Summary
A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.
Abstract
A avaliação da contratilidade cardíaca é de imensa importância para o desenvolvimento de novas terapêuticas e sua transição segura para os estágios clínicos. Embora os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) prometam servir como um modelo relevante para o ser humano em fases pré-clínicas de descoberta de medicamentos e farmacologia de segurança, sua maturidade ainda é controversa na comunidade científica e em constante desenvolvimento. Apresentamos uma tecnologia híbrida de contratilidade e impedância/potencial de campo extracelular (EFP), adicionando recursos significativos de promaturação a uma plataforma de 96 poços padrão da indústria.
O sistema de impedância/EFP monitora a funcionalidade celular em tempo real. Além da taxa de batimento das células contráteis, as leituras de espectroscopia de impedância elétrica detectam alterações morfológicas induzidas por compostos, como densidade celular e integridade da monocamada celular. No outro componente do sistema de análise de células híbridas, as células são cultivadas em membranas bio-compatíveis que imitam o ambiente mecânico do tecido cardíaco real. Este ambiente fisiológico suporta a maturação de hiPSC-CMs in vitro, levando a respostas contráteis semelhantes a mais adultos, incluindo efeitos inotrópicos positivos após o tratamento com isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil. Parâmetros como a amplitude da força de contração (mN/mm2) e a duração do batimento também revelam efeitos a jusante de compostos com influência nas propriedades eletrofisiológicas e no manuseio do cálcio.
O sistema híbrido fornece a ferramenta ideal para a análise holística de células, permitindo a avaliação pré-clínica do risco cardíaco além das perspectivas atuais de ensaios baseados em células relevantes para humanos.
Introduction
Um dos principais objetivos do desenvolvimento de medicamentos modernos é a melhoria da taxa de sucesso do banco ao leito de novas terapêuticas no pipeline de descoberta de medicamentos. O teste farmacológico de segurança desses novos medicamentos geralmente revela reações adversas a medicamentos no sistema cardiovascular que representam quase um quarto da taxa de atrito de medicamentos nos estágios pré-clínicos1. O desenvolvimento e a integração de novas metodologias de abordagem (NAMs) desempenham um papel fundamental na modernização da avaliação pré-clínica, em particular dos órgãos da bateria central, como o coração. Como essas metodologias são abordagens livres de animais, o uso de modelos celulares de base humana, como cardiomiócitos (MCs) de origem de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), tornou-se o cavalo de batalha na última década para a avaliação moderna de questões farmacológicas e toxicológicas de segurança2. Os sistemas de ensaio amplamente utilizados para tais investigações são as abordagens experimentais baseadas em microeletrodos (MEA) e corantes sensíveis à tensão3.
No entanto, a alegada imaturidade fenotípica e funcional desse tipo de célula coloca obstáculos no caminho de um modelo celular ideal de base humana, com o potencial de reduzir as lacunas translacionais entre estudos não clínicos e clínicos4.
Uma tremenda pesquisa foi conduzida ao longo dos anos para entender a razão do fenótipo imaturo implícito e encontrar maneiras de impulsionar o processo de maturação dos iPSC-CMs humanos in vitro.
A falta de sinais de maturação cardíaca, como tempos prolongados de cultura celular, ausência de outros tipos de células nas proximidades ou falta de estimulação hormonal, mostrou afetar o processo de maturação5. Além disso, o ambiente não fisiológico das placas regulares de cultura celular foi identificado como uma causa significativa que impede a maturação dos CMiPS humanos, devido à falta de rigidez fisiológica do substrato do coração humano nativo 5,6.
Diferentes sistemas de ensaio com foco em condições fisiológicas nativas foram desenvolvidos para lidar com essa questão, incluindo sistemas de cultura de células 3D em que as células são alinhadas tridimensionalmente para se assemelharem à arquitetura cardíaca nativa em vez de culturas celulares bidimensionais típicas7. Embora a maturação melhorada seja obtida com ensaios 3D, a necessidade de uma força de trabalho qualificada e o baixo rendimento desses sistemas dificultam um uso abundante deste no processo de desenvolvimento de medicamentos, uma vez que o tempo e o custo desempenham um papel fundamental na avaliação de novas terapêuticas em nível financeiro8.
Leituras importantes para avaliação farmacológica e toxicológica de segurança de novas terapêuticas são alterações nas características funcionais e estruturais dos CMiPS humanos, uma vez que as reações adversas medicamentosas induzidas por compostos do sistema cardiovascular geralmente afetam uma ou ambas as propriedades 1,9. Exemplos bem conhecidos de reações adversas tão amplas são medicamentos anticancerígenos da família das antraciclinas. Aqui, efeitos funcionais e estruturais adversos perigosos sobre o sistema cardiovascular são amplamente relatados durante e após o tratamento do câncer em pacientes, bem como com ensaios in vitro baseados em células10,11.
No presente estudo, descrevemos uma metodologia abrangente para a avaliação dos efeitos colaterais de compostos funcionais e estruturais em CM-hiPSC. A metodologia inclui a análise da força contrátil dos cardiomiócitos e da impedância/análise do Potencial de Campo Extracelular (PPE). A força contrátil é medida sob condições fisiológicas mecânicas, com as células cultivadas em substratos de silicone macios (33 kPa), refletindo o ambiente mecânico do tecido cardíaco humano nativo.
O sistema é equipado com placas de 96 poços para análise de alto rendimento de CMiPS humanos para estudos farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos de segurança cardíaca e, portanto, oferece uma vantagem às abordagens 3D atualmente usadas, como coração de Langendorff ou fatias cardíacas12,13.
Em detalhes, o sistema híbrido é composto por dois módulos, seja para a avaliação da contratilidade cardíaca em condições fisiológicas ou para a análise da toxicidade estrutural celular em tempo real 6,14. Ambos os módulos trabalham com placas especializadas de alto rendimento de 96 poços para aquisição de dados rápida e econômica.
Sem a necessidade de uma construção 3D, o módulo de contratilidade emprega placas especiais que contêm membranas de silicone flexíveis como substrato para as células, em vez do vidro rígido ou plástico que as placas de cultura celular regulares geralmente consistem. As membranas refletem as propriedades biomecânicas típicas do coração humano e, portanto, imitam as condições in vivo de uma maneira de alto rendimento. Embora as CMiPSC humanas muitas vezes não apresentem o comportamento dos cardiomiócitos adultos em relação à inotropia positiva induzida por compostos em outros ensaios baseados em células14, uma reação mais semelhante à adulta pode ser avaliada quando as células são cultivadas nas placas do módulo de contratilidade. Em estudos anteriores, foi demonstrado que as CMi iPSC apresentam efeitos inotrópicos positivos no tratamento com compostos como isoproterenol, S-Bay K8644 ou omecamtiv mecarbil 6,15. Aqui, múltiplos parâmetros de contratilidade podem ser avaliados, como parâmetros primários como a amplitude da força de contração (mN/mm2), duração do batimento e taxa de batimento, bem como parâmetros secundários do ciclo de contração, como área sob a curva, inclinações de contração e relaxamento, variações da taxa de batimento e arritmias (Figura Suplementar 1)16 . As alterações induzidas por drogas em todos os parâmetros são avaliadas de forma não invasiva por detecção capacitiva de distância. Os dados brutos são analisados posteriormente por softwares especializados.
O módulo de toxicidade estrutural adiciona seus parâmetros únicos de impedância e EFP como leitura da toxicidade celular estrutural e da análise das propriedades eletrofisiológicas17,18. A tecnologia de espectroscopia de impedância elétrica revela alterações induzidas por compostos na densidade celular ou na integridade celular e monocamada monitoradas em tempo real, como demonstrado com CMiPSC humanos tratados com compostos cardiotóxicos conhecidos13. Com leituras de impedância em diferentes frequências (1-100 kHz) é possível dissecar ainda mais uma resposta fisiológica e, assim, revelar mudanças na topografia da membrana, nas junções célula-célula ou célula-matriz é alcançável. O registro adicional de PFE de CMiPS humanos possibilita ainda a análise dos efeitos eletrofisiológicos provocados pelo tratamento composto, como foi demonstrado à luz do estudo CiPA17,19.
No presente estudo, foram empregados CMiPSC humanos, tratados com epirrubicina e doxorrubicina, ambos bem descritos como antraciclinas cardiotóxicas, e erlotinibe, um inibidor da tirosina quinase (TKI) com um risco bastante baixo de toxicidade cardiovascular. A avaliação crônica com epirrubicina, doxorrubicina e erlotinibe foi realizada por 5 dias. O resultado mostra pequenas alterações na contratilidade e impedância de bases quando as células foram tratadas com erlotinib, mas uma diminuição tóxica dependente do tempo e da dose na amplitude de contração e impedância de base quando tratadas com epirrubicina e doxorrubicina, respectivamente. As medidas agudas foram realizadas com o bloqueador dos canais de cálcio nifedipina e mostraram uma diminuição na amplitude de contração, duração do potencial de campo e impedância de base, demonstrando efeitos colaterais cardiotóxicos deste composto nos níveis funcionais e estruturais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: O fluxo de trabalho para a contratilidade e a medição da impedância/EFP é apresentado na Figura 2 Suplementar.
1. Revestimento da placa
- Abra a embalagem selada a vácuo e retire a placa de 96 poços. Os procedimentos de manuseio para placas de 96 poços de ambos os módulos são os mesmos. Deixe a placa de contração coberta pelo protetor de membrana fornecido adicionalmente até a medição no módulo de contratilidade.
- Revestir as placas flexíveis de 96 poços para semear cardiomiócitos.
- Prepare uma solução diluída de revestimento de gel EHS transferindo 2,75 mL de solução pronta para uso de gel EHS em um tubo de centrífuga estéril. Em seguida, adicione 8,25 mL de DPBS com Ca 2+ e Mg2+. Misture a solução com cuidado.
NOTA: Opcionalmente, a fibronectina também pode ser usada para revestir os poços: preparar 13 mL de solução de revestimento de fibronectina em um tubo de centrífuga estéril diluindo 650 μL de solução-estoque de fibronectina (1 μg/mL) em 13 mL de DPBS com Ca 2+ e Mg2+, resultando em uma solução de trabalho de 50 μg/mL. Misture a solução com cuidado.
- Prepare uma solução diluída de revestimento de gel EHS transferindo 2,75 mL de solução pronta para uso de gel EHS em um tubo de centrífuga estéril. Em seguida, adicione 8,25 mL de DPBS com Ca 2+ e Mg2+. Misture a solução com cuidado.
- Transfira a solução de revestimento para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório.
- Adicione 100 μL da solução de revestimento por poço com o robô de automação de laboratório usando o programa "ADD100μL". Colocar a tampa de volta na placa de 96 poços e incubar durante 3 h a 37 °C.
NOTA: O programa para o robô de automação de laboratório precisa ser predefinido manualmente de antemão.
2. Semeadura de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC em placas flexíveis de 96 poços (Dia 0)
- Descongele as células de acordo com as diretrizes do fabricante.
- Conte as células com uma câmara de contagem manual e ajuste as células no meio de chapeamento recomendado de acordo com as instruções do fabricante da célula (por exemplo, 1 x 105 células/poço), resultando em 11 x 106 células/11 mL para semear uma placa inteira de 96 poços.
- Remova a solução de gel EHS dos poços com o robô de automação de laboratório usando o programa "REMOVE100μL". Remova o reservatório reagente que contém a solução de revestimento dispensada do robô.
- Transfira a suspensão celular (11 mL no total) para um reservatório de reagente estéril colocado no robô de automação de laboratório e semeie as células com 100 μL/poço usando o programa "CELLS_ADD100 μL".
- Imediatamente após a semeadura celular, transfira a placa flexível de 96 poços para a incubadora (37 °C, 5% de CO2, com umidade controlada) e deixe as células assentarem durante a noite.
3. Troca média de placas flexíveis de 96 poços (Dia 1)
- Aquecer pelo menos 22 mL de meio de manutenção de cardiomiócitos por placa a 37 °C em um tubo de centrífuga de 50 mL, 18-24 h após a semeadura das placas.
- Transfira o meio fresco (pelo menos 22 mL) para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação de laboratório. Coloque um reservatório de reagente vazio no robô e execute a remoção do meio com o programa "REMOVE100μL". Posteriormente, trocar o reservatório reagente contendo o meio residual pelo reservatório reagente contendo o meio fresco e dispensar 200 μL do meio fresco por poço com o programa "ADD100μL". Execute esta etapa duas vezes para atingir 200 μL/poço.
- Imediatamente após a troca média, transfira a placa de volta para a incubadora.
- Realize uma troca média (200 μL/poço) a cada dois dias até a adição do composto.
4. Troca média final antes da adição do composto (Dia 5-7)
- Realize uma mudança final de meio 4-6 h antes da adição do composto.
- Aqueça pelo menos 22 mL de tampão de ensaio para uma placa flexível de 96 poços. O tampão de ensaio consiste em meio de manutenção ou seus derivados (por exemplo, meio sérico baixo/nenhum, meio livre de vermelho fenol ou outros tampões isotônicos).
- Transfira o meio fresco para um reservatório de reagente estéril e deixe-o ao lado do robô de automação do laboratório. Coloque um reservatório de reagente vazio no robô e execute a remoção do meio. Posteriormente, trocar o reservatório do reagente que contém o meio residual pelo reservatório do reagente que contém o meio fresco e dispensar 200 μL/poço do meio fresco.
- Imediatamente após a troca média, transfira a placa flexível de volta para a incubadora.
5. Adição de compostos e gravação de dados (Dia 5-7)
NOTA: Um exemplo de plano de medição para o experimento é dado na Figura Suplementar 3.
- Prepare a solução de trabalho por composto na concentração de 4x no exaustor de fluxo laminar usando uma placa de poço regular estéril de 96 profundidades. A solução composta é baseada no tampão de ensaio usado na etapa 4. Transferir a placa do poço de 96 profundidades que contém a solução composta por pelo menos 1 h para a incubadora para ajustá-la à mesma condição que a placa flexível.
NOTA: A concentração de 1x de cada droga utilizada para cada experimento é fornecida nas figuras e legendas. - Transfira a placa para o respectivo dispositivo de medição 1 h antes de realizar uma medição de linha de base.
- Abra o Protocolo de Edição no software de controle (parte do sistema de análise de células híbridas) e selecione a respectiva contratilidade ou impedância do modo de medição/EFP.
- Defina a duração da varredura (comprimento de uma medição; por exemplo, 30 s) e o intervalo de repetição (tempo entre as medições; por exemplo, 5 min) e salve o número do protocolo.
- Selecione Iniciar protocolo > Continuar e preencha os campos solicitados.
- Por fim, selecione Iniciar medição. Realize um mínimo de três medições de linha de base (varreduras) em intervalos de 5 minutos pouco antes da adição do composto.
NOTA: Dados de exemplo de uma medição de linha de base de contratilidade usando o módulo de contratilidade antes da adição de compostos são representados na Figura 4 Suplementar - Remova 50 μL do tampão de ensaio de cada poço sem remover a placa flexível de 96 poços do dispositivo de medição.
- Adicionar 50 μL da solução composta concentrada 4x em cada poço da placa, de acordo com o plano de medição.
- Selecione Adicionar marcador de região e defina o layout da placa composta e o volume da solução composta após a adição do composto.
- Finalmente, selecione Prosseguir com a medição padrão ou Prosseguir com a série de medição de acordo com o plano experimental.
6. Análise dos dados
- Com o software de gravação, meça varreduras, cujo comprimento e intervalo de repetição são definidos pelo usuário.
- Com o software de análise, capture a forma do sinal lendo parâmetros como amplitude, taxa de batida, largura de pulso e assim por diante, automaticamente.
NOTA: Um sinal médio, incluindo o desvio padrão, a chamada batida média, é calculado automaticamente com base nos dados de uma varredura. O usuário pode definir os parâmetros de contratilidade/IMP/EFP que o software calcula e exibe. - Com software de análise calcular a curva dose-resposta e IC50/EC50 para cada composto.
NOTA: Os dados brutos e os resultados da análise gerados com o software de análise podem ser facilmente exportados em uma variedade de formatos. Finalmente, os relatórios de dados são gerados automaticamente para resumir e arquivar os resultados experimentais. Uma descrição abrangente do que e como um sinal EFP é medido é discutida em 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os efeitos do inibidor de quinase erlotinib sobre a contratilidade dos CM-hiPSC são mostrados na Figura 1. As células foram tratadas com concentrações variando de 10 nM a 10 μM por 5 dias e os parâmetros de batimento foram registrados diariamente. O erlotinibe, um EGFR (receptor do fator de crescimento epidérmico) e inibidor da tirosina quinase com um risco comparativamente baixo de cardiotoxicidade, teve uma dose menor e um efeito dependente do tempo nos CM-hiPSC apenas em concentrações na gama micromolar. Na concentração mais baixa (10 nM), o erlotinib induziu uma diminuição estatisticamente insignificante da amplitude na primeira medição após a aplicação do composto (1 h). Em todas as medições subsequentes, nenhum efeito comparável foi medido nesta concentração. A diminuição transitória pode ser o resultado de um efeito composto, mas também resultar de uma distorção transitória do padrão de batimento durante o procedimento de adição de composto, por exemplo, de natureza térmica ou mecânica. As concentrações micromolares de erlotinib mostraram efeitos cardiotóxicos ligeiros, mas significativos, e dose-dependentes. O início do efeito foi observado a partir de 96 h com 1 μM de erlotinibe, enquanto 10 μM resultaram em uma diminuição significativa apenas 24 h após a adição do composto.
O agente quimioterápico epirrubicina teve um efeito dependente do tempo e da dose nos CM-hiPSC (Figura 2). As células cessaram o batimento dentro de 24 h após a aplicação de epirrubicina 10 μM. Com 1 μM, uma diminuição drástica da amplitude para 44% ± 2% do controle após 24 h foi seguida pela cessação completa do batimento até 48 h após a adição do composto. A 100 nM, observou-se uma diminuição dependente do tempo na amplitude do batimento durante um período de 5 dias com uma amplitude residual de 25% ± 3% no dia 5. Na concentração mais baixa de 10 nM, o efeito da epirrubicina foi apenas dose-dependente, mas não dependente do tempo, começando na primeira medição (1 h após a adição do composto). A amplitude flutuou de forma constante entre 60% e 80% do controle durante o período de 5 dias. Os desvios neste grupo foram maiores em comparação com as concentrações mais elevadas. Uma possível razão poderia ser o fato de que essa concentração teve um efeito mensurável apenas em uma parte dos poços.
A doxorrubicina é outra classe de medicação antraciclina, e a vitalidade celular dos CM-hiPSC foi investigada monitorando a impedância de base ao longo do tempo. A Figura 3 mostra que uma exposição de 24 horas à doxorrubicina de 300, 1, 3 e 10 μM diminui a viabilidade celular de maneira dependente da concentração e do tempo.
A nifedpinia é um bloqueador dos canais de cálcio di-hidropiridina que bloqueia principalmente os canais de cálcio do tipo L. O monitoramento a longo prazo ao longo de 24 h de viabilidade celular revela uma diminuição da impedância de base dependente do tempo e da concentração, que é usada como medida de toxicidade (Figura 4A). Após a aplicação de concentrações crescentes de nifedipina (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM), os registros do potencial de campo em hiPSC-CMs revelam um encurtamento dependente da concentração da duração do campo normalizada (FPD) conforme esperado (Figura 4B,C). A avaliação da nifedipina quanto à contratilidade cardíaca também mostrou uma diminuição significativa da amplitude dependente da concentração na medida aguda com concentrações de 10 nM e 30 nM (Figura 5).
Os resultados obtidos com o sistema de análise de células híbridas demonstram que três desfechos cardíacos (contratilidade, estrutura e eletrofisiologia) dos CM-hiPSC podem ser avaliados por meio de um único sistema.
Figura 1: Avaliação da contratilidade de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC tratados com erlotinib durante 5 dias. O eixo x mostra o tempo em horas, o eixo y plota a amplitude dos parâmetros em termos de porcentagem. Os asteriscos representam significância estatística com p < 0,05 (*) ou p < 0,01 (**) (teste de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Avaliação da contratilidade de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC tratados com antraciclina epirrubicina cardiotóxica durante 5 dias. O eixo x mostra o tempo em horas, o eixo y plota a amplitude dos parâmetros em termos de porcentagem. Os asteriscos representam significância estatística com p < 0,05 (*) ou p < 0. 01 (**) (teste de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Impedância de base de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC após tratamento com doxorrubicina. Curso temporal da impedância de base de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC por 24 h de exposição a 300, 1, 3 e 10 μM de doxorrubicina (n = 5). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Impedância e registros de EFP de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC. (A) Curso temporal da impedância de base de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC por 24 h, após exposição a nifedipina de 3, 10, 30 e 100 nM (n = 5). (B) Curso temporal da duração potencial de campo de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC por 1 h, após a exposição a nifedipina de 3, 10, 30 e 100 nM (n = 5). (C) Disposição do eletrodo da placa de impedância/EFP. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação da contratilidade (módulo de contratilidade) de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC tratados com nifedipina por 20 min. O eixo x mostra o tempo em min, o eixo Y plota a amplitude do parâmetro em termos de porcentagem. Os asteriscos representam significância estatística com p < 0. 05 (*) ou p < 0,01 (**) (teste de Wilcoxon Mann Whitney, n = 4). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Parâmetros de contratilidade e dados brutos avaliados com o módulo de contratilidade. (Esquerda) Parâmetros avaliados com o módulo de contratilidade. Parâmetros: Amplitude da força de contração (mN/mm2), duração do batimento, velocidade de curso ascendente e descendente, área sob curva (AUC), taxa de batida, variações da taxa de batida, eventos arrítmicos. (Direita) Registros de dados brutos de contratilidade de um poço com taxa de batimento de cardiomiócitos (A) não tratados, (B) variações da taxa de batimento, (C) logo após contrações e (D) eventos arrítmicos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 Suplementar: Fluxo de trabalho para medição de contratilidade e impedância/EFP. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 3 suplementar: Exemplo de layout de um plano de medição para uma placa de 96 poços. Quatro compostos (destacados em vermelho, verde claro, marrom e verde escuro) com quatro concentrações e quatro repetições são representados. Controles positivos e negativos (por exemplo, condições pré-cultura e DMSO) são destacados em amarelo. As células de backup são realçadas em azul. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 4 Suplementar: Dados de exemplo de uma medição de linha de base de contratilidade usando o módulo de contratilidade antes da adição de compostos. Em cada gráfico, a média de todos os ciclos de contração de uma varredura é representada. Para visualizar a taxa de batida, duas contrações consecutivas são mostradas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O sistema híbrido impedância/EFP/contratilidade é uma metodologia abrangente para avaliação farmacológica e toxicológica de alta segurança de rendimento de passivos cardíacos para o desenvolvimento de medicamentos pré-clínicos. Ele fornece uma abordagem moderna para testes de segurança pré-clínicos sem o uso de modelos animais, mas com maiores capacidades de rendimento que reduzem significativamente o tempo e os custos. Este sistema tem o potencial de ser usado como uma abordagem complementar para o Langendorff Heart e outros modelos animais para avaliação pré-clínica de toxicidade funcional e estrutural.
Como uma abordagem livre de animais, as CMi humanas são empregadas para o sistema híbrido20. Aqui, as placas flexíveis especiais de 96 poços com o efeito pró-maturação em CMiPSC humanas fornecem uma vantagem importante em comparação com outros ensaios baseados em células21,22, uma vez que o rendimento e um ambiente fisiológico são combinados exclusivamente para uma avaliação de risco cardíaco humano mais adulta 6,15.
A etapa mais crítica do protocolo é a aplicação do composto, especialmente quando os efeitos agudos devem ser examinados. Como as células são cultivadas em substratos moles que conduzem forças mecânicas, a aceleração excessiva durante o manuseio da placa e a aplicação de forças de cisalhamento durante a pipetagem podem resultar em alterações transitórias (5-10 min) dos parâmetros de contração e devem ser evitadas. Em geral, deve-se tomar cuidado durante as substituições de meios para evitar a ruptura das membranas. Recomenda-se o uso de equipamentos de automação laboratorial.
Antes que a análise composta seja realizada, é necessária uma etapa de pré-cultura de 5 a 7 dias, para que os CMCs iPSC humanos, geralmente adquiridos em um estado criopreservado, possam se recuperar do procedimento de descongelamento e construir um sincício adequado. Para ambos os módulos, a amplitude de contração, bem como a taxa de batida, fornecem informações sobre o ponto de partida ideal da medição que geralmente ocorre entre os dias 5-7. A medida basal é uma etapa crítica para identificar as características funcionais basais utilizadas como critérios de inclusão para os CM-hiPSC estudados3. Os valores basais precisam ser registrados logo antes do tratamento composto para que as mudanças no comportamento de contração possam ser comparadas às condições de não tratamento (Figura Suplementar 3).
Contabilizar as variabilidades e ter características basais definidas é fundamental para medições bem-sucedidas do hiPSC-CM e interpretação dos dados. Por esta razão, as recomendações de melhores práticas de Gintant et al., são seguidas usando o sistema de análise de células híbridas; por exemplo, a linha de base deve ser registrada antes da adição do composto, e o registro da linha de base deve atender a certos pré-requisitos3.
Embora as placas flexíveis de 96 poços estejam equipadas com membranas frágeis, uma placa protetora fornecida em combinação com o manuseio cauteloso evitará danos. As membranas são pré-tratadas para permitir a fixação estável das células ao substrato de silicone, que tem baixa biocompatibilidade intrínseca. O tratamento é estável por pelo menos 6 meses. Enquanto as células são constantemente mantidas a 37 °C, as propriedades mecânicas dos materiais de silicone são estáveis em uma ampla gama de temperaturas. Além disso, nem os medicamentos nem os solventes afetam as propriedades do silicone nas concentrações usadas em ensaios baseados em células (por exemplo, as concentrações de DMSO permanecem abaixo de 0,1%).
O sistema foi validado e otimizado com uma ampla gama de hiPSC-CMs comercialmente disponíveis. Ao usar células personalizadas, recomenda-se testar proteínas padrão da matriz extracelular (ECM) para a fixação celular ideal (por exemplo, fibronectina, matriz EHS e poli-L-lisina 6,15).
Eletrofisiologia, sinalização de cálcio e contratilidade são os três principais desfechos cardíacos que estão sendo abordados no desenvolvimento pré-clínico. O sistema híbrido está atualmente limitado a analisar dois desses desfechos cardíacos - contratilidade e eletrofisiologia. A sinalização de cálcio em cardiomiócitos não pode ser analisada diretamente, mas detectada tangencialmente através de contratilidade e propriedades eletrofisiológicas.
Tanto a impedância/PFE quanto a medida da força de contração são realizadas com monocamadas de cardiomiócitos. Apesar da vantagem de uma rigidez fisiológica mecânica do substrato durante a medição da contração, as células não experimentam o ambiente tridimensional do tecido humano real. Por outro lado, isso permite o uso de apenas uma fração dos caros modelos de células derivadas de células-tronco com equipamento de laboratório padrão. Assim, esta aplicação promete ter uma relação favorável de custo, robustez e previsibilidade em comparação com modelos in vivo/ex vivo ou 3D. Aplicações futuras do sistema híbrido podem incluir a análise de outros tipos de células contráteis, como células musculares lisas. Na regulação da homeostase cardiovascular, essas células desempenham um papel importante como contrapartes dos cardiomiócitos. O sistema híbrido também fornece complementos para projetos específicos, como a estimulação óptica de iPSC-CMs humanos. Para este propósito, uma tampa óptica dedicada pode ser aplicada a ambos os módulos para a estimulação de iPSC-CMs humanos que foram transfectados com Channelrhodopsin-2 durante os tempos de pré-cultura.
Assim, o sistema híbrido de impedância/EFP/contratilidade permite uma moderna avaliação pré-clínica de segurança e toxicidade, analisando três desfechos cardíacos diferentes (contratilidade, alterações estruturais e eletrofisiologia) dentro de uma metodologia. A vantagem de abordar esses endpoints com um modelo de células cardíacas baseado em humanos em um alto nível de rendimento eleva esse sistema híbrido além das perspectivas atuais de avaliação de risco cardíaco pré-clínico.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go. e P.L. são empregados na innoVitro GmbH, fabricante das placas flexíveis. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. e S.S. são empregados na Nanion Technologies GmbH, fabricante do dispositivo híbrido.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Ministério Federal Alemão para Assuntos Econômicos e Ação Climática (ZIM) e do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (KMUinnovativ). Agradecemos à FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc (Madison, WI, EUA) por gentilmente fornecer cardiomiócitos e à Ncardia B.V. (Leiden, Holanda) por gentilmente fornecer cardiomiócitos, usados neste estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
