Summary
ניתוח השינויים בתפקוד ההתכווצות ובשלמות התאים של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC אנושי הוא בעל חשיבות עצומה לפיתוח תרופות לא קליניות. מערכת היברידית של 96 תאים מטפלת בשני הפרמטרים בזמן אמת ובאופן פיזיולוגי לקבלת תוצאות אמינות ורלוונטיות לבני אדם, הנחוצות למעבר בטוח לשלבים קליניים.
Abstract
הערכת התכווצות הלב היא בעלת חשיבות עצומה לפיתוח טיפולים חדשים ומעברם הבטוח לשלבים קליניים. בעוד שקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) מבטיחים לשמש כמודל רלוונטי לאדם בשלבים פרה-קליניים של גילוי תרופות ופרמקולוגיה בטיחותית, בגרותם עדיין שנויה במחלוקת בקהילה המדעית ובפיתוח מתמיד. אנו מציגים טכנולוגיית התכווצות היברידית ועכבה/פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP), ומוסיפים תכונות פרו-התבגרות משמעותיות לפלטפורמה 96-well-well בתקן התעשייה.
מערכת העכבה/EFP מנטרת את הפונקציונליות התאית בזמן אמת. מלבד קצב הפעימה של תאים מתכווצים, קריאות ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית מזהות שינויים מורפולוגיים הנגרמים על-ידי תרכובת, כמו צפיפות התאים ותקינות המונו-שכבתי התאית. במרכיב השני של מערכת ניתוח התאים ההיברידית, התאים מגודלים בתרבית על גבי ממברנות תואמות ביולוגית המחקות את הסביבה המכנית של רקמת לב אמיתית. סביבה פיזיולוגית זו תומכת בהבשלה של hiPSC-CMs במבחנה, מה שמוביל לתגובות התכווצות דמויות מבוגרים יותר, כולל השפעות אינוטרופיות חיוביות לאחר טיפול באיזופרוטרנול, S-Bay K8644 או omecamtiv mecarbil. פרמטרים כגון משרעת כוח הכיווץ (mN/mm2) ומשך הפעימה חושפים גם הם השפעות במורד הזרם של תרכובות בעלות השפעה על תכונות אלקטרופיזיולוגיות וטיפול בסידן.
המערכת ההיברידית מספקת את הכלי האידיאלי לניתוח תאים הוליסטי, ומאפשרת הערכת סיכון לבבי פרה-קלינית מעבר לפרספקטיבות הנוכחיות של מבחנים מבוססי תאים רלוונטיים לבני אדם.
Introduction
אחת המטרות העיקריות של פיתוח תרופות מודרניות היא שיפור שיעור ההצלחה מספסל למיטה של טיפולים חדשים בצנרת גילוי התרופות. בדיקות פרמקולוגיות בטיחותיות של תרופות חדשות אלה מגלות לעתים קרובות תגובות שליליות של תרופות במערכת הלב וכלי הדם, המהוות כמעט רבע משיעור ההתשה של התרופה בשלבים פרה-קליניים1. הפיתוח והאינטגרציה של מתודולוגיות גישה חדשות (NAMs) ממלאים תפקיד מפתח במודרניזציה של הערכה פרה-קלינית, במיוחד איברי סוללות ליבה כמו הלב. מאחר שמתודולוגיות אלה הן גישות נטולות בעלי חיים, השימוש במודלים של תאים מבוססי אדם כמו קרדיומיוציטים (CMs) ממוצא תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) הפך לסוס העבודה בעשור האחרון עבור ההערכה המודרנית של סוגיות פרמקולוגיות וטוקסיקולוגיות בטיחותיות2. מערכות בדיקה הנמצאות בשימוש נרחב עבור חקירות כאלה הן מערך מיקרואלקטרודות (MEA) וגישות ניסיוניות מבוססות צבע רגישות למתח3.
אף על פי כן, חוסר הבשלות הפנוטיפית והתפקודית הנטענת של סוג תא זה מציב מכשולים בדרכו של מודל תא אידיאלי המבוסס על בני אדם, עם פוטנציאל לצמצם פערים תרגומיים בין מחקרים לא קליניים וקליניים4.
מחקר עצום נערך לאורך השנים כדי להבין את הסיבה לפנוטיפ הלא בוגר המשתמע ולמצוא דרכים לדחוף את תהליך ההבשלה של iPSC-CMs אנושיים במבחנה.
בהיעדר רמזי התבגרות לבביים כגון זמני תרבית תאים ממושכים, היעדר סוגי תאים אחרים בסביבה או היעדר גירוי הורמונלי הודגם כמשפיעים על תהליך ההבשלה5. כמו כן, הסביבה הלא פיזיולוגית של צלחות תרבית תאים רגילות זוהתה כגורם משמעותי המעכב את ההבשלה של iPSC-CMs אנושיים, בשל נוקשות המצע הפיזיולוגי החסר של הלב האנושי המקומי 5,6.
מערכות בדיקה שונות עם דגש על תנאים פיזיולוגיים מקומיים פותחו כדי להתמודד עם בעיה זו, כולל מערכות תרבית תאים תלת-ממדיות שבהן התאים מיושרים באופן תלת-ממדי כדי להידמות לארכיטקטורת הלב המקומית במקום לתרביות תאים דו-ממדיות טיפוסיות7. למרות שהתבגרות משופרת מתקבלת באמצעות בדיקות תלת-ממדיות, הצורך בכוח עבודה מיומן והתפוקה הנמוכה של מערכות אלה מעכבים שימוש רב בכך בתהליך פיתוח התרופות, שכן הזמן והעלות ממלאים תפקיד בסיסי בהערכת טיפולים חדשים ברמה הפיננסית8.
קריאות חשובות להערכה פרמקולוגית וטוקסיקולוגית בטיחותית של טיפולים חדשים הן שינויים במאפיינים תפקודיים ומבניים של iPSC-CMs אנושיים, שכן תגובות שליליות הנגרמות על ידי תרכובות של מערכת הלב וכלי הדם משפיעות בדרך כלל על אחד או שניהם ממאפיינים אלה 1,9. דוגמאות ידועות לתגובות שליליות רחבות כאלה הן תרופות אנטי סרטניות ממשפחת האנתרציקלין. כאן, השפעות תפקודיות ומבניות שליליות מסוכנות על מערכת הלב וכלי הדם מדווחות באופן נרחב במהלך ואחרי טיפול בסרטן בחולים, כמו גם עם בדיקות מבוססות תאי מבחנה 10,11.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה להערכת תופעות לוואי של תרכובות פונקציונליות ומבניות על hiPSC-CMs. המתודולוגיה כוללת ניתוח של כוח התכווצות קרדיומיוציטים וניתוח עכבה / פוטנציאל שדה חוץ-תאי (EFP). כוח ההתכווצות נמדד בתנאים מכניים פיזיולוגיים, כאשר התאים מתרבית על מצעי סיליקון רכים (33 kPa), המשקפים את הסביבה המכנית של רקמת הלב האנושית המקומית.
המערכת מצוידת בלוחות 96 באר לניתוח תפוקה גבוהה של iPSC-CMs אנושיים למחקרים פרמקולוגיים וטוקסיקולוגיים פרה-קליניים לבטיחות לב, ובכך מספקת יתרון לגישות תלת-ממדיות המשמשות כיום כמו לנגנדורף לב או פרוסות לב12,13.
בפירוט, המערכת ההיברידית מורכבת משני מודולים, או להערכת התכווצות הלב בתנאים פיזיולוגיים או לניתוח רעילות מבנית תאית בזמן אמת 6,14. שני המודולים עובדים עם לוחות מיוחדים בעלי תפוקה גבוהה של 96 בארות להשגת נתונים מהירה וחסכונית.
ללא צורך במבנה תלת-ממדי, מודול ההתכווצות משתמש בלוחות מיוחדים המכילים קרומי סיליקון גמישים כמצע לתאים במקום הזכוכית הנוקשה או הפלסטיק שמהם מורכבות בדרך כלל לוחות תרבית תאים רגילים. הממברנות משקפות תכונות לב ביומכניות אנושיות טיפוסיות ולכן מחקות תנאי in vivo באופן בעל תפוקה גבוהה. בעוד ש-iPSC-CMs אנושיים נכשלים לעתים קרובות בהצגת התנהגות קרדיומיוציטים של מבוגרים בנוגע לאינוטרופיה חיובית הנגרמת על-ידי תרכובות במבחנים אחרים המבוססים על תאים14, ניתן להעריך תגובה דמוית מבוגר יותר כאשר התאים מתרבית על הלוחות של מודול ההתכווצות. במחקרים קודמים, הוכח כי iPSC-CMs מציגים השפעות אינוטרופיות חיוביות על טיפול בתרכובות כגון איזופרוטרנול, S-Bay K8644, או omecamtiv mecarbil 6,15. כאן ניתן להעריך פרמטרים רבים של התכווצות, כגון פרמטרים ראשוניים כמו משרעת כוח הכיווץ (mN/mm2), משך פעימה וקצב פעימה, כמו גם פרמטרים משניים של מחזור הכיווץ כמו שטח מתחת לעקומה, מדרונות כיווץ והרפיה, וריאציות קצב פעימה והפרעות קצב (איור משלים 1)16 . שינויים הנגרמים על ידי תרופות בכל הפרמטרים מוערכים באופן לא פולשני על ידי חישת מרחק קיבולית. הנתונים הגולמיים מנותחים לאחר מכן על ידי תוכנה מיוחדת.
מודול הרעילות המבנית מוסיף את העכבה הייחודית שלו ואת פרמטרי EFP כקריאה לרעילות תאית מבנית ולניתוח תכונות אלקטרופיזיולוגיות17,18. טכנולוגיית ספקטרוסקופיית העכבה החשמלית חושפת שינויים המושרים על-ידי תרכובות בצפיפות התא או בתקינות התא והחד-שכבתית המנוטרים בזמן אמת, כפי שמוצג עם iPSC-CMs אנושיים שטופלו בתרכובות קרדיוטוקסיות ידועות13. עם קריאות עכבה בתדרים שונים (1-100 קילוהרץ) ניתן לנתח תגובה פיזיולוגית נוספת, וכך ניתן להשיג שינויים בטופוגרפיה של הממברנה, תא-תא או צמתים של מטריצת תא. הקלטת ה-EFP הנוספת של iPSC-CMs אנושיים מאפשרת גם ניתוח של השפעות אלקטרופיזיולוגיות הנגרמות על ידי טיפול תרכובת, כפי שהוכח לאור מחקר CiPA17,19.
במחקר הנוכחי נעשה שימוש ב-iPSC-CMs אנושיים, שטופלו באפירוביצין ודוקסורוביצין, שניהם מתוארים היטב כאנתרציקלין קרדיוטוקסי, וארלוטיניב, מעכב טירוזין קינאז (TKI) עם סיכון נמוך למדי לרעילות לב וכלי דם. הערכה כרונית עם אפירוביצין, דוקסורוביצין וארלוטיניב בוצעה במשך 5 ימים. התוצאה מראה שינויים קלים בהתכווצות ובעכבת הבסיס כאשר תאים טופלו בארלוטיניב, אך ירידה רעילה תלוית זמן ומינון במשרעת ההתכווצות ובעכבת הבסיס כאשר טופלו באפירוביצין ודוקסורוביצין בהתאמה. מדידות חריפות בוצעו עם חוסם תעלות הסידן ניפדיפין והראו ירידה באמפליטודת הכיווץ, משך פוטנציאל השדה ועכבת הבסיס, מה שהדגים תופעות לוואי קרדיוטוקסיות של תרכובת זו ברמה התפקודית כמו גם המבנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: זרימת העבודה למדידת כיווץ ועכבה/EFP ניתנת באיור משלים 2.
1. ציפוי צלחת
- פתחו את האריזה האטומה בוואקום והוציאו את צלחת 96 הבארות. נהלי הטיפול בלוחות 96 בארות של שני המודולים זהים. השאירו את לוחית הכיווץ מכוסה על ידי מגן הממברנה המסופק בנוסף עד למדידה במודול ההתכווצות.
- מצפים את הצלחות הגמישות של 96 באר לזריעת קרדיומיוציטים.
- הכן תמיסת ציפוי ג'ל EHS מדוללת על ידי העברת 2.75 מ"ל של תמיסה מוכנה לשימוש בג'ל EHS בצינור צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן הוסיפו 8.25 מ"ל של DPBS עם Ca 2+ ו-Mg2+. מערבבים את הפתרון בזהירות.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בפיברונקטין גם לציפוי הבארות: הכן תמיסת ציפוי פיברונקטין בגודל 13 מ"ל בצינור צנטריפוגה סטרילי על ידי דילול 650 μL של תמיסת מלאי פיברונקטין (1 מיקרוגרם/מ"ל) ב-13 מ"ל של DPBS עם Ca 2+ ו-Mg2+, וכתוצאה מכך תמיסת עבודה של 50 מיקרוגרם/מ"ל. מערבבים את הפתרון בזהירות.
- הכן תמיסת ציפוי ג'ל EHS מדוללת על ידי העברת 2.75 מ"ל של תמיסה מוכנה לשימוש בג'ל EHS בצינור צנטריפוגה סטרילי. לאחר מכן הוסיפו 8.25 מ"ל של DPBS עם Ca 2+ ו-Mg2+. מערבבים את הפתרון בזהירות.
- העבירו את תמיסת הציפוי למאגר ריאגנטים סטרילי המוצב ברובוט האוטומציה של המעבדה.
- הוסף 100 μL של פתרון הציפוי לכל באר עם רובוט אוטומציה במעבדה באמצעות התוכנית "ADD100μL". החזירו את המכסה לצלחת 96 הבארות ודגרו במשך 3 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: התוכנית עבור רובוט האוטומציה של המעבדה צריכה להיות מוגדרת מראש באופן ידני מראש.
2. זריעה של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי לצלחות גמישות של 96 בארות (יום 0)
- הפשרת התאים בהתאם להנחיות היצרן.
- ספרו את התאים באמצעות תא ספירה ידני והתאימו את התאים במדיום הציפוי המומלץ בהתאם להוראות יצרן התאים (למשל, 1 x 105 תאים /באר), וכתוצאה מכך 11 x 106 תאים / 11 מ"ל לזריעת צלחת שלמה של 96 בארות.
- הסר את תמיסת הג'ל EHS מהבארות באמצעות רובוט האוטומציה של המעבדה באמצעות התוכנית "REMOVE100μL". הסר את מאגר הריאגנטים המכיל את תמיסת הציפוי המחולקת מהרובוט.
- העבירו את מתלה התאים (11 מ"ל בסך הכל) למאגר ריאגנטים סטרילי הממוקם ברובוט האוטומציה של המעבדה וזרעו את התאים עם 100 μL/well באמצעות התוכנית "CELLS_ADD100 μL".
- מיד לאחר זריעת התאים, העבירו את צלחת 96 הבאר הגמישה לתוך האינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, מבוקר לחות) ותנו לתאים לשקוע בן לילה.
3. החלפה בינונית של צלחות 96-באר גמישות (יום 1)
- מחממים לפחות 22 מ"ל של תחזוקת קרדיומיוציטים בינוניים לצלחת ל-37 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל, 18-24 שעות לאחר זריעת הצלחות.
- העבירו את המדיום הטרי (לפחות 22 מ"ל) למאגר ריאגנטים סטרילי והשאירו אותו ממש ליד רובוט האוטומציה של המעבדה. מניחים מאגר ריאגנטים ריק ברובוט ומבצעים הסרה בינונית עם התוכנית "REMOVE100μL". לאחר מכן, החליפו את מאגר הריאגנטים המכיל את מדיום הפסולת עם מאגר הריאגנטים המכיל את המדיום הטרי וחלקו 200 מיקרוליטר של המדיום הטרי לבאר עם התוכנית "ADD100μL". בצע שלב זה פעמיים כדי להגיע ל-200 μL/well.
- מיד לאחר חילופי בינוני, להעביר את הצלחת בחזרה לתוך האינקובטור.
- יש לבצע החלפה בינונית (200 μL/well) אחת ליומיים עד להוספת התרכובת.
4. החלפה בינונית סופית לפני תוספת המתחם (יום 5-7)
- יש לבצע שינוי בינוני סופי 4-6 שעות לפני הוספת התרכובת.
- יש לחמם לפחות 22 מ"ל של חיץ בדיקה עבור צלחת גמישה אחת של 96 בארות. מאגר הבדיקה מורכב מאמצעי תחזוקה או נגזרות שלו (לדוגמה, מדיה נמוכה /ללא סרום, מדיה חופשית אדומה פנול או מאגרים איזוטוניים אחרים).
- מעבירים את המדיום הטרי למאגר ריאגנטים סטרילי ומשאירים אותו ממש ליד רובוט האוטומציה של המעבדה. מניחים מאגר ריאגנטים ריק ברובוט ומבצעים הסרה בינונית. לאחר מכן, החליפו את מאגר הריאגנטים המכיל את מדיום הפסולת עם מאגר הריאגנטים המכיל את המדיום הטרי וחלקו 200 μL/well של המדיום הטרי.
- מיד לאחר חילופי בינוני, להעביר את הצלחת הגמישה בחזרה לתוך האינקובטור.
5. תוספת מורכבת ורישום נתונים (יום 5-7)
הערה: תוכנית מדידה לדוגמה לניסוי ניתנת באיור משלים 3.
- הכינו תמיסת עבודה לכל תרכובת בריכוז של פי 4 במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית באמצעות צלחת קידוח סטרילית רגילה בעומק 96. הפתרון המורכב מבוסס על מאגר הבדיקה המשמש בשלב 4. מעבירים את צלחת הבאר בעומק 96 המכילה את התמיסה המורכבת למשך שעה אחת לפחות לתוך האינקובטור כדי להתאים אותה לאותו מצב כמו הלוח הגמיש.
הערה: הריכוז הגבוה פי 1 של כל תרופה המשמשת לכל ניסוי מסופק באיורים ובאגדות. - העבר את הלוחית למכשיר המדידה המתאים שעה אחת לפני ביצוע מדידה בסיסית.
- פתח את Edit Protocol בתוכנת הבקרה (חלק ממערכת ניתוח התאים ההיברידית) ובחר את מצב המדידה המתאים כיווץ או עכבה/EFP.
- הגדר את משך הטאטוא (אורך של מדידה אחת; לדוגמה, 30 שניות) ואת מרווח החזרה (זמן בין מדידות; למשל, 5 דקות) ושמור את מספר הפרוטוקול.
- בחר התחל פרוטוקול > המשך ומלא את השדות המבוקשים.
- לבסוף, בחר התחל מדידה. בצע לפחות שלוש מדידות בסיסיות (טאטוא) במרווחים של 5 דקות זמן קצר לפני הוספת התרכובת.
הערה: נתונים לדוגמה של מדידת בסיס של התכווצות באמצעות מודול ההתכווצות לפני תוספת מורכבת מתוארת באיור משלים 4 - הסר 50 μL של מאגר הבדיקה מכל באר מבלי להסיר את צלחת 96 הבאר הגמישה ממכשיר המדידה.
- הוסף 50 μL של תמיסת תרכובת מרוכזת פי 4 לכל באר של הצלחת, על פי תוכנית המדידה.
- בחר הוסף סמן אזור והגדר את פריסת הלוח המורכב ואת עוצמת הקול של התמיסה המורכבת לאחר הוספת המורכבת.
- לבסוף, בחר המשך עם מדידה סטנדרטית או המשך עם סדרות מדידה בהתאם לתוכנית הניסוי.
6. ניתוח נתונים
- עם תוכנת הקלטה, למדוד גורף, שאורכו ומרווח החזרה שלו מוגדרים על ידי המשתמש.
- באמצעות תוכנת ניתוח, לכוד את צורת האות על ידי קריאת פרמטרים כמו משרעת, קצב פעימה, רוחב פולס וכן הלאה, באופן אוטומטי.
הערה: אות ממוצע הכולל את סטיית התקן, מה שמכונה פעימה ממוצעת, מחושב באופן אוטומטי בהתבסס על הנתונים של מטאטא אחד. המשתמש יכול להגדיר את הפרמטרים של התכווצות/IMP/EFP שהתוכנה מחשבת ומציגת. - בעזרת תוכנת ניתוח מחשבים את עקומת המינון-תגובה ואת IC50/EC50 עבור כל תרכובת.
הערה: הנתונים הגולמיים ותוצאות הניתוח שנוצרו באמצעות תוכנת הניתוח ניתנים לייצוא בקלות במגוון פורמטים. לבסוף, דוחות הנתונים נוצרים באופן אוטומטי כדי לסכם ולאחסן בארכיון את תוצאות הניסוי. תיאור מקיף של מה וכיצד נמדד אות EFP נדון ב 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההשפעות של מעכב קינאז ארלוטיניב על ההתכווצות של hiPSC-CMs מוצגות באיור 1. התאים טופלו בריכוזים שנעו בין 10 ננומטר ל-10 מיקרומטר במשך 5 ימים ונרשמו פרמטרים של פעימות מדי יום. לארלוטיניב, EGFR (קולטן גורם גדילה אפידרמלי) ומעכב טירוזין קינאז עם סיכון נמוך יחסית לקרדיוטוקסיות, הייתה השפעה מינורית ותלוית זמן על hiPSC-CMs רק בריכוזים בטווח המיקרומולרי. בריכוז הנמוך ביותר (10 ננומטר), ארלוטיניב גרם לירידה חסרת משמעות סטטיסטית באמפליטודה במדידה הראשונה לאחר יישום תרכובת (1 שעות). בכל המדידות הבאות לא נמדדה השפעה דומה בריכוז זה. הירידה החולפת יכולה להיות תוצאה של אפקט מורכב, אך גם תוצאה של עיוות חולף של תבנית הפעימה במהלך הליך התוספת המורכבת, למשל, בעל אופי תרמי או מכני. ריכוזים מיקרומולאריים של ארלוטיניב הראו השפעות קרדיוטוקסיות קלות אך משמעותיות ותלויות מינון. הופעת ההשפעה נצפתה מ 96 שעות עם 1 μM erlotinib, בעוד 10 μM הביא לירידה משמעותית רק 24 שעות לאחר תוספת תרכובת.
לסוכן הכימותרפיה אפירוביצין הייתה השפעה תלוית זמן ומינון על hiPSC-CMs (איור 2). התאים הפסיקו לפעום תוך 24 שעות לאחר יישום של 10 μM epirubicin. עם 1 μM, ירידה דרסטית באמפליטודה ל 44% ± 2% של שליטה לאחר 24 שעות ואחריו הפסקה מוחלטת פעימה עד 48 שעות לאחר תוספת תרכובת. ב-100 ננומטר נצפתה ירידה תלוית זמן באמפליטודת פעימה על פני תקופה של 5 ימים עם משרעת שיורית של 25% ± 3% ביום 5. בריכוז הנמוך ביותר של 10 ננומטר, ההשפעה של אפירוביצין הייתה תלוית מינון בלבד אך לא תלוית זמן, החל מהמדידה הראשונה (שעה לאחר תוספת התרכובת). המשרעת נעה בהתמדה בין 60%-80% של שליטה במשך תקופה של 5 ימים. הסטיות בקבוצה זו היו גדולות יותר בהשוואה לריכוזים הגבוהים יותר. סיבה אפשרית אחת יכולה להיות העובדה שלריכוז זה הייתה השפעה ניתנת למדידה רק על חלק מהבארות.
דוקסורוביצין הוא סוג נוסף של תרופות אנתרציקלין, וחיוניות התאים של hiPSC-CMs נחקרה על ידי ניטור עכבת הבסיס לאורך זמן. איור 3 מראה שחשיפה של 24 שעות לדוקסורוביצין של 300, 1, 3 ו-10 מיקרומטר מקטינה את יכולת הקיום של התאים באופן תלוי ריכוז וזמן.
Nifedpinie הוא חוסם תעלות סידן דיהידרופירידין החוסם בעיקר תעלות סידן מסוג L. ניטור ארוך טווח במשך 24 שעות של כדאיות התאים חושף ירידה תלוית זמן וריכוז של עכבת הבסיס המשמשת כמדד לרעילות (איור 4A). לאחר יישום של עלייה בריכוזי הניפדיפין (3 ננומטר, 10 ננומטר, 30 ננומטר, 100 ננומטר), הקלטות פוטנציאליות של שדה ב-hiPSC-CMs מגלות קיצור תלוי ריכוז של משך השדה המנורמל (FPD) כצפוי (איור 4B,C). הערכת Nifedipine לגבי התכווצות הלב הראתה גם ירידה משמעותית באמפליטודה התלויה בריכוז לאחר מדידה חריפה עם ריכוזים של 10 ננומטר ו-30 ננומטר (איור 5).
התוצאות שהתקבלו עם מערכת ניתוח התאים ההיברידית מראות כי ניתן להעריך שלוש נקודות קצה לבביות (התכווצות, מבנה ואלקטרופיזיולוגיה) של hiPSC-CMs באמצעות מערכת אחת.
איור 1: הערכת התכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושיים שטופלו בארלוטיניב במשך 5 ימים. ציר x מציג זמן בשעות, ציר y מתווה משרעת פרמטר במונחים של אחוזים. כוכביות מייצגות מובהקות סטטיסטית עם p < 0.05 (*) או p < 0.01 (**) (מבחן וילקוקסון מאן וויטני, n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הערכת התכווצות של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושיים שטופלו באנתרציקלין אפירוביצין קרדיוטוקסי במשך 5 ימים. ציר x מציג זמן בשעות, ציר y מתווה משרעת פרמטר במונחים של אחוזים. כוכביות מייצגות מובהקות סטטיסטית עם p < 0.05 (*) או p < 0. 01 (**) (מבחן וילקוקסון מאן וויטני, n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: עכבת בסיס של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי לאחר טיפול בדוקסורוביצין. מהלך הזמן של עכבת הבסיס של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי לחשיפה של 24 שעות ל-300, 1, 3 ו-10 μM דוקסורוביצין (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: רישומי עכבה ו-EFP של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי. (A) מהלך הזמן של עכבת הבסיס של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי למשך 24 שעות, עם חשיפה ל-3, 10, 30 ו-100 ננומטר ניפדיפין (n = 5). (B) מהלך הזמן של משך הזמן הפוטנציאלי של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושי למשך שעה אחת, עם חשיפה ל-3, 10, 30 ו-100 ננומטר ניפדיפין (n = 5). (C) פריסת האלקטרודות של לוח העכבה/EFP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הערכת התכווצות (מודול התכווצות) של קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC אנושיים שטופלו בניפדיפין במשך 20 דקות. ציר x מציג זמן בדקות, ציר Y מתווה משרעת פרמטר במונחים של אחוזים. כוכביות מייצגות מובהקות סטטיסטית עם p < 0. 05 (*) או p < 0.01 (**) (מבחן וילקוקסון מאן וויטני, n = 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: פרמטרים של התכווצות ונתונים גולמיים שהוערכו באמצעות מודול ההתכווצות. (משמאל) פרמטרים שהוערכו באמצעות מודול ההתכווצות. פרמטרים: משרעת של כוח כיווץ (mN/mm2), משך פעימה, מכת מעלה ומהירות מכת מטה, מכת מעלה ואזור מכת מטה מתחת לעקומה (AUC), קצב פעימה, וריאציות קצב פעימה, אירועים קצביים. (זכות) רישומי נתונים גולמיים של התכווצות של באר אחת עם קצב פעימה קרדיומיוציטים (A) לא מטופל, (B) וריאציות קצב פעימה, (C) מוקדם לאחר צירים, ו- (D) אירועים קצביים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: זרימת עבודה למדידת כיווץ ועכבה/EFP. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 3: פריסה לדוגמה של תוכנית מדידה עבור לוח של 96 בארות. מתוארות ארבע תרכובות (מודגשות באדום, ירוק בהיר, חום וירוק כהה) עם ארבעה ריכוזים וארבעה שכפולים. בקרות חיוביות ושליליות (למשל, תנאים טרום-תרבית ו-DMSO) מודגשות בצהוב. תאי גיבוי מסומנים בכחול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 4: נתונים לדוגמה של מדידת בסיס של התכווצות באמצעות מודול ההתכווצות לפני תוספת מורכבת. בכל תרשים מתואר הממוצע של כל מחזורי הכיווץ של מטאטא אחד. כדי לדמיין את קצב הפעימה, מוצגות שתי התכווצויות רצופות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המערכת ההיברידית עכבה / EFP / התכווצות היא מתודולוגיה מקיפה להערכה פרמקולוגית וטוקסיקולוגית של בטיחות תפוקה גבוהה של התחייבויות לב לפיתוח תרופות פרה-קליניות. הוא מספק גישה מודרנית לבדיקות בטיחות פרה-קליניות ללא שימוש במודלים של בעלי חיים, אך עם יכולות תפוקה גבוהות יותר המפחיתות באופן משמעותי זמן ועלויות. למערכת זו יש פוטנציאל לשמש כגישה משלימה עבור לב לנגנדורף ומודלים אחרים של בעלי חיים להערכת רעילות תפקודית ומבנית פרה-קלינית.
כגישה נטולת בעלי חיים, משתמשים ב-iPSC-CMs אנושיים עבור המערכת ההיברידית20. כאן, הלוחות הגמישים המיוחדים של 96 בארות עם ההשפעה המעודדת התבגרות על iPSC-CMs אנושיים מספקים יתרון חשוב בהשוואה למבחנים אחרים מבוססי תאים21,22, שכן התפוקה והסביבה הפיזיולוגית משולבות באופן ייחודי להערכת הסיכון ללב אנושי בוגר יותר 6,15.
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול הוא היישום של התרכובת, במיוחד כאשר יש לבחון השפעות חריפות. מכיוון שהתאים מתורבתים על מצעים רכים אשר מוליכים כוחות מכניים, האצה מוגזמת במהלך הטיפול בצלחת והפעלת כוחות גזירה במהלך הצינורות עלולה לגרום לשינויים חולפים (5-10 דקות) בפרמטרים של הכיווץ ויש להימנע מהם. באופן כללי, יש לנקוט בזהירות במהלך החלפות מדיה כדי למנוע הפרעה של הממברנות. מומלץ להשתמש בציוד אוטומציה של מעבדות.
לפני ביצוע ניתוח התרכובת, נדרש שלב טרום תרבית של 5-7 ימים, כך ש- iPSC-CMs אנושיים, הנרכשים בדרך כלל במצב השתמר קריו, יוכלו להתאושש מהליך ההפשרה ולבנות סינכיטיום תקין. עבור שני המודולים, משרעת הכיווץ, כמו גם קצב הפעימה, נותנים תובנה לגבי נקודת ההתחלה האידיאלית של המדידה המתרחשת בדרך כלל בין הימים 5-7. המדידה הבסיסית היא שלב קריטי לזיהוי מאפיינים בסיסיים פונקציונליים המשמשים כקריטריוני הכללה עבור hiPSC-CMs שנחקרו3. יש לרשום את ערכי הבסיס ממש לפני הטיפול המורכב, כך שניתן יהיה להשוות את השינויים בהתנהגות ההתכווצות למצבים שאינם טיפול (איור משלים 3).
התחשבות בשונות והגדרת מאפיינים בסיסיים היא המפתח למדידות מוצלחות של hiPSC-CM ופענוח נתונים. מסיבה זו, המלצות שיטות עבודה מומלצות של Gintant et al., מיושמות באמצעות מערכת ניתוח התאים ההיברידית; לדוגמה, יש להקליט את קו הבסיס לפני התוספת המורכבת, וההקלטה הבסיסית צריכה לעמוד בתנאים מוקדמים מסוימים3.
למרות שלוחות 96 הבאר הגמישים מצוידים בקרומים שבירים, צלחת מגן מסופקת בשילוב עם טיפול זהיר תמנע נזק. הממברנות מטופלות מראש כדי לאפשר חיבור יציב של תאים למצע הסיליקון, בעל תאימות ביולוגית פנימית נמוכה. הטיפול יציב לפחות 6 חודשים. בעוד התאים נשמרים כל הזמן ב 37 מעלות צלזיוס, התכונות המכניות של חומרי סיליקון יציבים על פני טווח רחב של טמפרטורות. בנוסף, לא תרופות ולא ממסים משפיעים על תכונות הסיליקון בריכוזים המשמשים בבדיקות מבוססות תאים (למשל, ריכוזי DMSO נשארים מתחת ל-0.1%).
המערכת אומתה והותאמה עם מגוון רחב של hiPSC-CMs הזמינים מסחרית. בעת שימוש בתאים מותאמים אישית, מומלץ לבדוק חלבוני מטריצה חוץ-תאית סטנדרטית (ECM) לחיבור אופטימלי של התא (לדוגמה, פיברונקטין, מטריצת EHS ופולי-L-ליזין 6,15).
אלקטרופיזיולוגיה, איתות סידן והתכווצות הן שלוש נקודות הקצה הלבביות העיקריות המטופלות בהתפתחות פרה-קלינית. המערכת ההיברידית מוגבלת כיום לניתוח שתיים מנקודות הקצה הלבביות הללו - התכווצות ואלקטרופיזיולוגיה. איתות סידן בקרדיומיוציטים אינו ניתן לניתוח ישיר אלא מזוהה באופן משיק באמצעות התכווצות ותכונות אלקטרופיזיולוגיות.
גם העכבה / EFP כמו גם מדידת כוח הכיווץ מבוצעים עם מונוליירים של קרדיומיוציטים. למרות היתרון של נוקשות מצע מכני פיזיולוגי במהלך מדידת הכיווץ, התאים אינם חווים את הסביבה התלת-ממדית של רקמה אנושית אמיתית. מצד שני, זה מאפשר שימוש רק בחלק קטן מהמודלים היקרים של תאי גזע שמקורם בתאי גזע עם ציוד מעבדה סטנדרטי. לפיכך, יישום זה מבטיח להיות יחס חיובי של עלות, חוסן וחיזוי בהשוואה למודלים in vivo / ex vivo או 3D. יישומים עתידיים של המערכת ההיברידית עשויים לכלול ניתוח של סוגי תאים מתכווצים אחרים כגון תאי שריר חלקים. ברגולציה של הומאוסטזיס לב וכלי דם, תאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי כמו עמיתים של cardiomyocytes. המערכת ההיברידית מספקת גם תוספות לפרויקטים ספציפיים, כגון גירוי אופטי של iPSC-CMs אנושיים. לשם כך, ניתן להחיל מכסה אופטי ייעודי על שני המודולים לגירוי של iPSC-CMs אנושיים שעברו טרנספקציה עם Channelrhodopsin-2 בתקופות טרום-תרבות.
לפיכך, המערכת ההיברידית עכבה / EFP / התכווצות מאפשרת הערכת בטיחות ורעילות פרה-קלינית מודרנית על ידי ניתוח שלוש נקודות קצה לבביות שונות (התכווצות, שינויים מבניים ואלקטרופיזיולוגיה) במתודולוגיה אחת. היתרון של טיפול בנקודות קצה אלה באמצעות מודל תאי לב מבוסס אדם ברמת תפוקה גבוהה מרים את המערכת ההיברידית הזו מעבר לפרספקטיבות הנוכחיות של הערכת הסיכון הלבבי הפרה-קליני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go., ו- P.L. מועסקים ב- INNOVitro GmbH, יצרנית הלוחות הגמישים. U.T., E.D., M.L., M.Ge, N.F., ו- S.S. מועסקים ב- Nanion Technologies GmbH, יצרנית המכשיר ההיברידי.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמשרד הפדרלי הגרמני לענייני כלכלה ופעולה אקלימית (צים) וממשרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (KMUinnovativ). אנו מודים ל- FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב) על כך שסיפקה בחביבות קרדיומיוציטים ו- Ncardia B.V. (ליידן, הולנד) על אספקת קרדיומיוציטים בחביבות, המשמשים במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
