Summary
يتم تقديم طرق لإعداد النيماتكس النشطة من الأنابيب الدقيقة ومحركات kinesin ، بما في ذلك تحضير البروتين وبنائه واستخدام الآبار للحبس النيماتيكي النشط.
Abstract
أصبح تكوين المراحل النشطة القائمة على البوليمر الحيوي تقنية مهمة للباحثين المهتمين باستكشاف المجال الناشئ للبلورات السائلة النشطة وأدوارها المحتملة في بيولوجيا الخلية. تتكون هذه الأنظمة الجديدة من وحدات فرعية ذاتية القيادة تستهلك الطاقة محليا ، وتنتج سائلا ديناميكيا غير متوازن. لتشكيل المرحلة البلورية السائلة النشطة الموصوفة في هذا التقرير ، يتم الجمع بين مكونات البروتين المنقى بما في ذلك البوليمرات الحيوية والمحركات الجزيئية ، وتتشكل المرحلة النيماتيكية النشطة تلقائيا في وجود أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). لمراقبة الحالة النيماتيكية ، يجب أن تكون المادة محصورة في هندسة مناسبة للفحص المجهري بكثافة عالية بما يكفي. توضح هذه المقالة طريقتين مختلفتين لتشكيل مرحلة نيماتيكية نشطة باستخدام الأنابيب الدقيقة ومحركات كينيسين: تجميع طبقة نشطة ثنائية الأبعاد في واجهة زيت وماء وتجميع تحت طبقة زيت باستخدام بئر مرن. كما تم وصف تقنيات إدخال المادة الفعالة في آبار صغيرة بأشكال مختلفة.
Introduction
تتكون السوائل النشطة من جزيئات أو عناصر مدفوعة بالطاقة تستمد الوقود من بيئتها المحلية. في ظل الظروف المناسبة ، يمكن لهذه العناصر النشطة المتحركة أن تعمل بشكل جماعي لإنتاج ديناميكيات السوائل الناشئة على نطاقات طول طويلة. هناك مجموعة متنوعة من الأمثلة على سلوك المرحلة غير المتوازنة في الأدبيات ويمكن العثور على المراحل النشطة عبر طيف الأنظمة الحية. بعض الأمثلة البارزة هي مستعمرات البكتيريا1 ، صفائح الخلايا 2,3 ، وتدفق أو سرب الكائنات الحية 4,5. كما تمت دراسة المراحل النشطة على نطاق واسع في المراحل المكثفة من خيوط الهيكل الخلوي ، إما كجزء من الخلية6 أو في الأنظمة الاصطناعية المصممة للاستفادة من المكونات المستخرجة بيولوجيا7،8،9. يعتبر الترتيب البلوري السائل وتشكيل العيوب الطوبولوجية في كل من الأنظمة التي تحدث بشكل طبيعي والاصطناعية المجمعة من المستخلصات البيولوجية ذات أهمية خاصة لمجتمع البحث. في السنوات الأخيرة ، درست مجموعات البحث مثل هذه الأنظمة ، وخصائصها الفيزيائية الأساسية ، وصلتها بالبيولوجيا2،3،10،11.
تركز هذه الورقة على تكوين الحالة النيماتيكية النشطة من مزيج من الأنابيب الدقيقة والبروتينات الحركية الكينيسينية. البلورة السائلة النيماتيكية التقليدية هي مرحلة توازن للمادة تظهر فيها الجزيئات المكونة ترتيبا اتجاهيا. على سبيل المثال ، قد يظهر سائل يتكون من جزيئات صلبة نسبيا تشبه القضيب كلا من الطور النيماتيكي ، وفي درجات الحرارة المرتفعة ، مائع غير موجه في المرحلة12. تم تطوير أول مثال تجريبي لمرحلة نيماتيكية نشطة بواسطة Sanchez et al.13 ، مع تكييف تجربة سابقة في المختبر 14 حيث تم استخدام مجموعات من البروتينات الحركية لإنتاج حركة قص بين حزم الأنابيب الدقيقة المجاورة. عندما اقتصر نظام الأنابيب الدقيقة هذا على طبقة رقيقة ، ظهر ترتيب نيماتيكي عفوي. في السنوات الأخيرة ، تمت دراسة الحالة النيماتيكية النشطة بشكل مكثف من قبل العديد من المجموعات البحثية التجريبية15,16 والنظرية 17,18 ، مع التركيز على ظواهر مثل الاضطراب النشط - وهي حالة ينتج فيها السائل تدفقات فوضوية ذاتية الحركة 19 - والعيوب الطوبولوجية المتنقلة. يصف هذا البحث طرق تحضير وتشكيل الحالة النيماتيكية النشطة من الأنابيب الدقيقة ومحركات الكينيسين في أشكال هندسية تجريبية مختلفة. أولا ، يتم وصف طرق التحضير لحلول المكونات المختلفة ، تليها طرق لتشكيل النيماتيكية النشطة باستخدام هندسين مختلفين لغرفة التدفق. يتم عرض نتائج التصوير النموذجية. أخيرا ، يتم وصف طرق حصر النيماتيك النشط في الآبار والقنوات.
Protocol
1. تحضير المادة الفعالة
ملاحظة: يتم تجميع النيماتيك النشط 2D في عملية من ثلاث خطوات. أولا ، يتم تحضير محلولين منفصلين: أ) الأنابيب الدقيقة المبلمرة والمستقرة و ب) MIX (محلول يحتوي على محركات كينيسين). يتم الجمع بين هذه ويبدأ النشاط عند إضافة أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). ثم يتم حصر المادة في هندسة مناسبة ، بحيث تكون كثافتها عالية بما يكفي لظهور النظام النيماتيكي. يتم تضمين بروتوكولات لإعداد جميع المكونات الضرورية وكيفية تجميع المرحلة النشطة.
- إعداد مجموعة البروتين الحركي Kinesin
- التعبير عن وتنقية البروتينات الحركية المؤتلفة K401-BIO (محركات K401) من الإشريكية القولونية باتباع البروتوكول الذي وضعه إدغار سي يونغ20.
ملاحظة: بروتينات المحرك K401-BIO ثنائية وتتكون من رأسين متصلين بساق حلزوني. تم توفير المحركات من قبل مرفق برانديز للمواد الحيوية واستخدمت كما ورد سابقا16. لأغراض تكوين نيماتيكي نشط ، يتم توصيل جزيئات الكينيسين بالبيوتينيل ثم توصيلها عبر رابط الستربتافيدين لتشكيل مجموعات كينيسين تصل إلى أربعة محركات13،15،21،22. من المفيد التعبير عن الكينيسين بعلامة بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). - بعد تنقية وحضانة الستربتافيدين والمحركات على الجليد لمدة 40 دقيقة ، قم بتجميد محركات K401 في النيتروجين السائل في حصص 5 ميكرولتر بتركيز نهائي قدره 0.7 مجم / مل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. قم بإذابة الكينيسين برفق عند الحاجة ولا تعيد تجميده. - تحضير مجموعات من كينيسين المسمى بالبيوتين (المملكة العربية السعودية) عن طريق خلط 24٪ من محركات K401 0.7 مجم / مل ، و 27 مجلد٪ من 0.325 مجم / مل ستربتافيدين ، و 3 مجلد٪ من 5 مللي مول ديثيوثريتول (DTT) (لمنع التجميع) عند 4 درجات مئوية في 46 مجلد٪ M2B عازلة (80 مللي متر أنابيب [1،4-بيبيرازين ديثانيسلفونيك حمض ، درجة الحموضة 6.8] ، 2 مللي متر MgCl2 ، و 1 مللي متر EGTA [إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل إيثر) -N ، N,N′,N′-حمض رباعي الأسيتيك]). دع المملكة العربية السعودية تحتضن على الجليد لمدة 40 دقيقة.
- التعبير عن وتنقية البروتينات الحركية المؤتلفة K401-BIO (محركات K401) من الإشريكية القولونية باتباع البروتوكول الذي وضعه إدغار سي يونغ20.
- إعداد محلول الأنابيب الدقيقة
ملاحظة: Guanosine-5'-[(α,β)-methyleno] ثلاثي الفوسفات ، ملح الصوديوم (GMPCPP) هو نظير قابل للتحلل ببطء ل Guanosine triphosphate (GTP) ، والأنابيب الدقيقة المتكونة في وجود GMPCPP أكثر صلابة بثلاث مرات من الأنابيب الدقيقة GTP23 وأقصر. يعد استخدام الأنابيب الدقيقة القصيرة والصلبة مناسبا لتشكيل المرحلة النيماتيكية النشطة حيث تتحد هذه العوامل لتعزيز الترتيب البلوري السائل.- بلمرة التوبولين الدائري غير المسمى (99٪ ، انظر جدول المواد) باستخدام 0.6 mM GMPCPP بتركيز توبولين 6 مجم / مل.
ملاحظة: يمكن أيضا تنقية توبولين عالي الجودة من دماغ الأبقار أو الخنازير باتباع البروتوكولات المعمول بها أو الحصول عليها من مصدر موثوق آخر مثل مرفق برانديز للمواد الحيوية حيث يمكن شحن المواد مجمدة لمنع التلف. لتنقية التوبولين من دماغ الأبقار ، يرجى الرجوع إلى البروتوكول المنشور من Bate et al.24. لتنقية التوبولين من دماغ الخنازير ، راجع البروتوكولات المنشورة من Castoldi et al.25 و Tayar et al.26. - استعدادا للبلمرة ، قم بإعداد حمام حراري عند 37 درجة مئوية وقم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية. ادمج محلول التوبولين غير المسمى في المخزن المؤقت M2B (الخطوة 1.1.3) في أنبوب طرد مركزي فائق سعة 500 ميكرولتر مع توبولين يحمل علامة 4٪ مولي (انظر جدول المواد) لإنتاج 4٪ من الأنابيب الدقيقة الموسومة بعد البلمرة.
- تحقق من تركيز التوبولين باستخدام مقايسة برادفورد27. يجب أن يكون إجمالي تركيز التوبولين في أنبوب الطرد المركزي 6.5-6.9 مجم / مل.
- احتضان خليط التوبولين على الثلج لمدة 10 دقائق وأجهزة الطرد المركزي الفائقة لمدة 10 دقائق عند 352700 × جم عند 4 درجات مئوية. هذه الخطوة تزيل توبولين مختل وظيفيا ، والذي سيكون في بيليه.
- باستخدام ماصة ، استخرج بعناية المادة الطافية التي تحتوي على توبولين وظيفي في أنبوب طرد مركزي دقيق. أضف GMPCPP إلى تركيز نهائي قدره 0.6 mM للحث على بلمرة tubulin و DTT إلى تركيز نهائي قدره 1 mM لمنع تراكم البروتين.
- احتضان الخليط في حمام حراري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 14000 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الطافية ، ثم قم بتخفيف الحبيبات باستخدام المخزن المؤقت M2B للوصول إلى تركيز نهائي للأنابيب الدقيقة يبلغ 6 مجم / مل.
ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات على الأقل قبل الاستخدام. - للتحقق من بلمرة الأنابيب الدقيقة بنجاح ، قم بتخفيف 1 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة 100: 1 باستخدام المخزن المؤقت M2B والماصة على شريحة مجهرية. قم بتغطيتها بغطاء زلة للتصوير باستخدام مجهر مضان (انظر جدول المواد) بعدسة موضوعية 40x.
ملاحظة: يتم اختيار الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث وفقا لملصق التألق المستخدم على الأنابيب الدقيقة. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام وضع العلامات على الرودامين (انظر الخطوة 1.2.2) ، لذلك يتم التصوير باستخدام شريط إثارة من 515-560 نانومتر ومرشح تمرير طويل 590 نانومتر. يوضح الشكل 1 مثالا تمثيليا. - بعد اكتمال البلمرة ، قم بإسقاط وتجميد الأنابيب الدقيقة على شكل 2 ميكرولتر في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية (إذا لزم الأمر).
- بلمرة التوبولين الدائري غير المسمى (99٪ ، انظر جدول المواد) باستخدام 0.6 mM GMPCPP بتركيز توبولين 6 مجم / مل.
- إعداد ميكس
ملاحظة: MIX هو محلول مائي يتضمن مجموعات كينيسين-ستربتافيدين (المملكة العربية السعودية). يجب تخزين MIX المحضر عند -80 درجة مئوية في 4 ميكرولتر قبل التجربة. عندما يتم دمج MIX مع ATP ومحلول الأنابيب الدقيقة الموصوف في الخطوة 1.2 في درجة حرارة الغرفة ، يبدأ النشاط. يتم إعداد MIX على النحو التالي13,19.- قم بإعداد محلول لمنع تلاشي التألق (ANTIFADE) عن طريق خلط محلولين مضادين للأكسدة. اجمع AO1 (250 مليمول DTT، 65 مليمول كاتالاز) وAO2 (750 ميكرومتر كاتالاز، 3 مليمول جلوكوز أوكسيديز) بنسبة حجم 1:1. تشمل 20 mM Trolox ، وهو مضاد أكسدة آخر يستخدم لتقليل الضرر الناجم عن الفحص المجهري الفلوري.
- قم بإعداد MIX عن طريق صنع محلول من المملكة العربية السعودية (موصوف في الخطوة 1.1.3) يتضمن 6٪ بالوزن 20 كيلو دالتون من البولي إيثيلين جلايكول (PEG) للحث على تجميع الأنابيب الدقيقة ، و 3 ٪ ANTIFADE ، و 5 vol٪ بيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتيك (PKLDH) عند 70 ملغ / مل لتجديد ATP.
2. خلق النيماتيكية النشطة
ملاحظة: يبدأ النشاط في المادة بإضافة ATP. يتم تحضير الشبكة النشطة طازجة لكل تجربة عن طريق إضافة ATP بتركيز عال بما يكفي لتحفيز النشاط الحركي. لتشكيل مرحلة نيماتيكية نشطة موحدة ومتطورة بالكامل ، يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة بكثافة عالية بما فيه الكفاية. يمكن تحقيق ذلك عن طريق حصر الأنابيب الدقيقة بين سائلين غير قابلين للامتزاج لتشكيل طبقة نيماتيكية نشطة ثنائية الأبعاد (2D). تم تطوير هذه الطريقة في الأصل في جامعة برانديز13 ولا تزال تقنية شائعة لإنتاج مرحلة نيماتيكية متجانسة وعالية الجودة ونشطة.
- طريقة خلية التدفق لتشكيل نيماتيكي نشط
- إعداد أغطية ماء مع طلاء الأكريلاميد.
- نظف الأغطية جيدا بالماء والصابون والإيثانول و 0.1 M NaOH مع شطف بديل باستخدام ماء نانوبي. بمجرد شطفها ، قم بتغطية الأغطية بمحلول سيلان يتكون من 100 مل من الإيثانول ، و 1 مل من حمض الأسيتيك ، و 500 ميكرولتر من 3- (تريميثوكسي سيلليل) بروبيل ميثاكريلات لمدة 15 دقيقة ، ثم اشطفها بالماء النقي النانوي.
- قم بإعداد محلول أكريلاميد من 95 مل من الماء النقي النانوي و 5 مل من مادة الأكريلاميد 40٪ بالوزن ، ثم قم بإزالة الغاز من المحلول لمدة 30 دقيقة في فرن مفرغ.
- أضف 35 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) لتركيز نهائي 2.3 mM ثم 0.07 g من بيرسلفات الأمونيوم. صب محلول الأكريلاميد على أغطية الأغطية بينما يكون وجهه لأعلى واحتضانه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد شرائح المجهر مسعور. ماصة 100 ميكرولتر من محلول طارد للماء (انظر جدول المواد) على شريحة مجهر زجاجية نظيفة ، ثم ضع شريحة زجاجية نظيفة أخرى في الأعلى. هذا يضمن طلاء متساو لمحلول طارد الماء على السطح حيث يجلس لمدة 2 دقيقة. بعد 2 دقيقة ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية الثانية وشطف الشريحة الأولى جيدا بالماء النقي النانوي ، ثم جففها بغاز النيتروجين. قم بتنظيف المنطقة التي سيتم وضع الشريط فيها برفق (حول النمط) باستخدام الأسيتون للتأكد من أن المحلول المقاوم للماء لا يمنع الالتصاق بالزجاج.
- تحضير خليط من الزيت الهندسي الذي يحتوي على 1.8٪ (v / v) 008-FluoroSurfactant (انظر جدول المواد).
- قم بتجميع الشريحة الزجاجية والغطاء مع الشريحة الزجاجية الكارهة للماء في الجزء السفلي من خلية التدفق وانزلاق الغطاء المحب للماء كسطح علوي في هندسة شطيرة باستخدام فواصل لاصقة على الوجهين 40 ميكرومتر. ضع الفواصل على بعد 1.5 مم على شريحة المجهر الكارهة للماء. ثم ضع الغطاء المطلي بمادة الأكريلاميد أعلى الفواصل مع توجيه الجانب المعالج لأسفل للالتصاق. تأكد من اكتمال الالتصاق بضغط من جسم غير حاد.
ملاحظة: الهدف هو تجميع خلية تدفق بواجهة مسطحة من الزيت / الماء بالداخل (الشكل 2 أ ، ب). هذا هو المكان الذي ستتشكل فيه الطبقة النشطة. يمكن أيضا استخدام أشرطة وأفلام مباعدة بديلة لإنتاج سمك خلية مماثل. - بعد إنشاء خلية التدفق ، قم على الفور بماصة خليط الزيت في خلية التدفق ، وملء المساحة المغلقة.
- باستخدام ماصة ، في قارورة منفصلة ، امزج بلطف 6 ميكرولتر من المادة الفعالة مع 3.73 ميكرولتر من MIX ، و 1 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة ، و 0.6 ميكرولتر من محلول ATP (يمكن تغيير التركيز لتغيير سرعة الأنابيب الدقيقة) ، و 0.67 ميكرولتر من المخزن المؤقت M2B.
- ماصة مادة نشطة مختلطة حديثا في نهاية واحدة مفتوحة من خلية التدفق ، ستختلف الأحجام ولكن يجب أن تتجاوز حجم خلية التدفق (حوالي 3-6 ميكرولتر). سيتم إزاحة بعض الزيت بواسطة المحلول المائي أثناء حقنه في القناة ؛ يمكن أن يكون هذا شريرا في الطرف الآخر من قناة التدفق باستخدام قطعة صغيرة من المناديل الورقية.
- بعد التعبئة ، أغلق جانبي خلية التدفق بغراء إيبوكسي (انظر جدول المواد) يتصلب عند تعرضه لضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 ثانية.
ملاحظة: عند هذه النقطة ، تشكل المادة الفعالة شبكة 3D تظل معلقة في طبقة الماء. - لحصر الطبقة النشطة بين السائلين غير القابل للامتزاج في طبقة شبه 2D ، ضع خلية التدفق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح (انظر جدول المواد) مع الطور المائي في الأعلى وطبقة الزيت الأكثر كثافة تحتها. جهاز طرد مركزي عند 212 × جم لمدة 10 دقائق. بعد اكتمال هذه الخطوة ، يمكن نقل خلية التدفق إلى مجهر epi-fluorescence للتصوير بهدف تكبير 10x أو 20x. يوضح الشكل 2C ، D صورا نموذجية قبل هذه الخطوة وبعدها.
- إعداد أغطية ماء مع طلاء الأكريلاميد.
- طريقة مقلوبة لتشكيل نيماتيكي نشط
ملاحظة: هناك طريقة بديلة لتلك الموضحة في الخطوة 2.1 وهي تجميع الطبقة النيماتيكية النشطة تحت طبقة زيت سميكة محصورة في بئر PDMS عميق28. هذه الطريقة تنتج نتائج مماثلة ، وأسهل إلى حد ما في إتقانها ؛ ومع ذلك ، فإن جودة الصورة باستخدام هذه الطريقة عادة ما تكون ليست جيدة مثل طريقة خلية التدفق.- تحضير بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) باستخدام عامل معالجة المطاط الصناعي وقاعدة المطاط الصناعي (انظر جدول المواد). امزج المكونين بنسبة 1:10 باستخدام ملعقة معدنية. تظهر فقاعات صغيرة أثناء الخلط يصعب إزالتها ، ويبدو الخليط حليبي. لإزالة هذه الفقاعات ، ضع الخليط تحت فراغ لإزالة الغازات لمدة 1 ساعة ، وبعد ذلك يجب أن تظهر PDMS غير المعالجة شفافة.
ملاحظة: PDMS جاهز الآن لتشكيل أي شكل باستخدام قالب ، أو يمكن معالجته في الحاوية ثم قصه أو ثقبه بالنمط المطلوب. - صب PDMS في قالب مناسب واتركه طوال الليل ليعالج عند 60 درجة مئوية.
ملاحظة: غير معالج ، سطح PDMS المعالج كاره للماء ، ولكن مع المعالجة السطحية ، يمكن جعله محبا للماء. - لتحضير سطح PDMS محب للماء ، قم بطلاء PDMS بفرشاة بوليمر أكريلاميد29. تمنع هذه الخطوة أيضا البروتينات من الالتصاق بالسطح.
- ابدأ بتنظيف PDMS لمدة 10 دقائق باستخدام كل من الإيثانول والأيزوبروبانول ، ثم اشطفه جيدا بالماء منزوع الأيونات 3x وجففه. استخدم منظف البلازما لمدة 5 دقائق لتنظيف PDMS الجاف والمعالج. هذه الخطوة تجعل السطح أكثر محبة للماء.
- بعد ذلك ، قم بإعداد محلول سيلان (98.5٪ بالوزن الإيثانول ، 1٪ بالوزن حمض الخليك ، و 0.5٪ بالوزن تريميثوكسي سيليل بروبيل ميثاكريلات) واغمر الركيزة في هذا المحلول لمدة 15 دقيقة للتحضير لطلاء الأكريلاميد. اشطف الركيزة جيدا بالماء منزوع الأيونات واغمرها في محلول الأكريلاميد (2٪ بالوزن محلول أكريلاميد / مكرر ، 2.3 مللي مول TEMED ، و 3 مللي متر بيرسلفات الأمونيوم).
ملاحظة: يمكن تخزين هذه الركائز في درجة حرارة الغرفة مغطاة بمحلول الأكريلاميد في طبق بتري زجاجي ، ويجب استخدامها في غضون 2 أسابيع.
- عندما تكون جاهزا للاستخدام ، اشطف السطح بالماء منزوع الأيونات وجففه بالنيتروجين للاستخدام الفوري. أضف الخليط النشط (الموصوف في الخطوة 2.1.6) إلى الآبار وأضف زيت السيليكون على الفور في الأعلى بسمك حوالي 2 مم.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، سيتم وضع الخليط النشط بين الزيت والطلاء المحب للماء على PDMS ، لكنه سيظل ثلاثي الأبعاد إلى حد ما. - لدفع المادة إلى طبقة ثنائية الأبعاد ، قم بلصق جهاز PDMS على شريحة زجاجية ، وضعه في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح وقم بتدويره لمدة 12 دقيقة عند 212 × جم. يجب وضع الجهاز بحيث يكون زيت السيليكون أعلى الطبقة المائية. النتائج التمثيلية موضحة في الشكل 3.
- تحضير بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) باستخدام عامل معالجة المطاط الصناعي وقاعدة المطاط الصناعي (انظر جدول المواد). امزج المكونين بنسبة 1:10 باستخدام ملعقة معدنية. تظهر فقاعات صغيرة أثناء الخلط يصعب إزالتها ، ويبدو الخليط حليبي. لإزالة هذه الفقاعات ، ضع الخليط تحت فراغ لإزالة الغازات لمدة 1 ساعة ، وبعد ذلك يجب أن تظهر PDMS غير المعالجة شفافة.
3. إعداد النيماتكس النشطة في الأشكال الهندسية المحصورة
ملاحظة: يمكن أن يكون من الصعب حصر النيماتيكا النشطة مثل هذا النظام شبه ثنائي الأبعاد في هندسة الموائع الدقيقة الصغيرة مثل الآبار أو القنوات. هنا ، يتم وصف طريقة موثوقة لحصر المواد في آبار PDMS مختلفة الأشكال.
- أولا ، صمم قالبا رئيسيا لنظام PDMS. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق أعمدة الطباعة 3D على الركيزة. بعد الطباعة ثلاثية الأبعاد للقالب الرئيسي من الراتنج ، قم بتنظيفه باستخدام الأيزوبروبانول ثم عالج القالب تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 45 دقيقة وفي الفرن عند 120 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (الشكل 4).
ملاحظة: تعمل المعالجة تحت الأشعة فوق البنفسجية والمعالجة الحرارية اللاحقة على تحسين جودة النسخ المتماثل في PDMS عن طريق إزالة المونومرات وبقايا مثبطات الصور من الراتنج30. - استخدم القالب الرئيسي لإنشاء آبار من PDMS. قم بإعداد PDMS كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. اغمر القالب الرئيسي في PDMS غير المعالج وعالجه طوال الليل في فرن على حرارة 60 درجة مئوية.
- بعد اكتمال معالجة PDMS ، قم بإزالة القالب الرئيسي بعناية وقطع PDMS حسب الرغبة للعمل مع الآبار (الشكل 4). تعامل مع سطح PDMS كما هو موضح في الخطوة 2.2.3. قبل التجربة ، يمكن ربط السطح بشريحة زجاجية بغراء إيبوكسي لتسهيل التصوير.
- ماصة 1 ميكرولتر من الخليط النشط الموصوف في الخطوة 2.1.6 على ركيزة PDMS وأضف زيت السيليكون على الفور بلزوجة 100-1000 cSt28 أعلى قطرة الشبكة النشطة. ستنتقل الشبكة النشطة إلى البئر ؛ تستغرق هذه العملية ما يصل إلى 60 دقيقة (الشكل 4). كما هو موضح في الخطوة 2.2.5 ، يمكن تحسين الشبكة ثنائية الأبعاد عن طريق تدوير PDMS جيدا في جهاز الطرد المركزي للدلو المتأرجح لمدة 12 دقيقة عند 212 × جم.
Representative Results
يوضح الشكل 1 صورة تمثيلية للأنابيب الدقيقة المفردة المحضرة من توبولين GMPCPP. تصور الصورة الأنابيب الدقيقة القصيرة ذات الأطوال المتشابهة (مع وجود بعض التشتت). يجب أن ينتج التخفيف الكافي لمحلول الأنابيب الدقيقة صورة للأنابيب الدقيقة المنفصلة جيدا للتحقق من الطول. قد تكون الأنابيب الدقيقة الفردية صعبة في الصورة بسبب صغر حجمها. استخدام كاميرا عالية الحساسية مصممة للفحص المجهري الفلوري هو الأفضل لهذا التطبيق. يوضح الشكل 2 والشكل 3 أمثلة على صور الفحص المجهري الفلوري للتجارب الناجحة التي أجريت باستخدام طريقة خلية التدفق (القسم 2.1) والطريقة المقلوبة (القسم 2.2) ، على التوالي. الطبقة النيماتيكية النشطة جيدة التكوين متجانسة في الملمس ، مع عدم وجود مناطق فراغ كبيرة وعيوب طوبولوجية متحركة. لاحظ مع ذلك أنه قد يكون هناك بعض الفراغات الصغيرة المقبولة في نوى العيب. بالإضافة إلى الأمثلة الموضحة في الشكل 2 والشكل 3 ، تم تضمين ثلاثة أفلام تكميلية (الفيلم 1 والفيلم 2 والفيلم 3) لتوضيح كيفية ظهور النيماتيك النشط في تجربة ناجحة. تظهر جميع الأفلام الحركة المستمرة السلسة للمرحلة النيماتيكية النشطة. لا توجد اختلافات واضحة في تركيز الأنابيب الدقيقة بعد أن تصل المادة إلى حالتها المستقرة. طالما يوجد ATP كاف في النظام ، ستستمر المادة في التحرك بشكل موحد.
الشكل 1: صورة مجهر مضان للأنابيب الدقيقة GMPCPP. تم وضع علامة على الأنابيب الدقيقة GMPCPP بنسبة 4٪ مع توبولين الرودامين وبلمرة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تم إجراء التصوير في درجة حرارة الغرفة. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: نيماتكس الأنابيب الدقيقة في خلية التدفق. (أ) رسم تخطيطي مقطعي لخلية التدفق، هندسة 1 مم × 18 مم. (ب) منظر تخطيطي علوي لخلية التدفق. (ج) صورة مجهرية مضان توضح المظهر النموذجي للمحلول النشط قبل التجميع عند السطح البيني للزيت / الماء. (د) صورة مجهرية مضان للمرحلة النيماتيكية النشطة المجمعة في السطح البيني للزيت / الماء داخل خلية التدفق. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صورة مجهر مضان توضح نيماتيكية نشطة محضرة باستخدام الطريقة المقلوبة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مخطط التدفق يوضح طريقة الحبس النيماتيكي النشط في بئر PDMS ، بما في ذلك تصنيع القوالب ومعالجة السطح. شريط القياس على الصورة اليمنى (المادة الفعالة المحصورة) = 200 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الفيلم 1: نتيجة تمثيلية للنيماتيكية النشطة المحضرة باستخدام طريقة خلية التدفق. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 2: نتيجة تمثيلية للنيماتيك النشط المعد باستخدام الطريقة المقلوبة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
الفيلم 3: نتيجة تمثيلية للنيماتيكية النشطة المحضرة باستخدام الطريقة المقلوبة المحصورة في بئر بيضاوي الشكل. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيلم.
Discussion
هناك بعض النقاط في جميع أنحاء البروتوكولات التي يمكن للمجرب من خلالها إجراء بعض الفحوصات المهمة. قبل ملء أي من الجهازين بالمواد الفعالة ، يجب استخدام الفحص المجهري الفلوري (انظر الشكل 1) للتحقق من أن الأنابيب الدقيقة مبلمرة وطولها المثالي ~ 2-3 ميكرومتر. إذا لم تكن الأنابيب الدقيقة مرئية تحت المجهر ، فقد تكون قد أزيلت من البلمرة ولن تتشكل النيماتيكية النشطة. نظرا لأن الأنابيب الدقيقة الفردية صغيرة جدا ، فقد يكون من الصعب مراقبتها مباشرة من خلال المجهر. في هذه الدراسة ، تم استخدام كاميرا مضان عالية الجودة مصممة لتحدي تطبيقات الإضاءة المنخفضة مع البرنامج المرتبط للتحقق من نمو الفتيل. لا ينبغي أن تكون مجاميع الفلورسنت الكبيرة موجودة في هذه المرحلة ، لأن هذا قد يشير إلى إزالة البلمرة أو وجود بروتين مشوه. من الجيد أيضا عمل شريحة اختبار مجهر بسيطة من خلال الجمع بين الأنابيب الدقيقة و MIX و ATP بنفس النسب الموضحة في البروتوكولات. يجب أن يبدأ النشاط عند الجمع بين المكونات ويجب أن تبدو المادة مشابهة لتلك الموضحة في الشكل 2C مع وجود حزم وحركات خيوط ملحوظة مرئية في جميع الأنحاء.
عند استخدام طريقة خلية التدفق ، يكون وقت الطرد المركزي واتجاه خلية التدفق مهمين لتشكيل طبقة نشطة موحدة. قد تتطلب هذه الخطوة بعض الضبط الدقيق اعتمادا على نوع جهاز الطرد المركزي المستخدم. يعطي الطرد المركزي لخلية التدفق مع المستوى النشط الموجه بشكل عمودي على مستوى الدوران أفضل النتائج حيث يمكن دفع المواد إلى واجهة السوائل بشكل موحد. تحقق مرة أخرى من أن خلية التدفق محكمة الغلق بعناية قبل الطرد المركزي.
عند استخدام الطريقة المقلوبة لإنتاج نيماتات نشطة محصورة ، هناك عدة خطوات للتحسين. أولا ، من المهم استخدام طريقة طباعة 3D تنتج هياكل عالية الدقة. يمكن أن تتسبب الجدران الجانبية غير المستوية في التقاط الأنابيب الدقيقة ، مما يؤدي إلى تعطيل التدفقات. يجب ألا تكون الآبار عميقة جدا (تم استخدام آبار بعمق 150-200 ميكرومتر مع طبقة نفطية بسمك 2 مم في هذه الدراسة). قد يحتاج المجربون إلى ضبط هذه المعلمات قليلا عن طريق التجربة والخطأ للحصول على أفضل نتيجة.
تم استخدام طريقة خلية التدفق والطريقة المقلوبة من قبل مؤلفين مختلفين للنظر في مجموعة متنوعة من التأثيرات التي تؤثر على التدفقات النشطة ، بما في ذلك الزيوت المختلفة12 والهياكل المغمورة13. يعتمد اختيار الطريقة على الهدف التجريبي. باستخدام طريقة خلية التدفق ، يكون التصوير البصري من أعلى الطبقة النشطة أكثر وضوحا من الطريقة المقلوبة بسبب السوائل المختلفة التي تعلوها. في طريقة خلية التدفق ، يتم التصوير من خلال انزلاق غطاء زجاجي وطبقة رقيقة من الماء ، في حين تم تصميم الطريقة المقلوبة بحيث تكون طبقة الزيت في الأعلى. هذا يعني أن هناك حاجة إلى هدف مسافة عمل طويلة للطريقة المقلوبة ، ويتم تقليل جودة الصورة. يمكن ملاحظة اختلافات جودة الصورة من خلال مقارنة الشكل 2D (طريقة خلية التدفق) والشكل 3 (الطريقة المقلوبة) والفيلم 1 والفيلم 2 على التوالي. كانت هناك حاجة إلى عدسة تكبير أقل مع مسافة عمل أطول للشكل 3 من تلك المستخدمة في الشكل 2. يمكن تجنب عيوب التصوير هذه للطريقة المقلوبة إذا توفر مجهر مقلوب مناسب ، جنبا إلى جنب مع الأهداف مع مسافة عمل مناسبة لركائز شريحة المجهر. يمكن استخدام الزجاج الرقيق كركيزة للسماح باستخدام أهداف مسافة العمل القياسية.
كميزة ، تسمح الهندسة المقلوبة باستخدام مجموعة واسعة من لزوجة الزيت ، ولا تتطلب بالضرورة الطرد المركزي للدلو المتأرجح (إذا لم يكن ذلك متاحا) ، ويكون إعداد النظام أسهل نسبيا بمجرد إعداد القالب. ومع ذلك ، بالنسبة للحبس في الآبار باستخدام الطريقة المقلوبة ، قد يكون بعض الطرد المركزي مهما للحصول على المادة في طبقة 2D محددة جيدا.
تم استخدام طريقة خلية التدفق مؤخرا بنجاح كبير في التجارب التي تتطلب طبقة نشطة مستمرة. نظر عملنا الأخير في ديناميكيات العيوب الطوبولوجية في الطبقة النشطة ، حيث يكون التصوير عالي الجودة وتحليل النسيج مهما19. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام طريقة خلية التدفق للتحقيق في تأثيرات الهياكل المجهرية المغمورة بالزيت على التدفقات النشطة16 والأعمدة لاحتجاز العيوب في التدفقات النشطة31. تعمل هذه الطريقة بشكل جيد للغاية لتشكيل طبقة نشطة مستمرة ، وجودة الصورة ممتازة. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تنفيذ خطوة الطرد المركزي المستخدمة لإنتاج الطبقة النشطة 2D النهائية ، وخلايا التدفق عرضة للتسريبات وفقاعات الهواء. الطريقة المقلوبة هي بديل مفيد للغاية مع معدل نجاح مرتفع ، وسهلة البناء ، ويمكن استخدامها لأي نمط ركيزة أو هندسة بشرط إنشاء قالب رئيسي مطبوع 3D عالي الدقة. هذه الطريقة مفيدة أيضا للنظر في آثار الحبس الهندسي على الديناميات النيماتيكية النشطة لأنها تجعل ملء الآبار أمرا بسيطا نسبيا.
في هذا البحث ، تم وصف طريقتين لتشكيل نيماتيكي نشط من الأنابيب الدقيقة ومحركات كينيسين ، بالإضافة إلى تقنية لحصر المواد في الآبار. يمثل النظام المقدم أنظف مثال على مرحلة نيماتيكية نشطة حاليا في الأدبيات وقد تم استنساخه من قبل عدة مجموعات حول العالم. لا تكمن أهمية هذه المادة في الأصول البيولوجية لمكوناتها فحسب ، بل أيضا لأنها تفتح اتجاها جديدا تماما في السوائل المرتبة النشطة. من خلال العمل مع هذا النظام وتوضيح خصائصه الأساسية ، يمكن للعلماء التحرك نحو تصميم مراحل نشطة اصطناعية بالكامل.
التجارب التي تركز على آثار الحبس على النيماتكس النشطة لديها القدرة على الإجابة على الأسئلة الأساسية المتعلقة بسلوك التدفقات النشطة وديناميكيات العيوب الطوبولوجية في ظل الحبس الطوبولوجي. ستساعد الطريقة المقدمة هنا في أداء مجموعة متنوعة من التجارب التي تركز على الهندسة وتحليلها ، بما في ذلك الموائع الدقيقة والخلط النشط.
Disclosures
تم توفير بعض المواد المستخدمة في هذا العمل مجانا من قبل شركة Cytoskeleton Inc. (دنفر ، الولايات المتحدة الأمريكية).
Acknowledgments
يود المؤلفون الاعتراف بجائزة المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) DMR-1808926 للتمويل السخي. كما تم دعم المشروع من قبل NSF من خلال مركز التميز البحثي في العلوم والتكنولوجيا: مركز الآلات الخلوية والجزيئية الحيوية في جامعة كاليفورنيا ميرسيد (HRD-1547848) ومركز برانديز لأبحاث المواد الحيوية (DMR-2011486). نود أن نشكر الدكتور بن ليو في جامعة كاليفورنيا ميرسيد للمساعدة في طباعة القالب 3D ، والدكتور جوردي إيجنيس على المشورة العلمية أثناء تطوير الطريقة التجريبية المقلوبة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
- Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria. Physics Review Letters. 98 (15), 158102 (2007).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).
- Toner, J., Tu, Y. Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together. Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).
- Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).
- Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).
- Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).
- Memarian, F. L., et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).
- Bausch, A., Sciortino, A. R. Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).
- Maroudas-Sacks, Y., et al. Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis. Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).
- Liu, J., et al. Topological braiding and virtual particles on the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).
- Hirst, L. S. Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed. , CRC Press. (2019).
- Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8, 564 (2017).
- Thijssen, K., et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).
- Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. Dancing disclinations in confined active nematics. Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).
- Giomi, L. Geometry and topology of turbulence in active nematics. Physical Review X. 5 (3), 031003 (2015).
- Tan, A. J., et al. Topological chaos in active nematics. Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).
- Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod. The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
- Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli. Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).
- Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. Kinesin Protocol. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).
- Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments. Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).
- Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature. Journal of Visualized Experiments. (153), e60484 (2019).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. Microtubules. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. Probing the shear viscosity of an active nematic film. Physical Review E. 94 (6), 060602 (2016).
- Rudy, A., et al. Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS). Tribology Letters. 65, 3 (2017).
- Venzac, B., et al. PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it. Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).
- Khaladj, D. A., Hirst, L. S. Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows. Frontiers of Physics. 10, 880941 (2022).
