가장자리에서 과도한 포토 레지스트를 제거합니다.
  9. 먼저 500rpm에서 100rpm/s 가속도로 15초 동안 스핀을 적용한 다음 1450rpm에서 300rpm/s 가속도로 300초 동안 스핀을 적용합니다(그림 3E).
  10. 클린룸 면봉으로 가장자리 비드를 제거합니다.
  11. 실리콘 웨이퍼를 50°C 핫 플레이트에 놓고 웨이퍼에 아세톤을 분사하여 결함을 제거하고 균일한 코팅을 촉진합니다(그림 3F).
  12. 핫 플레이트의 온도를 95°C/min의 속도로 2°C까지 천천히 올립니다.
  13. 실리콘 웨이퍼를 95°C에서 50분 동안 소프트 베이크합니다(그림 3G).
  14. 핫 플레이트를 2°C/min의 속도로 실온으로 천천히 냉각합니다.
  15. 실리콘 웨이퍼를 마스크 얼라이너( 재료 표 참조)에 놓고 그 위에 포토마스크를 놓습니다(포토마스크 형상은 보충 그림 1 참조).
  16. 접촉식 마스크 얼라이너를 사용하여 포토마스크를 통해 실리콘 웨이퍼를 350mJ/cm2 UV 광(10초 동안 35mW/cm2)에 노출시킵니다(그림 3H).
  17. 웨이퍼를 50°C에서 5분 동안, 65°C에서 추가 5분 동안, 마지막으로 80°C에서 20분 동안 핫 플레이트에 놓아 실리콘 웨이퍼에 연속 노출 후 베이크를 적용합니다(그림 3I).
  18. 실리콘 웨이퍼를 2°C/min의 속도로 실온으로 천천히 냉각합니다.
  19. 실리콘 웨이퍼보다 약간 작은 직경의 자기 교반기를 비커에 놓습니다. 실리콘 웨이퍼를 거꾸로 뒤집어 비커 위에 놓습니다.
  20. 비커를 다른 큰 비커 안에 넣고 더 큰 비커에 새로운 현상액 용액을 채웁니다( 재료 표 참조). 교반기를 켠 상태에서 실리콘 웨이퍼를 현상액에 30분 동안 담근 상태로 둡니다(그림 3J).
  21. 실리콘 웨이퍼를 40kHz에서 1시간 동안 새로운 현상액으로 채워진 초음파 수조 초음파 처리기로 옮깁니다(그림 3K).
  22. IPA 용액으로 실리콘 웨이퍼를 철저히 세척하여 최종 실리콘 웨이퍼 몰드를 얻습니다(그림 3L).

2. 미세유동 칩의 제조

  1. 실리콘 웨이퍼 몰드를 근처의 작은 계량 보트에 트리클로로(1H,1H,2H,2H,2H-퍼플루오로옥틸) 실란(PFOCTS, 재료 표 참조) 10방울(~500μL)과 함께 데시케이터에 넣습니다.
  2. 데시케이터를 약 200Torr의 진공 펌프에 30분 동안 연결합니다.
  3. PFOCTS 코팅을 위해 데시케이터 밸브를 끄고 진공 펌프를 밤새 분리합니다.
  4. PDMS 베이스와 경화제(재료 표 참조)를 10:1 비율로 혼합하여 사전 경화된 폴리디메틸실록산( PDMS) 용액을 준비합니다.
  5. 혼합물을 원심분리기(실온에서 5분 동안 500 x g )에 넣어 탈기한다.
    알림: 이 원심분리를 통해 기포가 상단 표면으로 이동하여 결과적으로 단기간에 제거됩니다.
  6. 탈기된 PDMS 용액을 실리콘 웨이퍼 몰드에 붓습니다.
  7. 다시 탈기하여 금형 표면에 갇힌 기포를 제거한다.
  8. PDMS를 60°C 오븐에서 1시간 50분 동안 경화합니다(그림 3M).
  9. 메스를 사용하여 미세유체 칩 기하구조에 상응하는 경화된 PDMS 영역의 경계를 절단한다(도 3N).
  10. PDMS 부품을 떼어내고 절단 매트에 거꾸로 놓습니다.
  11. 면도기를 사용하여 PDMS 부품을 최종 모양으로 자릅니다(그림 3O).
  12. 생검 펀치( 재료 표 참조) 또는 끝이 뭉툭한 바늘(그림 3P)을 사용하여 PDMS의 입구 및 출구 구멍을 펀칭합니다.
    1. 배아 입구 구멍의 경우 직경 4mm의 펀치를 사용하십시오.
    2. 배아 출구 구멍의 경우 직경 1.3mm의 펀치를 사용하십시오.
    3. 가스 입구 구멍에는 2mm 펀치를 사용하십시오.
  13. 스카치 테이프를 사용하여 PDMS의 패턴 표면에 남아 있을 수 있는 미립자를 제거합니다.
  14. 24mm x 60mm 직사각형 유리 슬라이드를 먼저 아세톤으로 청소한 다음 IPA로 청소합니다.
  15. 여과 된 공기 공급원에 연결된 에어건으로 유리 표면을 건조시킵니다.
  16. 유리 슬라이드를 250°C 핫 플레이트에 2시간 동안 올려 탈수 베이크를 적용합니다(그림 3Q).
  17. 표면 오염을 방지하기 위해 유리 슬라이드를 비커로 덮으십시오.
  18. PDMS의 패턴이 있는 면이 위로 향하도록 놓고 탈수된 유리를 플라즈마 클리너에 밀어 넣습니다( 재료 표 참조).
  19. PDMS와 유리 슬라이드를 18W의 산소 플라즈마로 30초 동안 처리합니다.
  20. PDMS를 패턴 표면이 유리 슬라이드를 향하도록 유리 슬라이드에 놓고 공유 결합을 통해 마이크로 채널을 밀봉합니다(그림 3R).
  21. 핀셋을 사용하여 PDMS 부품을 유리 슬라이드에 부드럽게 밀어 완전히 접촉되도록 합니다.
  22. 완성된 마이크로유체 칩을 실온에서 밤새 보관하여 접합이 최종 강도에 도달할 수 있도록 합니다.

3. 초파리 배아의 제조

  1. Oregon-R 성인 파리가 사과 주스 한천 접시 (1.5 % 한천, 25 % 사과 주스, 2.5 % 자당)에 알을 낳고 주어진 실험을 위해 알을 낳은 후 원하는 발달 시간에 접시를 수집하도록합니다.
    참고: 본 실험을 위해, 플레이트를 140분에 수집하여 세포화 단계17에서 배아를 준비하고 분류하였다.
  2. 한천에 배아 난자 세척제(0.12M NaCl, 0.04% 트리톤-X 100)를 붓고 붓으로 배아를 부드럽게 저어 한천에서 제거합니다.
  3. 배아를 50 % 표백제로 90 초 동안 옮기고 가끔 저어줍니다. 조직 체를 통해 배아를 변형시키고 표백제를 물로 완전히 씻어냅니다.
  4. 배아를 완전히 덮을 수 있을 만큼 충분한 배아 난자 세척이 있는 90mm 유리 페트리 접시에 배아를 옮깁니다.
  5. 해부 현미경에서 트랜스 조명으로 배아를 검사하고 미세 유체 장치에 로딩하기 위해 원하는 발달 단계의 배아를 선택하십시오.
    참고: 이 응용 프로그램에서는 세포화 단계의 배아가 선택되었습니다. 적절한 발달 단계 선택을 보장하는 방법에 대한 자세한 설명은 Drosophila17의 실험실 핸드북에서 찾을 수 있습니다.

4. 미세유체 칩을 이용한 초파리 배아에 기계적 자극 가하기

  1. 7개의 배아 마이크로채널을 모두 프라이밍하여 주 배아 입구 포트를 통해 0.4μm 여과된 IPA로 채웁니다.
  2. IPA를 0.4μm 여과된 탈이온수(DI)로 교체합니다.
  3. DI 물을 배아 난자 세척액으로 교체하십시오.
  4. 유리 피펫을 사용하여 유리 페트리 접시에서 미리 선택된 약 100 개의 배아를 수집합니다.
  5. 배아를 배아 입구 포트에 피펫팅합니다(그림 4A).
  6. 배아 마이크로채널을 개방하기 위해 휴대용 진공 펌프를 사용하여 가스 유입구에 약 3 PSI 음압(즉, 진공)을 가한다.
  7. 배아가 자동으로 정렬되고 배아 마이크로채널에 정착되도록 미세유체 칩을 아래쪽으로 기울입니다(그림 4B).
  8. 배아 마이크로 채널 입구가 동시에 들어가는 여러 배아에 의해 막히면 미세 유체 칩을 위쪽으로 기울인 다음 다시 아래쪽으로 기울여 막힘을 제거합니다.
  9. 필요한 처리량에 따라 최대 300개의 배아를 배아 마이크로채널에 도입합니다.
  10. 배아 로딩이 완료되면 진공을 제거하여 배아를 고정시킵니다.
  11. 마이크로유체 칩을 다시 수평 위치로 기울입니다(도 4C).
  12. 압력 게이지가 있는 휴대용 양압원( 재료 표 참조)을 가스 유입구에 연결하여 3PSI 압축을 적용합니다(그림 4D).
  13. 압력 게이지를 지속적으로 점검하여 일관된 압축 수준이 적용되었는지 확인하십시오.
  14. 기계적으로 자극된 배아에 대해 라이브 이미징 실험을 수행할 경우 가스 주입구가 압력 소스에 연결된 표준 현미경 스테이지 유리 슬라이드 홀더에 미세유체 칩을 놓습니다.
  15. 압축 실험이 완료되면 다운스트림 분석을 위해 배아를 수집할 수 있습니다. 이렇게하려면 먼저 가스 입구에 진공을 적용하여 배아를 자유롭게하십시오.
  16. 이어서, 미세유체 칩을 위쪽으로 기울여 배아가 배아 도입 포트 쪽으로 이동하도록 한다(도 4E).
  17. 유리 피펫을 사용하여 미세유체 칩으로부터 배아를 수집한다.
    참고 : 수집시 배아 발달 및 생존력에 대한 압축의 영향은 초파리를 성인으로 성장시켜 조사 할 수 있습니다. 또한 미세유체 장치의 고처리량 처리 기능을 통해 많은 수의 샘플이 필요한 다운스트림 오믹스 기반 분석에 배아를 사용할 수 있습니다(그림 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

마이크로유체 시스템은 변형가능한 PDMS 측벽에 의해 분리된 2개의 서브-구획으로 분할된다. 첫 번째 구획은 초파리 배아가 도입되고 자동으로 정렬되고 정렬되고 압축되는 액체 시스템입니다. 두 번째 구획은 압축 채널의 유효 폭을 정밀하게 제어하기 위해 막 다른 마이크로 채널을 통해 압축 채널 양쪽의 가스 압력이 제어되는 가스 시스템입니다. 미세유체 장치는 바닥에 유리 슬라이드로 밀봉되어 있어 미세유체 장치의 관련 치수에 대한 샘플(보충 그림 2)의 고해상도 라이브 이미징이 가능합니다.

초파리 배아와 같은 다세포 유기체는 원하는 배아 발달 단계에서 선택됩니다. Drosophila 배아의 경우 부화 할 때까지 배아 크기가 변하지 않기 때문에 모든 발달 단계가이 접근법과 동등하게 호환됩니다. 선택된 샘플은 유리 마이크로피펫을 사용하여 큰 입구(즉, 직경 4 mm)를 통해 마이크로유체 장치 내로 도입된다. 그런 다음 장치를 아래쪽으로 기울여 배아가 평행 방식으로 구성된 7 개의 압축 채널로 흐를 수 있도록합니다. 배아 입구를 압축 채널에 연결하는 좁은 심방은 배아가 압축 채널의 입구에 도달하기 전에 배아의 자동 정렬을 보장합니다. 가스 유입구에 적용된 진공은 변형 가능한 측벽을 바깥쪽으로 편향시켜 유효 마이크로 채널 폭을 늘리고 배아가 압축 채널에 순차적으로 들어갈 수 있도록합니다. 7개의 압축 채널은 길이가 22mm이며 병렬로 한 번에 최대 300개의 초파리 배아를 수용할 수 있습니다. 압축 채널은 마이크로 채널의 너비가 샘플의 너비보다 훨씬 작은 수준으로 감소하는 병목 현상에서 종료되어 배아를 유지하면서 유체가 흐를 수 있습니다. 이 접근법을 통해 배아는 압축 채널 내에 집중됩니다. 배아의 도입 후, 가스 입구의 진공이 제거되고, 마이크로 채널 측벽은 원래 위치로 돌아가 양쪽에서 정렬 된 배아를 고정시킨다. 압축은 가스 유입구에 양압을 가함으로써 달성 될 수 있으며, 이는 변형 가능한 측벽을 안쪽으로 편향시키고 효과적인 마이크로 채널 폭을 감소시킵니다. 배아에 가해지는 압축량은 마이크로채널 치수, 변형 가능한 측벽의 두께, PDMS의 영률 및 적용된 압력을 조정하여 정밀하게 조절할 수 있습니다. 압축 실험 후, 배아는 가스 유입구에 진공을 적용하고 미세유체 장치를 다른 방향으로 기울임으로써 하류 분석을 위해 수집될 수 있다.

이 미세유체 장치는 연질 리소그래피(18)를 사용하여 제조되었다. 그러나 초두꺼운 포토레지스트를 사용하여 높은 종횡비 특징을 가진 두꺼운 구조물을 제조하려면 표준 제조에 대해 정의된 프로토콜에서 크게 벗어나야 합니다(그림 3). 헥사메틸디실라잔(HDMS) 코팅과 함께 스핀 코팅 전에 실리콘 웨이퍼를 세척하여 유기 잔류물을 제거하고 베이킹하여 표면 수분을 제거했습니다. 이러한 추가 단계는 두꺼운 포토레지스트 층과 실리콘 웨이퍼의 결합을 향상시켰습니다. 포토레지스트는 또한 점도를 낮추기 위해 주입되기 전에 가열되었는데, 이는 전체 웨이퍼 표면을 덮는 데 중요했습니다. 타겟 포토레지스트 코팅 두께는 3개의 스피닝 단계를 통해 달성되었으며, 여기서 각 스피닝 단계는 웨이퍼 표면을 오염시키지 않으면서 과도한 포토레지스트를 점진적으로 제거하였다. 이전에 공개된 방법(19)에 영감을 얻어, 포토레지스트의 용매 중 하나인 아세톤을 실리콘 웨이퍼에 분사하여 포토레지스트 결함을 제거하고 코팅의 균일성을 증가시켰다. 연속적인 베이킹 단계 동안, 온도는 열 응력을 최소화하기 위해 천천히 변화되었고, 이는 실리콘 웨이퍼로부터 포토레지스트의 박리로 이어질 수 있었다. 유사한 우려로 인해 베이킹 온도가 감소하면서 지속 시간이 늘어났습니다. 높은 종횡비 트렌치의 포토리소그래피 제조에서 가장 어려운 단계 중 하나는 UV 노출 후 경화되지 않은 포토레지스트를 제거하는 것이었습니다. 현상액 용액이 트렌치로 침투하는 것을 최대화하기 위해 실리콘 웨이퍼를 거꾸로 뒤집고 교반기를 사용하여 현상액 용액과 연속적으로 혼합했습니다. 이러한 방식으로 새로운 현상액 용액이 경화되지 않은 포토레지스트와 반응하여 제거할 수 있습니다. 이 단계는 나머지 포토 레지스트가 제거 된 초음파 수조가 뒤 따랐다. 일단 실리콘 웨이퍼 몰드가 성공적으로 생성되면, 표준 복제 성형 공정은 최종 미세유체 장치(20)의 제조를 위한 경화제 혼합, 탈기, 주입, 경화, 박리, 펀칭 및 플라즈마 본딩으로 구성되었다.

미세 유체 장치의 기능은 Drosophila 배아를 압축 채널에 넣고 가스 채널에 양압을 가함으로써 실험적으로 결정되었습니다. 현미경으로 배아의 감소하는 폭을 측정하면(그림 5A) 가스 압력을 사용하여 목표 압축 수준을 얻는 방법을 알 수 있습니다(그림 5B). 압축을 받는 정렬된 배아의 타임랩스 이미지도 이 시스템과 컨포칼 현미경의 호환성을 보여줍니다.

Figure 1
도 1: 미세유체 장치의 설계 및 기능. 미세 유체 장치는 최대 300 개의 전체 초파리 배아를 동시에 테스트 할 수있는 7 개의 병렬 압축 마이크로 채널로 구성됩니다. (A) 배아는 주 배아 입구를 통해 장치에 도입되었고, 미세 채널에 들어갈 때 자동으로 후-전방 축을 따라 정렬되었습니다. (B) 배아는 가스 주입구를 통해 음압이 가해졌을 때 변형 가능한 미세 채널 측벽을 바깥쪽으로 편향시키기 때문에 자유롭게 움직였습니다. 이것은 단일 차선으로 적재 및 하역을 허용했습니다. 음압이 제거되었을 때, 배아는 마이크로 채널에 고정화되었다. 양압이 가해지면 마이크로 채널 측벽이 안쪽으로 편향되어 배아를 압축했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 기계생물학 연구를 위한 미세유체 압축 실험의 공정 흐름. (A) 고 처리량 미세 유체 기계 자극 장치는 PDMS와 유리 슬라이드로 만들어져 수백 개의 다세포 생물학적 샘플을 처리합니다. (B) 이 장치는 초파리 난실, 초파리 배아 또는 뇌 오가노이드와 같은 다양한 다세포 시스템과 함께 작동하도록 맞춤화되었습니다. 이 장치는 바이오시스템에 안정적 또는 동적 압축 패턴을 적용할 수 있습니다. (C) 시스템은 압축되는 동안 시간이 지남에 따라 컨포칼 현미경으로 이미지화할 수 있습니다. 압축에 반응하여 형광 표지된 단백질의 발현 수준 및 국소화를 분석할 수 있다. 수집 시 자극 후 테스트 및 이미징을 위해 시스템을 분석할 수 있습니다. 미세 유체 장치의 고처리량 처리 능력은 또한 2차원 시차 겔 전기영동 이미지 예와 함께 그림에 표시된 것처럼 많은 수의 샘플이 필요한 오믹스 기반 생물학적 분석에서 시스템을 용해하고 사용할 수 있도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 두꺼운 포토레지스트와 높은 종횡비 트렌치가 있는 실리콘 웨이퍼 금형의 제조 공정. (A,B) 전체 제조 공정은 포토레지스트 코팅용 실리콘 웨이퍼를 준비하는 것으로 시작되었습니다. () 두꺼운 포토레지스트 코팅을 실리콘 웨이퍼에 균일하게 도포하였다. (H, I) 포토레지스트는 포토마스크를 통한 UV 노광으로 패터닝되었다. (J-L) 경화되지 않은 포토레지스트를 실리콘 웨이퍼로부터 제거하였다. (-) PDMS 부품은 소프트 리소그래피를 통해 제작되었습니다. (질문,R) 장치를 유리 슬라이드에 밀봉하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 미세유체 장치의 작동 . (A) 먼저, 배아를 주 배아 입구로 피펫팅하였다. (B) 둘째, 가스 유입구에 음압을 가하고 미세유체 장치를 아래쪽으로 기울여 배아가 정렬되어 미세채널에 로딩될 수 있도록 했습니다. (C) 셋째, 배아를 고정화하기 위해 음압을 제거하였다. (D) 넷째, 배아를 압축하기 위해 가스 채널에 양압을 가하였다. (E) 마지막으로, 배아는 다시 음압으로 전환하고 미세유체 장치를 위쪽으로 기울여 미세유체 장치로부터 수집하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 배아 압축 수준의 실험적 측정. (A) 상이한 가스 압력 수준 하에서 마이크로유체 장치 내부의 대표적인 배아. 배아는 진공 상태나 신경 압력 상태에서 상당한 압박을 경험하지 않지만 양압이 가해지면 압축됩니다. (B) 상이한 가스 압력 수준에서 배아에 적용된 단축 압축 변형의 양 (오차 막대는 표준 편차를 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 동일한 전략에 따라 설계 및 제작된 미세유체 장치에서 뇌 오가노이드 의 압축. (A) 가스 압력이 증가함에 따라 증가하는 수준에서 뇌 유기체의 압축. (B) 다른 압력 수준에서 마이크로 채널 내부의 뇌 유기체의 너비. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 실리콘 웨이퍼 몰드의 포토리소그래피 제작에 사용되는 포토마스크의 평면도. 직경 4 영역 내에 위치한 5 개의 동일한 미세 유체 장치 형상이 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 관련 치수를 갖는 본 연구에 사용된 마이크로유체 장치의 평면도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 기사는 수백 개의 전체 초파리 배아에 기계적 자극을 자동으로 정렬, 고정 및 정확하게 적용하는 미세 유체 장치의 개발에 대해 설명합니다. 미세 유체 시스템과 얇은 유리 커버 슬립의 통합은 자극 중에 고해상도 컨포칼 현미경으로 배아의 이미징을 가능하게했습니다. 미세유체 장치는 또한 다운스트림 생물학적 분석을 실행하기 위한 자극 직후 배아의 수집을 가능하게 했습니다. 이 장치의 설계 고려 사항, 제조 방법 및 특성화에 대해 자세히 설명했습니다. 실리콘 웨이퍼 금형 제조 프로토콜은 높은 종횡비 트렌치로 포토레지스트의 균일한 두꺼운 코팅을 허용했습니다.

이러한 제조 접근법이 성공하려면 베이킹 단계의 온도를 낮추고 포토레지스트로 코팅된 후 실리콘 웨이퍼의 가열 및 냉각 속도를 최소화하는 것이 중요합니다. 이것이 제대로 수행되지 않으면 포토레지스트 코팅이 쉽게 박리되어 금형 형상을 변경할 수 있습니다. 일단 실리콘 웨이퍼 몰드가 성공적으로 제조되면, 가열 및 냉각 사이클(21)을 포함하는 연속적인 PDMS 복제 성형 단계들 동안 원래의 몰드의 손상을 방지하기 위해 더 내구성 있는 재료로 복사될 수 있다. 복제 성형을 통한 PDMS 미세유체 장치의 제조는 금형으로부터 높은 종횡비 측벽 구조의 성공적인 박리에 의존한다. 이 제조 단계를 신뢰할 수 있으려면 실리콘 웨이퍼의 표면을 실란화제로 적절하게 코팅하여 박리를 용이하게 하는 것이 중요합니다. 코팅은 또한 각 박리 단계에서 실란 층의 부분 제거를 보상하기 위해 약 20개의 PDMS 장치를 제조한 후 갱신되어야 합니다. 그렇지 않으면 측벽이 포토레지스트 패턴 내부에 달라붙어 금형을 사용할 수 없게 될 수 있습니다. 샘플에 적용되는 압축 수준은 측벽의 기계적 특성의 함수이기 때문에 PDMS 복제 성형 공정 파라미터를 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 경화제 비율, 온도 및 지속 시간은 제조 중에 면밀히 모니터링해야 합니다. 또한,이 장치 전략은 많은 수의 다세포 유기체에 동시에 기계적 자극을 적용하기위한 것이기 때문에, 마이크로 채널 내부의 응집은 막힘을 초래할 수있다. 비록 이러한 문제가 본원에서 이용되는 유기체에 대해서는 경험되지 않았지만, 이것이 발생한다면, 샘플(22)의 도입 동안 담체 용액을 사용하는 것과 같이, 이 문제를 극복하기 위한 문헌으로부터의 잠재적인 해결책이 있다.

이 작업에서는 초파리 배아가 전체 다세포 유기체로 사용되었지만 여기에 제시된 설계 및 제조 전략은 그에 따라 장치의 크기를 변경하여 다른 다세포 시스템의 기계적 자극에 적용할 수 있습니다(그림 2). 이는 중앙 마이크로채널 폭과 높이를 다세포 시스템의 폭과 높이와 일치하도록 확장하여 달성할 수 있습니다. 이 접근법을 통해 샘플은 마이크로 채널로 들어갈 수 있으며 양의 공압으로 변형 가능한 측벽을 편향시켜 유사하게 압축 할 수 있습니다. 이 접근법을 입증하기 위해 Drosophila 계란 챔버와 뇌 오가노이드에 대해 유사한 장치가 제작되었습니다. 이러한 시스템은 초파리 배아 실험과 유사한 생물학적 시스템의 정확한 기계적 압축을 가능하게 했습니다(그림 6). 또한, 이 접근법은 고정화된 샘플 주변의 배지 보충을 가능하게 하기 때문에, 샘플을 방해하지 않고 빠른 매체 교환이 필요한 화학적 자극 실험에 매우 유용할 수 있다. 전반적으로 이 다재다능한 접근 방식은 미세 유체 시스템의 정밀 및 고처리량 자동화 기능을 결합하는 동시에 작은 조직 샘플, 유기체, 배아 및 난모세포와 같은 다양한 다세포 시스템에 대한 새로운 기계생물학 연구를 가능하게 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는이 원고에 설명 된 제품에 재정적 이해 관계가 없으며 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 과학 재단 (CMMI-1946456), 공군 과학 연구실 (FA9550-18-1-0262) 및 국립 보건원 (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes Fisher 14-955-111B Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer University Wafer 452
Biopsy punches Ted Pella 15110
Bleach Not brand specific
Blunt needle set CML Supply 901
Contact Mask Aligner Quintel Q4000 MA
Cutting mat Dahle Vantage 10670 size: 24" x 36"
Developer Kayaku Advance Materials SU-8 2000
Direct Write Lithographer Heidelberg MLA100
Dissecting microscope Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish Fisher FB0875713A
Glass slide Warner Instruments 64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven Yes Engineering YES-3TA
NaCl Not brand specific
Oven Labnet I5110A
Paintbrush Not brand specific
PDMS Dow Corning Sylgard 184
Photoresist MicroChem SU-8 2100
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Portable pressure source hygger Quietest HGD946
Pressure gauge Cole-Parmer EW-68950-25
Spin Coater Laurell WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) Sigma-Aldrich 448931-10G
Triton-X 100 Fisher AAA16046AP
Tubing Saint-Gobain 02-587-1A
Ultrasonic Cleaner Cole-Parmer UX-08895-05
Vacuum Pump Cole-Parmer EW-07164-87

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
  2. Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
  3. Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
  4. Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
  5. Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
  6. Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
  7. Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
  8. Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  9. Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
  10. Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
  11. Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
  12. Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
  13. Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
  14. Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
  15. Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
  16. Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
  17. Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
  18. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
  19. Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
  20. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
  21. Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
  22. Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).

Tags

생명 공학 190 호
고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sönmez, U. M., Frey, N.,More

Sönmez, U. M., Frey, N., Minden, J. S., LeDuc, P. R. Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System. J. Vis. Exp. (190), e64281, doi:10.3791/64281 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter