Summary
Det nuvarande protokollet beskriver design, tillverkning och karakterisering av ett mikrofluidiskt system som kan anpassa, immobilisera och exakt komprimera hundratals Drosophila melanogaster-embryon med minimal användarintervention. Detta system möjliggör högupplöst avbildning och återvinning av prover för analys efter stimulering och kan skalas för att rymma andra multicellulära biologiska system.
Abstract
Under embryogenesen genererar samordnad cellrörelse mekaniska krafter som reglerar genuttryck och aktivitet. För att studera denna process har verktyg som aspiration eller coverslip-kompression använts för att mekaniskt stimulera hela embryon. Dessa tillvägagångssätt begränsar experimentell design eftersom de är oprecisa, kräver manuell hantering och bara kan bearbeta ett par embryon samtidigt. Mikrofluidiska system har stor potential för att automatisera sådana experimentella uppgifter samtidigt som de ökar genomströmningen och precisionen. Denna artikel beskriver ett mikrofluidiskt system utvecklat för att exakt komprimera hela Drosophila melanogaster (fruktfluga ) embryon. Detta system har mikrokanaler med pneumatiskt manövrerade deformerbara sidoväggar och möjliggör embryoinriktning, immobilisering, kompression och insamling efter stimulering. Genom att parallellisera dessa mikrokanaler till sju banor kan stadiga eller dynamiska kompressionsmönster appliceras på hundratals Drosophila-embryon samtidigt. Att tillverka detta system på en glasöverdragare underlättar samtidig mekanisk stimulering och avbildning av prover med högupplösta mikroskop. Dessutom gör användningen av biokompatibla material, som PDMS, och förmågan att strömma vätska genom systemet denna enhet kapabel till långsiktiga experiment med medieberoende prover. Detta tillvägagångssätt eliminerar också kravet på manuell montering som mekaniskt belastar prover. Dessutom möjliggör förmågan att snabbt samla in prover från mikrokanalerna analyser efter stimulering, inklusive -omics-analyser som kräver stora provantal som inte kan uppnås med traditionella mekaniska stimuleringsmetoder. Geometrin i detta system är lätt skalbar till olika biologiska system, vilket gör det möjligt för många fält att dra nytta av de funktionella funktioner som beskrivs häri, inklusive hög provgenomströmning, mekanisk stimulering eller immobilisering och automatiserad inriktning.
Introduction
Levande system upplever och svarar ständigt på olika mekaniska ingångar under hela sin livstid1. Mekanotransduktion har kopplats till många sjukdomar, inklusive utvecklingsstörningar, muskel- och benförlust och neuropatologier genom signalvägar som direkt eller indirekt påverkas av den mekaniska miljön2. De gener och proteiner som regleras av mekanisk stimulering3 i de mekanokänsliga signalvägarna4 förblir emellertid i stort sett okända5, vilket förhindrar belysning av de mekaniska regleringsmekanismerna och identifiering av molekylära mål för sjukdomar associerade med patologisk mekanotransduktion 6,7 . En begränsande faktor för att projicera mekanobiologistudier på de relaterade fysiologiska processerna är att använda enskilda celler med konventionella odlingsskålar istället för intakta flercelliga organismer. Modellorganismer, såsom Drosophila melanogaster (bananfluga), har bidragit starkt till att förstå gener, signalvägar och proteiner som är involverade i djurutveckling 8,9,10. Ändå har användningen av Drosophila och andra flercelliga modellorganismer i mekanobiologisk forskning hindrats av utmaningar med experimentella verktyg. Konventionella tekniker för att förbereda, sortera, avbilda eller tillämpa olika stimuli kräver mestadels manuell manipulation; Dessa metoder är tidskrävande, kräver expertis, introducerar variabilitet och begränsar experimentell design och provstorlek11. De senaste mikrotekniska framstegen är en stor resurs för att möjliggöra nya biologiska analyser med mycket hög genomströmning och mycket kontrollerade experimentella parametrar12,13,14.
Denna artikel beskriver utvecklingen av en förbättrad mikrofluidisk anordning för att justera, immobilisera och exakt tillämpa mekanisk stimulering i form av enaxlig kompression på hundratals hela Drosophila-embryon 15 (Figur 1). Integrering av det mikrofluidiska systemet med en glasbeläggning möjliggjorde högupplöst konfokal avbildning av proverna under stimuleringen. Den mikrofluidiska anordningen möjliggjorde också snabb insamling av embryona efter stimuleringen för löpande -omics-analyser (figur 2). Förklaringar av designövervägandena för denna enhet, liksom tillverkningen med mjuk litografi och experimentell karakterisering, beskrivs häri. Eftersom tillverkning av en kiselskivform av en sådan anordning kräver en enhetlig beläggning av tjock fotoresist (tjocklek >200 μm) över stora områden med höga bildförhållande (AR) diken (AR >5), modifierade denna metod avsevärt det traditionella fotolitografiska formtillverkningsprotokollet. På detta sätt underlättade denna metod hantering, vidhäftning, beläggning, mönstring och utveckling av fotoresisten. Dessutom diskuteras potentiella fallgropar och deras lösningar. Slutligen demonstrerades mångsidigheten i denna design- och tillverkningsstrategi med hjälp av andra flercelliga system som Drosophila äggkammare och hjärnorganoider16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av kiselskivans form
- Rengör kiselskivan (se materialtabellen) först med aceton och sedan med isopropylalkohol (IPA).
- Placera kiselskivan på en 250 °C kokplatta i 30 minuter för uttorkning (figur 3A).
- Täck kiselskivan med hexametyldisilazan (HDMS) i en ångugn (se materialtabell) (processtemperatur: 150 °C, processtryck: 2 Torr, processtid: 5 min, HDMS-volym: 5 μL) (figur 3B).
- Placera en flaska SU-8 2100 fotoresist (se materialtabell) i en 60 °C ugn i 15 minuter för att minska viskositeten.
OBS: Vid uppvärmning i ugnen minskar viskositeten hos fotoresisten. Fotoresister med sänkt viskositet kan hanteras lättare och kan hällas mer exakt ovanpå skivan. - Placera kiselskivan på en 60 °C värmeplatta och häll 1 ml av den uppvärmda fotoresisten för varje tum av skivan tills fotoresisten täcker större delen av ytan (figur 3C).
- Överför den fotoresistbelagda kiselskivan till en spinnbeläggning (se Materialförteckning).
- Applicera förspinn först vid 250 rpm i 30 s och sedan vid 350 rpm i ytterligare 30 s, båda med 100 rpm/s acceleration (figur 3D).
- Ta bort överskottet av fotoresist från kanterna på kiselskivan med en renrumspinne.
- Snurra först vid 500 rpm i 15 s med 100 rpm/s acceleration och sedan vid 1450 rpm i 30 s med 300 rpm/s acceleration (figur 3E).
- Ta bort kantpärlan med en renrumspinne.
- Placera kiselskivan på en 50 °C värmeplatta och spraya aceton på skivan för att avlägsna brister och främja enhetlig beläggning (figur 3F).
- Höj långsamt temperaturen på kokplattan till 95 °C med en hastighet av 2 °C/min.
- Grädda kiselskivan mjukt vid 95 °C i 50 minuter (figur 3G).
- Kyl långsamt ner värmeplattan till rumstemperatur med en hastighet av 2 °C/min.
- Placera kiselskivan på en maskjusterare (se Materialförteckning) och placera fotomasken ovanpå den (se kompletterande figur 1 för fotomaskgeometrin).
- Exponera kiselskivan för 350 mJ/cm 2 UV-ljus (35 mW/cm2 i 10 s) genom fotomasken med hjälp av kontaktmaskjusteraren (bild 3H).
- Applicera på varandra följande efterexponerade bakningar på kiselskivan genom att placera skivan på en värmeplatta vid 50 °C i 5 minuter, vid 65 °C i ytterligare 5 minuter och slutligen vid 80 °C i ytterligare 20 minuter (figur 3I).
- Kyl långsamt ner kiselskivan till rumstemperatur med en hastighet av 2 °C/min.
- Placera en magnetomrörare med en något mindre diameter än kiselskivan i en bägare. Vänd kiselskivan upp och ner och placera den ovanpå bägaren.
- Placera bägaren inuti en annan större bägare och fyll den större bägaren med en ny utvecklarlösning (se Materialförteckning). Låt kiselskivan vara nedsänkt i utvecklaren i 30 minuter med omröraren påslagen (figur 3J).
- Överför kiselskivan till en ultraljudsbad sonicator fylld med den färska utvecklaren i 1 h vid 40 kHz (Figur 3K).
- Tvätta kiselskivan noggrant med en IPA-lösning för att erhålla den slutliga kiselskivformen (figur 3L).
2. Tillverkning av mikrofluidikchipet
- Placera kiselskivans form i en exsickator tillsammans med 10 droppar (~ 500 μL) triklor (1H,1H,2H,2H-perfluoroktyl)silan (PFOCTS, se materialförteckning) i en liten vägbåt i närheten.
- Anslut exsickatorn till en vakuumpump på ca 200 Torr i 30 min.
- Stäng av exsickatorventilen och koppla bort vakuumpumpen över natten för PFOCTS-beläggning.
- Bered den förhärdade polydimetylsiloxanlösningen (PDMS) genom att blanda PDMS-basen med härdningsmedlet (se materialförteckningen) i förhållandet 10:1.
- Avgasa blandningen genom att placera den i en centrifug (500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur).
OBS: Denna centrifugering gör att bubblor kan migrera till den övre ytan och följaktligen avlägsnas på kort tid. - Häll den avgasade PDMS-lösningen på kiselskivans form.
- Avgasa det igen för att ta bort luftbubblorna som fångats på mögelytan.
- Bota PDMS i en ugn på 60 °C i 1 h och 50 min (figur 3M).
- Använd en skalpell för att skära gränserna för det härdade PDMS-området som motsvarar den mikrofluidiska chipgeometrin (figur 3N).
- Skala PDMS-delen och lägg den upp och ner på en skärmatta.
- Använd en rakhyvel för att skära PDMS-delen i sin slutliga form (bild 3O).
- Stansa inlopps- och utloppshålen på PDMS med hjälp av en biopsistans (se materialtabell) eller en nål med trubbig spets (figur 3P).
- För embryoinloppshålet, använd en stans med en diameter på 4 mm.
- För embryoutloppshålen, använd en stans med en diameter på 1,3 mm.
- För gasinloppshålet, använd en 2 mm stans.
- Använd en bit tejp för att ta bort eventuella partiklar som kan finnas kvar på den mönstrade ytan på PDMS.
- Rengör en 24 mm x 60 mm rektangulär glasskiva först med aceton och sedan med IPA.
- Torka glasytan med en luftpistol ansluten till en filtrerad luftkälla.
- Applicera en uttorkningsbakning på glasskivan genom att placera den på en 250 °C kokplatta i 2 timmar (figur 3Q).
- Täck glasskivan med en bägare för att förhindra ytkontaminering.
- Placera PDMS, med den mönstrade sidan uppåt, och det uttorkade glaset i en plasmarengörare (se Materialförteckning).
- Behandla PDMS och glasskivan med syreplasma vid 18 W i 30 s.
- Placera PDMS på glasskivan med dess mönstrade yta vänd mot glasskivan för att täta mikrokanalerna via kovalent bindning (figur 3R).
- Använd pincett för att försiktigt trycka PDMS-delen mot glasskivan för att säkerställa full konformationskontakt.
- Förvara det färdiga mikrofluidiska chipet vid rumstemperatur över natten så att bindningen når sin slutliga styrka.
3. Beredning av bananflugeembryon
- Låt Oregon-R vuxna flugor lägga ägg på äppeljuiceagarplattor (1,5% agar, 25% äppeljuice, 2,5% sackaros) och samla plattorna vid önskad utvecklingstid efter äggläggning för det givna experimentet.
OBS: För de aktuella experimenten samlades plattorna in vid 140 min för att förbereda och sortera efter embryon vid cellulariseringssteg17. - Översvämma agar med embryoäggtvätt (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) och agitera försiktigt embryona med en pensel för att lossa dem från agaren.
- Överför embryona till en 50% blekmedelslösning i 90 s, rör om ibland. Sila embryona genom en vävnadssikt och tvätta noggrant bort blekmedelslösningen med vatten.
- Överför embryona till en 90 mm glas petriskål med tillräckligt med embryoäggtvätt för att helt täcka embryona.
- Undersök embryona med transillumination på ett dissekeringsmikroskop och välj embryon från önskat utvecklingsstadium för laddning i mikrofluidikanordningen.
OBS: I denna applikation valdes embryon vid cellulariseringssteget. De detaljerade beskrivningarna av hur man säkerställer korrekt val av utvecklingsstadium finns i laboratoriehandboken för Drosophila17.
4. Applicera mekanisk stimulering på fruktflugeembryon med hjälp av mikrofluidikchipet
- Grundmåla alla sju embryomikrokanaler genom att fylla dem med 0,4 μm filtrerad IPA genom huvudinloppsporten för embryon.
- Byt ut IPA mot 0,4 μm filtrerat avjoniserat (DI) vatten.
- Byt ut DI-vattnet med embryoäggtvättlösning.
- Samla cirka 100 förvalda embryon från petriskålen i glas med en glaspipett.
- Pipettera embryona i embryoinloppsporten (figur 4A).
- Applicera ett undertryck på cirka 3 PSI (dvs. vakuum) på gasinloppet med en bärbar vakuumpump för att öppna embryomikrokanalerna.
- Luta det mikrofluidiska chipet nedåt så att embryona automatiskt justeras och sätter sig i embryots mikrokanaler (figur 4B).
- Om embryots mikrokanalinlopp täpps till av att flera embryon kommer in samtidigt, luta mikrofluidikchipet uppåt och sedan nedåt igen för att rensa igensättningen.
- Baserat på den erforderliga genomströmningen, introducera så många som 300 embryon i embryomikrokanalerna.
- När embryoladdningen är klar, ta bort vakuumet för att immobilisera embryona.
- Luta det mikrofluidiska chipet tillbaka till horisontellt läge (figur 4C).
- Anslut en bärbar övertryckskälla (se materialförteckning) med en tryckmätare till gasinloppet för att applicera 3 PSI-kompression (figur 4D).
- Kontrollera kontinuerligt tryckmätaren för att säkerställa att en konsekvent kompressionsnivå tillämpas.
- Om levande avbildningsexperiment kommer att utföras på de mekaniskt stimulerade embryona, placera det mikrofluidiska chipet på en standardglasskivhållare för mikroskopsteg med gasinloppet anslutet till tryckkällan.
- När kompressionsexperimentet är avslutat kan embryona samlas in för nedströmsanalys. För att göra detta, applicera först vakuumet på gasinloppet för att frigöra embryonerna.
- Luta sedan det mikrofluidiska chipet uppåt så att embryona rör sig mot embryots introduktionsport (figur 4E).
- Samla embryon från det mikrofluidiska chipet med en glaspipett.
OBS: Vid insamling kan effekterna av kompression på embryonal utveckling och livskraft undersökas genom att odla bananflugorna till vuxen ålder. Den mikrofluidiska anordningens höga kapacitet för bearbetning av dataflöde gör det också möjligt att använda embryon i omics-baserade analyser nedströms som kräver ett stort antal prover (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det mikrofluidiska systemet är uppdelat i två underfack åtskilda av deformerbara PDMS-sidoväggar. Det första facket är det flytande systemet där Drosophila-embryon introduceras, automatiskt justeras, radas upp och komprimeras. Det andra facket är ett gassystem där gastrycket på vardera sidan av kompressionskanalerna styrs via återvändsgrändsmikrokanaler för att exakt styra kompressionskanalernas effektiva bredd. Den mikrofluidiska anordningen förseglas med en glasskiva i botten, vilket möjliggör högupplöst live-avbildning av proverna (tilläggsfigur 2) för de relevanta dimensionerna av den mikrofluidiska anordningen.
Multicellulära organismer såsom Drosophila-embryon väljs vid det önskade embryonala utvecklingsstadiet. När det gäller Drosophila-embryona är alla utvecklingsstadier lika kompatibla med detta tillvägagångssätt eftersom embryostorleken inte förändras förrän de kläcks. Utvalda prover införs i den mikrofluidiska anordningen genom det stora inloppet (dvs 4 mm diameter) med användning av en glasmikropipett. Enheten lutas sedan nedåt så att embryona kan strömma in i de sju kompressionskanalerna organiserade på ett parallellt sätt. Det förträngande atriumet som förbinder embryoinloppet med kompressionskanalen säkerställer automatisk inriktning av embryona innan de når ingången till kompressionskanalerna. Vakuumet som appliceras på gasinloppet avböjer de deformerbara sidoväggarna utåt, ökar den effektiva mikrokanalbredden och låter embryona komma in i kompressionskanalerna i följd. De sju kompressionskanalerna är 22 mm långa och rymmer parallellt upp till 300 Drosophila-embryon i en enda körning. Kompressionskanaler slutar i en flaskhals där mikrokanalens bredd minskar till en nivå som är mycket mindre än provernas, vilket gör att vätska kan strömma igenom samtidigt som embryona behålls. Genom detta tillvägagångssätt koncentreras embryona inom kompressionskanalerna. Efter införandet av embryona avlägsnas vakuumet i gasinloppet, och mikrokanals sidoväggar återgår till sitt ursprungliga läge och immobiliserar de uppradade embryona från vardera sidan. Kompression kan uppnås genom att applicera positivt tryck på gasinloppet, vilket avböjer de deformerbara sidoväggarna inåt och minskar den effektiva mikrokanalbredden. Mängden kompression som appliceras på embryon kan regleras exakt genom att skräddarsy mikrokanaldimensionerna, tjockleken på de deformerbara sidoväggarna, Youngs modul för PDMS och det applicerade trycket. Efter kompressionsexperimentet kan embryona samlas in för nedströmsanalys genom att applicera ett vakuum på gasinloppet och luta den mikrofluidiska anordningen i en annan riktning.
Denna mikrofluidiska anordning tillverkades med mjuk litografi18. Tillverkning av tjocka strukturer med höga bildförhållande med ultrathick photoresist kräver dock stora avvikelser från protokoll som definierats för standardtillverkningen (figur 3). Tillsammans med hexametyldisilazanbeläggning (HDMS) rengjordes kiselskivorna före spinnbeläggning för att avlägsna organiska rester och bakades för att avlägsna ytfuktighet. Dessa extra steg förbättrade bindningen av det tjocka fotoresistskiktet till kiselskivan. Fotoresisten värmdes också upp innan den hälldes för att minska viskositeten, vilket var avgörande för att täcka hela skivans yta. Målet fotoresist beläggningstjocklek uppnåddes genom tre snurrande steg, där varje snurrande steg gradvis avlägsnade överskott av fotoresist utan att förorena skivans yta. Inspirerad av tidigare publicerade metoder19 sprutades aceton, som är ett av lösningsmedlen i fotoresisten, på kiselskivan för att eliminera fotoresistfel och öka beläggningens enhetlighet. Under de på varandra följande bakstegen ändrades temperaturen långsamt för att minimera termisk spänning, vilket kan leda till delaminering av fotoresisten från kiselskivan. På grund av liknande problem minskade baktemperaturen samtidigt som dess varaktighet ökade. Ett av de mest utmanande stegen i den fotolitografiska tillverkningen av diken med högt bildförhållande var avlägsnandet av den ohärdade fotoresisten efter UV-exponering. För att maximera utvecklarlösningens penetration i dikena vändes kiselskivan upp och ner och blandades kontinuerligt med utvecklarlösningen med en omrörare. På detta sätt kan den färska utvecklarlösningen reagera med och ta bort den ohärdade fotoresisten. Detta steg följdes av ett ultraljudsbad där den återstående fotoresisten avlägsnades. När kiselskivformen väl genererades framgångsrikt bestod standardreplikformningsprocessen av härdningsmedelblandning, avgasning, hällning, härdning, skalning, stansning och plasmabindning för tillverkning av den slutliga mikrofluidiska anordningen20.
Funktionaliteten hos den mikrofluidiska anordningen bestämdes experimentellt genom att ladda Drosophila-embryon i kompressionskanalerna och applicera positivt tryck på gaskanalerna. Mätningar av embryonas minskande bredd under ett mikroskop (figur 5A) visar hur gastryck kan användas för att erhålla en målkompressionsnivå (figur 5B). Time-lapse-bilder av justerade embryon som genomgår komprimering visar också detta systems kompatibilitet med konfokalmikroskopi.
Figur 1: Den mikrofluidiska anordningens utformning och funktion. Den mikrofluidiska anordningen består av sju parallella kompressionsmikrokanaler som kan testa upp till 300 hela Drosophila-embryon samtidigt. (A) Embryon fördes in i produkten via huvudembryoinloppet, och de justerades automatiskt längs den bakre främre axeln när de kom in i mikrokanalerna. (B) Embryon rörde sig fritt när undertryck applicerades genom gasinloppet eftersom detta avböjde de deformerbara mikrokanaliga sidoväggarna utåt. Detta möjliggjorde deras lastning samt lossning som en enda körfält. När undertrycket avlägsnades immobiliserades embryona i mikrokanalerna. När positivt tryck applicerades komprimerade mikrokanalsväggarna embryona genom att avböja inåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Processflöde av mikrofluidiska kompressionsexperiment för mekanobiologistudier. (A) Den mikrofluidiska mekanostimuleringsanordningen med hög genomströmning är tillverkad av PDMS och en glasskiva för att bearbeta hundratals multicellulära biologiska prover. (B) Enheten är skräddarsydd för att fungera med olika flercelliga system såsom Drosophila äggkammare, Drosophila embryon eller hjärnorganoider. Denna enhet kan tillämpa stabila eller dynamiska komprimeringsmönster på biosystemen. (C) Systemen kan avbildas med ett konfokalmikroskop över tid när de komprimeras. Uttrycksnivåerna och lokaliseringen av fluorescerande märkta proteiner som svar på kompression kan analyseras. Vid insamling kan systemen analyseras för testning och avbildning efter stimulering. Den mikrofluidiska anordningens höga bearbetningskapacitet gör det också möjligt att lysera och använda systemen i omics-baserade biologiska analyser som kräver ett stort antal prover, vilket visas i figuren med ett 2-dimensionellt differentialgelelektroforesbildexempel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillverkningsprocess av kiselskivformen med tjocka fotoresist och diken med högt bildförhållande. (A,B) Den övergripande tillverkningsprocessen började med att förbereda kiselskivan för fotoresistbeläggning. (C–G) En tjock fotoresistbeläggning applicerades jämnt på kiselskivan. (H,I) Fotoresisten mönstrades med UV-exponering genom fotomasken. (J-L) Ohärdad fotoresist avlägsnades från kiselskivan. (M–P) PDMS-delen tillverkades genom mjuk litografi. (Q,R) Enheten förseglades till glasskivan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mikrofluidanordningens funktion . (A) Först pipetterades embryon till huvudembryoinloppet. (B) För det andra applicerades undertryck på gasinloppet och den mikrofluidiska anordningen lutades nedåt för att göra det möjligt för embryona att anpassa sig och laddas in i mikrokanalerna. (C) För det tredje avlägsnades undertryck för att immobilisera embryona. (D) För det fjärde applicerades positivt tryck på gaskanalerna för att komprimera embryona. (E) Slutligen samlades embryona in från den mikrofluidiska anordningen genom att växla tillbaka till undertryck och luta mikrofluidikanordningen uppåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Experimentell mätning av embryokompressionsnivå . (A) Representativa embryon inuti mikrofluidikanordningen under olika gastrycksnivåer. Medan embryona inte upplever signifikant kompression under vakuum eller i neurala trycktillstånd, komprimeras de när positivt tryck appliceras. (B) Mängden enaxlig tryckspänning som appliceras på embryona vid olika gastrycksnivåer (felstänger representerar standardavvikelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kompression av hjärnorganoider i en mikrofluidisk anordning utformad och tillverkad enligt samma strategi. (A) Kompressionen av hjärnorganoiderna vid ökande nivåer när gastrycket ökar. (B) Bredden på hjärnorganoiderna inuti mikrokanalerna vid olika trycknivåer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Ovanifrån av fotomasken som används vid fotolitografisk tillverkning av kiselskivans form. Det finns fem identiska mikrofluidiska enhetsgeometrier belägna inom området med en diameter på 4 i diameter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Ovanifrån av den mikrofluidiska anordningen som används i denna studie med relevanta dimensioner. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Artikeln beskriver utvecklingen av en mikrofluidisk anordning för att automatiskt justera, immobilisera och exakt tillämpa mekanisk stimulering på hundratals hela Drosophila-embryon . Integrationen av det mikrofluidiska systemet med en tunn glasbeläggning möjliggjorde avbildning av embryon med högupplöst konfokalmikroskopi under stimuleringen. Den mikrofluidiska anordningen möjliggjorde också insamling av embryona direkt efter stimuleringen för att köra nedströms biologiska analyser. Designövervägandena, tillverkningsmetoden och karakteriseringen av denna enhet beskrivs i detalj. Tillverkningsprotokollet för kiselskivans form möjliggjorde en jämn tjock beläggning av fotoresisten med diken med högt bildförhållande.
För att denna tillverkningsmetod ska lyckas är det viktigt att sänka temperaturen på bakstegen och minimera uppvärmnings- och kylningshastigheterna för kiselskivan efter att den är belagd med fotoresist. Om detta inte görs ordentligt kan fotoresistbeläggningen enkelt delaminera och ändra formgeometrin. När kiselskivformen har tillverkats framgångsrikt kan den kopieras till mer hållbara material för att förhindra att den ursprungliga formen skadas under på varandra följande PDMS-replikgjutningssteg, som också innehåller värme- och kylcykler21. Tillverkningen av PDMS-mikrofluidikanordningen genom replikgjutning är beroende av framgångsrik skalning av sidoväggsstrukturer med högt bildförhållande från formen. För att detta tillverkningssteg ska vara tillförlitligt är det viktigt att ordentligt belägga ytan på kiselskivan med ett silaniseringsmedel för att underlätta skalningen. Beläggningen bör också förnyas efter tillverkning av cirka 20 PDMS-enheter för att kompensera för delvis avlägsnande av silanskiktet under varje skalningssteg. Annars kan sidoväggarna fastna inuti fotoresistmönstret, vilket gör formen oanvändbar. Eftersom kompressionsnivån som appliceras på proverna är en funktion av sidoväggarnas mekaniska egenskaper är det viktigt att hålla PDMS-replikformningsprocessparametrarna konsekventa. Härdningsmedlets förhållande, temperatur och varaktighet måste övervakas noggrant under tillverkningen. Dessutom, eftersom denna enhetsstrategi är för att applicera mekanisk stimulering samtidigt på ett stort antal multicellulära organismer, kan deras aggregering inuti mikrokanalerna leda till igensättning. Även om detta problem inte upplevdes med de organismer som används häri, om detta inträffar, finns det potentiella lösningar från litteraturen för att övervinna detta problem, såsom att använda bärarlösningar under introduktionen av proverna22.
Även om Drosophila-embryon användes som en hel flercellig organism i detta arbete, kan design- och tillverkningsstrategin som presenteras här tillämpas på mekanisk stimulering av andra flercelliga system genom att ändra enhetens dimensioner i enlighet därmed (Figur 2). Detta kan åstadkommas genom att utöka den centrala mikrokanalbredden och höjden för att matcha de flercelliga systemen. Genom detta tillvägagångssätt kan prover komma in i mikrokanalerna och komprimeras på liknande sätt genom att avböja de deformerbara sidoväggarna med positivt pneumatiskt tryck. För att demonstrera detta tillvägagångssätt tillverkades liknande anordningar för Drosophila äggkammare, liksom hjärnorganoider. Dessa system möjliggjorde exakt mekanisk komprimering av dessa biologiska system som liknar Drosophila-embryoexperimenten (figur 6). Eftersom detta tillvägagångssätt möjliggör påfyllning av media runt de immobiliserade proverna kan det också vara mycket användbart för kemiska stimuleringsexperiment som kräver snabbt medieutbyte utan att störa proverna. Sammantaget kombinerar detta mångsidiga tillvägagångssätt precisionen och automatiseringsfunktionerna med hög genomströmning hos mikrofluidiska system samtidigt som det möjliggör nya mekanobiologistudier på olika flercelliga system som små vävnadsprover, organoider, embryon och oocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intressen i de produkter som beskrivs i detta manuskript och har inget annat att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (CMMI-1946456), Air Force Office of Scientific Research (FA9550-18-1-0262) och National Institute of Health (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes | Fisher | 14-955-111B | Perferate with air holes |
| 100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer | University Wafer | 452 | |
| Biopsy punches | Ted Pella | 15110 | |
| Bleach | Not brand specific | ||
| Blunt needle set | CML Supply | 901 | |
| Contact Mask Aligner | Quintel | Q4000 MA | |
| Cutting mat | Dahle | Vantage 10670 | size: 24" x 36" |
| Developer | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Direct Write Lithographer | Heidelberg | MLA100 | |
| Dissecting microscope | Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light | ||
| Glass petri dish | Fisher | FB0875713A | |
| Glass slide | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| HMDS Vapor Prime Oven | Yes Engineering | YES-3TA | |
| NaCl | Not brand specific | ||
| Oven | Labnet | I5110A | |
| Paintbrush | Not brand specific | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Photoresist | MicroChem | SU-8 2100 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Portable pressure source | hygger Quietest | HGD946 | |
| Pressure gauge | Cole-Parmer | EW-68950-25 | |
| Spin Coater | Laurell | WS-650-8B | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Ultrasonic Cleaner | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Vacuum Pump | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
References
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
- Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
- Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
- Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34 (2020).
- Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
- Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
- Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392 (2020).
- Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
- Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
- Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
- Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
- Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162 (2019).
- Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
- Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
- Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491 (2010).
- Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006 (2011).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
- Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241 (2020).
- Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).
