Summary
İnsan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kasılma fonksiyonlarındaki ve hücresel bütünlüğündeki değişikliklerin analizi, klinik olmayan ilaç gelişimi için büyük önem taşımaktadır. Hibrit bir 96 kuyucuklu hücre analiz sistemi, klinik aşamalara güvenli bir geçiş için gerekli olan güvenilir, insanla ilgili sonuçlar için her iki parametreyi de gerçek zamanlı ve fizyolojik bir şekilde ele alır.
Abstract
Kardiyak kontraktilitenin değerlendirilmesi, yeni terapötiklerin geliştirilmesi ve klinik aşamalara güvenli geçişi için büyük önem taşımaktadır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaç keşfi ve güvenlik farmakolojisinin klinik öncesi aşamalarında insanla ilgili bir model olarak hizmet etme sözü verirken, olgunlukları bilimsel toplulukta hala tartışmalıdır ve sürekli gelişme halindedir. Hibrit kontraktilite ve empedans/hücre dışı alan potansiyeli (EFP) teknolojisi sunarak endüstri standardı 96 kuyucuklu bir platforma önemli pro-olgunlaşma özellikleri ekliyoruz.
Empedans/EFP sistemi, hücresel işlevselliği gerçek zamanlı olarak izler. Kasılma hücrelerinin vuruş hızının yanı sıra, elektriksel empedans spektroskopisi okumaları, hücre yoğunluğu ve hücresel tek katmanın bütünlüğü gibi bileşiğin neden olduğu morfolojik değişiklikleri tespit eder. Hibrit hücre analiz sisteminin diğer bileşeninde, hücreler gerçek kalp dokusunun mekanik ortamını taklit eden biyo-uyumlu membranlar üzerinde kültürlenir. Bu fizyolojik ortam, hiPSC-CM'lerin in vitro olgunlaşmasını destekler ve izoproterenol, S-Bay K8644 veya omecamtiv mekarbil ile tedaviden sonra pozitif inotropik etkiler de dahil olmak üzere daha yetişkin benzeri kontraktil yanıtlara yol açar. Kasılma kuvvetinin genliği (mN /mm2) ve atma süresi gibi parametreler, elektrofizyolojik özellikler ve kalsiyum kullanımı üzerinde etkisi olan bileşiklerin aşağı akış etkilerini de ortaya koymaktadır.
Hibrit sistem, bütünsel hücre analizi için ideal bir araç sağlar ve insanla ilgili hücre bazlı testlerin mevcut perspektiflerinin ötesinde klinik öncesi kardiyak risk değerlendirmesine izin verir.
Introduction
Modern ilaç geliştirmenin ana hedeflerinden biri, ilaç keşif boru hattındaki yeni terapötiklerin tezgahtan başucuna başarı oranının iyileştirilmesidir. Bu yeni ilaçların güvenli farmakolojik testleri genellikle kardiyovasküler sistem üzerinde preklinik aşamalarda ilaç yıpranma oranının neredeyse dörtte birini oluşturan advers ilaç reaksiyonlarını ortaya koymaktadır1. Yeni yaklaşım metodolojilerinin (NAM'lar) geliştirilmesi ve entegrasyonu, klinik öncesi değerlendirmenin, özellikle de kalp gibi çekirdek pil organlarının modernizasyonunda kilit bir rol oynamaktadır. Bu metodolojiler hayvansız yaklaşımlar olduğundan, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kökenli kardiyomiyositler (CM'ler) gibi insan bazlı hücre modellerinin kullanılması, son on yılda güvenlik farmakolojik ve toksikolojik konularının modern değerlendirmesi için iş gücü haline gelmiştir2. Bu tür araştırmalar için yaygın olarak kullanılan tahlil sistemleri mikroelektrot dizisi (MEA) ve voltaja duyarlı boya bazlı deneysel yaklaşımlardır3.
Bununla birlikte, bu hücre tipinin iddia edilen fenotipik ve fonksiyonel olgunlaşmamışlığı, klinik olmayan ve klinik çalışmalar arasındaki translasyonel boşlukları azaltma potansiyeli olan ideal bir insan tabanlı hücre modelinin önüne engeller koymaktadır4.
İma edilen olgunlaşmamış fenotipin nedenini anlamak ve insan iPSC-CM'lerinin olgunlaşma sürecini in vitro olarak zorlamanın yollarını bulmak için yıllar boyunca muazzam araştırmalar yapılmıştır.
Uzun hücre kültürü süreleri, civardaki diğer hücre tiplerinin yokluğu veya hormonal stimülasyon eksikliği gibi kardiyak olgunlaşma ipuçlarının eksikliğinin olgunlaşma sürecini etkilediği gösterilmiştir5. Ayrıca, düzenli hücre kültürü plakalarının fizyolojik olmayan ortamı, doğal insan kalbinin eksik fizyolojik substrat sertliği nedeniyle insan iPSC-CM'lerinin olgunlaşmasını engelleyen önemli bir neden olarak tanımlanmıştır 5,6.
Bu sorunun üstesinden gelmek için, hücrelerin tipik iki boyutlu hücre kültürleri yerine doğal kardiyak mimariye benzeyecek şekilde üç boyutlu olarak hizalandığı 3D hücre kültürü sistemleri de dahil olmak üzere doğal fizyolojik koşullara odaklanan farklı tahlil sistemleri geliştirilmiştir7. Her ne kadar 3D analizlerle daha iyi olgunlaşma elde edilse de, vasıflı bir işgücüne duyulan ihtiyaç ve bu sistemlerin düşük verimi, ilaç geliştirme sürecinde bunun bol miktarda kullanılmasını engellemektedir, çünkü zaman ve maliyet, yeni terapötiklerin finansal düzeyde değerlendirilmesinde temel bir rol oynamaktadır8.
Yeni terapötiklerin güvenlik farmakolojik ve toksikolojik değerlendirmesi için önemli okumalar, insan iPSC-CM'lerinin fonksiyonel ve yapısal özelliklerindeki değişikliklerdir, çünkü kardiyovasküler sistemin bileşiğe bağlı advers ilaç reaksiyonları genellikle bu özelliklerden birini veya her ikisini de etkiler 1,9. Bu kadar geniş advers reaksiyonların iyi bilinen örnekleri, antrasiklin ailesinin anti-kanser ilaçlarıdır. Burada, kardiyovasküler sistem üzerindeki tehlikeli fonksiyonel ve olumsuz yapısal etkiler, hastalarda kanser tedavisi sırasında ve sonrasında ve ayrıca in vitro hücre bazlı tahlillerde yaygın olarak bildirilmektedir10,11.
Bu çalışmada, hiPSC-CM'ler üzerindeki hem fonksiyonel hem de yapısal bileşik yan etkilerinin değerlendirilmesi için kapsamlı bir metodoloji açıklanmaktadır. Metodoloji, kardiyomiyosit kontraktil kuvvetinin analizini ve empedans/Hücre Dışı Alan Potansiyeli (EFP) analizini içerir. Kasılma kuvveti, fizyolojik mekanik koşullar altında, doğal insan kalp dokusunun mekanik ortamını yansıtan yumuşak (33 kPa) silikon substratlar üzerinde kültürlenmiş hücrelerle ölçülür.
Sistem, klinik öncesi kardiyak güvenlik farmakolojik ve toksikolojik çalışmaları için insan iPSC-CM'lerinin yüksek verimli analizi için 96 kuyucuklu plakalarla donatılmıştır ve bu nedenle Langendorff kalp veya kalp dilimleri12,13 gibi şu anda kullanılan 3D yaklaşımlara avantaj sağlar.
Ayrıntılı olarak, hibrid sistem, fizyolojik koşullar altında kardiyak kontraktilitenin değerlendirilmesi veya gerçek zamanlı hücresel yapısal toksisitenin analizi için iki modülden oluşur 6,14. Her iki modül de hızlı ve uygun maliyetli veri toplama için özel yüksek verimli 96 delikli plakalarla çalışır.
Bir 3D yapıya ihtiyaç duymadan, kontraktilite modülü, normal hücre kültürü plakalarının genellikle içerdiği sert cam veya plastik yerine, hücreler için substrat olarak esnek silikon membranlar içeren özel plakalar kullanır. Membranlar tipik insan biyomekanik kalp özelliklerini yansıtır ve bu nedenle in vivo koşulları yüksek verimle taklit eder. İnsan iPSC-CM'leri genellikle diğer hücre bazlı tahlillerde bileşik kaynaklı pozitif inotropi ile ilgili yetişkin kardiyomiyosit davranışını gösteremezken, hücreler kontraktilite modülünün plakaları üzerinde kültürlendiğinde daha yetişkin benzeri bir reaksiyon değerlendirilebilir. Önceki çalışmalarda, iPSC-CM'lerin izoproterenol, S-Bay K8644 veya omecamtiv mecarbil 6,15 gibi bileşiklerle tedavi üzerine pozitif inotropik etkiler gösterdiği gösterilmiştir. Burada, kasılma kuvvetinin genliği (mN/mm2), vuruş süresi ve vuruş hızı gibi birincil parametrelerin yanı sıra eğrinin altındaki alan, kasılma ve gevşeme eğimleri, vuruş hızı değişimleri ve aritmiler gibi büzülme döngüsünün ikincil parametreleri gibi çoklu kontraktilite parametreleri değerlendirilebilir (Ek Şekil 1)16 . Tüm parametrelerdeki ilaca bağlı değişiklikler, kapasitif mesafe algılaması ile non-invaziv olarak değerlendirilir. Ham veriler daha sonra özel yazılımlar tarafından analiz edilir.
Yapısal toksisite modülü, yapısal hücresel toksisite ve elektrofizyolojik özelliklerin analizi için bir okuma olarak benzersiz empedans ve EFP parametrelerini ekler17,18. Elektriksel empedans spektroskopisi teknolojisi, bilinen kardiyotoksik bileşiklerle muamele edilmiş insan iPSC-CM'lerinde gösterildiği gibi, gerçek zamanlı olarak izlenen hücre yoğunluğunda veya hücre ve tek katmanlı bütünlükte bileşiğin neden olduğu değişiklikleri ortaya koymaktadır13. Farklı frekanslarda (1-100 kHz) empedans okumaları ile fizyolojik bir yanıtı daha da incelemek mümkündür ve böylece membran topografyasındaki, hücre-hücre veya hücre-matris kavşaklarındaki değişiklikleri ortaya çıkarmak mümkündür. İnsan iPSC-CM'lerinin ek EFP kaydı, CiPA çalışması17,19'un ışığında gösterildiği gibi, bileşik işlemle ortaya çıkan elektrofizyolojik etkilerin analizini de sağlar.
Bu çalışmada, her ikisi de kardiyotoksik antrasiklinler olarak iyi tanımlanan epirubisin ve doksorubisin ve oldukça düşük kardiyovasküler toksisite riski olan bir tirozin kinaz inhibitörü (TKI) olan erlotinib ile tedavi edilen insan iPSC-CM'leri kullanılmıştır. Epirubisin, doksorubisin ve erlotinib ile kronik değerlendirme 5 gün boyunca yapıldı. Sonuç, hücreler erlotinib ile tedavi edildiğinde kontraktilitede ve baz empedansında küçük değişiklikler gösterir, ancak sırasıyla epirubisin ve doksorubisin ile tedavi edildiğinde kasılma genliği ve baz empedansında zaman ve doza bağlı toksik bir azalma gösterir. Kalsiyum kanal blokeri nifedipin ile akut ölçümler yapıldı ve kasılma genliğinde, alan potansiyel süresinde ve baz empedansında azalma göstererek bu bileşiğin fonksiyonel ve yapısal seviyeler üzerindeki kardiyotoksik yan etkilerini gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Kontraktilite ve empedans/EFP ölçümü için iş akışı Ek Şekil 2'de verilmiştir.
1. Plaka kaplama
- Vakumla kapatılmış ambalajı açın ve 96 delikli plakayı çıkarın. Her iki modülün 96 delikli plakaları için taşıma prosedürleri aynıdır. Kasılma plakasını, kontraktilite modülünde ölçüm yapılana kadar ek olarak verilen membran koruması ile örtülü bırakın.
- Kardiyomiyositlerin tohumlanması için esnek 96 delikli plakaları kaplayın.
- 2,75 mL EHS jel kullanıma hazır çözeltiyi steril bir santrifüj tüpünde aktararak seyreltilmiş bir EHS jel kaplama çözeltisi hazırlayın. Ardından Ca 2+ve Mg 2+ ile 8,25 mL DPBS ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın.
NOT: İsteğe bağlı olarak, fibronektin kuyucukları kaplamak için de kullanılabilir: Ca 2 +ve Mg 2 + ile 13 mL DPBS'de 650 μL fibronektin stok çözeltisini (1 μg / mL) seyrelterek steril bir santrifüj tüpünde 13 mL fibronektin kaplama çözeltisi hazırlayın ve 50 μg / mL çalışma çözeltisi elde edin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın.
- 2,75 mL EHS jel kullanıma hazır çözeltiyi steril bir santrifüj tüpünde aktararak seyreltilmiş bir EHS jel kaplama çözeltisi hazırlayın. Ardından Ca 2+ve Mg 2+ ile 8,25 mL DPBS ekleyin. Çözeltiyi dikkatlice karıştırın.
- Kaplama çözeltisini laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilmiş steril bir reaktif rezervuarına aktarın.
- "ADD100μL" programını kullanarak laboratuvar otomasyon robotu ile kuyu başına 100 μL kaplama çözeltisi ekleyin. Kapağı tekrar 96 delikli plakaya yerleştirin ve 37 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Laboratuvar otomasyon robotu programının önceden manuel olarak ayarlanması gerekir.
2. İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin esnek 96 delikli plakalara tohumlanması (Gün 0)
- Hücreleri üreticinin yönergelerine göre çözün.
- Hücreleri manuel bir sayım odasıyla sayın ve hücreleri önerilen kaplama ortamındaki hücreleri hücre üreticisinin talimatlarına göre ayarlayın (örneğin, 1 x 105 hücre / kuyu), bu da96 delikli bir plakanın tamamını tohumlamak için 11 x 10 6 hücre / 11 mL ile sonuçlanır.
- "REMOVE100μL" programını kullanarak laboratuvar otomasyon robotu ile EHS jel çözeltisini kuyulardan çıkarın. Dağıtılan kaplama çözeltisini içeren reaktif haznesini robottan çıkarın.
- Hücre süspansiyonunu (toplam 11 mL) laboratuvar otomasyon robotuna yerleştirilen steril bir reaktif rezervuarına aktarın ve "CELLS_ADD100 μL" programını kullanarak hücreleri 100 μL / kuyucuk ile tohumlayın.
- Hücre tohumlamasından hemen sonra, esnek 96 delikli plakayı inkübatöre aktarın (37 ° C,% 5 CO2, nem kontrollü) ve hücrelerin gece boyunca yerleşmesine izin verin.
3. Esnek 96 delikli plakaların orta değişimi (1. Gün)
- Plakaları tohumladıktan 18-24 saat sonra, 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde plaka başına en az 22 mL kardiyomiyosit bakım ortamını 37 ° C'ye ısıtın.
- Taze ortamı (en az 22 mL) steril bir reaktif haznesine aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun hemen yanında bırakın. Robota boş bir reaktif haznesi yerleştirin ve "REMOVE100μL" programı ile orta kaldırma işlemini gerçekleştirin. Daha sonra, atık ortamı içeren reaktif rezervuarını, taze ortamı içeren reaktif rezervuarı ile değiştirin ve "ADD100μL" programı ile kuyu başına 200 μL taze ortam dağıtın. 200 μL/kuyuya ulaşmak için bu adımı iki kez gerçekleştirin.
- Orta değişimden hemen sonra, plakayı tekrar inkübatöre aktarın.
- Bileşik ilavesine kadar her gün bir orta değişim (200 μL / kuyu) gerçekleştirin.
4. Bileşik eklemeden önce son orta değişim (Gün 5-7)
- Bileşik eklemeden 4-6 saat önce son bir ortam değişimi gerçekleştirin.
- Esnek bir 96 delikli plaka için en az 22 mL tahlil tamponunu ısıtın. Tahlil tamponu, bakım ortamından veya bunların türevlerinden oluşur (örneğin, düşük / hiç serum ortamı, fenol kırmızısı içermeyen ortam veya diğer izotonik tamponlar).
- Taze ortamı steril bir reaktif haznesine aktarın ve laboratuvar otomasyon robotunun hemen yanında bırakın. Robota boş bir reaktif haznesi yerleştirin ve orta temizleme işlemini gerçekleştirin. Daha sonra, atık ortamını içeren reaktif rezervuarını, taze ortamı içeren reaktif rezervuarı ile değiştirin ve taze ortamın 200 μL / kuyucuğunu dağıtın.
- Orta değişimden hemen sonra, esnek plakayı inkübatöre geri aktarın.
5. Bileşik toplama ve veri kaydı (Gün 5-7)
NOT: Deney için örnek bir ölçüm planı Ek Şekil 3'te verilmiştir.
- Steril normal 96 derinliğinde bir kuyu plakası kullanarak laminer akış davlumbazında 4x konsantrasyonda bileşik başına çalışma çözeltisi hazırlayın. Bileşik çözelti, adım 4'te kullanılan tahlil tamponuna dayanır. Bileşik çözeltiyi içeren 96 derinliğindeki kuyucuk plakasını, esnek plaka ile aynı duruma ayarlamak için en az 1 saat boyunca inkübatöre aktarın.
NOT: Her deney için kullanılan her ilacın 1x konsantrasyonu şekil ve efsanelerde verilmiştir. - Bir taban çizgisi ölçümü yapmadan önce plakayı ilgili ölçüm cihazına 1 saat aktarın.
- Kontrol yazılımında (hibrit hücre analiz sisteminin bir parçası) Düzenleme Protokolü'nü açın ve ilgili ölçüm modu kontraktilitesini veya empedansını/EFP'yi seçin.
- Süpürme süresini (bir ölçümün uzunluğu; örneğin, 30 sn) ve tekrarlama aralığını (ölçümler arasındaki süre; örneğin, 5 dakika) tanımlayın ve protokol numarasını kaydedin.
- Protokolü başlat > Devam'ı seçin ve istenen alanları doldurun.
- Son olarak, Ölçümü başlat'ı seçin. Bileşik eklemeden kısa bir süre önce 5 dakikalık aralıklarla en az üç temel ölçüm (süpürme) gerçekleştirin.
NOT: Bileşik ilavesinden önce kontraktilite modülünü kullanan bir kontraktilite taban çizgisi ölçümünün örnek verileri Ek Şekil 4'te gösterilmiştir. - Esnek 96 delikli plakayı ölçüm cihazından çıkarmadan her bir kuyucuktan 50 μL tahlil tamponunu çıkarın.
- Ölçüm planına göre, plakanın her bir kuyucuğuna 4x konsantre bileşik çözeltinin 50 μL'sini ekleyin.
- Bölge işaretçisi ekle'yi seçin ve bileşik toplama işleminden sonra bileşik plaka düzenini ve bileşik çözeltisinin hacmini tanımlayın.
- Son olarak, Standart ölçümle devam et veya Deneysel plana göre ölçüm serileriyle ilerle'yi seçin.
6. Veri analizi
- Kayıt yazılımıyla, uzunluğu ve tekrarlama aralığı kullanıcı tarafından tanımlanan ölçüm süpürmeleri.
- Analiz yazılımıyla, genlik, vuruş hızı, darbe genişliği ve benzeri parametreleri otomatik olarak okuyarak sinyalin şeklini yakalayın.
NOT: Ortalama vuruş olarak adlandırılan standart sapmayı içeren ortalama bir sinyal, bir taramanın verilerine dayanarak otomatik olarak hesaplanır. Kullanıcı, yazılımın hesapladığı ve görüntülediği kontraktilite/IMP/EFP parametrelerini tanımlayabilir. - Analiz yazılımı ile her bileşik için doz-yanıt eğrisini ve IC50/EC50'yi hesaplayın.
NOT: Ham veriler ve analiz yazılımı ile oluşturulan analiz sonuçları, çeşitli formatlarda kolayca dışa aktarılabilir. Son olarak, deneysel sonuçları özetlemek ve arşivlemek için veri raporları otomatik olarak oluşturulur. Bir EFP sinyalinin ne ve nasıl ölçüldüğüne dair kapsamlı bir açıklama 17'de tartışılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kinaz inhibitörü erlotinibin hiPSC-CM'lerin kontraktilitesi üzerine etkileri Şekil 1'de gösterilmiştir. Hücreler 5 gün boyunca 10 nM ila 10 μM arasında değişen konsantrasyonlarla tedavi edildi ve günlük vuruş parametreleri kaydedildi. Nispeten düşük kardiyotoksisite riski olan bir EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) ve tirozin kinaz inhibitörü olan Erlotinib, sadece mikromolar aralıktaki konsantrasyonlarda hiPSC-CM'ler üzerinde küçük bir doz ve zamana bağlı etkiye sahipti. En düşük konsantrasyonda (10 nM), erlotinib bileşik uygulamasından sonra ilk ölçümde genlikte istatistiksel olarak önemsiz bir azalmaya neden oldu (1 saat). Sonraki tüm ölçümlerde, bu konsantrasyonda karşılaştırılabilir bir etki ölçülmemiştir. Geçici azalma, bir bileşik etkisinin sonucu olabilir, ancak aynı zamanda, örneğin termal veya mekanik nitelikte, bileşik ekleme prosedürü sırasında vuruş deseninin geçici bir bozulmasından da kaynaklanabilir. Erlotinibin mikromolar konsantrasyonları hafif fakat önemli zaman ve doza bağlı kardiyotoksik etkiler göstermiştir. Etkinin başlangıcı 1 μM erlotinib ile 96 saatten itibaren görülürken, 10 μM, bileşik ilavesinden sadece 24 saat sonra önemli bir azalmaya neden oldu.
Kemoterapi ajanı epirubisin, hiPSC-CM'ler üzerinde hem zamana hem de doza bağımlı bir etkiye sahipti (Şekil 2). Hücreler, 10 μM epirubisin uygulamasından sonra 24 saat içinde atmayı bıraktı. 1 μM ile, genlikte% 44'e ± 24 saat sonra kontrolün% 2'sine kadar ciddi bir düşüş, bileşik ilavesinden sonra 48 saate kadar tam bir atım bırakma izledi. 100 nM'de, 5 günlük bir süre boyunca atım genliğinde zamana bağlı bir azalma gözlendi ve 5. günde% 25 ±% 3'lük bir kalıntı genlik gözlendi. 10 nM'lik en düşük konsantrasyonda, epirubisinin etkisi sadece doza bağımlıydı, ancak ilk ölçümden başlayarak zamana bağlı değildi (bileşik ilavesinden 1 saat sonra). Genlik, 5 günlük süre boyunca kontrolün% 60-80'i arasında istikrarlı bir şekilde dalgalandı. Bu gruptaki sapmalar, daha yüksek konsantrasyonlara kıyasla daha büyüktü. Bunun olası bir nedeni, bu konsantrasyonun kuyuların sadece bir kısmı üzerinde ölçülebilir bir etkiye sahip olması olabilir.
Doksorubisin başka bir antrasiklin ilaç sınıfıdır ve hiPSC-CM'lerin hücre canlılığı, zaman içinde baz empedansı izlenerek araştırılmıştır. Şekil 3, 300, 1, 3 ve 10 μM doksorubisine 24 saat maruz kalmanın, hücre canlılığını konsantrasyon ve zamana bağlı bir şekilde azalttığını göstermektedir.
Nifedpinie, öncelikle L-tipi kalsiyum kanallarını bloke eden bir dihidropiridin kalsiyum kanal blokeridir. Hücre canlılığının 24 saat boyunca uzun süreli izlenmesi, toksisitenin bir ölçüsü olarak kullanılan baz empedansının zamana ve konsantrasyona bağlı bir azalmasını ortaya koymaktadır (Şekil 4A). Artan nifedipin konsantrasyonlarının (3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM) uygulanması üzerine, hiPSC-CM'ler üzerindeki alan potansiyel kayıtları, beklendiği gibi normalleştirilmiş alan süresinin (FPD) konsantrasyona bağlı bir kısalmasını ortaya koymaktadır (Şekil 4B, C). Kardiyak kontraktiliteye ilişkin nifedipin değerlendirmesi de akut ölçümlerde 10 nM ve 30 nM konsantrasyonlarında konsantrasyona bağlı genlikte anlamlı bir azalma göstermiştir (Şekil 5).
Hibrid hücre analiz sistemi ile elde edilen sonuçlar, hiPSC-CM'lerin üç kardiyak sonlanım noktasının (kontraktilite, yapı ve elektrofizyoloji) tek bir sistem kullanılarak değerlendirilebileceğini göstermektedir.
Şekil 1: 5 gün boyunca erlotinib ile tedavi edilen insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilite değerlendirmesi. X ekseni zamanı saat cinsinden gösterir, y ekseni parametre genliğini yüzde cinsinden çizer. Yıldız işaretleri, p < 0.05 (*) veya p < 0.01 (**) ile istatistiksel anlamlılığı temsil eder (Wilcoxon Mann Whitney testi, n = 4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 5 gün boyunca kardiyotoksik antrasiklin epirubisin ile tedavi edilen insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin kontraktilite değerlendirmesi. X ekseni zamanı saat cinsinden gösterir, y ekseni parametre genliğini yüzde cinsinden çizer. Yıldız işaretleri, p < 0.05 (*) veya p < 0 ile istatistiksel anlamlılığı temsil eder. 01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney testi, n = 4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Doksorubisin tedavisi sonrası insan iPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin baz empedansı. İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin baz empedansının 300, 1, 3 ve 10 μM doksorubisine 24 saat maruz kalması için zaman seyri (n = 5). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin empedansı ve EFP kayıtları. (A) İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin baz empedansının 3, 10, 30 ve 100 nM nifedipine maruz kaldıktan sonra 24 saat boyunca zaman seyri (n = 5). (B) İnsan iPSC türevi kardiyomiyositlerin alan potansiyel süresinin 3, 10, 30 ve 100 nM nifedipine maruz kalması üzerine 1 saat boyunca zaman seyri (n = 5). (C) Empedans/EFP plakasının elektrot düzeni. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 20 dakika boyunca nifedipin ile tedavi edilen insan iPSC türevi kardiyomiyositlerin kontraktilite değerlendirmesi (kontraktilite modülü). X ekseni zamanı min cinsinden gösterir, Y ekseni parametre genliğini yüzde cinsinden çizer. Yıldız işaretleri p < 0 ile istatistiksel anlamlılığı temsil eder. 05 (*) veya p < 0.01 (**) (Wilcoxon Mann Whitney testi, n = 4). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Kontraktilite parametreleri ve kontraktilite modülü ile değerlendirilen ham veriler. (Solda) Kontraktilite modülü ile değerlendirilen parametreler. Parametreler: Kasılma kuvvetinin genliği (mN/mm2), vuruş süresi, yukarı vuruş ve aşağı vuruş hızı, eğri altında yukarı ve aşağı vuruş alanı (AUC), vuruş hızı, vuruş hızı değişimleri, aritmik olaylar. (Sağda) Tedavi edilmeyen kardiyomiyosit (A) atma hızı, (B) vuruş hızı değişimleri, (C) kasılmalardan sonra erken ve (D) aritmik olaylar içeren bir kuyunun kontraktilitesi ham veri kayıtları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Kontraktilite ve empedans/EFP ölçümü için iş akışı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 3: 96 delikli bir plaka için bir ölçüm planının örnek düzeni. Dört konsantrasyon ve dört kopya ile dört bileşik (kırmızı, açık yeşil, kahverengi ve koyu yeşil ile vurgulanır) tasvir edilmiştir. Pozitif ve negatif kontroller (örneğin, kültür öncesi koşullar ve DMSO) sarı renkle vurgulanır. Yedekleme hücreleri mavi renkle vurgulanır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 4: Bileşik eklemeden önce kontraktilite modülünü kullanan bir kontraktilite taban çizgisi ölçümünün örnek verileri. Her grafikte, bir taramanın tüm büzülme döngülerinin ortalaması gösterilmektedir. Vuruş hızını görselleştirmek için, iki ardışık kasılma gösterilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Empedans/EFP/kontraktiliteli hibrid sistem, klinik öncesi ilaç geliştirme için kardiyak yükümlülüklerin yüksek verim güvenliği farmakolojik ve toksikolojik değerlendirmesi için kapsamlı bir metodolojidir. Hayvan modelleri kullanılmadan klinik öncesi güvenlik testleri için modern bir yaklaşım sağlar, ancak zaman ve maliyetleri önemli ölçüde azaltan daha yüksek verim yetenekleri ile. Bu sistem, Langendorff Kalbi ve klinik öncesi fonksiyonel ve yapısal toksisite değerlendirmesi için diğer hayvan modelleri için tamamlayıcı bir yaklaşım olarak kullanılma potansiyeline sahiptir.
Hayvansız bir yaklaşım olarak, hibrid sistem20 için insan iPSC-CM'leri kullanılmaktadır. Burada, insan iPSC-CM'leri üzerinde olgunlaşma yanlısı etkiye sahip özel esnek 96 kuyucuklu plakalar, diğer hücre bazlı tahlillere kıyasla önemli bir avantaj sağlar21,22, çünkü verim ve fizyolojik bir ortam, daha yetişkin benzeri insan kardiyak risk değerlendirmesi 6,15 için benzersiz bir şekilde birleştirilmiştir.
Protokoldeki en kritik adım, özellikle akut etkilerin incelenmesi gerektiğinde, bileşiğin uygulanmasıdır. Hücreler mekanik kuvvetler ileten yumuşak substratlar üzerinde kültürlendiğinden, plaka kullanımı sırasında aşırı hızlanma ve pipetleme sırasında kesme kuvvetlerinin uygulanması, kasılma parametrelerinde geçici (5-10 dakika) değişikliklere neden olabilir ve kaçınılmalıdır. Genel olarak, membranların bozulmasını önlemek için ortam değişimleri sırasında dikkatli olunmalıdır. Laboratuvar otomasyon ekipmanlarının kullanılması önerilir.
Bileşik analizi yapılmadan önce, 5-7 günlük bir kültür öncesi adım gereklidir, böylece genellikle kriyo-korunmuş bir durumda edinilen insan iPSC-CM'leri çözülme prosedüründen kurtulabilir ve uygun bir sinsityum oluşturabilir. Her iki modül için de büzülme genliği ve atma hızı, genellikle 5-7. günler arasında gerçekleşen ölçümün ideal başlangıç noktası hakkında fikir verir. Temel ölçüm, incelenen hiPSC-CM'ler için dahil etme kriteri olarak kullanılan fonksiyonel taban çizgisi özelliklerini tanımlamak için kritik bir adımdır3. Temel değerlerin bileşik tedaviden hemen önce kaydedilmesi gerekir, böylece kasılma davranışındaki değişiklikler tedavi dışı koşullarla karşılaştırılabilir (Ek Şekil 3).
Değişkenliklerin muhasebeleştirilmesi ve tanımlanmış temel özelliklere sahip olmak, hiPSC-CM'nin başarılı ölçümleri ve veri yorumlama için anahtardır. Bu nedenle, Gintant ve ark.'nın en iyi uygulama önerileri, hibrit hücre analiz sistemi kullanılarak takip edilir; Örneğin, taban çizgisi bileşik eklemeden önce kaydedilmelidir ve taban çizgisi kaydı belirli önkoşulları yerine getirmelidir3.
Esnek 96 delikli plakalar kırılgan membranlarla donatılmış olsa da, dikkatli kullanımla birlikte sağlanan bir koruyucu plaka hasarı önleyecektir. Membranlar, hücrelerin düşük içsel biyouyumluluğa sahip silikon substrata stabil bir şekilde bağlanmasını sağlamak için ön işlemden geçirilir. Tedavi en az 6 ay boyunca stabildir. Hücreler sürekli olarak 37 ° C'de tutulurken, silikon malzemelerin mekanik özellikleri geniş bir sıcaklık aralığında kararlıdır. Ek olarak, ne ilaçlar ne de çözücüler, hücre bazlı tahlillerde kullanılan konsantrasyonlarda silikonun özelliklerini etkilemez (örneğin, DMSO konsantrasyonları% 0.1'in altında kalır).
Sistem, ticari olarak temin edilebilen çok çeşitli hiPSC-CM'lerle doğrulanmış ve optimize edilmiştir. Özel yapım hücreler kullanıldığında, optimum hücre bağlantısı için standart hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin test edilmesi önerilir (örneğin, fibronektin, EHS matrisi ve poli-L-lizin 6,15).
Elektrofizyoloji, kalsiyum sinyalizasyonu ve kontraktilite, preklinik gelişimde ele alınan üç ana kardiyak sonlanım noktasıdır. Hibrid sistem şu anda bu kardiyak sonlanım noktalarından ikisini analiz etmekle sınırlıdır: kontraktilitesi ve elektrofizyolojisi. Kardiyomiyositlerde kalsiyum sinyalizasyonu doğrudan analiz edilemez, ancak kontraktilitesi ve elektrofizyolojik özellikleri ile teğet olarak tespit edilir.
Hem empedans/EFP hem de büzülme kuvveti ölçümü kardiyomiyositlerin tek katmanlı ile gerçekleştirilir. Kasılma ölçümü sırasında fizyolojik mekanik substrat sertliğinin avantajına rağmen, hücreler gerçek insan dokusunun üç boyutlu ortamını deneyimlemezler. Öte yandan, bu, pahalı kök hücre türevi hücre modellerinin sadece bir kısmının standart laboratuvar ekipmanlarıyla kullanılmasına izin verir. Bu nedenle, bu uygulama in vivo / ex vivo veya 3D modellere kıyasla uygun bir maliyet, sağlamlık ve öngörücülük ilişkisine sahip olmayı vaat ediyor. Hibrit sistemin gelecekteki uygulamaları, düz kas hücreleri gibi diğer kasılma hücre tiplerinin analizini içerebilir. Kardiyovasküler homeostazın düzenlenmesinde, bu hücreler kardiyomiyositlerin muadilleri olarak önemli bir rol oynamaktadır. Hibrit sistem ayrıca insan iPSC-CM'lerinin optik stimülasyonu gibi belirli projeler için eklentiler sağlar. Bu amaçla, kültür öncesi zamanlarda Channelrhodopsin-2 ile transfekte edilen insan iPSC-CM'lerinin uyarılması için her iki modüle de özel bir optik kapak uygulanabilir.
Bu nedenle, empedans/EFP/kontraktiliteli hibrid sistem, üç farklı kardiyak sonlanım noktasını (kontraktilite, yapısal değişiklikler ve elektrofizyoloji) tek bir metodoloji içinde analiz ederek modern preklinik güvenlik ve toksisite değerlendirmesine olanak tanır. Bu uç noktaları yüksek verim seviyesinde insan tabanlı bir kardiyak hücre modeli ile ele almanın avantajı, bu hibrit sistemi klinik öncesi kardiyak risk değerlendirmesinin mevcut perspektiflerinin ötesine taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
B.L., M.Go. ve P.L., esnek plakaların üreticisi olan innoVitro GmbH'de çalışmaktadır. U.T., E.D., M.L., M.Ge., N.F. ve S.S., hibrit cihazın üreticisi Nanion Technologies GmbH'de çalışmaktadır.
Acknowledgments
Bu çalışma, Alman Federal Ekonomik İşler ve İklim Eylemi Bakanlığı (ZIM) ve Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı'ndan (KMUinnovativ) gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışmada kullanılan kardiyomiyositleri nazik bir şekilde sağladığı için FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc.'e (Madison, WI, ABD) ve kardiyomiyositleri nazik bir şekilde sağladığı için Ncardia B.V.'ye (Leiden, Hollanda) teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial human iPSC-derived cardiomyocytes | Fujifilm Cellular Dynamics International (FCDI) | R1059 | |
| Centrifuge (50 mL tubes) | Thermo Fisher Scientific | 15878722 | |
| 12-channel adjustable pipette (100-1250 μL) | Integra Biosciences | 4634 | |
| DPBS with Ca2+ and Mg2+ | GE Healthcare HyClone | SH304264.01 | |
| 96 deep well plate | Thermo Fisher Scientific | A43075 | |
| EHS gel | Extracellular Matrix Gel | ||
| FLEXcyte 96/CardioExcyte hybrid device | Nanion Technologies | 19 1004 1005 | Hybrid cell analysis system |
| FLX-96 FLEXcyte Sensor Plates | Nanion Technologies | 20 1010 | |
| Fibronectin stock solution (Optional to Geltrex) | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | ThermoFischer Scientific | A1569601 | |
| Human iPSC-derived cardiomyocytes plating and maintenance medium | FCDI | R1059 | |
| Incubator (37 °C, 5% CO2) | Thermo Fisher Scientific | 51023121 | |
| Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 51032678 | |
| NSP-96 CardioExcyte 96 Sensor Plates 2.0 mm transparent | Nanion Technologies | 20 1011 | |
| Pipette tips (1250µL) | Integra Biosciences | 94420813 | |
| Reagent Reservoir | Integra Biosciences | 8096-11 | |
| Serological pipette (e.g. 25 mL) | Thermo Fisher Scientific | 16440901 | |
| Single channel adjustable pipette (e.g. 100-1000 μL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Vacuum aspiration system | Thermo Fisher Scientific | 15567479 | |
| Optional: VIAFLO ASSIST | Integra Biosciences | 4500 | Lab automation Robot |
| Water bath (37 °C) | Thermo Fisher Scientific | 15365877 |
References
- Weaver, R. J., Valentin, J. -P. Today's challenges to de-risk and predict drug safety in human "mind-the-gap". Toxicological Sciences. 167 (2), 307-321 (2019).
- Burnett, S. D., Blanchette, A. D., Chiu, W. A., Rusyn, I. Human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiomyocytes as an in vitro model in toxicology: strengths and weaknesses for hazard identification and risk characterization. Expert Opinion on Drug Metabolism Toxicology. 17 (8), 887-902 (2021).
- Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
- Pang, L. Toxicity testing in the era of induced pluripotent stem cells: A perspective regarding the use of patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiac safety evaluation. Current Opinion in Toxicology. 23, 50-55 (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Gossmann, M., et al. Integration of mechanical conditioning into a high throughput contractility assay for cardiac safety assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 105, 106892 (2020).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. New Methods in Cardiovascular Biology. 107 (1), 35-44 (2010).
- Zuppinger, C. 3D Cardiac cell culture: a critical review of current technologies and applications. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 87 (2019).
- Laverty, H. G., et al. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines. British Journal of Pharmacology. 163 (4), 675-693 (2011).
- Volkova, M., Russel, R. Anthracycline cardiotoxicity: prevalence, pathogenesis and treatment. Current Cardiology Reviews. 7 (4), 214-220 (2011).
- Bozza, W., et al. Anthracycline-induced cardiotoxicity: molecular insights obtained from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs). The AAPS Journal. 23 (2), (2021).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Brown, G. E., Khetani, S. R. Microfabrication of liver and heart tissues for drug development. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), 20170225 (2018).
- Scott, C. W., et al. An impedance-based cellular assay using human iPSC-derived cardiomyocytes to quantify modulators of cardiac contractility. Toxicological Sciences. 142 (2), 313-338 (2014).
- Gossmann, M., et al. Mechano-pharmacological characterization of cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 38 (3), 1182-1198 (2016).
- Rappaz, B., et al. Automated multi-parameter measurement of cardiomyocytes dynamics with digital holographic microscopy. Optics Express. 23 (10), 13333-13347 (2015).
- Doerr, L., et al. New easy-to-use hybrid system for extracellular potential and impedance recordings. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 175-188 (2014).
- Obergrussberger, A., et al. Safety pharmacology studies using EFP and impedance. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 223-232 (2016).
- Bot, C., et al. Cross-site comparison of excitation-contraction coupling using impedance and field potential recordings in hiPSC cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 93, 46-58 (2018).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Edwards, S. L., et al. A multiwell cardiac µGMEA platform for action potential recordings from human iPSC-derived cardiomyocyte constructs. Stem Cell Reports. 11 (2), 522-536 (2018).
- Zlochiver, V., Kroboth, S., Beal, C. R., Cook, J. A., Joshi-Mukherjee, R. R.Human iPSC-derived cardiomyocyte networks on multiwell micro-electrode arrays for recurrent action potential recordings. Journal of Visualized Experiments. (149), e59906 (2019).
