Summary
Analysen af ændringer i kontraktil funktion og cellulær integritet af humane iPSC-afledte kardiomyocytter er af enorm betydning for udviklingen af ikke-kliniske lægemidler. Et hybrid 96-brønds celleanalysesystem adresserer begge parametre i realtid og fysiologisk for pålidelige, menneskerelevante resultater, der er nødvendige for en sikker overgang til kliniske stadier.
Abstract
Vurdering af hjertekontraktilitet er af enorm betydning for udviklingen af nye lægemidler og deres sikre overgang til kliniske stadier. Mens menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) lover at tjene som en human-relevant model i prækliniske faser af lægemiddelopdagelse og sikkerhedsfarmakologi, er deres modenhed stadig kontroversiel i det videnskabelige samfund og under konstant udvikling. Vi præsenterer en hybrid kontraktilitets- og impedans/ekstracellulært feltpotentiale (EFP)-teknologi, der tilføjer betydelige pro-modningsfunktioner til en industristandard 96-brønds platform.
Impedans/EFP-systemet overvåger cellulær funktionalitet i realtid. Udover slaghastigheden for kontraktile celler registrerer de elektriske impedansspektroskopiudlæsninger sammensatte inducerede morfologiske ændringer som celletæthed og integritet af det cellulære monolag. I den anden komponent i hybridcelleanalysesystemet dyrkes cellerne på biokompatible membraner, der efterligner det mekaniske miljø i ægte hjertevæv. Dette fysiologiske miljø understøtter modningen af hiPSC-CM'er in vitro, hvilket fører til mere voksenlignende kontraktile reaktioner, herunder positive inotrope virkninger efter behandling med isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil. Parametre som amplituden af kontraktionskraft (mN/mm2) og slagvarighed afslører også downstream-effekter af forbindelser med indflydelse på elektrofysiologiske egenskaber og calciumhåndtering.
Hybridsystemet giver det ideelle værktøj til holistisk celleanalyse, der muliggør præklinisk hjerterisikovurdering ud over de nuværende perspektiver for humanrelevante cellebaserede assays.
Introduction
Et af de vigtigste mål for moderne lægemiddeludvikling er at forbedre succesraten fra bænk til seng for nye lægemidler i lægemiddelopdagelsespipelinen. Sikkerhedsfarmakologisk afprøvning af disse nye lægemidler afslører ofte bivirkninger på det kardiovaskulære system, der tegner sig for næsten en fjerdedel af lægemiddelnedslidningshastigheden på prækliniske stadier1. Udviklingen og integrationen af nye tilgangsmetoder (NAMs) spiller en central rolle i moderniseringen af præklinisk vurdering, især kernebatteriorganer som hjertet. Da disse metoder er dyrefrie tilgange, er brugen af menneskebaserede cellemodeller som kardiomyocytter (CM'er) af induceret pluripotent stamcelleoprindelse (iPSC) blevet arbejdshesten i løbet af det sidste årti for den moderne vurdering af sikkerhedsfarmakologiske og toksikologiske spørgsmål2. Almindeligt anvendte analysesystemer til sådanne undersøgelser er mikroelektrodearray (MEA) og spændingsfølsomme farvestofbaserede eksperimentelle tilgange3.
Ikke desto mindre lægger den påståede fænotypiske og funktionelle umodenhed af denne celletype hindringer i vejen for en ideel menneskebaseret cellemodel med potentiale til at reducere translationelle huller mellem ikke-kliniske og kliniske undersøgelser4.
Enorm forskning er blevet udført gennem årene for at forstå årsagen til den underforståede umodne fænotype og for at finde måder at skubbe modningsprocessen af humane iPSC-CM'er in vitro.
Manglende hjertemodningssignaler såsom forlængede cellekulturtider, fravær af andre celletyper i nærheden eller mangel på hormonel stimulering viste sig at påvirke modningsprocessen5. Det ikke-fysiologiske miljø af regelmæssige cellekulturplader blev også identificeret som en væsentlig årsag, der hindrer modningen af humane iPSC-CM'er på grund af den manglende fysiologiske substratstivhed i det indfødte menneskelige hjerte 5,6.
Forskellige analysesystemer med fokus på indfødte fysiologiske forhold blev udviklet til at tackle dette problem, herunder 3D-cellekultursystemer, hvor celler justeres tredimensionelt for at ligne native hjertearkitektur i stedet for typiske todimensionelle cellekulturer7. Selv om der opnås forbedret modning med 3D-analyser, hæmmer behovet for en kvalificeret arbejdsstyrke og den lave gennemstrømning af disse systemer en rigelig anvendelse af dette i lægemiddeludviklingsprocessen, da tid og omkostninger spiller en grundlæggende rolle i vurderingen af nye behandlinger på et finansielt niveau8.
Vigtige aflæsninger til sikkerhedsfarmakologisk og toksikologisk vurdering af nye lægemidler er ændringer i funktionelle og strukturelle egenskaber ved humane iPSC-CM'er, da sammensatte inducerede bivirkninger i det kardiovaskulære system normalt påvirker en eller begge af disse egenskaber 1,9. Kendte eksempler på sådanne brede bivirkninger er anticancerlægemidler fra antracyklinfamilien. Her rapporteres farlige funktionelle og negative strukturelle virkninger på det kardiovaskulære system bredt under og efter kræftbehandling hos patienter samt med in vitro-cellebaserede assays10,11.
I denne undersøgelse beskriver vi en omfattende metode til vurdering af både funktionelle og strukturelle sammensatte bivirkninger på hiPSC-CM'er. Metoden omfatter analyse af kardiomyocytkontraktil kraft og impedans / ekstracellulært feltpotentiale (EFP) analyse. Den kontraktile kraft måles under fysiologiske mekaniske forhold, hvor cellerne dyrkes på bløde (33 kPa) silikonesubstrater, hvilket afspejler det mekaniske miljø i naturligt humant hjertevæv.
Systemet er udstyret med 96-brøndsplader til analyse af høj kapacitet af humane iPSC-CM'er til prækliniske hjertesikkerhedsfarmakologiske og toksikologiske undersøgelser og giver dermed en fordel for aktuelt anvendte 3D-tilgange som Langendorff hjerte eller hjerteskiver12,13.
I detaljer består hybridsystemet af to moduler, enten til vurdering af hjertekontraktilitet under fysiologiske forhold eller analyse af cellulær strukturel toksicitet i realtid 6,14. Begge moduler arbejder med specialiserede 96-brøndsplader med høj kapacitet til hurtig og omkostningseffektiv dataindsamling.
Uden behov for en 3D-konstruktion anvender kontraktilitetsmodulet specialplader, der indeholder fleksible silikonemembraner som substrat for cellerne i stedet for det stive glas eller plast, som almindelige cellekulturplader normalt består af. Membranerne afspejler typiske humane biomekaniske hjerteegenskaber og efterligner derfor in vivo-forhold på en høj gennemstrømningsmåde. Mens humane iPSC-CM'er ofte ikke viser voksenkardiomyocytadfærd med hensyn til sammensat induceret positiv inotropi i andre cellebaserede assays14, kan en mere voksenlignende reaktion vurderes, når cellerne dyrkes på kontraktilitetsmodulets plader. I tidligere undersøgelser er det blevet påvist, at iPSC-CM'er udviser positive inotrope virkninger ved behandling med forbindelser som isoproterenol, S-Bay K8644 eller omecamtiv mecarbil 6,15. Her kan flere kontraktilitetsparametre vurderes, såsom primære parametre som amplituden af kontraktionskraft (mN/mm2), slagvarighed og slaghastighed samt sekundære parametre for sammentrækningscyklussen som areal under kurven, sammentræknings- og afslapningshældninger, slaghastighedsvariationer og arytmier (supplerende figur 1)16 . Lægemiddelinducerede ændringer i alle parametre vurderes ikke-invasivt ved kapacitiv afstandsmåling. De rå data analyseres efterfølgende af specialiseret software.
Det strukturelle toksicitetsmodul tilføjer sine unikke impedans- og EFP-parametre som aflæsning for strukturel cellulær toksicitet og analyse af elektrofysiologiske egenskaber17,18. Den elektriske impedansspektroskopiteknologi afslører forbindelsesinducerede ændringer i celletæthed eller celle- og monolagsintegritet overvåget i realtid, som vist med humane iPSC-CM'er behandlet med kendte kardiotoksiske forbindelser13. Med impedansudlæsninger ved forskellige frekvenser (1-100 kHz) er det muligt at dissekere et fysiologisk respons yderligere, og dermed er det muligt at afsløre ændringer i membrantopografi, cellecelle- eller cellematrixkryds. Den yderligere EFP-registrering af humane iPSC-CM'er gør det yderligere muligt at analysere elektrofysiologiske virkninger fremkaldt ved sammensat behandling, som det blev vist i lyset af CiPA-undersøgelsen17,19.
I denne undersøgelse blev humane iPSC-CM'er anvendt, behandlet med epirubicin og doxorubicin, begge velbeskrevne som kardiotoksiske antracykliner, og erlotinib, en tyrosinkinasehæmmer (TKI) med en ret lav risiko for kardiovaskulær toksicitet. Kronisk vurdering med epirubicin, doxorubicin og erlotinib blev udført i 5 dage. Resultatet viser mindre ændringer i kontraktilitet og baseimpedans, når celler blev behandlet med erlotinib, men et tids- og dosisafhængigt toksisk fald i sammentrækningsamplitude og baseimpedans ved behandling med henholdsvis epirubicin og doxorubicin. Akutte målinger blev udført med calciumkanalblokker nifedipin og viser et fald i sammentrækningsamplitude, feltpotentiel varighed og baseimpedans, hvilket viser kardiotoksiske bivirkninger af denne forbindelse på funktionelle såvel som strukturelle niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Arbejdsprocessen for kontraktilitet og impedans/EFP-måling er vist i supplerende figur 2.
1. Pladebelægning
- Åbn den vakuumforseglede emballage, og tag 96-brøndspladen ud. Håndteringsprocedurer for 96-brøndsplader i begge moduler er de samme. Lad sammentrækningspladen være dækket af den yderligere medfølgende membranafskærmning indtil måling i kontraktilitetsmodulet.
- Overtræk de fleksible 96-brøndplader til såning af kardiomyocytter.
- Forbered en fortyndet EHS-gelbelægningsopløsning ved at overføre 2,75 ml brugsklar EHS-gelopløsning i et sterilt centrifugeglas. Tilsæt derefter 8,25 ml DPBS med Ca 2+ og Mg2+. Bland opløsningen omhyggeligt.
BEMÆRK: Eventuelt kan fibronectin også bruges til belægning af brøndene: Forbered 13 ml fibronectinbelægningsopløsning i et sterilt centrifugerør ved at fortynde 650 μL fibronectinstamopløsning (1 μg / ml) i 13 ml DPBS med Ca 2+ og Mg2+, hvilket resulterer i en 50 μg / ml arbejdsløsning. Bland opløsningen omhyggeligt.
- Forbered en fortyndet EHS-gelbelægningsopløsning ved at overføre 2,75 ml brugsklar EHS-gelopløsning i et sterilt centrifugeglas. Tilsæt derefter 8,25 ml DPBS med Ca 2+ og Mg2+. Bland opløsningen omhyggeligt.
- Overfør belægningsopløsningen til et sterilt reagensreservoir placeret i laboratorieautomatiseringsrobotten.
- Tilsæt 100 μL af belægningsopløsningen pr. brønd med laboratorieautomatiseringsrobotten ved hjælp af programmet "ADD100μL". Låget sættes tilbage på 96-brøndspladen og inkuberes i 3 timer ved 37 °C.
BEMÆRK: Programmet til laboratorieautomatiseringsrobotten skal forudindstilles manuelt på forhånd.
2. Såning af humane iPSC-afledte kardiomyocytter i fleksible plader med 96 brønde (dag 0)
- Optø cellerne i henhold til producentens retningslinjer.
- Tæl cellerne med et manuelt tællekammer, og juster cellerne i det anbefalede pletteringsmedium i henhold til celleproducentens instruktioner (f.eks. 1 x 105 celler / hul), hvilket resulterer i 11 x 106 celler / 11 ml til såning af en hel plade med 96 huller.
- Fjern EHS-gelopløsningen fra brøndene med laboratorieautomatiseringsrobotten ved hjælp af programmet "REMOVE100μL". Fjern reagensbeholderen, der indeholder den dispenserede belægningsopløsning, fra robotten.
- Overfør cellesuspensionen (11 ml i alt) til et sterilt reagensreservoir placeret i laboratorieautomatiseringsrobotten, og frø cellerne med 100 μL / brønd ved hjælp af programmet "CELLS_ADD100 μL".
- Umiddelbart efter cellesåning overføres den fleksible 96-brøndplade til inkubatoren (37 ° C, 5% CO2, fugtighedsreguleret) og lad cellerne slå sig ned natten over.
3. Medium udskiftning af fleksible 96-brøndsplader (dag 1)
- Mindst 22 ml kardiomyocytvedligeholdelsesmedium opvarmes pr. plade til 37 °C i et 50 ml centrifugeglas 18-24 timer efter podning af pladerne.
- Overfør det friske medium (mindst 22 ml) til et sterilt reagensreservoir, og lad det stå lige ved siden af laboratorieautomatiseringsrobotten. Placer et tomt reagensreservoir i robotten, og udfør fjernelse af medium med programmet "REMOVE100μL". Derefter udskiftes reagensbeholderen, der indeholder affaldsmediet, med reagensbeholderen, der indeholder det friske medium, og der dispenseres 200 μL af det friske medium pr. hul med programmet "ADD100μL". Udfør dette trin to gange for at nå 200 μL/brønd.
- Umiddelbart efter medium udveksling overføres pladen tilbage i inkubatoren.
- Udfør en medium udveksling (200 μL / hul) hver anden dag indtil sammensat tilsætning.
4. Endelig mediumudveksling før sammensat tilsætning (dag 5-7)
- Udfør en endelig medieændring 4-6 timer før sammensat tilsætning.
- Varm mindst 22 ml analysebuffer op til en fleksibel plade med 96 brønde. Assaybufferen består af vedligeholdelsessubstrat eller derivater heraf (f.eks. lav/ingen serummedier, phenolrøde frie medier eller andre isotoniske buffere).
- Overfør det friske medium til et sterilt reagensreservoir, og lad det stå lige ved siden af laboratorieautomatiseringsrobotten. Anbring en tom reagensbeholder i robotten, og udfør fjernelse af mediet. Derefter udskiftes reagensbeholderen, der indeholder affaldsmediet, med reagensbeholderen, der indeholder det friske medium, og der dispenseres 200 μL/hul af det friske medium.
- Umiddelbart efter medium udveksling overføres den fleksible plade tilbage i inkubatoren.
5. Sammensat addition og dataregistrering (dag 5-7)
BEMÆRK: Et eksempel på en måleplan for forsøget findes i supplerende figur 3.
- Forbered arbejdsløsning pr. forbindelse ved 4x koncentration i laminar flowhætten ved hjælp af en steril almindelig 96-dyb brøndplade. Den sammensatte opløsning er baseret på den analysebuffer, der anvendes i trin 4. Den 96 dybe brøndplade indeholdende den sammensatte opløsning overføres i mindst 1 time til inkubatoren for at justere den til samme tilstand som den fleksible plade.
BEMÆRK: 1x koncentrationen af hvert lægemiddel, der anvendes til hvert eksperiment, er angivet i figurerne og legenderne. - Pladen overføres til den respektive måleenhed 1 time, før der udføres en basislinjemåling.
- Åbn Rediger protokol i kontrolsoftwaren (en del af hybridcelleanalysesystemet), og vælg den respektive måletilstands kontraktilitet eller impedans / EFP.
- Definer fejevarigheden (længden af en måling; f.eks. 30 s) og gentagelsesintervallet (tid mellem målinger; f.eks. 5 min), og gem protokolnummeret.
- Vælg Start protokol > Fortsæt , og udfyld de ønskede felter.
- Til sidst skal du vælge Start måling. Udfør mindst tre baselinemålinger (sweeps) i intervaller på 5 minutter kort før tilsætning af forbindelse.
BEMÆRK: Eksempeldata for en baselinemåling af kontraktilitet ved hjælp af kontraktilitetsmodulet før tilsætning af forbindelser er vist i supplerende figur 4 - 50 μL af analysebufferen fjernes fra hvert hul uden at fjerne den fleksible 96-brøndsplade fra måleenheden.
- Der tilsættes 50 μL af den 4x koncentrerede blandingsopløsning i hvert hul på pladen i overensstemmelse med måleplanen.
- Vælg Tilføj områdemarkør, og definer layoutet af den sammensatte plade og volumenet af den sammensatte opløsning efter tilsætning af forbindelse.
- Til sidst skal du vælge Fortsæt med standardmåling eller Fortsæt med måleserier i henhold til forsøgsplanen.
6. Analyse af data
- Med optagelsessoftware måles fejninger, hvis længde og gentagelsesinterval defineres af brugeren.
- Med analysesoftware kan du fange signalets form ved automatisk at læse parametre som amplitude, slaghastighed, pulsbredde osv.
BEMÆRK: Et gennemsnitligt signal inklusive standardafvigelsen, det såkaldte middelslag, beregnes automatisk baseret på dataene for et feje. Brugeren kan definere kontraktilitets-/IMP/EFP-parametrene, som softwaren beregner og viser. - Med analysesoftware beregnes dosis-responskurven og IC50/EC50 for hver forbindelse.
BEMÆRK: De rå data og analyseresultaterne, der genereres med analysesoftwaren, kan nemt eksporteres i en række forskellige formater. Endelig genereres datarapporterne automatisk for at opsummere og arkivere de eksperimentelle resultater. En omfattende beskrivelse af, hvad og hvordan et EFP-signal måles, diskuteres i 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Virkningen af kinasehæmmer erlotinib på kontraktiliteten af hiPSC-CM'er er vist i figur 1. Cellerne blev behandlet med koncentrationer fra 10 nM til 10 μM i 5 dage, og slagparametre blev registreret dagligt. Erlotinib, en EGFR (epidermal vækstfaktorreceptor) og tyrosinkinasehæmmer med en sammenlignelig lav risiko for kardiotoksicitet, havde kun en mindre dosis og tidsafhængig virkning på hiPSC-CM'er ved koncentrationer i mikromolært område. Ved den laveste koncentration (10 nM) inducerede erlotinib et statistisk insignifikant fald i amplitude ved den første måling efter sammensat applikation (1 time). I alle efterfølgende målinger blev der ikke målt nogen sammenlignelig effekt ved denne koncentration. Det forbigående fald kan være resultatet af en sammensat effekt, men også resultatet af en forbigående forvrængning af slagmønsteret under den sammensatte additionsprocedure, for eksempel af termisk eller mekanisk art. Mikromolære koncentrationer af erlotinib viste lette, men signifikante tids- og dosisafhængige kardiotoksiske virkninger. Virkningen indtrådte fra 96 timer med 1 μM erlotinib, mens 10 μM resulterede i et signifikant fald kun 24 timer efter sammensat tilsætning.
Kemoterapimiddel epirubicin havde både en tids- og dosisafhængig virkning på hiPSC-CM'er (figur 2). Cellerne ophørte med at slå inden for 24 timer efter påføring af 10 μM epirubicin. Med 1 μM blev et drastisk fald i amplitude til 44% ± 2% af kontrollen efter 24 timer efterfulgt af fuldstændig beatstop indtil 48 timer efter sammensat tilsætning. Ved 100 nM blev der observeret et tidsafhængigt fald i slagamplitude over en periode på 5 dage med en restamplitude på 25% ± 3% på dag 5. Ved den laveste koncentration på 10 nM var virkningen af epirubicin kun dosisafhængig, men ikke tidsafhængig, startende ved den første måling (1 time efter sammensat tilsætning). Amplituden svingede støt mellem 60% -80% af kontrollen over en periode på 5 dage. Afvigelserne i denne gruppe var større sammenlignet med de højere koncentrationer. En mulig årsag kunne være, at denne koncentration kun havde en målbar effekt på en del af brøndene.
Doxorubicin er en anden antracyklinklasse af medicin, og cellevitaliteten af hiPSC-CM'er blev undersøgt ved at overvåge baseimpedansen over tid. Figur 3 viser, at en 24 timers eksponering for 300, 1, 3 og 10 μM doxorubicin nedsætter cellelevedygtigheden på en koncentrations- og tidsafhængig måde.
Nifedpinie er en dihydropyridin calciumkanalblokker, der primært blokerer L-type calciumkanaler. Langtidsovervågning over 24 timers cellelevedygtighed afslører et tids- og koncentrationsafhængigt fald i baseimpedans, der anvendes som et mål for toksicitet (figur 4A). Ved anvendelse af stigende nifedipinkoncentrationer (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM) viser feltpotentialeregistreringer på hiPSC-CM'er en koncentrationsafhængig forkortelse af feltvarigheden normaliseret (FPD) som forventet (figur 4B,C). Nifedipinvurdering vedrørende hjertekontraktilitet viste også et signifikant koncentrationsafhængigt amplitudefald ved akut måling med 10 nM og 30 nM koncentrationer (figur 5).
Resultaterne opnået med hybridcelleanalysesystemet viser, at tre hjerteendepunkter (kontraktilitet, struktur og elektrofysiologi) af hiPSC-CM'er kan vurderes ved hjælp af et system.
Figur 1: Kontraktilitetsvurdering af humane iPSC-afledte kardiomyocytter behandlet med erlotinib i 5 dage. X-aksen viser tid i timer, y-aksen afbilder parameteramplitude i procent. Stjerner repræsenterer statistisk signifikans med p < 0,05 (*) eller p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kontraktilitetsvurdering af humane iPSC-afledte kardiomyocytter behandlet med kardiotoksisk antracyklinepirubicin over 5 dage. X-aksen viser tid i timer, y-aksen afbilder parameteramplitude i procent. Stjerner repræsenterer statistisk signifikans med p < 0,05 (*) eller p < 0. 01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Baseimpedans af humane iPSC-afledte kardiomyocytter efter doxorubicinbehandling. Tidsforløb for baseimpedans af humane iPSC-afledte kardiomyocytter for 24 timers eksponering for 300, 1, 3 og 10 μM doxorubicin (n = 5). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Impedans- og EFP-optagelser af humane iPSC-afledte kardiomyocytter. A) Tidsforløb for baseimpedansen af humane iPSC-afledte kardiomyocytter i 24 timer efter eksponering for 3, 10, 30 og 100 nM nifedipin (n = 5). B) Tidsforløb for feltpotentialvarigheden af humane iPSC-afledte kardiomyocytter i 1 time efter eksponering for 3, 10, 30 og 100 nM nifedipin (n = 5). C) Elektrodelayout af impedans/EFP-pladen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Kontraktilitetsvurdering (kontraktilitetsmodul) af humane iPSC-afledte kardiomyocytter behandlet med nifedipin i 20 min. X-aksen viser tid i min, Y-aksen plotter parameteramplitude i procent. Stjerner repræsenterer statistisk signifikans med p < 0. 05 (*) eller p < 0,01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney-test, n = 4). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Kontraktilitetsparametre og rådata vurderet med kontraktilitetsmodulet. (Venstre) Parametre vurderet med kontraktilitetsmodulet. Parametre: Amplitude af kontraktionskraft (mN/mm2), slagvarighed, op- og nedslagshastighed, opslag og nedslagområde under kurve (AUC), slaghastighed, variationer i slaghastighed, arytmiske hændelser. (Højre) Kontraktilitet rå dataoptagelser af en brønd med ubehandlet kardiomyocyt (A) slaghastighed, (B) slaghastighedsvariationer, (C) tidligt efter sammentrækninger og (D) arytmiske hændelser. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Arbejdsproces for kontraktilitet og impedans/EFP-måling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Eksempel på layout af en måleplan for en 96-brønds plade. Fire forbindelser (fremhævet i rød, lysegrøn, brun og mørkegrøn) med fire koncentrationer og fire replikater er afbildet. Positive og negative kontroller (f.eks. prækulturbetingelser og DMSO) fremhæves med gult. Backupceller er fremhævet med blåt. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4: Eksempeldata for en baselinemåling af kontraktilitet ved hjælp af kontraktilitetsmodulet før tilsætning af forbindelser. I hvert diagram er gennemsnittet af alle sammentrækningscyklusser for et feje afbildet. For at visualisere slaghastigheden vises to på hinanden følgende sammentrækninger. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Impedans/EFP/kontraktilitetshybridsystemet er en omfattende metode til sikkerhed, farmakologisk og toksikologisk vurdering af hjerteansvar for præklinisk lægemiddeludvikling med høj kapacitet. Det giver en moderne tilgang til præklinisk sikkerhedstest uden brug af dyremodeller, men med højere gennemløbskapacitet, der reducerer tid og omkostninger betydeligt. Dette system har potentiale til at blive brugt som en komplementær tilgang til Langendorff Heart og andre dyremodeller til præklinisk funktionel og strukturel toksicitetsvurdering.
Som en dyrefri tilgang anvendes humane iPSC-CM'er til hybridsystemet20. Her giver de specielle fleksible plader med 96 brønde med pro-modningseffekt på humane iPSC-CM'er en vigtig fordel sammenlignet med andre cellebaserede assays21,22, da gennemstrømning og et fysiologisk miljø kombineres unikt til mere voksenlignende human hjerterisikovurdering 6,15.
Det mest kritiske trin i protokollen er anvendelsen af forbindelsen, især når akutte virkninger skal undersøges. Da cellerne dyrkes på bløde substrater, der leder mekaniske kræfter, kan overdreven acceleration under pladehåndtering og anvendelse af forskydningskræfter under pipettering resultere i forbigående (5-10 min) ændringer af sammentrækningsparametrene og bør undgås. Generelt skal man være forsigtig under medieudskiftninger for at undgå forstyrrelse af membranerne. Brug af laboratorieautomatiseringsudstyr anbefales.
Før den sammensatte analyse udføres, kræves et prækulturtrin på 5-7 dage, således at humane iPSC-CM'er, der normalt erhverves i en kryokonserveret tilstand, kan komme sig efter optøningsproceduren og opbygge et korrekt syncytium. For begge moduler giver sammentrækningsamplituden såvel som slaghastigheden indsigt i det ideelle udgangspunkt for målingen, der normalt finder sted mellem dag 5-7. Baselinemålingen er et kritisk skridt til at identificere funktionelle baseline-egenskaber, der anvendes som inklusionskriterier for de undersøgte hiPSC-CM'er3. Baselineværdierne skal registreres lige før sammensat behandling, så ændringer i sammentrækningsadfærd kan sammenlignes med ikke-behandlingsmæssige tilstande (supplerende figur 3).
Regnskab for variabiliteter og definerede baselinekarakteristika er nøglen til vellykkede målinger af hiPSC-CM og datafortolkning. Af denne grund følges anbefalinger om bedste praksis fra Gintant et al. ved hjælp af hybridcelleanalysesystemet; For eksempel skal baseline registreres før den sammensatte tilsætning, og baseline-registreringen skal opfylde visse forudsætninger3.
Selvom de fleksible 96-brøndsplader er udstyret med skrøbelige membraner, forhindrer en medfølgende beskyttelsesplade i kombination med forsigtig håndtering skader. Membranerne forbehandles for at muliggøre stabil fastgørelse af celler til silikonesubstratet, som har lav iboende biokompatibilitet. Behandlingen er stabil i mindst 6 måneder. Mens cellerne konstant holdes på 37 °C, er silikonematerialernes mekaniske egenskaber stabile over et bredt temperaturområde. Derudover påvirker hverken lægemidler eller opløsningsmidler silikonens egenskaber ved koncentrationer, der anvendes i cellebaserede assays (f.eks. DMSO-koncentrationer forbliver under 0,1%).
Systemet blev valideret og optimeret med en bred vifte af kommercielt tilgængelige hiPSC-CM'er. Ved anvendelse af specialfremstillede celler anbefales det at teste standard ekstracellulære matrixproteiner (ECM) for optimal cellebinding (f.eks. fibronectin, EHS-matrix og poly-L-lysin 6,15).
Elektrofysiologi, calciumsignalering og kontraktilitet er de tre vigtigste hjerteendepunkter, der behandles i præklinisk udvikling. Hybridsystemet er i øjeblikket begrænset til at analysere to af disse hjerteendepunkter - kontraktilitet og elektrofysiologi. Calciumsignalering i kardiomyocytter kan ikke analyseres direkte, men detekteres tangentielt via kontraktilitet og elektrofysiologiske egenskaber.
Både impedans/EFP samt måling af sammentrækningskraft udføres med monolag af kardiomyocytter. På trods af fordelen ved en fysiologisk mekanisk substratstivhed under sammentrækningsmåling oplever cellerne ikke det tredimensionelle miljø af ægte humant væv. På den anden side tillader dette kun brugen af en brøkdel af de dyre stamcelleafledte cellemodeller med standard laboratorieudstyr. Derfor lover denne applikation at have et gunstigt forhold mellem omkostninger, robusthed og forudsigelighed sammenlignet med in vivo / ex vivo eller 3D-modeller. Fremtidige anvendelser af hybridsystemet kan omfatte analyse af andre kontraktile celletyper såsom glatte muskelceller. I reguleringen af kardiovaskulær homeostase spiller disse celler en vigtig rolle som modstykker af kardiomyocytter. Hybridsystemet giver også tilføjelser til specifikke projekter, såsom optisk stimulering af humane iPSC-CM'er. Til dette formål kan et dedikeret optisk låg påføres begge moduler til stimulering af humane iPSC-CM'er, der blev transfekteret med Channelrhodopsin-2 i prækulturtider.
Således giver impedans / EFP / kontraktilitetshybridsystemet mulighed for moderne præklinisk sikkerheds- og toksicitetsvurdering ved at analysere tre forskellige hjerteendepunkter (kontraktilitet, strukturelle ændringer og elektrofysiologi) inden for en metode. Fordelen ved at adressere disse endepunkter med en menneskebaseret hjertecellemodel på et højt gennemløbsniveau løfter dette hybridsystem ud over de nuværende perspektiver for præklinisk hjerterisikovurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go. og P.L. er ansat hos innoVitro GmbH, der fremstiller de fleksible plader. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. og SS er ansat hos Nanion Technologies GmbH, producenten af hybridenheden.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra det tyske forbundsministerium for økonomi og klima (ZIM) og fra det tyske forbundsministerium for uddannelse og forskning (KMUinnovativ). Vi takker FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, USA) for venligt at levere kardiomyocytter og Ncardia BV (Leiden, Holland) for venligt at levere kardiomyocytter, der anvendes i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
