Summary
يعد تحليل التغيرات في وظيفة الانقباض والسلامة الخلوية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC ذا أهمية كبيرة لتطوير الأدوية غير السريرية. يعالج نظام تحليل الخلايا الهجين المكون من 96 بئرا كلا المعلمتين في الوقت الفعلي وبطريقة فسيولوجية للحصول على نتائج موثوقة وذات صلة بالإنسان ، وهي ضرورية للانتقال الآمن إلى المراحل السريرية.
Abstract
يعد تقييم انقباض القلب ذا أهمية كبيرة لتطوير علاجات جديدة وانتقالها الآمن إلى المراحل السريرية. في حين أن الخلايا العضلية القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC-CMs) تبشر بأن تكون بمثابة نموذج ذي صلة بالإنسان في المراحل قبل السريرية لاكتشاف الأدوية وسلامة الصيدلة ، إلا أن نضجها لا يزال مثيرا للجدل في المجتمع العلمي وقيد التطوير المستمر. نقدم تقنية الانقباض الهجين والمعاوقة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP) ، مما يضيف ميزات مهمة مؤيدة للنضج إلى منصة 96 بئرا متوافقة مع معايير الصناعة.
يراقب نظام المعاوقة / EFP الوظائف الخلوية في الوقت الفعلي. إلى جانب معدل ضربات الخلايا المقلصة ، تكتشف قراءات التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية التغيرات المورفولوجية التي يسببها المركب مثل كثافة الخلية وسلامة الطبقة الخلوية الأحادية. في المكون الآخر لنظام تحليل الخلايا الهجينة ، يتم استزراع الخلايا على أغشية متوافقة حيويا تحاكي البيئة الميكانيكية لأنسجة القلب الحقيقية. تدعم هذه البيئة الفسيولوجية نضوج hiPSC-CMs في المختبر ، مما يؤدي إلى استجابات انقباضية تشبه البالغين بما في ذلك التأثيرات المؤثرة في التقلص العضلي الإيجابية بعد العلاج بالإيزوبروتيرينول أو S-Bay K8644 أو omecamtiv mecarbil. كما تكشف معلمات مثل سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ومدة النبض عن تأثيرات المصب للمركبات ذات التأثير على الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ومعالجة الكالسيوم.
يوفر النظام الهجين الأداة المثالية لتحليل الخلايا الشامل ، مما يسمح بتقييم مخاطر القلب قبل السريرية بما يتجاوز المنظورات الحالية للمقايسات القائمة على الخلايا ذات الصلة بالإنسان.
Introduction
أحد الأهداف الرئيسية لتطوير الأدوية الحديثة هو تحسين معدل نجاح العلاجات الجديدة في خط أنابيب اكتشاف الأدوية. غالبا ما تكشف الاختبارات الدوائية الآمنة لهذه الأدوية الجديدة عن تفاعلات دوائية ضارة على نظام القلب والأوعية الدموية الذي يمثل ما يقرب من ربع معدل استنزاف الدواء في المراحل قبل السريرية1. يلعب تطوير ودمج منهجيات النهج الجديدة (NAMs) دورا رئيسيا في تحديث التقييم قبل السريري ، ولا سيما أجهزة البطارية الأساسية مثل القلب. نظرا لأن هذه المنهجيات هي نهج خالية من الحيوانات ، فإن استخدام نماذج الخلايا البشرية مثل خلايا عضلة القلب (CMs) من أصل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) أصبح العمود الفقري على مدار العقد الماضي للتقييم الحديث للقضايا الدوائية والسميةللسلامة 2. أنظمة الفحص المستخدمة على نطاق واسع لمثل هذه التحقيقات هي مصفوفة الأقطاب الدقيقة (MEA) والنهج التجريبية القائمة على الصبغة الحساسة للجهد3.
ومع ذلك ، فإن عدم النضج الظاهري والوظيفي المزعوم لهذا النوع من الخلايا يضع عقبات في طريق نموذج الخلية المثالي القائم على الإنسان ، مع إمكانية تقليل الفجوات الانتقالية بين الدراسات غير السريرية والسريرية4.
تم إجراء أبحاث هائلة على مر السنين لفهم سبب النمط الظاهري الضمني غير الناضج وإيجاد طرق لدفع عملية نضج iPSC-CMs البشرية في المختبر.
تبين أن الافتقار إلى إشارات النضج القلبي مثل أوقات زراعة الخلايا المطولة ، أو عدم وجود أنواع أخرى من الخلايا في المنطقة المجاورة ، أو نقص التحفيز الهرموني يؤثر على عملية النضج5. أيضا ، تم تحديد البيئة غير الفسيولوجية لألواح زراعة الخلايا العادية كسبب مهم يعيق نضوج iPSC-CMs البشرية ، بسبب تصلب الركيزة الفسيولوجية المفقودة لقلب الإنسان الأصلي 5,6.
تم تطوير أنظمة فحص مختلفة مع التركيز على الظروف الفسيولوجية الأصلية لمعالجة هذه المشكلة ، بما في ذلك أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد حيث يتم محاذاة الخلايا ثلاثية الأبعاد لتشبه بنية القلب الأصلية بدلا من مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد النموذجية7. على الرغم من الحصول على نضج محسن باستخدام فحوصات 3D ، فإن الحاجة إلى قوة عاملة ماهرة وإنتاجية منخفضة لهذه الأنظمة تعوق الاستخدام الوفير لهذا في عملية تطوير الأدوية ، حيث يلعب الوقت والتكلفة دورا أساسيا في تقييم العلاجات الجديدة على المستوى المالي8.
قراءات مهمة للسلامة التقييم الدوائي والسمي للعلاجات الجديدة هي تغييرات في الخصائص الوظيفية والهيكلية ل iPSC-CMs البشرية ، لأن التفاعلات الدوائية الضارة التي يسببها المركب لنظام القلب والأوعية الدموية عادة ما تؤثر على أحد هذه الخصائص أو كليهما 1,9. الأمثلة المعروفة لمثل هذه التفاعلات السلبية الواسعة هي الأدوية المضادة للسرطان من عائلة أنثراسيكلين. هنا ، يتم الإبلاغ على نطاق واسع عن الآثار الهيكلية الوظيفية والضارة الخطرة على نظام القلب والأوعية الدموية أثناء وبعد علاج السرطان في المرضى وكذلك مع المقايسات القائمة على الخلايا في المختبر 10,11.
في هذه الدراسة ، وصفنا منهجية شاملة لتقييم كل من الآثار الجانبية المركبة الوظيفية والهيكلية على hiPSC-CMs. تتضمن المنهجية تحليل قوة انقباض خلايا عضلة القلب وتحليل المعاوقة / إمكانات المجال خارج الخلية (EFP). يتم قياس قوة الانقباض في ظل الظروف الميكانيكية الفسيولوجية ، مع الخلايا المستزرعة على ركائز سيليكون ناعمة (33 كيلو باسكال) ، مما يعكس البيئة الميكانيكية لأنسجة القلب البشرية الأصلية.
تم تجهيز النظام بألواح 96 بئرا لتحليل الإنتاجية العالية ل iPSC-CMs البشرية للدراسات الدوائية والسمية لسلامة القلب قبل السريرية ، وبالتالي يوفر ميزة لنهج 3D المستخدمة حاليا مثل Langendorff القلب أو شرائح القلب12,13.
بالتفصيل ، يتكون النظام الهجين من وحدتين ، إما لتقييم انقباض القلب في ظل الظروف الفسيولوجية أو تحليل السمية الهيكلية الخلوية في الوقت الفعلي 6,14. تعمل كلتا الوحدتين مع لوحات متخصصة عالية الإنتاجية من 96 بئرا للحصول على البيانات بسرعة وفعالية من حيث التكلفة.
بدون الحاجة إلى بناء 3D ، تستخدم وحدة الانقباض لوحات خاصة تحتوي على أغشية سيليكون مرنة كركيزة للخلايا بدلا من الزجاج الصلب أو البلاستيك الذي تتكون منه عادة لوحات زراعة الخلايا العادية. تعكس الأغشية خصائص القلب الميكانيكية الحيوية البشرية النموذجية ، وبالتالي تحاكي الظروف في الجسم الحي بطريقة إنتاجية عالية. في حين أن iPSC-CMs البشرية غالبا ما تفشل في إظهار سلوك خلايا عضلة القلب البالغة فيما يتعلق بتقلص التقلص العضلي الإيجابي الناجم عن المركب في المقايسات الأخرى القائمة على الخلايا14 ، يمكن تقييم تفاعل أكثر شبها بالبالغين عندما يتم استزراع الخلايا على ألواح وحدة الانقباض. في الدراسات السابقة ، ثبت أن iPSC-CMs تظهر تأثيرات مؤثرة في التقلص العضلي إيجابية عند العلاج بمركبات مثل الأيزوبروتيرينول أو S-Bay K8644 أو omecamtiv mecarbil 6,15. هنا ، يمكن تقييم معلمات انقباض متعددة ، مثل المعلمات الأولية مثل سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ، ومدة الضرب ، ومعدل الضرب ، بالإضافة إلى المعلمات الثانوية لدورة الانكماش مثل المنطقة الواقعة أسفل المنحنى ، والانكماش ، ومنحدرات الاسترخاء ، وتغيرات معدل الضرب ، وعدم انتظام ضربات القلب (الشكل التكميلي 1)16 . يتم تقييم التغيرات التي يسببها الدواء في جميع المعلمات بشكل غير جراحي بواسطة استشعار المسافة بالسعة. يتم تحليل البيانات الأولية لاحقا بواسطة برامج متخصصة.
تضيف وحدة السمية الهيكلية معاوقة فريدة ومعلمات EFP كقراءة للسمية الخلوية الهيكلية وتحليل الخصائص الفيزيولوجية الكهربية17,18. تكشف تقنية التحليل الطيفي للمقاومة الكهربائية عن التغيرات التي يسببها المركب في كثافة الخلايا أو سلامة الخلية والطبقة الأحادية التي يتم رصدها في الوقت الفعلي ، كما هو موضح مع iPSC-CMs البشرية المعالجة بمركبات سامة للقلبمعروفة 13. مع قراءات المعاوقة على ترددات مختلفة (1-100 كيلو هرتز) ، من الممكن تشريح الاستجابة الفسيولوجية بشكل أكبر ، وبالتالي يمكن الكشف عن التغييرات في تضاريس الغشاء أو تقاطعات الخلية الخلوية أو مصفوفة الخلية. يتيح تسجيل EFP الإضافي ل iPSC-CMs البشرية تحليل التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية الناتجة عن المعالجة المركبة ، كما هو موضح في ضوء دراسة CiPA17,19.
في هذه الدراسة ، تم استخدام iPSC-CMs البشرية ، وعولجوا ب epirubicin و doxorubicin ، وكلاهما موصوف جيدا بأنه أنثراسيكلين سام للقلب ، و erlotinib ، مثبط التيروزين كيناز (TKI) مع خطر منخفض إلى حد ما من سمية القلب والأوعية الدموية. تم إجراء تقييم مزمن باستخدام epirubicin و doxorubicin و erlotinib لمدة 5 أيام. تظهر النتيجة تغيرات طفيفة في الانقباض ومقاومة القاعدة عند معالجة الخلايا ب erlotinib ، ولكن انخفاض السمية المعتمدة على الوقت والجرعة في سعة الانقباض ومقاومة القاعدة عند معالجتها ب epirubicin و doxorubicin على التوالي. تم إجراء القياسات الحادة باستخدام نيفيديبين حاصرات قنوات الكالسيوم وأظهرت انخفاضا في سعة الانقباض ومدة جهد المجال ومقاومة القاعدة ، مما يدل على الآثار الجانبية السمية للقلب لهذا المركب على المستويات الوظيفية والهيكلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يرد سير العمل لقياس الانقباض والمعاوقة / EFP في الشكل التكميلي 2.
1. طلاء لوحة
- افتح العبوة محكمة الغلق وأخرج اللوحة المكونة من 96 بئرا. إجراءات المناولة لألواح 96 بئرا لكلتا الوحدتين هي نفسها. اترك لوحة الانكماش مغطاة بواقي الغشاء المزود بشكل إضافي حتى القياس في وحدة الانقباض.
- قم بتغطية الألواح المرنة المكونة من 96 بئرا لبذر خلايا عضلة القلب.
- قم بإعداد محلول طلاء جل EHS المخفف عن طريق نقل 2.75 مل من محلول جل EHS الجاهز للاستخدام في أنبوب طرد مركزي معقم. ثم أضف 8.25 مل من DPBS مع Ca 2+ و Mg2+. خلط الحل بعناية.
ملاحظة: اختياريا ، يمكن أيضا استخدام الفبرونيكتين لطلاء الآبار: تحضير 13 مل من محلول طلاء الفبرونيكتين في أنبوب طرد مركزي معقم عن طريق تخفيف 650 ميكرولتر من محلول مخزون الفبرونيكتين (1 ميكروغرام / مل) في 13 مل من DPBS مع Ca 2+ و Mg2+ ، مما ينتج عنه حل عمل 50 ميكروغرام / مل. خلط الحل بعناية.
- قم بإعداد محلول طلاء جل EHS المخفف عن طريق نقل 2.75 مل من محلول جل EHS الجاهز للاستخدام في أنبوب طرد مركزي معقم. ثم أضف 8.25 مل من DPBS مع Ca 2+ و Mg2+. خلط الحل بعناية.
- انقل محلول الطلاء إلى خزان كاشف معقم يوضع في روبوت أتمتة المختبر.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الطلاء لكل بئر باستخدام روبوت أتمتة المختبر باستخدام برنامج "ADD100μL". ضع الغطاء مرة أخرى على لوحة 96 بئر واحتضنها لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب ضبط برنامج روبوت أتمتة المختبر مسبقا يدويا.
2. بذر خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC في لوحات مرنة من 96 بئرا (اليوم 0)
- قم بإذابة الخلايا وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد اليدوي واضبط الخلايا في وسط الطلاء الموصى به وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للخلية (على سبيل المثال ، 1 × 105 خلايا / بئر) ، مما ينتج عنه 11 × 106 خلايا / 11 مل لبذر لوحة كاملة من 96 بئرا.
- قم بإزالة محلول جل البيئة والصحة والسلامة من الآبار باستخدام روبوت أتمتة المختبر باستخدام برنامج "REMOVE100μL". قم بإزالة خزان الكاشف الذي يحتوي على محلول الطلاء المستغنى عنه من الروبوت.
- نقل معلق الخلية (إجمالي 11 مل) إلى خزان كاشف معقم يوضع في روبوت أتمتة المختبر وزرع الخلايا ب 100 ميكرولتر / بئر باستخدام البرنامج "CELLS_ADD100 μL".
- مباشرة بعد بذر الخلية ، انقل اللوحة المرنة المكونة من 96 بئرا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، يتم التحكم في رطوبتها) واترك الخلايا تستقر طوال الليل.
3. تبادل متوسط لألواح 96 بئر مرنة (اليوم 1)
- قم بتسخين ما لا يقل عن 22 مل من وسط صيانة خلايا عضلة القلب لكل لوحة إلى 37 درجة مئوية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، بعد 18-24 ساعة من بذر الألواح.
- انقل الوسط الطازج (22 مل على الأقل) إلى خزان كاشف معقم واتركه بجوار روبوت أتمتة المختبر. ضع خزان كاشف فارغ في الروبوت وقم بإجراء إزالة متوسطة باستخدام برنامج "REMOVE100μL". بعد ذلك ، استبدل خزان الكاشف الذي يحتوي على وسط النفايات بخزان الكاشف الذي يحتوي على الوسط الطازج ووزع 200 ميكرولتر من الوسط الطازج لكل بئر مع برنامج "ADD100μL". نفذ هذه الخطوة مرتين للوصول إلى 200 ميكرولتر / بئر.
- مباشرة بعد التبادل المتوسط ، انقل اللوحة مرة أخرى إلى الحاضنة.
- قم بإجراء تبادل متوسط (200 ميكرولتر / بئر) كل يومين حتى إضافة المركب.
4. التبادل المتوسط النهائي قبل إضافة المركب (اليوم 5-7)
- قم بإجراء تغيير متوسط نهائي قبل 4-6 ساعات من إضافة المركب.
- قم بتسخين ما لا يقل عن 22 مل من مخزن الفحص المؤقت للوحة واحدة مرنة من 96 بئرا. يتكون المخزن المؤقت للفحص من وسيط صيانة أو مشتقات منه (على سبيل المثال ، وسائط مصل منخفضة / معدومة ، أو وسائط خالية من الفينول الأحمر ، أو غيرها من المخازن المؤقتة متساوية التوتر).
- انقل الوسط الطازج إلى خزان كاشف معقم واتركه بجوار روبوت أتمتة المختبر. ضع خزان كاشف فارغ في الروبوت وقم بإجراء إزالة متوسطة. بعد ذلك ، استبدل خزان الكاشف الذي يحتوي على وسط النفايات بخزان الكاشف الذي يحتوي على الوسط الطازج ووزع 200 ميكرولتر / بئر من الوسط الطازج.
- مباشرة بعد التبادل المتوسط ، انقل اللوحة المرنة مرة أخرى إلى الحاضنة.
5. إضافة مركب وتسجيل البيانات (اليوم 5-7)
ملاحظة: يرد مثال على خطة القياس للتجربة في الشكل التكميلي 3.
- قم بإعداد محلول العمل لكل مركب بتركيز 4x في غطاء التدفق الصفحي باستخدام لوحة بئر عادية معقمة بعمق 96. يعتمد الحل المركب على مخزن الفحص المؤقت المستخدم في الخطوة 4. انقل لوحة البئر التي يبلغ عمقها 96 والتي تحتوي على المحلول المركب لمدة 1 ساعة على الأقل إلى الحاضنة لضبطها على نفس حالة اللوحة المرنة.
ملاحظة: يتم توفير تركيز 1x لكل دواء يستخدم لكل تجربة في الأشكال والأساطير. - انقل اللوحة إلى جهاز القياس المعني 1 ساعة قبل إجراء قياس خط الأساس.
- افتح بروتوكول التحرير في برنامج التحكم (جزء من نظام تحليل الخلايا الهجينة) وحدد انقباض وضع القياس المعني أو المعاوقة / EFP.
- حدد مدة المسح (طول قياس واحد ؛ على سبيل المثال ، 30 ثانية) وفاصل التكرار (الوقت بين القياسات ؛ على سبيل المثال ، 5 دقائق) واحفظ رقم البروتوكول.
- حدد بدء البروتوكول > متابعة واملأ الحقول المطلوبة.
- أخيرا ، حدد بدء القياس. قم بإجراء ما لا يقل عن ثلاثة قياسات أساسية (عمليات مسح) في فواصل زمنية مدتها 5 دقائق قبل وقت قصير من إضافة المركب.
ملاحظة: يوضح الشكل التكميلي 4 أمثلة على بيانات قياس خط أساس الانقباض باستخدام وحدة الانقباض قبل إضافة المركب - قم بإزالة 50 ميكرولتر من مخزن الفحص المؤقت من كل بئر دون إزالة لوحة 96 بئر المرنة من جهاز القياس.
- أضف 50 ميكرولتر من محلول المركب المركز 4x في كل بئر من اللوحة ، وفقا لخطة القياس.
- حدد إضافة علامة منطقة وحدد تخطيط اللوحة المركبة وحجم الحل المركب بعد إضافة المركب.
- أخيرا ، حدد متابعة القياس القياسي أو متابعة سلسلة القياس وفقا للخطة التجريبية.
6. تحليل البيانات
- باستخدام برنامج التسجيل ، قم بقياس عمليات المسح ، التي يتم تحديد طولها وفاصل تكرارها من قبل المستخدم.
- باستخدام برنامج التحليل ، التقط شكل الإشارة عن طريق قراءة معلمات مثل السعة ومعدل النبض وعرض النبضة وما إلى ذلك تلقائيا.
ملاحظة: يتم حساب الإشارة المتوسطة بما في ذلك الانحراف المعياري ، ما يسمى بمتوسط النبض ، تلقائيا بناء على بيانات عملية مسح واحدة. يمكن للمستخدم تحديد معلمات الانقباض / IMP / EFP التي يحسبها البرنامج ويعرضها. - باستخدام برنامج التحليل ، احسب منحنى الاستجابة للجرعة و IC50 / EC50 لكل مركب.
ملاحظة: يمكن تصدير البيانات الأولية ونتائج التحليل التي تم إنشاؤها باستخدام برنامج التحليل بسهولة في مجموعة متنوعة من التنسيقات. وأخيرا، يتم إنشاء تقارير البيانات تلقائيا لتلخيص النتائج التجريبية وأرشفتها. تمت مناقشة وصف شامل لما وكيف يتم قياس إشارة EFP في 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1 تأثيرات مثبط الكيناز erlotinib على انقباض hiPSC-CMs. تمت معالجة الخلايا بتركيزات تتراوح من 10 نانومتر إلى 10 ميكرومتر لمدة 5 أيام وتم تسجيل معلمات النبض يوميا. كان ل Erlotinib ، وهو EGFR (مستقبل عامل نمو البشرة) ومثبط التيروزين كيناز مع مخاطر منخفضة نسبيا للسمية القلبية ، جرعة طفيفة وتأثير يعتمد على الوقت على hiPSC-CMs فقط عند التركيزات في نطاق micromolar. عند أدنى تركيز (10 نانومتر) ، تسبب erlotinib في انخفاض غير ذي دلالة إحصائية في السعة عند القياس الأول بعد التطبيق المركب (1 ساعة). في جميع القياسات اللاحقة ، لم يتم قياس أي تأثير مماثل عند هذا التركيز. يمكن أن يكون الانخفاض العابر نتيجة لتأثير مركب ، ولكنه ينتج أيضا عن تشويه عابر لنمط الإيقاع أثناء إجراء إضافة المركب ، على سبيل المثال ، ذات الطبيعة الحرارية أو الميكانيكية. أظهرت تركيزات Micromolar من erlotinib تأثيرات سمية قلبية طفيفة ولكنها مهمة تعتمد على الوقت والجرعة. شوهدت بداية التأثير من 96 ساعة مع 1 ميكرومتر erlotinib ، في حين أن 10 ميكرومتر أدت إلى انخفاض كبير بعد 24 ساعة فقط من إضافة المركب.
كان لعامل العلاج الكيميائي epirubicin تأثير يعتمد على الوقت والجرعة على hiPSC-CMs (الشكل 2). توقفت الخلايا عن النبض في غضون 24 ساعة بعد تطبيق 10 ميكرومتر من epirubicin. مع 1 ميكرومتر ، تبع انخفاض حاد في السعة إلى 44٪ ± 2٪ من التحكم بعد 24 ساعة توقف كامل للنبض حتى 48 ساعة بعد إضافة المركب. عند 100 نانومتر ، لوحظ انخفاض يعتمد على الوقت في سعة النبض على مدى 5 أيام بسعة متبقية تبلغ 25٪ ± 3٪ في اليوم الخامس. عند أدنى تركيز قدره 10 نانومتر ، كان تأثير الإبيروبيسين يعتمد فقط على الجرعة ولكن لا يعتمد على الوقت ، بدءا من القياس الأول (1 ساعة بعد إضافة المركب). تقلبت السعة بشكل مطرد بين 60٪ -80٪ من السيطرة على مدى 5 أيام. كانت الانحرافات في هذه المجموعة أكبر مقارنة بالتركيزات الأعلى. قد يكون أحد الأسباب المحتملة هو حقيقة أن هذا التركيز كان له تأثير قابل للقياس فقط على جزء من الآبار.
دوكسوروبيسين هي فئة أخرى من أدوية الأنثراسيكلين ، وتم فحص حيوية الخلية ل hiPSC-CMs من خلال مراقبة مقاومة القاعدة بمرور الوقت. يوضح الشكل 3 أن التعرض لمدة 24 ساعة ل 300 و 1 و 3 و 10 ميكرومتر دوكسوروبيسين يقلل من صلاحية الخلية بطريقة تعتمد على التركيز والوقت.
Nifedpinie هو مانع لقنوات الكالسيوم ثنائي هيدروبيريدين يمنع بشكل أساسي قنوات الكالسيوم من النوع L. تكشف المراقبة طويلة المدى لأكثر من 24 ساعة من صلاحية الخلية عن انخفاض يعتمد على الوقت والتركيز في مقاومة القاعدة والتي تستخدم كمقياس للسمية (الشكل 4 أ). عند تطبيق تركيزات نيفيديبين المتزايدة (3 نانومتر ، 10 نانومتر ، 30 نانومتر ، 100 نانومتر) ، تكشف التسجيلات الميدانية المحتملة على hiPSC-CMs عن تقصير يعتمد على التركيز لمدة المجال الطبيعية (FPD) كما هو متوقع (الشكل 4B ، C). أظهر تقييم نيفيديبين فيما يتعلق بانقباض القلب أيضا انخفاضا كبيرا في السعة المعتمدة على التركيز عند القياس الحاد بتركيزات 10 نانومتر و 30 نانومتر (الشكل 5).
تظهر النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام نظام تحليل الخلايا الهجينة أنه يمكن تقييم ثلاث نقاط نهاية قلبية (الانقباض والبنية والفيزيولوجيا الكهربية) ل hiPSC-CMs باستخدام نظام واحد.
الشكل 1: تقييم انقباض خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC المعالجة ب erlotinib لمدة 5 أيام. يظهر المحور السيني الوقت بالساعات ، ويرسم المحور ص سعة المعلمة من حيث النسبة المئوية. تمثل العلامات النجمية دلالة إحصائية مع p < 0.05 (*) أو p < 0.01 (**) (اختبار ويلكوكسون مان ويتني ، ن = 4). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تقييم انقباض خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC المعالجة بأنثراسيكلين إبيروبيسين السمية للقلب على مدار 5 أيام. يظهر المحور السيني الوقت بالساعات ، ويرسم المحور ص سعة المعلمة من حيث النسبة المئوية. تمثل العلامات النجمية دلالة إحصائية مع p < 0.05 (*) أو p < 0. 01 (**) (اختبار ويلكوكسون مان ويتني ، ن = 4). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: المعاوقة الأساسية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC بعد العلاج بالدوكسوروبيسين. المسار الزمني للمقاومة الأساسية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC لمدة 24 ساعة من التعرض ل 300 و 1 و 3 و 10 ميكرومتر دوكسوروبيسين (ن = 5). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تسجيلات المعاوقة وEFP لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC. (أ) المسار الزمني للمقاومة الأساسية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC لمدة 24 ساعة ، عند التعرض ل 3 و 10 و 30 و 100 نانومتر نيفيديبين (ن = 5). (ب) المدة الزمنية للمجال المحتمل لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC لمدة 1 ساعة ، عند التعرض ل 3 و 10 و 30 و 100 نانومتر نيفيديبين (ن = 5). (ج) تخطيط القطب الكهربائي للوحة المعاوقة / EFP. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: تقييم الانقباض (وحدة الانقباض) لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPSC المعالجة بالنيفيديبين لمدة 20 دقيقة. يظهر المحور السيني الوقت بالدقيقة ، ويرسم المحور Y سعة المعلمة من حيث النسبة المئوية. تمثل العلامات النجمية دلالة إحصائية مع p < 0. 05 (*) أو p < 0.01 (**) (اختبار ويلكوكسون مان ويتني ، ن = 4). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: معلمات الانقباض والبيانات الأولية التي تم تقييمها باستخدام وحدة الانقباض. (يسار) المعلمات التي تم تقييمها باستخدام وحدة الانقباض. المعلمات: سعة قوة الانكماش (mN / mm2) ، مدة الضرب ، السكتة الدماغية ، وسرعة الضربة السفلية ، والسكتة الدماغية ، ومنطقة السكتة الدماغية السفلية تحت المنحنى (AUC) ، ومعدل الضرب ، وتغيرات معدل الضربات ، وأحداث عدم انتظام ضربات القلب. (يمين) تسجيلات البيانات الأولية للانقباض لبئر واحد مع خلية عضلية قلبية غير معالجة (أ) معدل النبض ، (ب) تغيرات معدل النبض ، (ج) مبكرا بعد الانقباضات ، و (د) أحداث عدم انتظام ضربات القلب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: سير العمل للانقباض والمعاوقة / قياس EFP. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 3: مثال على تخطيط خطة قياس للوحة مكونة من 96 بئرا. تم تصوير أربعة مركبات (مظللة باللون الأحمر والأخضر الفاتح والبني والأخضر الداكن) بأربعة تركيزات وأربعة مكررات. يتم تمييز الضوابط الإيجابية والسلبية (على سبيل المثال ، ظروف ما قبل الاستزراع و DMSO) باللون الأصفر. يتم تمييز خلايا النسخ الاحتياطي باللون الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 4: مثال على بيانات قياس خط أساس الانقباض باستخدام وحدة الانقباض قبل إضافة المركب. في كل رسم بياني ، يتم تصوير متوسط جميع دورات الانكماش لمسح واحد. لتصور معدل النبض، يظهر انقباضان متتاليان. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد النظام الهجين للمقاومة / EFP / الانقباض منهجية شاملة للتقييم الدوائي والسمي عالي الإنتاجية للالتزامات القلبية لتطوير الأدوية قبل السريرية. يوفر نهجا حديثا لاختبار السلامة قبل السريرية دون استخدام النماذج الحيوانية ، ولكن مع قدرات إنتاجية أعلى تقلل بشكل كبير من الوقت والتكاليف. هذا النظام لديه القدرة على استخدامه كنهج تكميلي لقلب Langendorff والنماذج الحيوانية الأخرى لتقييم السمية الوظيفية والهيكلية قبل السريرية.
كنهج خال من الحيوانات ، يتم استخدام iPSC-CMs البشرية للنظام الهجين20. هنا ، توفر الألواح المرنة الخاصة المكونة من 96 بئرا مع التأثير المؤيد للنضج على iPSC-CMs البشرية ميزة مهمة مقارنة بالمقايسات الأخرى القائمة على الخلايا21,22 ، حيث يتم الجمع بين الإنتاجية والبيئة الفسيولوجية بشكل فريد لتقييم مخاطر القلب البشري الأكثر شبها بالبالغين 6,15.
الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي تطبيق المركب ، خاصة عندما يتم فحص الآثار الحادة. نظرا لأن الخلايا مستزرعة على ركائز ناعمة تقوم بتوصيل القوى الميكانيكية ، فإن التسارع المفرط أثناء مناولة الألواح وتطبيق قوى القص أثناء السحب يمكن أن يؤدي إلى تغييرات عابرة (5-10 دقائق) في معلمات الانكماش ويجب تجنبها. بشكل عام ، يجب توخي الحذر أثناء استبدال الوسائط لتجنب تعطيل الأغشية. يوصى باستخدام معدات أتمتة المختبرات.
قبل إجراء التحليل المركب ، يلزم اتخاذ خطوة ما قبل الاستزراع من 5 إلى 7 أيام ، بحيث يمكن ل iPSC-CMs البشرية ، التي يتم الحصول عليها عادة في حالة محفوظة بالتبريد ، التعافي من إجراء الذوبان وبناء مخلوي مناسب. بالنسبة لكلتا الوحدتين ، تعطي سعة الانكماش ، بالإضافة إلى معدل الضرب ، نظرة ثاقبة لنقطة البداية المثالية للقياس الذي يحدث عادة بين الأيام 5-7. يعد قياس خط الأساس خطوة حاسمة لتحديد خصائص خط الأساس الوظيفية المستخدمة كمعايير إدراج ل hiPSC-CMs التي تمت دراستها3. يجب تسجيل قيم خط الأساس قبل المعالجة المركبة مباشرة بحيث يمكن مقارنة التغيرات في سلوك الانكماش بالظروف غير العلاجية (الشكل التكميلي 3).
يعد حساب المتغيرات وتحديد خصائص خط الأساس أمرا أساسيا لنجاح قياسات hiPSC-CM وتفسير البيانات. لهذا السبب ، يتم اتباع توصيات أفضل الممارسات من Gintant et al. باستخدام نظام تحليل الخلايا الهجينة. على سبيل المثال ، يجب تسجيل خط الأساس قبل الإضافة المركبة ، ويجب أن يفي تسجيل خط الأساس بمتطلبات أساسية معينة3.
على الرغم من أن الألواح المرنة المكونة من 96 بئرا مجهزة بأغشية هشة ، إلا أن لوحة الحماية المقدمة مع المعالجة الحذرة ستمنع التلف. تتم معالجة الأغشية مسبقا لتمكين الارتباط المستقر للخلايا بركيزة السيليكون ، والتي تتميز بتوافق حيوي جوهري منخفض. العلاج مستقر لمدة 6 أشهر على الأقل. بينما يتم الحفاظ على الخلايا باستمرار عند 37 درجة مئوية ، فإن الخواص الميكانيكية لمواد السيليكون مستقرة على نطاق واسع من درجات الحرارة. بالإضافة إلى ذلك ، لا تؤثر الأدوية ولا المذيبات على خصائص السيليكون عند التركيزات المستخدمة في المقايسات القائمة على الخلايا (على سبيل المثال ، تظل تركيزات DMSO أقل من 0.1٪).
تم التحقق من صحة النظام وتحسينه مع مجموعة واسعة من hiPSC-CMs المتاحة تجاريا. عند استخدام خلايا مصنوعة حسب الطلب ، يوصى باختبار بروتينات المصفوفة خارج الخلية القياسية (ECM) للارتباط الأمثل بالخلية (على سبيل المثال ، الفبرونيكتين ، ومصفوفة EHS ، و poly-L-lysine 6,15).
الفيزيولوجيا الكهربية ، وإشارات الكالسيوم ، والانقباض هي نقاط النهاية القلبية الرئيسية الثلاث التي يتم تناولها في التطوير قبل السريري. يقتصر النظام الهجين حاليا على تحليل اثنتين من نقاط النهاية القلبية هذه - الانقباض والفيزيولوجيا الكهربية. لا يمكن تحليل إشارات الكالسيوم في خلايا عضلة القلب مباشرة ولكن يتم اكتشافها بشكل عرضي عن طريق الانقباض والخصائص الفيزيولوجية الكهربية.
يتم إجراء كل من المعاوقة / EFP وكذلك قياس قوة الانكماش باستخدام طبقات أحادية من خلايا عضلة القلب. على الرغم من ميزة صلابة الركيزة الميكانيكية الفسيولوجية أثناء قياس الانكماش ، فإن الخلايا لا تواجه البيئة ثلاثية الأبعاد للأنسجة البشرية الحقيقية. من ناحية أخرى ، يسمح هذا باستخدام جزء صغير فقط من نماذج الخلايا الجذعية المشتقة باهظة الثمن مع معدات المختبرات القياسية. وبالتالي ، يعد هذا التطبيق بأن يكون له علاقة مواتية من التكلفة والمتانة والتنبؤ مقارنة بنماذج الجسم الحي / الجسم الحي أو 3D. قد تشمل التطبيقات المستقبلية للنظام الهجين تحليل أنواع أخرى من الخلايا المقلصة مثل خلايا العضلات الملساء. في تنظيم الاتزان القلبي الوعائي، تلعب هذه الخلايا دورا رئيسيا كنظيرة للخلايا العضلية القلبية. يوفر النظام الهجين أيضا إضافات لمشاريع محددة ، مثل التحفيز البصري ل iPSC-CMs البشرية. لهذا الغرض ، يمكن تطبيق غطاء بصري مخصص على كلتا الوحدتين لتحفيز iPSC-CMs البشرية التي تم نقلها باستخدام Channelrhodopsin-2 خلال أوقات ما قبل الاستزراع.
وبالتالي ، فإن النظام الهجين للمقاومة / EFP / الانقباض يسمح بتقييم السلامة والسمية قبل السريرية الحديثة من خلال تحليل ثلاث نقاط نهاية قلبية مختلفة (الانقباض ، والتغيرات الهيكلية ، والفيزيولوجيا الكهربية) ضمن منهجية واحدة. إن ميزة معالجة نقاط النهاية هذه باستخدام نموذج خلية قلبية قائم على الإنسان على مستوى إنتاجية مرتفع ترفع هذا النظام الهجين إلى ما وراء المنظورات الحالية لتقييم مخاطر القلب قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم توظيف B.L. ، M.GO ، و P.L. في INNOVitro GmbH ، الشركة المصنعة للألواح المرنة. تعمل U.T. ، E.D. ، M.L. ، M.Ge. ، NF ، و S.S. في Nanion Technologies GmbH ، الشركة المصنعة للجهاز الهجين.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بمنح من الوزارة الاتحادية الألمانية للشؤون الاقتصادية والعمل المناخي (ZIM) ومن الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحث (KMUinnovativ). نشكر شركة FUJIFILM Cellular Dynamics، Inc (ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية) على تفضلها بتوفير خلايا عضلة القلب و Ncardia B.V. (ليدن ، هولندا) على تفضلها بتوفير خلايا عضلة القلب ، المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
