Summary
Præsenteret her er metoder til fremstilling af aktiv nematik fra mikrotubuli og kinesinmotorer, herunder proteinforberedelse og konstruktion og anvendelse af brønde til aktiv nematisk indeslutning.
Abstract
Dannelsen af biopolymerbaserede aktive faser er blevet en vigtig teknik for forskere, der er interesserede i at udforske det nye felt af aktive flydende krystaller og deres mulige roller i cellebiologi. Disse nye systemer består af selvdrevne underenheder, der forbruger energi lokalt og producerer en dynamisk væske uden for ligevægt. For at danne den aktive flydende krystalfase, der er beskrevet i denne rapport, kombineres oprensede proteinkomponenter, herunder biopolymerer og molekylære motorer, og den aktive nematiske fase dannes spontant i nærvær af adenosintrifosfat (ATP). For at observere den nematiske tilstand skal materialet indesluttes i en passende geometri til mikroskopi ved en høj nok densitet. Denne artikel beskriver to forskellige metoder til dannelse af en aktiv nematisk fase ved hjælp af mikrotubuli og kinesinmotorer: samling af et todimensionelt aktivt lag ved en olie- og vandgrænseflade og samling under et olielag ved hjælp af en elastomerisk brønd. Teknikker til at indsætte det aktive materiale i små brønde af forskellige former er også beskrevet.
Introduction
Aktive væsker er sammensat af energidrevne partikler eller elementer, der trækker brændstof fra deres lokale miljø. Under de rette forhold kan disse bevægelige aktive elementer virke kollektivt for at producere emergent væskedynamik over lange længdeskalaer. Der er en række eksempler på en sådan uligevægtsfaseadfærd i litteraturen, og aktive faser kan findes på tværs af spektret af levende systemer. Nogle bemærkelsesværdige eksempler er kolonier af bakterier1, celleark2,3 og flokke eller sværmning af organismer 4,5. Aktive faser er også blevet undersøgt grundigt i kondenserede faser af cytoskeletale filamenter, enten som en del af celle6 eller i syntetiske systemer designet til at gøre brug af biologisk ekstraherede komponenter 7,8,9. Flydende krystallinsk orden og dannelse af topologiske defekter i både naturligt forekommende og syntetiske systemer samlet fra biologiske ekstrakter er af særlig interesse for forskersamfundet. I de senere år har forskergrupper undersøgt sådanne systemer, deres grundlæggende fysiske egenskaber og deres relevans for biologi 2,3,10,11.
Dette papir fokuserer på dannelsen af den aktive nematiske tilstand fra en kombination af mikrotubuli og kinesinmotorproteiner. Den traditionelle nematiske flydende krystal er en ligevægtsfase af stof, hvor de bestanddele molekyler udviser orienteringsordre. For eksempel kan en væske bestående af relativt stive stanglignende molekyler udvise både den nematiske fase og ved højere temperaturer en uorienteret isotrop væskefase12. Det første eksperimentelle eksempel på en aktiv nematisk fase blev udviklet af Sanchez et al.13 og tilpassede et tidligere in vitro-eksperiment 14, hvor klynger af motorproteiner blev brugt til at producere en forskydningsbevægelse mellem nærliggende mikrotubulusbundter. Da dette mikrotubulussystem var begrænset til et tyndt lag, opstod spontan nematisk orden. I de senere år er den aktive nematiske tilstand blevet studeret intensivt af flere eksperimentelle 15,16 og teoretiske 17,18 forskningsgrupper, der fokuserer på fænomener som aktiv turbulens - en tilstand, hvor væsken producerer selvdrevne kaotiske strømme 19 - og mobile topologiske defekter. Dette papir beskriver metoder til at forberede og danne den aktive nematiske tilstand fra mikrotubuli og kinesinmotorer i forskellige eksperimentelle geometrier. Først beskrives forberedelsesmetoder for de forskellige komponentopløsninger efterfulgt af metoder til dannelse af den aktive nematik ved hjælp af to forskellige flowkammergeometrier. Typiske billeddannelsesresultater vises. Endelig beskrives metoder til begrænsning af den aktive nematik i brønde og kanaler.
Protocol
1. Forberedelse af det aktive materiale
BEMÆRK: Den 2D aktive nematic samles i en tre-trins proces. Først fremstilles to separate opløsninger: a) polymeriserede, stabiliserede mikrotubuli og b) MIX (en opløsning indeholdende kinesinmotorer). Disse kombineres, og aktiviteten påbegyndes ved tilsætning af adenosintrifosfat (ATP). Materialet begrænses derefter i en passende geometri, således at dens densitet er høj nok til, at nematisk orden kan opstå. Protokoller er inkluderet til forberedelse af alle nødvendige komponenter og hvordan man samler den aktive fase.
- Fremstilling af Kinesinmotorisk proteinklynge
- Ekspres og rens rekombinante K401-BIO motorproteiner (K401 motorer) fra Escherichia coli efter protokollen af Edgar C. Young20.
BEMÆRK: K401-BIO motorproteiner er dimeriske og består af to hoveder forbundet med en spiralformet stilk. Motorerne blev leveret af Brandeis Biomaterials Facility og brugt som tidligere rapporteret16. Med henblik på dannelse af en aktiv nematisk biotinyleres kinesinmolekylerne og forbindes derefter via en streptavidinforbindelse til dannelse af kinesinklynger på op til fire motorer 13,15,21,22. Det er nyttigt at udtrykke kinesin med et grønt fluorescerende protein (GFP) tag. - Efter rensning og inkubation af streptavidin og motorer på is i 40 minutter lynfryses K401-motorerne i flydende nitrogen i 5 μL alikvoter i en slutkoncentration på 0,7 mg/ml og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her. Optø forsigtigt kinesin, når det er nødvendigt, og genfrys ikke. - Forberede klynger af biotinmærket kinesin (KSA) ved at blande 24 vol% af 0,7 mg / ml K401-motorer, 27 vol% 0,325 mg / ml streptavidin og 3 vol% 5 mM dithiothreitol (DTT) (for at forhindre aggregering) ved 4 ° C i 46 vol% M2B buffer (80 mM RØR [1,4-Piperazinediethanesulfonsyre, pH 6,8], 2 mM MgCl2 og 1 mM EGTA [ethylenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N,N′,N′-tetraeddikesyre]). Lad KSA inkubere på is i 40 min.
- Ekspres og rens rekombinante K401-BIO motorproteiner (K401 motorer) fra Escherichia coli efter protokollen af Edgar C. Young20.
- Fremstilling af mikrotubulusopløsning
BEMÆRK: Guanosin-5'-[(α,β)-methyleno]triphosphat, natriumsalt (GMPCPP) er en langsomt hydrolyserbar analog af guanosintrifosfat (GTP), og mikrotubuli dannet i nærværelse af GMPCPP er tre gange stivere end GTP-mikrotubuli23 og kortere. Brugen af korte, stive mikrotubuli er gunstig for dannelsen af den aktive nematiske fase, da disse faktorer kombineres for at fremme flydende krystallinsk bestilling.- Polymeriser umærket cycled tubulin (99%, se Tabel over materialer) ved anvendelse af 0,6 mM GMPCPP ved en tubulinkoncentration på 6 mg / ml.
BEMÆRK: Tubulin af høj kvalitet kan også renses fra kvæg eller svinehjerne efter etablerede protokoller eller fås fra en anden pålidelig kilde såsom Brandeis Biomaterials Facility, hvor materialer kan sendes frosne for at forhindre skade. For tubulinrensning fra kvæghjerne henvises til den offentliggjorte protokol fra Bate et al.24. For tubulinrensning fra svinehjerne henvises til de offentliggjorte protokoller fra Castoldi et al.25 og Tayar et al.26. - Som forberedelse til polymerisation fremstilles et varmebad ved 37 °C og forkøles centrifugen til 4 °C. Kombiner den umærkede tubulinopløsning i M2B-buffer (trin 1.1.3) i et 500 μL ultracentrifugerør med 4 mol% rhodaminmærket tubulin (se materialetabel) for at producere 4% mærkede mikrotubuli efter polymerisation.
- Kontroller tubulinkoncentrationen ved hjælp af et Bradford-assay27. Den totale tubulinkoncentration i centrifugerøret skal være 6,5-6,9 mg/ml.
- Tubulinblandingen inkuberes på is i 10 minutter og ultracentrifuge i 10 minutter ved 352.700 x g ved 4 °C. Dette trin fjerner dysfunktionel tubulin, som vil være i pelleten.
- Ved hjælp af en pipette ekstraheres forsigtigt supernatanten indeholdende funktionelt tubulin i et mikrocentrifugerør. Der tilsættes GMPCPP til en slutkoncentration på 0,6 mM for at inducere tubulinpolymerisation og DTT til en endelig koncentration på 1 mM for at forhindre proteinaggregering.
- Blandingen inkuberes i varmebadet ved 37 °C i 30 min., centrifugeres derefter igen i 10 minutter ved 14.000 x g ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og pelleten fortyndes derefter med M2B-buffer for at nå en endelig mikrotubulikoncentration på 6 mg/ml.
BEMÆRK: Denne opløsning kan opbevares ved stuetemperatur i mindst 4 timer før brug. - For at kontrollere, at mikrotubuli er polymeriseret med succes, fortyndes 1 μL af mikrotubulusopløsningen 100: 1 med M2B-buffer og pipette på et mikroskopglas. Dæk med en dækselseddel til billeddannelse ved hjælp af et fluorescensmikroskop (se Materialetabel) med en 40x objektiv linse.
BEMÆRK: Excitations- og emissionsbølgelængder vælges i henhold til fluorescensmærkningen, der anvendes på mikrotubuli. I denne protokol anvendes rhodaminmærkning (se trin 1.2.2), så billeddannelse udføres ved hjælp af et excitationsbånd på 515-560 nm og et 590 nm langt pasfilter. Figur 1 viser et repræsentativt eksempel. - Når polymerisationen er afsluttet, dropfryses mikrotubuli som 2 μL aliquoter i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C (om nødvendigt).
- Polymeriser umærket cycled tubulin (99%, se Tabel over materialer) ved anvendelse af 0,6 mM GMPCPP ved en tubulinkoncentration på 6 mg / ml.
- Forberedelse af MIX
BEMÆRK: MIX er en vandig opløsning, der inkluderer kinesin-streptavidin-klyngerne (KSA). Tilberedt MIX skal opbevares ved -80 °C i 4 μL alikvoter inden forsøget. Når MIX kombineres med ATP og mikrotubulusopløsningen beskrevet i trin 1.2 ved stuetemperatur, påbegyndes aktiviteten. MIX fremstilles som følger13,19.- Forbered en opløsning til forebyggelse af fluorescensfading (ANTIFADE) ved at blande to antioxidantopløsninger. Kombiner AO1 (250 mM DTT, 65 mM katalase) og AO2 (750 μM katalase, 3 mM glucoseoxidase) i et 1: 1 volumenforhold. Medtag 20 mM Trolox, en anden antioxidant, der bruges til at reducere skader forårsaget af fluorescensmikroskopi.
- Mix fremstilles ved at fremstille en opløsning af KSA (beskrevet i trin 1.1.3), der inkluderer 6 vægt% 20 kDa polyethylenglycol (PEG) for at inducere bundtning af mikrotubuli, 3 vol% ANTIFADE og 5 vol% pyruvatkinase / mælkedehydrogenase (PKLDH) ved 70 mg / ml til ATP-regenerering.
2. Oprettelse af den aktive nematiske
OBS: Aktivitet i materialet initieres ved ATP-tilføjelse. Det aktive netværk fremstilles frisk til hvert eksperiment ved at tilsætte ATP i en koncentration, der er høj nok til at fremkalde motorisk aktivitet. For at danne en ensartet, fuldt udviklet aktiv nematisk fase skal mikrotubuli være med en tilstrækkelig høj densitet. Dette kan opnås ved at begrænse mikrotubuli mellem to ublandbare væsker for at danne et todimensionelt (2D) aktivt nematisk lag. Denne metode blev oprindeligt udviklet på Brandeis University13 og er stadig en populær teknik til fremstilling af en homogen, høj kvalitet, aktiv nematisk fase.
- Flowcellemetode til aktiv nematisk dannelse
- Forbered hydrofile dækslips med en acrylamidbelægning.
- Rengør dækslerne grundigt med sæbevand, ethanol og 0,1 M NaOH med alternative skylninger med nanorent vand. Når de er skyllet, skal du belægge dækslerne med en silanopløsning bestående af 100 ml ethanol, 1 ml eddikesyre og 500 μL 3-(trimethoxysilyl) propylmethacrylat i 15 minutter og skyll derefter med nanorent vand.
- Forbered en acrylamidopløsning fra 95 ml nanorent vand og 5 ml 40 vægt% acrylamid og afgass derefter opløsningen i 30 minutter i en vakuumovn.
- Der tilsættes 35 μL tetramethylethylendiamin (TEMED) til en slutkoncentration på 2,3 mM og derefter 0,07 g ammoniumpersulfat. Hæld acrylamidopløsningen over dækslerne, mens du vender opad, og inkuber natten over ved stuetemperatur.
- Forbered hydrofobe mikroskopglas. Pipetter 100 μL af en vandafvisende opløsning (se Materialetabel) på et rent glasmikroskopglas, og placer derefter et andet rent glasglas ovenpå. Dette sikrer en jævn belægning af den vandafvisende opløsning på overfladen, hvor den sidder i 2 min. Efter 2 minutter fjernes det andet glasglas og skylles det første dias grundigt med nanorent vand, og tørres derefter med nitrogengas. Rengør forsigtigt det område, hvor båndet skal placeres (omkring mønsteret) med acetone for at sikre, at den vandafvisende opløsning ikke forhindrer vedhæftning til glasset.
- Forbered en blanding af konstrueret olie, der indeholder 1,8% (v / v) 008-fluoroverfladeaktivt stof (se materialetabel).
- Saml glasrutsjebanen og dækslippet med det hydrofobe glasglas på bunden af flowcellen, og det hydrofile dæksel glider som den øverste overflade i en sandwichgeometri ved hjælp af 40 μm dobbeltsidede klæbeafstandsstykker. Placer afstandsstykkerne 1,5 mm fra hinanden på det hydrofobe mikroskopglas. Placer derefter den akrylamidbelagte dæksel oven på afstandsstykkerne med den behandlede side nedad for at klæbe. Sørg for, at vedhæftningen er komplet med tryk fra en stump genstand.
BEMÆRK: Målet er at samle en flowcelle med en flad olie/vand-grænseflade indeni (figur 2A, B). Det er her det aktive lag dannes. Alternative afstandsbånd og film kan også bruges til at producere en lignende celletykkelse. - Når flowcellen er konstrueret, pipetteres olieblandingen straks ind i flowcellen og fylder det lukkede rum.
- Ved hjælp af en pipette blandes forsigtigt 6 μL aktivt materiale med 3,73 μL MIX, 1 μL mikrotubuliopløsning, 0,6 μL ATP-opløsning (koncentrationen kan varieres for at variere mikrotubulushastigheden) og 0,67 μL M2B-buffer i et separat hætteglas.
- Pipetter friskblandet aktivt materiale i den ene åbne ende af flowcellen, volumener vil variere, men bør overstige volumenet af flowcellen (ca. 3-6 μL). Noget olie vil blive fortrængt af den vandige opløsning, når den injiceres i kanalen; Dette kan vejes op i den modsatte ende af strømningskanalen ved hjælp af et lille stykke silkepapir.
- Efter påfyldning forsegles begge sider af flowcellen med en epoxylim (se Materialetabel), der hærder, når den udsættes for UV-lys i 20 s.
BEMÆRK: På dette tidspunkt danner det aktive materiale et 3D-netværk, der forbliver suspenderet i vandlaget. - For at begrænse det aktive lag mellem de to ublandbare væsker i et kvasi-2D-lag skal du placere flowcellen i en svingende spandcentrifuge (se Materialetabel) med den vandige fase ovenpå og det tættere olielag nedenunder. Centrifuge ved 212 x g i 10 min. Når dette trin er afsluttet, kan flowcellen føres til et epifluorescensmikroskop til billeddannelse med et 10x eller 20x forstørrelsesmål. Figur 2C,D viser typiske billeder før og efter dette trin.
- Forbered hydrofile dækslips med en acrylamidbelægning.
- Omvendt metode til aktiv nematisk dannelse
BEMÆRK: En alternativ metode til den, der er beskrevet i trin 2.1, er at samle det aktive nematiske lag under et tykt olielag, der er begrænset til en dyb PDMS-brønd28. Denne metode giver lignende resultater og er noget lettere at mestre; Billedkvaliteten ved hjælp af denne metode er dog normalt ikke så god som flowcellemetoden.- Polydimethylsiloxan (PDMS) fremstilles ved hjælp af et elastomerhærdningsmiddel og en elastomerbase (se Materialetabel). Bland de to komponenter i forholdet 1:10 ved hjælp af en metalspatel. Små bobler vises under blanding, som er vanskelige at fjerne, og blandingen ser mælkeagtig ud. For at fjerne disse bobler skal blandingen placeres under et vakuum for at afgasse i 1 time, hvorefter det uhærdede PDMS skal fremstå gennemsigtigt.
BEMÆRK: PDMS er nu klar til at danne enhver form ved hjælp af en form, eller den kan hærde i beholderen og derefter skæres eller stanses i det ønskede mønster. - Hæld PDMS i en passende form og lad natten over hærde ved 60 °C.
BEMÆRK: Ubehandlet er overfladen af hærdet PDMS hydrofob, men med overfladebehandling kan den gøres hydrofil. - For at forberede en hydrofil PDMS-overflade skal du belægge PDMS med en acrylamidpolymerbørste29. Dette trin forhindrer også proteiner i at klæbe til overfladen.
- Start med at rengøre PDMS i 10 min med både ethanol og isopropanol, skyll derefter grundigt med deioniseret vand 3x og tør. Brug en plasmarenser i 5 minutter til at rengøre det tørre, hærdede PDMS. Dette trin gør overfladen mere hydrofil.
- Derefter fremstilles en silanopløsning (98,5 vægt% ethanol, 1 vægt% eddikesyre og 0,5 vægt% trimethoxysilylpropylmethacrylat) og substratet nedsænkes i opløsningen i 15 minutter for at forberede sig på acrylamidbelægningen. Substratet skylles grundigt med deioniseret vand og nedsænkes i acrylamid opløsning (2 vægt% acrylamid / bisopløsning, 2,3 mM TEMED og 3 mM ammoniumpersulfat).
BEMÆRK: Disse substrater kan opbevares ved stuetemperatur dækket af acrylamid opløsning i en glas petriskål og skal anvendes inden for 2 uger.
- Når den er klar til brug, skylles overfladen med deioniseret vand og tørres med nitrogen til øjeblikkelig brug. Den aktive blanding (beskrevet i trin 2.1.6) tilsættes i brøndene, og der tilsættes straks silikoneolie ovenpå med en tykkelse på ca. 2 mm.
BEMÆRK: På dette stadium vil den aktive blanding blive klemt mellem olien og den hydrofile belægning på PDMS, men den vil stadig være noget tredimensionel. - For at skubbe materialet længere ind i et 2D-lag skal du lime PDMS-enheden på et glasglas, placere det i en svingende spandcentrifuge og dreje i 12 minutter ved 212 x g. Enheden skal placeres således, at silikoneolien er på toppen af det vandige lag. Repræsentative resultater er vist i figur 3.
- Polydimethylsiloxan (PDMS) fremstilles ved hjælp af et elastomerhærdningsmiddel og en elastomerbase (se Materialetabel). Bland de to komponenter i forholdet 1:10 ved hjælp af en metalspatel. Små bobler vises under blanding, som er vanskelige at fjerne, og blandingen ser mælkeagtig ud. For at fjerne disse bobler skal blandingen placeres under et vakuum for at afgasse i 1 time, hvorefter det uhærdede PDMS skal fremstå gennemsigtigt.
3. Forberedelse af aktiv nematik i begrænsede geometrier
BEMÆRK: Aktiv nematik som dette kvasi-todimensionelle system kan være udfordrende at begrænse til små mikrofluidiske geometrier såsom brønde eller kanaler. Her beskrives en pålidelig metode til at begrænse materialet i forskellige formede PDMS-brønde.
- Først skal du designe en masterform til PDMS. Dette kan opnås ved at 3D-printe søjler på et substrat. Efter 3D-udskrivning af harpiksmasterformen rengøres med isopropanol og hærder derefter formen under en UV-lampe i 45 minutter og i ovnen ved 120 ° C i 2 timer (figur 4).
BEMÆRK: Hærdning under UV og termisk efterhærdning forbedrer kvaliteten af replikation i PDMS ved at fjerne monomerer og fotohæmmerrester fra harpiksen30. - Brug masterformen til at oprette brønde fra PDMS. Forbered PDMS som beskrevet i trin 2.2.1. Nedsænk masterformen i uhærdet PDMS og hærd natten over i en ovn ved 60 °C.
- Når PDMS-hærdningen er afsluttet, skal du forsigtigt fjerne masterformen og skære PDMS som ønsket for at arbejde med brøndene (figur 4). PDMS-overfladen behandles som beskrevet i trin 2.2.3. Før eksperimentet kan overfladen fastgøres til et glasglas med epoxylim for at gøre billeddannelsen lettere.
- Der pipetteres 1 μL af den aktive blanding, der er beskrevet i trin 2.1.6, på PDMS-substratet, og der tilsættes straks silikoneolie med 100-1000 cSt viskositet28 oven på den aktive netværksdråbe. Det aktive netværk flytter ind i brønden; denne proces tager op til 60 minutter (figur 4). Som beskrevet i trin 2.2.5 kan 2D-netværket forbedres ved at dreje PDMS-brønden ned i den svingende spandcentrifuge i 12 minutter ved 212 x g.
Representative Results
Figur 1 viser et repræsentativt billede af enkeltmikrotubuli fremstillet af GMPCPP-tubulin. Billedet viser korte mikrotubuli af lignende længder (med en vis spredning til stede). Tilstrækkelig fortynding af mikrotubulusopløsningen bør give et billede af godt adskilte mikrotubuli til længdekontrol. De enkelte mikrotubuli kan være udfordrende at forestille sig på grund af deres lille størrelse. Brug af et højfølsomt kamera designet til fluorescensmikroskopi er bedst til denne applikation. Figur 2 og figur 3 viser eksempler på fluorescensmikroskopibilleder af vellykkede eksperimenter udført ved hjælp af henholdsvis flowcellemetoden (punkt 2.1) og den omvendte metode (afsnit 2.2). Et velformet aktivt nematisk lag er homogent i tekstur, uden signifikante tomrumsområder og mobile topologiske defekter til stede. Bemærk dog, at der kan være nogle acceptable små hulrum i defektkernerne. Ud over eksemplerne vist i figur 2 og figur 3 er der inkluderet tre supplerende film (film 1, film 2 og film 3) for at demonstrere, hvordan den aktive nematik skal fremstå i et vellykket eksperiment. Alle filmene demonstrerer den glatte kontinuerlige bevægelse af den aktive nematiske fase. Der ses ingen variationer i mikrotubuluskoncentrationen, efter at materialet har nået sin steady state. Så længe der er tilstrækkelig ATP til stede i systemet, vil materialet fortsætte med at bevæge sig ensartet.
Figur 1: Fluorescensmikroskopbillede af GMPCPP-mikrotubuli. GMPCPP-mikrotubuli blev mærket med 4% med rhodamintubulin og polymeriseret i 20 minutter ved 37 °C. Billeddannelse blev udført ved stuetemperatur. Skala bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Mikrotubulusnematik i en flowcelle . (A) Tværsnitsskematisk af flowcellen, 1 mm x 18 mm geometri. (B) Skematisk oversigt over flowcellen i øverste visning. (C) Fluorescensmikroskopibillede, der viser det typiske udseende af den aktive opløsning før samling i olie/vand-grænsefladen. (D) Fluorescensmikroskopibillede af den aktive nematiske fase samlet ved olie/vand-grænsefladen inde i flowcellen. Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Fluorescensmikroskopbillede, der viser en aktiv nematik fremstillet ved hjælp af den omvendte metode. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Flowdiagram, der illustrerer metoden til aktiv nematisk indeslutning i en PDMS-brønd, herunder formfremstilling og overfladebehandling. Skalabjælke på højre billede (begrænset aktivt materiale) = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Film 1: Repræsentativt resultat for aktiv nematik fremstillet ved hjælp af flowcellemetoden. Klik her for at downloade denne film.
Film 2: Repræsentativt resultat for aktiv nematik fremstillet ved hjælp af den omvendte metode. Klik her for at downloade denne film.
Film 3: Repræsentativt resultat for aktiv nematik fremstillet ved hjælp af den omvendte metode begrænset til en elliptisk brønd. Klik her for at downloade denne film.
Discussion
Der er et par punkter i protokollerne, hvor eksperimentatoren kan foretage nogle vigtige kontroller. Før en af anordningerne fyldes med aktivt materiale, skal fluorescensmikroskopi (se figur 1) bruges til at kontrollere, at mikrotubuli er polymeriseret og ideelt ~ 2-3 μm i længden. Hvis mikrotubuli ikke er synlige under mikroskopet, kan de have depolymeriseret, og den aktive nematiske dannes ikke. Fordi individuelle mikrotubuli er meget små, kan det være udfordrende at observere dem direkte gennem mikroskopet. I denne undersøgelse blev et fluorescenskamera af høj kvalitet designet til udfordrende applikationer med svagt lys brugt med den tilhørende software til at verificere filamentvækst. Signifikante fluorescerende aggregater bør ikke være til stede på dette stadium, da dette kan indikere depolymerisering eller tilstedeværelsen af denatureret protein. Det er også en god ide at lave et simpelt mikroskoptestglas ved at kombinere mikrotubuli, MIX og ATP i de samme forhold som beskrevet i protokollerne. Aktiviteten skal begynde med at kombinere komponenterne, og materialet skal se ud som vist i figur 2C med bundter til stede og mærkbare filamentbevægelser synlige hele vejen igennem.
Ved anvendelse af flowcellemetoden er centrifugetiden og orienteringen af flowcellen vigtig for dannelsen af et ensartet aktivt lag. Dette trin kan kræve en vis finjustering afhængigt af den anvendte centrifugetype. Centrifugering af flowcellen med det aktive plan orienteret vinkelret på rotationsplanet giver de bedste resultater, da materiale kan skubbes ensartet ind på væskegrænsefladen. Dobbelttjek, at flowcellen er omhyggeligt forseglet, før den centrifugeres.
Når du bruger den omvendte metode til at producere begrænset aktiv nematik, er der flere trin til optimering. For det første er det vigtigt at bruge en 3D-printmetode, der producerer strukturer med høj opløsning. Ujævne sidevægge kan få mikrotubuli til at fange, hvilket vil forstyrre strømmene. Brøndene bør ikke være for dybe (150-200 μm dybe brønde med et 2 mm tykt overliggende olielag blev brugt i denne undersøgelse). Eksperimenter skal muligvis justere disse parametre lidt ved forsøg og fejl for at få det bedste resultat.
Flowcellemetoden og den omvendte metode er blevet brugt af forskellige forfattere til at se på en række effekter, der påvirker de aktive strømme, herunder forskellige olier12 og nedsænkede strukturer13. Valget af metode afhænger af det eksperimentelle mål. Ved hjælp af flowcellemetoden er optisk billeddannelse ovenfra det aktive lag klarere end for den omvendte metode på grund af de forskellige overliggende væsker. I flowcellemetoden udføres billeddannelse gennem en glasdækselslip og et tyndt lag vand, mens den omvendte metode er designet til at have olielaget ovenpå. Det betyder, at der er behov for et langdistancemål for den omvendte metode, og billedkvaliteten reduceres. Forskelle i billedkvalitet kan ses ved at sammenligne figur 2D (flowcellemetode) og figur 3 (omvendt metode) og film 1 og film 2. Der kræves et lavere forstørrelsesglas med en længere arbejdsafstand for figur 3 end det, der blev brugt til figur 2. Disse billeddannelsesulemper for den omvendte metode kan undgås, hvis der findes et passende omvendt mikroskop kombineret med mål med en passende arbejdsafstand for mikroskopets diasunderlag. Tyndere glas kan bruges som et underlag for at muliggøre brugen af standard arbejdsdistancemål.
Som en fordel giver den omvendte geometri mulighed for anvendelse af et bredere udvalg af olieviskositeter, kræver ikke nødvendigvis svingende spandcentrifugering (hvis dette ikke er tilgængeligt), og forberedelse af systemet er relativt lettere, når formen er forberedt. Ved indeslutning i brønde ved hjælp af den omvendte metode kan en vis centrifugering dog være vigtig for at få materialet ind i et veldefineret 2D-lag.
Flowcellemetoden er for nylig blevet brugt med stor succes i eksperimenter, hvor der kræves et kontinuerligt aktivt lag. Vores seneste arbejde har set på dynamikken i topologiske defekter i det aktive lag, hvor billeddannelse og teksturanalyse af høj kvalitet er vigtig19. Derudover er flowcellemetoden blevet brugt til at undersøge virkningerne af olienedsænkede mikrostrukturer på aktive strømme16 og søjler for at fange defekter i de aktive strømme31. Denne metode fungerer meget godt til dannelse af et kontinuerligt aktivt lag, og billedkvaliteten er fremragende. Imidlertid kan centrifugeringstrinnet, der bruges til at producere det endelige 2D-aktive lag, være vanskeligt at udføre, og flowcellerne er tilbøjelige til lækager og luftbobler. Den omvendte metode er et meget nyttigt alternativ med en høj succesrate, er let at konstruere og kan bruges til ethvert substratmønster eller geometri, forudsat at der kan oprettes en 3D-printet masterform i høj opløsning. Denne metode er også nyttig til at se på virkningerne af geometrisk indeslutning på aktiv nematisk dynamik, fordi den gør påfyldningsbrønde relativt ligetil.
I dette papir beskrives to måder at danne en aktiv nematik fra mikrotubuli og kinesinmotorer plus en teknik til at begrænse materialerne i brønde. Det præsenterede system repræsenterer det reneste eksempel på en aktiv nematisk fase, der i øjeblikket er i litteraturen og er blevet gengivet af flere grupper rundt om i verden. Betydningen af dette materiale ligger ikke kun i den biologiske oprindelse af dets komponenter, men også fordi det åbner en helt ny retning i aktive ordnede væsker. Ved at arbejde med dette system og belyse dets grundlæggende egenskaber kan forskere bevæge sig mod design af fuldsyntetiske aktive faser.
Eksperimenterne fokuserede på virkningerne af indeslutning på aktiv nematik har potentialet til at besvare grundlæggende spørgsmål vedrørende aktive strømmes opførsel og topologisk defektdynamik under topologisk indeslutning. Metoden, der præsenteres her, vil hjælpe med udførelsen af en række geometrifokuserede eksperimenter og deres analyse, herunder mikrofluidik og aktiv blanding.
Disclosures
Nogle materialer, der blev brugt i dette arbejde, blev leveret gratis af Cytoskeleton Inc. (Denver, USA).
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende National Science Foundation (NSF) -prisen DMR-1808926 for generøs finansiering. Projektet blev også støttet af NSF gennem Center of Research Excellence in Science and Technology: Center for Cellular and Biomolecular Machines ved University of California Merced (HRD-1547848) og Brandeis Biomaterials Facility Materials Research Science and Engineering Center (DMR-2011486). Vi vil gerne takke Dr. Bin Liu ved University of California Merced for hjælp til 3D-udskrivning af formen og Dr. Jordi Ignes for videnskabelig rådgivning under udviklingen af den omvendte eksperimentelle metode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 kD PEG (polyethylene glycol)) | Sigma Aldrich | 1419109 | Depletion agent CAS Number: 125061-88-3 |
| 3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514-50ML | CAS Number: 2530-85-0 |
| 3D printer & Resin | Phrozen | Phrozen sonic mini 8K 3D printer - Aqua Gray 8K resin | |
| 40% Acrylamide Solution | BIO-RAD | 1610140 | CAS Number: 7732-18-5, 79-06-1 |
| Acetic Acid | Fisher | CAS Number: 64-19-7 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-64-1 | |
| Adhesive sheets (NOTE: "Parafilm" is an alternative) | Grace Bio-Labs | 620001 | SecureSeal |
| Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | CAS Number: 7727-54-0 |
| Aquapel (NOTE: "RainX" is an alternative) | Aquapel Glass Treatment | hydrophobic glass treatment | |
| ATP (Adenosine triphosphate) | Sigma Aldrich | A1852 | CAS Number: 34369-07-8 |
| Beakers | VWR | ||
| Catalase | Sigma Aldrich | C9322 | CAS Number: "9001-05-2" |
| Desiccator | Bel-art | ||
| Digital CMOS camera | Hamamatsu | ORCA - Flash4.0 LT+ | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma Aldrich | D9779 | CAS Number: "3483-12-3" |
| EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00004291 | CAS Number: 67-42-5 |
| Ethanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 64-17-5 | |
| Fluorescence microscope | Leica | DM 2500P | |
| Glass Coverslips | VWR | 48368-040 | |
| Glass Slides | VWR | 16004-430 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | CAS Number: 50-99-7 |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | 345386 | CAS Number: 9001-37-0 |
| GMPCPP (guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate) | Jena Bioscience | NU-405S | CAS Number: 14997-54-7 |
| HFE7500 Oil | 3M | ||
| Hot Plate | Fisher Scientific | Thermix hot plate model 100M | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | ||
| KCl (potassium chloride) | Sigma Aldrich | P5405 | CAS Number: 7447-40-7 |
| Methanol | Sigma Aldrich | CAS Number: 67-56-1 | |
| MgCl2 (Magnesium Chloride) | Sigma Aldrich | 208337 | CAS Number: 7786-30-3 |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf - Thermo Fisher | 1.5 mL | |
| Nanopure water purifier | Sartorius | arium mini | |
| NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma Aldrich | SX0603 | CAS Number: 1310-73-2 |
| Petri Dishes | VWR | ||
| PH Meter | Thermo Scientist | Orion 3 STAR | |
| Phosphoenol-pyruvate (PEP) | Sigma Aldrich | MFCD00044476 | CAS Number: 4265-07-0 |
| PIPES (1,4-Piperazinediethanesulfonic acid) | Sigma Aldrich | CAS Number: 5625-37-6 | |
| Pipettes (0.2 - 1000 µl) | VWR | ||
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 2594628 | |
| RAN Surfactant (NOTE: "FluoSurf" from Emulso is an alternative) | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant-2wtH-50G | |
| Silicon Oil (100mpa s-1000 mpa s) | Sigma Aldrich | CAS Number: 63148-52-7 | |
| Streptavidin | Thermofisher | S888 | |
| Swinging Bucket Centrifuge | Thermo Scientist | Sorvall legend RT+ | |
| Sylgard 184 Elastomer base | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Sylgard 184 Elastomer Curing agent | World Precision Instruments | SYLG184 | |
| Table top centrifuge | Eppendorf | MiniSpin Plus | |
| TEMED (Tetramethylethylenediamine) | BIO-RAD | 1610800 | CAS Number: 110-18-9 |
| Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) | Sigma Aldrich | MFCD00006846 | CAS Number: 53188-07-1 |
| Tubulin | Cytoskeleton | T240-B | |
| Tubulin (Rhodamine labeled) | Cytoskeleton | TL590M-A | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima Max-TL | |
| UV Light | RapidFix | ||
| UV-curable glue (NOTE: "Norland NO81" is an alternative) | RapidFix | ||
| Water Bath | Thelco | ||
| Whatman Filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001325 |
References
- Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria. Physics Review Letters. 98 (15), 158102 (2007).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).
- Toner, J., Tu, Y. Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together. Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).
- Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).
- Needleman, D., Dogic, Z. Active matter at the interface between materials science and cell biology. Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048 (2017).
- Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. Self-organizing motors divide active liquid droplets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).
- Memarian, F. L., et al. Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).
- Bausch, A., Sciortino, A. R. Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).
- Maroudas-Sacks, Y., et al. Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis. Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).
- Liu, J., et al. Topological braiding and virtual particles on the cell membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).
- Hirst, L. S. Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed. , CRC Press. (2019).
- Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8, 564 (2017).
- Thijssen, K., et al. Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).
- Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. Dancing disclinations in confined active nematics. Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).
- Giomi, L. Geometry and topology of turbulence in active nematics. Physical Review X. 5 (3), 031003 (2015).
- Tan, A. J., et al. Topological chaos in active nematics. Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).
- Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod. The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
- Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli. Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).
- Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. Kinesin Protocol. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).
- Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments. Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).
- Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature. Journal of Visualized Experiments. (153), e60484 (2019).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. Microtubules. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. Probing the shear viscosity of an active nematic film. Physical Review E. 94 (6), 060602 (2016).
- Rudy, A., et al. Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS). Tribology Letters. 65, 3 (2017).
- Venzac, B., et al. PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it. Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).
- Khaladj, D. A., Hirst, L. S. Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows. Frontiers of Physics. 10, 880941 (2022).
